CN115541778B - 一种测定人血浆中阿普斯特浓度的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种测定人血浆中阿普斯特浓度的检测方法。所述血浆中阿普斯特浓度的检测方法，包括以下步骤：将含阿普斯特的血浆、阿普斯特‑d5的乙腈溶液混合进行沉淀反应，将所得上清液分别注入液相色谱‑质谱仪，进行多反应监测反应，用内标法以标准曲线计算血浆中阿普斯特的含量，所述标准曲线以阿普斯特的浓度为横坐标，以阿普斯特和阿普斯特‑d5的峰面积比值为纵坐标。本发明基于沉淀法和液质联用技术进行血浆中阿普斯特的检测，可用于检测生物体内的阿普斯特浓度，提供了一种快速、准确、稳定的检测方法。

Description

一种测定人血浆中阿普斯特浓度的检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种血浆中阿普斯特浓度的检测方法。
背景技术
阿普斯特是一种口服的环单磷酸腺苷（cAMP）特异性磷酸二酯酶-4（PDE4）小分子抑制剂。PDE4的抑制能够升高细胞内的cAMP水平，PDE4降解cAMP可导致免疫细胞激活和促炎细胞因子释放。因此抑制PDE4可能能够降低PDE4介导的炎症反应。阿普斯特片，2014年03月21日在美国获批上市销售，批准的适应症为活动性银屑病关节炎，适用光疗或者***治疗的中度至重度斑块状银屑病和与白塞病相关的口腔溃疡。2014年9月，FDA 批准阿普斯特用于治疗中重度斑块状银屑病。由于其有希望的治疗结果和安全性，该药物分子在皮肤病学中变得非常流行。据研究报道，目前国内有关测定人体内阿普斯特血药浓度的方法尚未研究，而测定其在生物体内的血浆药物浓度对于评价药物疗效和分析药理作用等方面具有很重要的作用，因此开发一种测定血浆中阿普斯特浓度的检测方法，进行阿普斯特在中国健康受试者空腹及餐后状态下体内的药动学及人体生物等效性研究，不仅可以为阿普斯特相关制剂一致性评价提供依据，而且具有广泛的经济效益和社会效益。
发明内容
为解决现有技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种血浆中阿普斯特浓度的检测方法。本发明基于沉淀法和液质联用技术进行血浆中阿普斯特的检测，可用于检测生物体内的阿普斯特浓度，提供了一种快速、准确、稳定的检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种血浆中阿普斯特浓度的检测方法，包括以下步骤：
将含阿普斯特的血浆、阿普斯特-d5的乙腈溶液混合进行沉淀反应，涡旋混合5min，置4 ℃台式高速冷冻离心机（96孔板）中，4750 r/min离心10 min，每孔取上清100 µL，转移至另一96孔板，每孔加10%乙腈水溶液100 µL稀释，涡旋混合5 min后，进行液质联用检测，用内标法以标准曲线计算血浆中阿普斯特的含量，所述标准曲线以阿普斯特的浓度为横坐标，以阿普斯特和阿普斯特-d5的峰面积比值为纵坐标。
进一步地，所述液质联用检测的高效液相色谱条件包括：色谱柱为PhenomenexKinetex C18 (2.1×50 mm，2.6 µm)色谱柱，采用梯度洗脱，流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为0.1 %甲酸乙腈溶液，洗脱程序为0~0.5 min，流动相A的体积百分含量保持63%，流动相B的体积含量保持37%；0.5~1.3 min，流动相A的体积百分含量从63%下降到0.0%，流动相B的体积百分含量从37%上升到100%；1.3~2.4 min，流动相A的体积百分含量保持0.0%，流动相B的体积含量保持100%；2.4~2.41 min，流动相A的体积百分含量从0.0%上升到63%，流动相B的体积百分含量从100%下降到37%；2.41~3 min，流动相A的体积百分含量保持63%，流动相B的体积含量保持37%，流速为0.45 mL/min，柱温为40℃，进样量为5 µL；
进一步地，所述液质联用检测的质谱条件包括：使用三重四级杆质谱仪，离子源为电喷雾离子源，采用负离子模式，采用多反应监测扫描模式，离子化电压：5500 V；入口电压（EP）：10 V；碰撞室出口电压（CXP）：13 V；喷雾气（Gas1）：50；辅助加热气（Gas2）：55；气帘气：35，所述阿普斯特的离子对为461.2/257.1（定量离子对），碰撞能量（CE）：14 V，去簇电压（DP）：190 V；所述阿普斯特-d5的离子对为466.1/262.3，CE：14 V，DP：190 V。
