CN115541796A - 藏茵陈特征图谱的构建方法和鉴定藏茵陈的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了藏茵陈特征图谱的构建方法和鉴定藏茵陈的方法，所述藏茵陈特征图谱包括如下几种物质的特征峰：异芒果苷、獐牙菜苦苷、芒果苷、龙胆苦苷、当药苷、异荭草苷、甲基当药宁、齐墩果酸和熊果酸。采用该藏茵陈特征图谱中的特征峰作为衡量指标，可以准确地鉴定出藏茵陈，辨别真伪，尤其是可以筛选出对于肝胆疾病疗效好的藏茵陈，有助于藏茵陈质量控制。并且，构建方法和鉴定方法操作简便，具有重现性好、精密度高和稳定性强等优点，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及色谱检测领域。具体地，本发明涉及藏茵陈特征图谱的构建方法和鉴定藏茵陈的方法。
背景技术
藏茵陈为藏药八珍之一，有清热、解毒，清肝利胆的功效，可用于治疗肝炎、胆囊炎、急性黄疸性肝炎和肾盂肾炎等疾病。藏茵陈的基原复杂，不同种类的藏茵陈药材成分差异大，含量明显不同。目前针对藏茵陈的检测方法有显微观察法、薄层层析法、红外光谱法和高效液相色谱法等，其中，通过高效液相色谱法建立指纹图谱符合中医药整体综合的特点，是目前国际上通用的方法。但指纹图谱由于相似度的限制，只能对同种或两种以内的药材进行质量评价，适用范围窄，且目前所使用的活性成分评价指标单一，不能全面的控制藏茵陈的质量，限制了藏茵陈的开发利用。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出了藏茵陈特征图谱的构建方法、鉴定藏茵陈的方法和筛选具有治疗肝胆疾病的藏茵陈的方法，采用该藏茵陈特征图谱中的特征峰作为衡量指标，可以准确地鉴定出藏茵陈，辨别真伪，尤其是可以筛选出对于肝胆疾病疗效好的藏茵陈，有助于藏茵陈质量控制。并且，构建方法和鉴定方法操作简便，具有重现性好、精密度高和稳定性强等优点，适于推广应用。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种构建藏茵陈特征图谱的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)对照品溶液的制备：称取不同种对照品，加有机溶剂，制得混合对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：取藏茵陈样品，加入有机溶剂，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用所述有机溶剂补足减少的重量，过滤，收集滤液；(3)获得特征图谱：以对照品溶液作为参照物，将对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，选择多批藏茵陈的色谱图，确定所述色谱图中的共有特征峰，即得藏茵陈特征图谱。通过对所述藏茵陈特征图谱进行研究分析，可以获得9个特征峰，从而有助于准确地鉴定藏茵陈。并且，该方法操作简便，具有重现性好、精密度高和稳定性强等优点，适于推广应用。
根据本发明的实施例，所述藏茵陈选自：抱茎獐牙菜、北方獐牙菜、紫红獐牙菜、川西獐牙菜或大籽獐牙菜。发明人采集不同地区的多批龙胆科獐牙菜属、花锚属、扁蕾属、喉毛花属的诸如大籽獐牙菜、川西獐牙菜、抱茎獐牙菜、北方獐牙菜、印度獐牙菜、四数獐牙菜、紫红獐牙菜、普兰獐牙菜、华北獐牙菜、獐牙菜、岐伞獐牙菜、大花花锚、卵萼花锚、廻旋扁蕾、卵叶扁蕾、湿生扁蕾、扁蕾，喉毛花进行研究，发现所选的五种藏茵陈(抱茎獐牙菜、北方獐牙菜、紫红獐牙菜、川西獐牙菜和大籽獐牙菜)的化学成分多，含量高，均含有13种以上的化学成分，其中共有的化学成分有10种，而藏茵陈的有效成分对于治疗急慢性肝炎、慢性胆囊炎等具有显著的效果，据此可以认为以上五种藏茵陈为治疗肝病的优质药材，而根据这五种藏茵陈建立的特征图谱可以评价藏茵陈的质量。
根据本发明的实施例，所述不同种对照品选自：龙胆苦苷、獐牙苦苷、当药苷、芒果苷、新芒果苷、异芒果苷、当药醇苷、甲基当药宁、木犀草素、当药黄素、异牡荆素、异荭草苷、齐墩果酸和熊果酸的至少两个。通过以上述几种化合物作为对照品，可以有效地比对出供试品出现的特征峰所对应的是何种物质，从而有助于深入研究。
根据本发明的实施例，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙睛、异丙醇或丙酮。由此，可以有效地提取出藏茵陈中的组分。
根据本发明的实施例，所述液相色谱仪的检测条件如下：色谱柱的固定相为十八烷基键合硅胶；流动相为流动相A和流动相B，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为0.1％磷酸溶液；柱温为20～40℃；
梯度洗脱条件如下：
检测波长条件如下：
