JP7365711B2 - 微量の血液中のビタミンk1およびビタミンk2を同時に検出する方法 - Google Patents
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Description
(1)2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムモジュールの選択、2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムの構築、および2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置の分析条件の確立を含む血液中のビタミンK1およびビタミンK2を検出する分析方法の確立と、
(2)標準溶液の標定であって、
(2a)少なくとも3種の混合標準溶液を調製し、前記混合標準溶液は、内部標準物質、ビタミンK1およびビタミンK2を有する溶液であり、且つ、前記少なくとも3種の混合標準溶液中の内部標準物質の濃度は同じであり、
(2b)2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置を用い、ステップ(1)で確立した分析方法により、前記少なくとも3種の混合標準溶液のそれぞれを検出し、前記少なくとも3種の混合標準溶液のそれぞれに対応する第1検出結果を取得し、
(2c)それぞれの前記第1検出結果、前記混合標準溶液中の内部標準物質、ビタミンK1およびビタミンK2の濃度に基づき、ビタミンK1およびビタミンK2にそれぞれ対応する検量線方程式をそれぞれフィッティングする、標準溶液の標定と、
(3)血液サンプルの測定であって、
(3a)血液サンプルに前記混合標準溶液中と同じ量の内部標準物質および抽出試薬を加えて抽出した後、遠心処理を行い、遠心処理後の上清をブローで乾燥し、再溶解液を用いて再溶解させ、分析サンプルを取得し、
(3b)2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置を用い、ステップ(1)で確立した前記分析方法により、前記血液サンプルを検出し、前記血液サンプルに対応する第2検出結果を取得し、
(3c)前記ビタミンK1およびビタミンK2のそれぞれに対応する検量線方程式および前記第2検出結果に基づき、前記血液サンプル中のビタミンK1およびビタミンK2の濃度を取得する、血液サンプルの測定と、
を含む血液中のビタミンK1およびビタミンK2を同時に検出する方法を提供する。
前記液体ポンプは少なくとも2セットであり、そのうちの一方のセットの液体ポンプは前記オートサンプラに接続され、他方のセットの液体ポンプは独立してポンプ動作を行い、
前記オートサンプラは、サンプル注入動作を行うために用いられ、
前記カラムインキュベーターは、2次元液体のカラム切替動作を行うために少なくとも1セットの切替弁を含み、
前記切替弁のうちの各セットは、独立して六方弁または十方弁から選ばれる。
一方のセットの液体ポンプがオートサンプラに直列に接続され、オートサンプラが第1次元カラムに接続されて切替弁にアクセスされ、他方のセットの液体ポンプが切替弁にアクセスされて第2次元カラムに接続され、第2次元カラムが質量分析装置にアクセスされ、且つ、切替弁により、サンプル注入、2次元転移、分析という3種の状態を含む前記システムの分析状態を制御することと、
前記サンプル注入時に、サンプルを第1次元カラムにより分析し、非目的分析物を切替弁の廃液から排出することと、
前記2次元転移時に、第1次元カラムと第2次元カラムとを直列に接続し、目的分析物を第1次元カラムから第2次元カラムに転移することと、
前記分析時に、サンプルを第2次元カラムにより分析し、質量分析装置を接続してデータ収集を行うことと、
を含む。
2次元液体クロマトグラフィーの移動相の流速が0.5~2.0mL/minであることと、
前記移動相は超純水、メタノール、アセトニトリル、および任意の2種または3種の任意の割合の混合溶媒を含む極性溶媒であり、前記移動相に0.01%~1%のギ酸が含まれることと、
2次元液体クロマトグラフィーのサンプル注入量は1~100μLであることと、
2次元液体クロマトグラフィーカラムインキュベーターのカラム温度は20~60℃であることと、
質量分析装置は、APCI源、正イオンスキャンモードを採用し、霧化ガス流量が0.5~3L/minで、加熱ガス流量が3~20L/minで、イオン源温度が100~400℃で、脱溶媒管温度が30~300℃で、ヒータブロック温度が30~500℃で、乾燥ガス流量が0~20L/minで、インターフェース電圧が1~5kVであることと、