进一步地，含阿普斯特的血浆样品检测方法为：取96孔板，每孔加含阿普斯特的血浆样品100 µL，再加质量浓度为20.0 ng/mL内标工作溶液（内标工作溶液稀释剂为乙腈溶液））300 µL，涡旋混合5 min，置4 ℃台式高速冷冻离心机（96孔板）中，4750 r/min离心10min，每孔取上清100 µL，转移至另一96孔板，每孔加10%乙腈水溶液100 µL稀释，涡旋混合5min，进行液质联用检测，用内标法以标准曲线计算血浆中阿普斯特的含量，所述标准曲线以阿普斯特的浓度为横坐标，以阿普斯特和阿普斯特-d5的峰面积比值为纵坐标。
更进一步地，所述内标工作溶液的制作方法为：称量1 mg阿普斯特-d5标准品，用N，N-二甲基甲酰胺溶解，配成1 mg/mL的内标母液，用乙腈溶液进一步将内标母液稀释为浓度为20.0 ng/mL阿普斯特-d5的乙腈溶液即为内标工作溶液。
进一步地，所述标准曲线由包括以下步骤的方法制得：称量1 mg阿普斯特，用N，N-二甲基甲酰胺溶解得到1mg/mL的阿普斯特母液，精密移取阿普斯特母液适量，用50%乙腈水溶液稀释至质量浓度为100 ng/mL阿普斯特工作溶液，用50%乙腈水溶液将所述工作溶液稀释成40、80、200、600，2000，4000，9600和12000 ng/mL的标准曲线工作液，取空白血浆285µL，加入不同浓度的标准曲线工作液15 µL，得到2.00，4.00，10.0，30.0，100，200，480和600ng/mL的标准曲线样品，取所述标准曲线样品100 µL，加400 µL阿普斯特-d5的乙腈溶液（内标工作溶液）进行沉淀反应，涡旋混合5 min，置4℃台式高速冷冻离心机（96孔板）中，4750r/min离心10 min，每孔取上清100 µL，转移至另一96孔板，每孔加10%乙腈水溶液100 µL稀释，涡旋混合5 min进行液质联用检测，使用内标法对所得数据进行处理，以阿普斯特的浓度为横坐标，阿普斯特和阿普斯特-d5的峰面积比值为纵坐标，以1/x2为权重系数，利用加权最小二乘法进行线性回归，得到所述标准曲线。
本发明建立了一种基于沉淀法和液质联用技术的血浆中阿普斯特检测方法，可用于检测生物体内的阿普斯特浓度，为临床和基础研究提供可靠的分析手段，本发明使用蛋白质沉淀法处理含阿普斯特的血浆样品，通过一步沉淀反应去除杂质和内源性干扰物，在高效液相色谱的分离过程中，向流动相中加入了甲酸，使阿普斯特在电离后形成更多的加氢的准分子离子峰，对应的特征性碎片离子的丰度随之升高，提高了检测得灵敏度；在定量的过程中，以阿普斯特-d5为内标物，通过准分子离子峰→子离子的特异性的、高灵敏度的监测实现对阿普斯特的定量检测。
本发明的有益效果
本发明建立的测定人血浆中阿普斯特浓度的方法具有灵敏度高、准确可靠、选择性好、基质效应小、快速简便等优点。该方法使用乙腈对血浆样品进行蛋白沉淀，内标工作溶液直接配制到沉淀剂中，减少了操作步骤，使操作更简化，并且有机试剂消耗少，大大提高了临床适用性和工作效率；选用0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈为流动相，提高灵敏度，出峰位置稳定，且缩短了单针检测时间；该方法使用同位素标记的内标，方法的耐用性大大提高；此外为了减小该分析方法的基质效应，将蛋白沉淀离心后的上清进行1:1稀释（稀释液：10 %乙腈水）。经方法学验证该方法符合生物样本分析要求，实际样本再分析的通过率为100%，将该方法成功应用于临床血药浓度检测，结果可靠。本试验为阿普斯特相关制剂的生物等效性研究提供了数据参考，适用于阿普斯特的血药浓度检测及其药代动力学研究，为阿普斯特制剂一致性评价提供依据。
附图说明
图1为加入内标后的含600 ng/mL(定量限)阿普斯特的血浆中阿普斯特的色谱图；
图2为加入内标后的含600 ng/mL(定量限)阿普斯特的血浆中内标物质的色谱图；
图3为空白血浆中阿普斯特的色谱图；
图4为空白血浆中内标物质的色谱图。
具体实施方式
在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发明。本发明中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特点，不是旨在于限制本发明。