流速条件如下：
| 时间(min) | 流速(mL/min) |
| 0～30 | 0.7 |
| 30～35 | 由0.7升至1 |
| 35～135 | 1 |
| 135～138 | 由1降至0.7 |
| 138～150 | 0.7 |
发明人经过大量实验得到上述较佳的检测条件，由此，可以分离出上述9种特征峰，分离度高，进而可以准确地鉴定藏茵陈，辨别真伪，尤其是可以获得治疗肝胆疾病效果较好的藏茵陈。例如，在选择检测波长时，发明人通过紫外分光光度计在180～600nm范围内进行扫描，检测最大吸收波长，根据紫外吸收图谱确定波长，发现藏茵陈中化学成分复杂，采用恒定波长不能检测出全部物质，不利于藏茵陈的质量控制。并且，发明人对藏茵陈的多种物质的保留时间进行研究，发现色谱分析时间大于60分钟，尤其是达到150分钟，可以有效地分离出各特征峰，从而有助于藏茵陈的鉴定，辨别真伪，尤其是可以获得治疗肝胆疾病效果较好的藏茵陈。
根据本发明的实施例，发明人对所构建的特征图谱进行分析，获知所述特征图谱存在9个共有特征峰，所述特征峰中以当药苷为标准峰，其余特征峰的相对出峰时间从前往后依次为0.349～0.364、0.633～0.650、0.848～0.857、0.898～0.925、1.000、1.605～1.838、4.176～4.667、4.503～4.927和5.429～5.475。上述出峰时间下1号峰来自异芒果苷；2号峰来自獐牙菜苦苷；3号峰来自芒果苷；4号峰来自龙胆苦苷；5号峰来自当药苷；6号峰来自异荭草苷；7号峰来自甲基当药宁；8号峰来自未知物质；9号峰来自齐墩果酸和熊果酸。其中所述未知物质的特征峰在多种藏茵陈中均存在，但是尚未鉴定出该峰对应的是何种物质，因此，以该未知物质的峰作为特征峰，可以进一步提高藏茵陈鉴定的准确性；所述齐墩果酸和熊果酸为同分异构体，在此条件下无法完全分离，同在9号峰上。采用上述9个特征峰作为衡量指标，可以准确且有效地鉴定藏茵陈，不仅能鉴定其真伪，更重要的是评价其质量优劣，即是否获得优质的具有治疗肝胆疾病功效的藏茵陈。由此，有助于藏茵陈质量控制，适于推广应用。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种鉴定藏茵陈的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待测样品进行预处理，得到上样液；对所述上样液进行液相色谱检测，获得色谱图；确定所述色谱图中是否含有前面所述藏茵陈特征图谱的构建方法所得藏茵陈特征图谱中的特征峰；当所述色谱图中含有所述特征峰，则是所述待测样品为藏茵陈的指示。由此，根据本发明实施例的方法可以准确地判断待测样品是否为藏茵陈，重现性好，精密度高，稳定性强，适于推广应用。
根据本发明的实施例，所述液相色谱的检测条件是如前面所述构建藏茵陈特征图谱的方法中所限定的。由此，可以有效地分离得到上述9个特征峰，分离度高。
根据本发明的实施例，所述藏茵陈具有治疗肝胆疾病的药效。由此，采用本发明的方法可以筛选出治疗肝胆疾病效果好的优质藏茵陈。
有益效果：
本发明突破了指纹图谱对相似度的限制，建立了藏茵陈的特征图谱(只测相对保留时间)，此图谱适用范围广，通过对五种藏茵陈(抱茎獐牙菜、北方獐牙菜、紫红獐牙菜、川西獐牙菜和大籽獐牙菜)研究获得了9个共有峰，并对其中8个峰进行了指认，克服了仅用常见的獐牙菜苦苷、芒果苷等成分去鉴别藏茵陈的缺陷，能够比较全面的鉴别藏茵陈的质量。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明实施例1的藏茵陈HPLC特征图谱；
图2显示了根据本发明对比例7的藏茵陈HPLC特征图谱；
图3显示了根据本发明对比例8的藏茵陈HPLC特征图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：HPLC特征图谱的构建
1.1实验仪器及试剂：Agilent1260高效液相色谱仪、月旭Ultimate XB-C18色谱柱KQ-700VDB超声仪、色谱纯乙腈、分析纯磷酸、分析纯甲醇和超纯水。
1.2对照品：龙胆苦苷、獐牙苦苷、当药苷、芒果苷、新芒果苷、异芒果苷、当药醇苷、甲基当药宁、木犀草素、当药黄素、异牡荆素、异荭草苷、齐墩果酸和熊果酸，购自中国食品药品检定研究院。
1.3供试品：共选取23批样品，涉及五种藏茵陈种类。具体为抱茎獐牙菜6批、北方獐牙菜1批、紫红獐牙菜2批、川西獐牙菜9批和大籽獐牙菜5批。
1.4步骤
(1)色谱检测条件：以十八烷基键合硅胶为固定相，以乙腈为流动相A、0.1％磷酸为流动相B，柱温为30℃，流速0.7～1ml/min，检测波长205～240nm。按下表梯度洗脱，并按下表进行检测波长和流速变换，理论板数按当药苷峰计算应不低于10000，分析时间150分钟。
