CN115219616B

CN115219616B - 基于液质联用技术测定生物样本中内源性物质包括辅酶q10浓度的方法

Info

Publication number: CN115219616B
Application number: CN202210736726.6A
Authority: CN
Inventors: 王祥艳; 唐晓荞; 郏自明; 樊柏林; 黎炎梅; 张寅静
Original assignee: Hubei Provincial Center For Disease Control And Prevention (hubei Academy Of Preventive Medicine)
Current assignee: Hubei Provincial Center For Disease Control And Prevention (hubei Academy Of Preventive Medicine)
Priority date: 2022-06-27
Filing date: 2022-06-27
Publication date: 2024-06-25
Anticipated expiration: 2042-06-27
Also published as: CN115219616A

Abstract

本发明公开了一种基于液质联用技术测定生物样本中内源性物质包括辅酶Q10浓度的方法,采用正常基质加入内源性对照品去配制校正标样，先计算得出配制校正标样中正常基质中内源性物质的本底，后用本底与加入内源性对照品的浓度去回算得到标准曲线，以标准曲线计算获得待测样品中内源性物质的浓度，采用此方法能够消除空白基质中本身含有的内源性分析物的干扰。另外，采用本发明的方法成功建立了一种进样量少、高灵敏度、高准确度和高选择性的方法用于大鼠血浆中辅酶Q10的浓度检测，进样量仅为1μL，数据采集时间仅为3.6min，为辅酶Q10体内药代动力学研究提供了基础。

Description

基于液质联用技术测定生物样本中内源性物质包括辅酶Q10 浓度的方法

技术领域

本发明涉及生物技术及分析化学领域，具体涉及基于液质联用技术测定内源性物质包括辅酶Q10浓度的方法。

背景技术

液相质谱技术被广泛用于生物样本中药物及其代谢产物的定量检测中，传统检测对象通常是外源性物质，在生物基质中不存在。研究者们把目标待测物添加到空白基质中配制定成定量标准曲线样本和质控样品模拟实际样本，通过标准曲线定量出生物样本中化合物的浓度。然而在生物样本中内源性物质分析时，却很难找到与之相对应的空白基质，没有空白基质，就无法模拟实际样本，各种风险无法避免，可能导致检测结果的不可靠。对于临床生物样本分析来说，事关用药安全。准确对内源性物质进行定量成为世纪难题。

辅酶Q10是一种内源性的脂溶性醌类化合物，在人体和一些哺乳动物体内广泛存在。辅酶Q10具有抗氧化、清除自由基，提高人体免疫力，抗衰防老、缓解疲劳和保护心血管等多种功效。近些年来被广泛用作化妆品和食品中的添加剂，同时也有研究发现在临床治疗领域具有抗帕金森、治疗小儿心肌炎、控制复发性口腔溃疡、改善心衰、减轻胸闷等方面的作用。然而，辅酶Q10属于脂溶性大的内源性化合物，其空白基质更难以获取以及内源性或其他来源的干扰，其生物样品的检测有其独特的技术难点。

内源性化合物的生物样品的定量分析目前主要是有四个策略，一是标准加入法，二是背景扣除法，三是替代基质(简化基质、人造基质或经净化的基质)法，四是替代待测物法。标准加入法需要每个试验样品单独一条标准曲线，对试验样品的用量很大，只适合可采集的大容积数量少的试验样品的分析。背景扣除法是先得到空白基质中峰响应值的比值(R_blk)，样品分析得到的峰响应比值为R,扣除空白基质中的本底，用调整后的峰响应值R’＝R-R_blk，标准曲线用调整后的峰响应比值R’为Y值和加入的标曲样品的浓度为X进行线性回归。因为用调整后的Y值进行回归，所以背景扣除法需要额外的数据处理软件进行线性回归和样品数据的处理，利用excel软件或者spss这种统计分析软件在扣除背景后，拟合回归方程，样品浓度也不能直接从仪器软件得到，统计分析软件额外计算出来，数据处理分析方法极为复杂。替代基质法是采用替代基质代替试验样品基质，替代基质的复杂程度差别很大，由于基质不同会引起仪器相应的差异和提取回收率的不同，在辅酶Q10的UPLC-MS/MS定量分析方法研究过程中，发明人曾分别使用光照除辅酶Q10和4％牛血清白蛋白(BSA)作为替代基质，发现光照除辅酶Q10的替代基质，在实际试验样品分析中存在内标响应波动的状况，考虑为内标在光照除辅酶Q10的替代基质与试验样品的基质效应不同导致，而用4％BSA作为替代基质用液液萃取方法处理样品存在提取回收率过低的现象，需要萃取浓缩几次以提高回收率，处理方法复杂，而当4％BSA作为替代基质采用蛋白沉淀处理时与实际样品存在提取回收率不一致的现象。替代分析物法由于引入的是机体内不存在的化合物，需要证明其与内源性物质存在恒定比列关系，同时也需证明替代物与分析物具有相似的基质效应和回收率，在实际应中相较其他方法更加复杂和费用更加昂贵。

因此，有必要研究一种基质效应影响小、干扰小、采样量少、灵敏度高、可靠、成本低的生物样本中内源性物质(辅酶Q10)的液相质谱分析检测方法，为辅酶Q10乃至所有内源性化合物的药代动力学研究提供基础。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种基于液质联用技术测定生物样本中内源性物质包括辅酶Q10浓度的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