除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。现根据说明书附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
1 .仪器和试药
1)分析仪器
AB SCIEX Tripe Quad 5500液相色谱-质谱联用***（美国AB SCIEX公司）；3K15台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；Allegra X-15R台式高速冷冻离心机（96孔板，美国贝克曼库尔特公司）；MDF-U5412N医用低温箱（日本松下公司）；Milli-Q Advantage A10超纯水器（美国Millipore公司）；DG-2500R多管漩涡混合仪（上海巴玖实业有限公司）。数据处理软件：Analyst 1.6.3（美国AB SCIEX公司）；Watson LIMS 7.5 SPS1（美国赛默飞世尔公司）。
2)试剂
阿普斯特对照品（纯度99.7%，北京曼哈格生物科技有限公司）；阿普斯特-d5对照品（化学纯度98.7%，同位素内标纯度99.5 %，北京曼哈格生物科技有限公司）；甲醇，乙腈（色谱纯，德国默克公司）；甲酸（色谱纯，美国ACS恩科化学）；N，N-二甲基甲酰胺（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）科技有限公司）。受试制剂：阿普斯特片（规格：30 mg，批号：02007001）；参比制剂：阿普斯特片（规格：30 mg，批号：H02366A，Cegene InternationaSar生产）。
2.实验方法与结果
1)溶液配制
标准品溶液配制：精密称量1 mg阿普斯特标准品，用N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解得到1 mg/mL的阿普斯特母液。精密量取1 mL阿普斯特母液适量置10 mL容量瓶中，加50%乙腈水溶液至刻度，使质量浓度为100 µg/mL阿普斯特工作溶液。用50%乙腈水溶液将阿普斯特工作溶液稀释成40、80、200、600，2000，4000，9600，和12000 ng/mL的标准曲线工作液。
内标工作液配制：精密称量约1 mg阿普斯特-d5标准品，用一定量的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解，配成1 mg/mL的内标母液。用乙腈溶液进一步将内标母液稀释为20.0 ng/mL的内标工作液。
2)含阿普斯特的血浆样品预处理
取2 mL深孔96孔板，每孔加100 µL含阿普斯特的血浆样品，再加质量浓度为20.0ng/mL内标工作溶液300 µL，涡旋混合5 min，置4℃台式高速冷冻离心机（96孔板）中离心10min（4750 r/min），每孔取100 µL上清液，转移至另一2 mL深孔96孔板，向新的96孔板中加10%乙腈水溶液100 µL稀释，涡旋混合5 min，涡旋混合后将混合液加到插有内插管的进样瓶中，启动液质联用仪检测程序对阿普斯特进行检测。
3)高效液相色谱条件
液质联用检测的高效液相色谱条件包括：色谱柱为Phenomenex Kinetex C18(2.1×50 mm，2.6 µm)色谱柱，采用梯度洗脱，流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，洗脱程序为0~0.5 min，流动相A的体积百分含量保持63%，流动相B的体积含量保持37%；0.5~1.3 min，流动相A的体积百分含量从63%下降到0.0%，流动相B的体积百分含量从37%上升到100%；1.3~2.4 min，流动相A的体积百分含量保持0.0%，流动相B的体积含量保持100%；2.4~2.41 min，流动相A的体积百分含量从0.0%上升到63%，流动相B的体积百分含量从100%下降到37%；2.41~3.0 min，流动相A的体积百分含量保持63%，流动相B的体积含量保持37%，流速为0.45 mL/min，柱温为40℃，进样量为5 µL；
表1液相梯度洗脱程序
4)三重四级杆质谱检测条件