(2)对照品溶液制备：取适量龙胆苦苷、獐牙苦苷、当药苷、芒果苷、新芒果苷、异芒果苷、当药醇苷、甲基当药宁、木犀草素、当药黄素、异牡荆素、异荭草苷、齐墩果酸和熊果酸对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含0.5mg的溶液，即得对照品溶液；
(3)供试品溶液制备：取藏茵陈样品0.2g，精密称定，置100ml具塞三角瓶中，加入80％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率270W，频率40kHz)40分钟，取出，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，用干燥滤纸滤过，弃去初滤液，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；
(4)获得特征图谱：分别吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，选择合格的多批藏茵陈的色谱图，确定所述色谱图中的共有特征峰，即得藏茵陈特征图谱。
根据上述检测方法，所得藏茵陈的特征图谱参见图1，特征峰为9个，其中5号峰为标准峰，9个峰与标准峰相比，相对保留时间分别为：0.349，0.633，0.848，0.898，1.000，1.838，4.667，4.927，5.475，其中1号峰对应的物质为异芒果苷；2号峰对应的物质为獐牙菜苦苷；3号峰对应的物质为芒果苷；4号峰对应的物质为龙胆苦苷；5号峰对应的物质为当药苷；6号峰对应的物质为异荭草苷；7号峰对应的物质为甲基当药宁；9号峰对应的物质为齐墩果酸和熊果酸。(其中8号峰物质未确定)
实施例2：特征图谱检测方法的方法学考察
2.1重复性试验
取同一样品6份，制成供试品溶液，记录色谱图，计算各共有峰相对保留时间的RSD<0.43％，满足RSD<5％的要求，表明方法重现性良好。
2.2精密度试验
取同一供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图，计算各共有峰的相对保留时间的RSD<0.43％，满足RSD<5％的要求，表明仪器精密度良好。
2.3稳定性试验
取同一份供试品溶液，记录0h、3h、5h、10h、15h、20h和24h的色谱图，各色谱峰的相对保留时间的RSD<1.02％，满足RSD<5％的要求，表明样品在24h内稳定。
对比例1
在该对比例中，将实施例1中的色谱检测波长替换为恒定波长240nm，其余色谱检测方法同实施例1。
结果表明，采用恒定波长所得色谱图中特征峰数量减少，未出现齐墩果酸和熊果酸的特征峰，不利于藏茵陈质量控制。而本发明在115～135分钟内对波长进行了调整，既保证了色谱图中前8个物质顺利出峰，又能检测到齐墩果酸和熊果酸，能够有效控制藏茵陈的质量。
对比例2
在该对比例中，将实施例1中色谱的流速替换为恒定流速1ml/min，其余色谱检测方法同实施例1。
结果表明，采用恒定流速1ml/min所得色谱图中前5个特征峰提前出现，并且出现重叠，分离度差，不能满足检测需求。而本发明在0～30分钟内将流速设置为0.7ml/min，避免了由于前5个特征峰距离较近出现重叠现象，分离效果好，能够满足检测需求。
对比例3
在该对比例中，将实施例1中的流动相替换为甲醇-0.1％磷酸溶液，其余色谱检测方法同实施例1。
结果表明，所得色谱图中各物质不能完全分离，出现色谱峰重叠现象，调整洗脱条件后在洗脱时间内仍不能达到检测需求。而采用本发明的流动相，各物质能够有效分离，且所得色谱峰尖锐，不拖尾，检测效果良好。
对比例4
在该对比例中，将实施例1中的流动相替换为乙腈-甲醇，其余色谱检测方法同实施例1。
结果表明，所得色谱图中各物质不能完全分离，出现色谱峰重叠现象，调整洗脱条件后在洗脱时间内仍不能达到检测需求。而采用本发明的流动相，各物质能够有效分离，且色谱峰尖锐，不拖尾，检测效果良好。
对比例5
在该对比例中，将实施例1中的流动相替换为乙腈-0.02磷酸溶液，其余色谱检测方法同实施例1。
结果表明，所得色谱图的分离度有改善，但峰形和理论塔板数均不理想，调整洗脱条件后检测效果仍不理想。而采用本发明的流动相，所得色谱图中各特征明显，峰形尖锐，不拖尾，检测效果良好。
对比例6
在该对比例中，将实施例1中流动相洗脱条件替换为固定体积比为12:88的乙腈-0.1磷酸溶液，其余色谱检测方法同实施例1。
结果表明，所得色谱图中后面4个特征峰的分离度差，出现色谱峰重叠现象，不能满足检测需求。而采用本发明的流动相洗脱条件，所得色谱图中各特征峰明显，峰形尖锐，不拖尾，检测效果良好。
对比例7
在该对比例中，选取11种藏茵陈(抱茎獐牙菜、北方獐牙菜、紫红獐牙菜、川西獐牙菜、大籽獐牙菜、华北獐牙菜、普兰獐牙菜、岐伞獐牙菜、四数獐牙菜、印度獐牙菜和獐牙菜)进行研究，其中23批样品(抱茎獐牙菜、北方獐牙菜、紫红獐牙菜、川西獐牙菜和大籽獐牙菜)来源同实施例1，另外6种藏茵陈来源参见下表。采用实施例1的方法对上述藏茵陈进行色谱检测分析。