を含む。
2次元液体クロマトグラフィーの第1次元カラムはフェニルヘキシルであることと、第2次元カラムはC18であることと、
を含む。
前記ビタミンK2に対応する検量線方程式の2つの変数は、それぞれ、ビタミンK2のクロマトグラフピーク面積とビタミンK2に対応する内部標準物質のクロマトグラフピーク面積との比、およびビタミンK2の濃度とビタミンK2に対応する内部標準物質の濃度との比である。
標準混合中間液の調製であって、ビタミンK1標準原液、ビタミンK2標準原液を異なる割合で混合し、希釈液を用いて希釈し、少なくとも3種の異なる濃度の標準混合中間液を得て、光を避けて保存する、標準混合中間液の調製と、
混合内部標準作動液の調製であって、ビタミンK1内部標準物質原液、ビタミンK2内部標準物質原液を異なる割合で混合し、希釈液を用いて希釈し、混合内部標準作動液を得て、光を避けて保存する、混合内部標準作動液の調製と、
混合標準溶液の調製であって、同じ体積かつ異なる濃度の少なくとも3種の標準混合中間液をそれぞれ取り出し、同じ体積の前記混合内部標準作動液および同じ体積の前記希釈液をそれぞれ加え、1500~3000r/minで30s~1min渦巻いて均一に混合し、少なくとも3種の異なる混合標準溶液を作成する、混合標準溶液の調製と、
を含み、
前記希釈液は、メタノールまたはメタノール水溶液、アセトニトリルまたはアセトニトリル水溶液、イソプロパノールまたはイソプロパノール水溶液を含み、前記メタノール水溶液、アセトニトリル水溶液、イソプロパノール水溶液の体積濃度は、独立して50%~100%から選ばれる。
前記混合内部標準作動液中のビタミンK1内部標準物質の濃度は10~30ng/mLであり、ビタミンK2内部標準物質の濃度は10~30ng/mLである。
本願に係る分析方法は、全血、血清、または血漿を含む血液サンプルに適用でき、適用範囲が広い。
本願に係る分析方法は、指先血または踵血を含む非常に微量の血液サンプルだけで検出することができ、患者の採血苦痛を減少することができる。
血液サンプルを遠心速度1000~3000r/minで10~20min遠心し、遠心後の上清を前記血液サンプルとして-80℃の条件で保存することを更に含む。
血液サンプルに前記混合標準溶液中と同じ量の内部標準物質を加え、抽出試薬を更に加えて1000~2500r/minの回転速度で5~15min渦巻いて振動混合させてから、10000~15000r/minの回転速度で5~15min高速遠心し、遠心処理後の上清の一部または全てを窒素ブローで乾燥し、再溶解液を用いて再溶解させ、1000~2500r/minの回転速度で1~5min渦巻いて振動混合させ、分析サンプルを得ることを含む。
前記極性抽出試薬は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、またはイソプロパノールのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含み、
前記非極性抽出試薬は、n-ヘキサン、シクロヘキサン、n-オクタン、または石油エーテルのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含み、
前記再溶解液は、メタノール、エタノール、またはアセトニトリルのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む。
一方のセットが前記オートサンプラに接続され、他方のセットが独立してポンプ動作を行う2セットの液体ポンプと、
サンプル注入動作を行うための1台のオートサンプラと、
六方弁である2セットの切替弁を含む1台のカラムインキュベーターと、
を備え、
前記質量分析装置はAPCIイオン源を備えた。
一方のセットの液体ポンプがオートサンプラに直列に接続され、オートサンプラが第1次元カラムに接続されて切替弁にアクセスされ、他方のセットの液体ポンプが切替弁にアクセスされて第2次元カラムに接続され、第2次元カラムが質量分析装置にアクセスされ、且つ、切替弁により、サンプル注入、2次元転移、分析という3種の状態を含む前記システムの分析状態を制御することと、
サンプル注入時に、サンプルを第1次元カラムにより分析し、非目的分析物を切替弁の廃液から排出することと、
2次元転移時に、第1次元カラムと第2次元カラムとを直列に接続し、目的分析物を第1次元カラムから第2次元カラムに転移することと、
分析時に、サンプルを第2次元カラムにより分析し、質量分析装置を接続してデータ収集を行うことと、
を含んだ。