液质联用检测的质谱条件包括：使用三重四级杆质谱仪，离子源为电喷雾离子源，采用负离子模式，采用多反应监测扫描模式，离子化电压：5500 V；入口电压（EP）：10 V；碰撞室出口电压（CXP）：13 V；喷雾气（Gas1）：50；辅助加热气（Gas2）：55；气帘气：35，所述阿普斯特的离子对为461.2→257.1（定量离子对），碰撞能量（CE）：14 V，去簇电压（DP）：190 V；所述阿普斯特-d5的离子对为466.1→262.3，CE：14 V，DP：190 V。
5)标准曲线的建立
取空白血浆285 µL，加入不同浓度的标准曲线工作液15 µL，得到2.0，4.0，10.0，30.0，100.0，200.0，480.0和600.0 ng/mL的标准曲线样品，取所述标准曲线样品100 µL，加400 µL阿普斯特-d5的乙腈溶液（内标工作溶液）进行沉淀反应，涡旋混合5 min，置4℃台式高速冷冻离心机（96孔板）中，4750 r/min离心10 min，每孔取上清100 µL，转移至另一96孔板，每孔加10%乙腈水溶液100 µL稀释，涡旋混合5 min后进行液质联用检测，使用内标法对所得数据进行处理，以阿普斯特的浓度为横坐标，阿普斯特和阿普斯特-d5的峰面积比值为纵坐标，以1/x2为权重系数，利用加权最小二乘法进行线性回归，求得标准曲线为y=0.0147982*x+-0.00436850（n=9），线性范围是2.00～60000 ng/mL，相关系数r2为0.9977，定量下线为2.00 ng/mL。
6)残留
通过在注射高浓度样品后注射空白基质样品（空白血浆）来评价残留，图1为加入内标后的含600 ng/mL(定量限)阿普斯特的血浆中阿普斯特的色谱图，分析物（阿普斯特）的保留时间为1.17 min；图2为加入内标后的含600 ng/mL(定量限)阿普斯特的血浆中内标物质的色谱图，内标（阿普斯特-d5）的保留时间为1.15 min，均得到较好的响应值与峰形。
图3为空白血浆中阿普斯特的色谱图；图4为空白血浆中内标物质的色谱图。将图1和图2与图3和4进行比较，发现空白血浆样品的色谱图在阿普斯特与阿普斯特-d5的色谱峰附近中没有干扰峰出现，说明该方法的残留小，对分析物（阿普斯特）及内标（阿普斯特-d5）的定量均无影响。
7)精密度和准确度考察
按标准曲线样品的配制方法，分别配制含2.0、6.0、50.0、450 ng/mL阿普斯特的质控样品，每个浓度独立配制6个样本，连续检测3天。根据当天配制的标准曲线，计算质控样品的浓度，进而计算批内、批间精密度和准确度，结果如表2和表3所示。从表2的数据可以看出，本发明公开的方法的批内、批间准确度和精密度均在±15％范围以内，说明该方法准确且可重复，适合推广。
表2准确度与精密度实验结果
8)选择性
取6个受试者的空白血浆制备空白基质样品与定量下限样品，空白基质样品除用300 µL乙腈溶液代替内标工作溶液外，其余步骤按“含阿普斯特的血浆样品预处理”项处理样品，定量下限样品按“含阿普斯特的血浆样品预处理”项处理样品。结果表明本研究6个受试者的空白基质干扰组分在阿普斯特与阿普斯特-d5保留时间处的响应均为0，表明该方法具有良好的选择性，能区分阿普斯特与阿普斯特-d5与基质中的内源性组分。
9)提取回收率和基质效应考察
回收率：将质控样品按“含阿普斯特的血浆样品预处理”项处理，得峰面积A；取100µL空白血浆，加入300 µL乙腈沉淀剂，混匀离心后取上清液100到新的2 mL深孔96孔板，再向新的96孔板中加100 µL 混合对照品，涡旋混合5 min，混匀后进样检测，得峰面积B。峰面积A与B的比值为回收率，结果见表3。
表3提取回收率实验结果
基质效应：分别取6个受试者的空白基质、1个高血脂空白基质及1个溶血各100 µL，加入300 µL乙腈沉淀剂，混匀离心后取上清液100 µL到新的2 mL深孔96孔板，再向新的96孔板中加100 µL混合对照品，涡旋混合5 min，混匀后进样检测，得分析物峰面积C，内标峰面积D。取100 µL纯水，加入300 µL乙腈沉淀剂，混匀离心后取上清液100 µL到新的2 mL深孔96孔板，再向新的96孔板中加100 µL混合对照品，涡旋混合5 min，混匀后进样检测，得分析物峰面积E，内标峰面积F。基质效应用内标归一化的基质因子的变异系数（CV）来评价。基质因子为基质存在下的峰面积与不含基质的相应峰面积比值，即阿普斯特的基质因子为C/E，阿普斯特-d5的基质因子为D/F。进一步通过阿普斯特的基质因子除以阿普斯特-d5的基质因子，计算经内标归一化的基质因子，再计算内标归一化的基质因子的变异系数，结果见表4。
表4 6批不同来源血浆、高脂及溶血的基质效应