结果参见图2，增加藏茵陈种类导致共有特征峰减少，11种藏茵陈的共有特征峰仅为3个，分别为獐牙菜苦苷、当药苷和齐墩果酸的特征峰，三种成分在藏茵陈中较常见，不能全面评价藏茵陈的质量。
对比例8
在该对比例中，选取实施例1中的3种藏茵陈(不含川西獐牙菜和大籽獐牙菜)进行研究，色谱检测方法同实施例1。
结果参见图3，减少藏茵陈的种类导致共有特征峰增至12个，增加了异牡荆苷、当药醇苷等物质的特征峰。虽然衡量指标增加，但筛选条件过于苛刻，导致特征图谱的适用范围变窄，不利于藏茵陈的开发利用。
对比例9
在该对比例中，将实施例1中的川西獐牙菜替换为四数獐牙菜进行研究，色谱检测方法同实施例1。
结果表明，将川西獐牙菜替换为四数獐牙菜会造成共有特征峰减少，只有4个共有特征峰，分别为獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、齐墩果酸和熊果酸的特征峰，五种成分在藏茵陈中较为普遍，不能全面评价藏茵陈的质量。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种藏茵陈特征图谱的构建方法，其特征在于，包括：
(1)对照品溶液的制备：称取不同种对照品，加有机溶剂，制得混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取藏茵陈样品，加入有机溶剂，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用所述有机溶剂补足减少的重量，过滤，收集滤液；
(3)获得特征图谱：以对照品溶液作为参照物，将对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，选择多批藏茵陈的色谱图，确定所述色谱图中的共有特征峰，即得藏茵陈特征图谱，所述液相色谱仪的检测条件如下：
流动相包括：流动相A和流动相B，所述流动相A为乙腈，所述流动相B为磷酸溶液；
采用梯度洗脱方式，流速为0.7～1ml/min；
检测波长为205～240nm，柱温为20～40℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸溶液的浓度为0.05～0.2％；
所述梯度洗脱条件如下：
所述检测波长条件如下：
；
所述流速条件如下：
。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藏茵陈选自抱茎獐牙菜、北方獐牙菜、紫红獐牙菜、川西獐牙菜或大籽獐牙菜；
所述不同种对照品选自龙胆苦苷、獐牙苦苷、当药苷、芒果苷、新芒果苷、异芒果苷、当药醇苷、甲基当药宁、木犀草素、当药黄素、异牡荆素、异荭草苷、齐墩果酸和熊果酸的至少两个。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙睛、异丙醇或丙酮。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征图谱存在9个共有特征峰，所述特征峰中以当药苷为标准峰，其余特征峰的相对出峰时间从前往后依次为0.349～0.364、0.633～0.650、0.848～0.857、0.898～0.925、1.000、1.605～1.838、4.176～4.667、4.503～4.927和5.429～5.475。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述特征图谱包括如下几种物质的特征峰：异芒果苷、獐牙菜苦苷、芒果苷、龙胆苦苷、当药苷、异荭草苷、甲基当药宁、齐墩果酸和熊果酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述特征图谱进一步包括未知物质特征峰，所述未知物质特征峰的相对保留时间为4.503～4.927。
8.一种鉴定藏茵陈的方法，其特征在于，包括：
将待测样品进行预处理，得到上样液；
对所述上样液进行液相色谱检测，获得色谱图；
确定所述色谱图中是否含有权利要求7所述藏茵陈特征图谱的构建方法所得藏茵陈特征图谱中的特征峰；
当所述色谱图中含有所述特征峰，则是所述待测样品为藏茵陈的指示。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的检测条件是如权利要求1或2所述方法中所限定的。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述藏茵陈具有治疗肝胆疾病的药效。
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