2セットの液体ポンプは、移動相がメタノール(0.2%のギ酸を含む)で、流速が1.2mL/minで、定組成溶離が5.50minであることと、
カラムインキュベーターは、カラム温度が50℃で、カラムがKinetex Phenyl-Hexyl 2.6μm 100*4.6mmおよびKinetex C18 2.6μm 100*4.6mmであり、2つの六方弁を含み、0.00min左弁位置1-2、1.40min左弁位置1-6、1.85min左弁位置1-2で、右弁位置は常に1-6であることと、
オートサンプラは、温度が15℃で、プローブ洗浄液がメタノールで、サンプル注入量が30μLであることと、
を含んだ。
APCI源、正イオンスキャンモードを採用することと、
霧化ガス流量が1.5L/minで、イオン源温度が400℃で、脱溶媒管温度が200℃で、ヒータブロック温度が300℃で、乾燥ガス流量が0L/minであることと、
インターフェース電圧が5kVで、衝突ガスがアルゴンガスで、パラメータを200kPaとすることと、
を含んだ。
標準混合中間液の調製:同じ体積のビタミンK1標準原液、ビタミンK2標準原液を取り出した。
構築した2次元液体クロマトグラフィー-質量分析装置を用いて上記実施例1で得られた各濃度の混合標準溶液を検出し、9種の異なる濃度の混合標準溶液のグラフを得た。
混合標準溶液中と同じ量の混合内部標準作動液を10μL取り出し、取り出した混合内部標準作動液に20μLの血清サンプルを加え、更に2種の抽出剤である100μLのメタノールおよび1000μLのn-ヘキサンを加え、2500r/minの回転速度で10min渦巻いて振動混合させてから、14000r/minの回転速度で10min高速遠心した。遠心後の900μLの上清を窒素ブローで乾燥し、100μLのメタノールを用いて再溶解させ、2500r/minの回転速度で1min渦巻いて振動混合した後、分析サンプルを得た。
上記実施例2で調製した9種の濃度の混合標準溶液を実施例3に従って実行してクロマトグラムを得た。クロマトグラフピーク面積-濃度でプロットして検量線を得た結果、ビタミンK1およびビタミンK2の線形範囲は以下のとおりである。
ビタミンK1は0.05ng/mL~500.00ng/mLの範囲内にあり、線形が良好であり、相関係数R2>0.99であった。
ビタミンK1:0.011ng/mL。
(3)定量限界(LOQ):
ビタミンK1:0.013ng/mL。
実施例7:微量の血清中のビタミンK1およびビタミンK2を検出する方法の回収率および精密度
実施例2における任意の3種の混合標準溶液を取って高、中、低という3種の濃度に作成してサンプル追加回収率実験および精密度実験を行い、実施例2~5の処理方式および検出条件に従って検出し、3バッチを繰り返し分析して測定し、得られた血清中のビタミンK1、ビタミンK2の回収率および精密度の結果は以下の表2に示すとおりであった。
(1)本願は、2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置を構築し、2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置を用いて血液中のビタミンK1およびビタミンK2を同時に検出することを実現し、微量の血液サンプルの検出に特に適用される。ここで、血液サンプルは血清、血漿、全血を含む。サンプル使用量は20~200μLである。
Claims (14)
- (1)2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムモジュールの選択、2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムの構築、および2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置の分析条件の確立を含む血液中のビタミンK1およびビタミンK2を検出する分析方法の確立と、
(2)標準溶液の標定であって、
(2a)少なくとも3種の混合標準溶液を調製し、前記混合標準溶液は、内部標準物質、ビタミンK1およびビタミンK2を有する溶液であり、且つ、前記少なくとも3種の混合標準溶液中の内部標準物質の濃度は同じであり、
(2b)2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置を用い、ステップ(1)で確立した分析方法により、前記少なくとも3種の混合標準溶液のそれぞれを検出し、前記少なくとも3種の混合標準溶液のそれぞれに対応する第1検出結果を取得し、