从以上结果可以看出，本发明公开的基于沉淀法和液质联用技术的血浆中阿普斯特定量检测法能够快速、稳定地检测生物样本中阿普斯特的浓度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种血浆中阿普斯特浓度的检测方法，其特征在于，由以下步骤实现：
将含阿普斯特的血浆样品、阿普斯特-d5的乙腈溶液混合进行蛋白沉淀反应，将所得上清液稀释后注入液相色谱-质谱仪，采用多反应监测扫描模式进行检测，用内标法以标准曲线计算血浆中阿普斯特的浓度，所述标准曲线以阿普斯特的浓度为横坐标，以阿普斯特和阿普斯特-d5的峰面积比值为纵坐标；
所述混合进行蛋白沉淀反应的具体操作为：取2 mL深孔96孔板，每孔加100 µL含阿普斯特的血浆样品，再加质量浓度为20.0ng/mL内标工作溶液300 µL，涡旋混合5 min，置4℃96孔板台式高速冷冻离心机中4750 r/min离心10min，每孔取100 µL上清液，转移至另一新的2 mL深孔96孔板，再向其中加10%乙腈水溶液100 µL稀释，涡旋混合5 min，启动液质联用仪检测程序对血浆中的阿普斯特进行检测；
所述标准曲线由包括以下步骤的方法制得：称量1 mg阿普斯特，用N，N-二甲基甲酰胺溶解得到1 mg/mL的阿普斯特母液，用50%乙腈水溶液稀释至质量浓度为100 ng/mL阿普斯特工作溶液，再用50%乙腈水溶液将所述工作溶液稀释成40、80、200、600，2000，4000，9600和12000 ng/mL的标准曲线工作液，取空白血浆285 µL，加入不同浓度的标准曲线工作液15µL，得到2.0，4.0，10.0，30.0，100.0，200.0，480.0和600.0 ng/mL的标准曲线样品；取所述标准曲线样品100 µL，加400 µL阿普斯特-d5的乙腈溶液进行沉淀反应，涡旋混合5 min，置4℃台式高速冷冻离心机中，4750 r/min离心10 min，每孔取上清100 µL，转移至另一96孔板，每孔加10%乙腈水溶液100 µL稀释，涡旋混合5 min进行液质联用检测分析，使用内标法对所得数据进行处理，以阿普斯特的浓度为横坐标，阿普斯特和阿普斯特-d5的峰面积比值为纵坐标，以1/x2为权重系数，利用加权最小二乘法进行线性回归，得到所述标准曲线；
所述内标工作溶液为阿普斯特-d5的乙腈溶液，其配制方法为：称量1 mg阿普斯特-d5标准品，用N，N-二甲基甲酰胺溶解，配成1 mg/mL的内标母液，用乙腈溶液进一步将内标母液稀释为浓度为20.0 ng/mL阿普斯特-d5的乙腈溶液。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述采用多反应监测扫描模式进行检测中，所述阿普斯特的定量离子对为461.2→257.1，所述阿普斯特-d5的离子对为466.1→262.3。
3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱仪中液相条件为：色谱柱为Phenomenex Kinetex C18 (2.1×50 mm，2.6 µm)色谱柱，流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脱，洗脱程序为洗脱程序为：0~0.5min，流动相A的体积百分含量保持63%，流动相B的体积含量保持37%；0.5~1.3 min，流动相A的体积百分含量从63%下降到0.0%，流动相B的体积百分含量从37%上升到100%；1.3~2.4min，流动相A的体积百分含量保持0.0%，流动相B的体积含量保持100%；2.4~2.41 min，流动相A的体积百分含量从0.0%上升到63%，流动相B的体积百分含量从100%下降到37%；2.41~3.0 min，流动相A的体积百分含量保持63%，流动相B的体积含量保持37%，流速为0.45 mL/min，柱温为40℃，进样量为5 µL。
4. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱仪中质谱条件为：使用三重四级杆质谱仪，离子源为电喷雾离子源，负离子模式，采用多反应监测扫描模式，离子化电压：5500 V ；入口电压：10 V；碰撞室出口电压：13 V；喷雾气：50；辅助加热气：55；气帘气：35，碰撞能量：14 V，去簇电压：190 V。
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