(2c)それぞれの前記第1検出結果、前記混合標準溶液中の内部標準物質、ビタミンK1およびビタミンK2の濃度に基づき、ビタミンK1およびビタミンK2にそれぞれ対応する検量線方程式をそれぞれフィッティングする、標準溶液の標定と、
(3)血液サンプルの測定であって、
(3a)血液サンプルに、前記内部標準物質の前記血液サンプル中での濃度を前記内部標準物質の前記混合標準溶液中での濃度と同一となるように、前記内部標準物質を加え、更に抽出試薬を加えて抽出した後、遠心処理を行い、遠心処理後の上清をブローで乾燥し、再溶解液を用いて再溶解させ、分析サンプルを取得し、
(3b)2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置を用い、ステップ(1)で確立した前記分析方法により、前記分析サンプルを検出し、前記血液サンプルに対応する第2検出結果を取得し、
(3c)前記ビタミンK1およびビタミンK2のそれぞれに対応する検量線方程式および前記第2検出結果に基づき、前記血液サンプル中のビタミンK1およびビタミンK2の濃度を取得する、血液サンプルの測定と、
を含む、血液中のビタミンK1およびビタミンK2を同時に検出する方法。 - ステップ(1)に記載の2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムモジュールは、液体ポンプ、オートサンプラ、カラムインキュベーターおよび質量分析装置を含み、
前記液体ポンプは少なくとも2セットであり、そのうちの一方のセットの液体ポンプは前記オートサンプラに接続され、他方のセットの液体ポンプは独立してポンプ動作を行い、
前記オートサンプラは、サンプル注入動作を行うために用いられ、
前記カラムインキュベーターは、2次元液体のカラム切替動作を行うために少なくとも1セットの切替弁を含み、
前記切替弁のうちの各セットは、独立して六方弁または十方弁から選ばれる、請求項1に記載の方法。 - ステップ(1)に記載の2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置システムの構築は、
一方のセットの液体ポンプがオートサンプラに直列に接続され、オートサンプラが第1次元カラムに接続されて切替弁にアクセスされ、他方のセットの液体ポンプが切替弁にアクセスされて第2次元カラムに接続され、第2次元カラムが質量分析装置にアクセスされ、且つ、切替弁により、サンプル注入、2次元転移、分析という3種の状態を含む前記システムの分析状態を制御することと、
前記サンプル注入時に、サンプルを第1次元カラムにより分析し、非目的分析物を切替弁の廃液から排出することと、
前記2次元転移時に、第1次元カラムと第2次元カラムとを直列に接続し、目的分析物を第1次元カラムから第2次元カラムに転移することと、
前記分析時に、サンプルを第2次元カラムにより分析し、質量分析装置を接続してデータ収集を行うことと、
を含む、請求項1または2に記載の方法。 - ステップ(1)に記載の2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置の分析条件の確立は、
2次元液体クロマトグラフィーの移動相の流速が0.5~2.0mL/minであることと、
前記移動相は超純水、メタノール、アセトニトリル、および任意の2種または3種の任意の割合の混合溶媒を含む極性溶媒であり、前記移動相に0.01%~1%のギ酸が含まれることと、
2次元液体クロマトグラフィーのサンプル注入量は1~100μLであることと、
2次元液体クロマトグラフィーカラムインキュベーターのカラム温度は20~60℃であることと、
質量分析装置は、APCI源、正イオンスキャンモードを採用し、霧化ガス流量が0.5~3L/minで、加熱ガス流量が3~20L/minで、イオン源温度が100~400℃で、脱溶媒管温度が30~300℃で、ヒータブロック温度が30~500℃で、乾燥ガス流量が0~20L/minで、インターフェース電圧が1~5kVであることと、
を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。 - ステップ(1)に記載の2次元液体クロマトグラフィータンデム型質量分析装置の分析条件の確立は、
2次元液体クロマトグラフィーの第1次元カラムはフェニルヘキシルであることと、第2次元カラムはC18であることと、
を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記内部標準物質は、ビタミンK1同位体マーカー及びビタミンK2同位体マーカーを含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ビタミンK1に対応する検量線方程式の2つの変数は、それぞれ、ビタミンK1のクロマトグラフピーク面積と前記ビタミンK1同位体マーカーのクロマトグラフピーク面積との比、およびビタミンK1の濃度と前記ビタミンK1同位体マーカーの濃度との比であり、
前記ビタミンK2に対応する検量線方程式の2つの変数は、それぞれ、ビタミンK2のクロマトグラフピーク面積と前記ビタミンK2同位体マーカーのクロマトグラフピーク面積との比、およびビタミンK2の濃度と前記ビタミンK2同位体マーカーの濃度との比である、請求項6に記載の方法。 - ステップ(2a)に記載の少なくとも3種の混合標準溶液を調製する方法は、
標準混合中間液の調製であって、ビタミンK1標準原液、ビタミンK2標準原液および希釈液という3つの液を異なる体積割合で混合し、少なくとも3種の異なる濃度の標準混合中間液を得て、光を避けて保存する、標準混合中間液の調製と、
混合内部標準作動液の調製であって、ビタミンK1内部標準物質原液、ビタミンK2内部標準物質原液を異なる体積割合で混合し、希釈液を用いて希釈し、混合内部標準作動液を得て、光を避けて保存する、混合内部標準作動液の調製と、
混合標準溶液の調製であって、同じ体積かつ異なる濃度の少なくとも3種の標準混合中間液をそれぞれ取り出し、同じ体積の前記混合内部標準作動液および同じ体積の前記希釈液をそれぞれ加え、1500~3000r/minで30s~1min渦巻いて均一に混合し、少なくとも3種の異なる混合標準溶液を作成する、混合標準溶液の調製と、
を含み、
前記希釈液は、メタノールまたはメタノール水溶液、アセトニトリルまたはアセトニトリル水溶液、イソプロパノールまたはイソプロパノール水溶液を含み、前記メタノール水溶液、アセトニトリル水溶液、イソプロパノール水溶液の体積濃度は、独立して50%~100%から選ばれる、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。 - 前記標準混合中間液中のビタミンK1の濃度は0.05~500ng/mLであり、ビタミンK2の濃度は0.05~500ng/mLであり、
前記混合内部標準作動液中のビタミンK1内部標準物質の濃度は10~30ng/mLであり、ビタミンK2内部標準物質の濃度は10~30ng/mLである、請求項8に記載の方法。 - 前記血液サンプルは、全血、血清、または血漿を含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記血液サンプルの使用量は20μL以上である、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(3a)の前に、
血液サンプルを遠心速度1000~3000r/minで10~20min遠心し、遠心後の上清を前記血液サンプルとして-80℃の条件で保存することを更に含む、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。 - ステップ(3a)は、
血液サンプルに、前記内部標準物質の前記血液サンプル中での濃度を前記内部標準物質の前記混合標準溶液中での濃度と同一となるように、前記内部標準物質を加え、抽出試薬を更に加えて抽出した後、1000~2500r/minの回転速度で5~15min渦巻いて振動混合させてから、10000~15000r/minの回転速度で5~15min高速遠心し、遠心処理後の上清の一部または全てを窒素ブローで乾燥し、再溶解液を用いて再溶解させ、1000~2500r/minの回転速度で1~5min渦巻いて振動混合させ、分析サンプルを得ることを含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。 - 前記抽出試薬は極性抽出試薬と非極性抽出試薬との組み合わせであり、
前記極性抽出試薬は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、またはイソプロパノールのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含み、
前記非極性抽出試薬は、n-ヘキサン、シクロヘキサン、n-オクタン、または石油エーテルのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含み、
前記再溶解液は、メタノール、エタノール、またはアセトニトリルのうちのいずれか1種または少なくとも2種の組み合わせを含む、請求項13に記載の方法。
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