基于液质联用技术测定生物样本中内源性物质浓度的方法，包括定量分析步骤，在含有内源性物质的真实基质中添加内源性对照品后制成校正标样，先用加入的校正标样中的内源性对照品的浓度X1为横坐标，将以分析物与内标的色谱峰面积比Y1为纵坐标，用加权最小二乘法以校正标样中加入内源性对照品的浓度X1与峰面积比Y1进行线性回归，得到回归方程Y1＝a+bX1，由此方程得到用于配制校正标样曲线的真实基质的本底值为c＝∣-a/b∣；再用校正标样中内源性物质的总浓度X2为横坐标，所述内源性物质的总浓度＝配制校正标样曲线的真实基质的本底值+加入的内源性对照品的浓度，分析物与内标的色谱峰面积比Y2为纵坐标，用加权最小二乘法以校正标样中内源性物质的总浓度X2与峰面积比Y2进行线性回归，所得的回归方程Y2＝A+BX2，即为标准曲线，以此计算待测生物样本中内源性物质的浓度。

进一步地，还包括，质控样品的理论浓度值也应为配制该质控样品的真实基质的本底浓度加上质控样品中加入内源性对照品的浓度的总和，来计算质控样品的准确度。

本发明采用正常基质加入内源性对照品去配制校正标样，先计算得出配制校正标样中正常基质中内源性物质的本底，后用本底与加入内源性对照品的浓度去回算得到标准曲线，以标准曲线计算获得待测样品中内源性物质的浓度，采用本发明方法能够有效消除空白基质中本身含有的内源性分析物的干扰，相比于传统的标准加入法、背景扣除法、替代基质法、替代待测物法具有明显的优势。本发明的方法可用于生物样本中各种内源性化合物的定量检测分析，有效消除基质效应、无干扰、采样量少、准确度高，不需要额外的数据软件来进行回归，直接在仪器上进样，直接可在仪器软件上得到样品浓度结果，不需要额外的数据处理软件处理，定量分析方法简单易操作。

本发明还具体公开了基于液质联用技术测定血浆中辅酶Q10浓度的方法，包括：取系列辅酶Q10标准曲线工作溶液分别与空白血浆混合得到校正标样，经预处理后注入UPLC-MS/MS中进行分析；向待测血浆中加入内标工作溶液、预处理后注入UPLC-MS/MS中进行分析；先用校正标样中加入的辅酶Q10的浓度X1为横坐标，将以辅酶Q10与内标的色谱峰面积比Y1为纵坐标，用加权最小二乘法以校正标样中加入辅酶Q10的浓度X1与峰面积比Y1进行线性回归，得到回归方程Y1＝a+bX1，由此方程得到用于配制校正标样的空白血浆的本底值为c＝∣-a/b∣；再用校正标样中辅酶Q10的总浓度为横坐标，所述辅酶Q10的总浓度＝配制校正标样的空白血浆的本底值+加入的辅酶Q10的浓度，分析物与内标的色谱峰面积比Y2为纵坐标，用加权最小二乘法以校正标样中辅酶Q10的总浓度X2与峰面积比Y2进行线性回归，所得的回归方程Y2＝A+BX2，即为标准曲线，以此标准曲线计算待测血浆中辅酶Q10的浓度。

本发明相比于替代分析物法不需要寻找机体内不存在但经验证与内源性物质存在着恒定比例关系的替代分析物，不需要复杂验证过程，同时不需要费用更低，就可以采用与生物样本一致的真实基质，可有效消除基质效应和回收率的差异。相比于替代基质法，本分析物辅酶Q10由于光不稳定，曾使用过光照除掉真实基质中的辅酶Q10得到的替代基质，由于基质的不同，样品处理后进样存在着与实际生物样本的基质分析时内标波动，存在基质效应和提取回收率不同的问题，光照除辅酶Q10不适用辅酶Q10的分析。同时也使用过4％BSA作为替代基质，也是存在提取回收率低的问题。相比于标准加入法，由于样本量(样本体积和样本数量)的限制，在实际实验中生物分析本量只有100微升甚至更少，一般没有那么大体积的样品量，所以标准加入法不适用于微量大数量的样本分析。相比于背景扣除法，本方法和背景扣除法均是采用真实基质，但是背景扣除法是需要额外的数据处理软件进行线性回归和样品数据的处理，利用excel软件或者spss这种统计分析软件再扣除背景后，拟合回归方程，样品浓度也不能直接从仪器软件得到，统计分析软件额外计算出来，数据处理分析方法极为复杂。进一步地，还包括，向系列质控工作溶液分别与空白血浆混合得到质控样品、预处理后注入UPLC-MS/MS中进行分析，质控样品中辅酶Q10的理论浓度值为配制质控样品的空白血浆的本底浓度加上质控样品中加入辅酶Q10浓度的总和。

工作溶液的配制：称取辅酶Q10对照品两份，分别加异丙醇溶解并稀释，制成辅酶Q10对照品储备液S01和S02；取对照品储备液S01，用甲醇稀释得到一系列浓度的标准曲线工作溶液；取对照品储备液S02，用甲醇稀释得到一系列浓度的质控工作溶液；

内标溶液的配制：称取辅酶Q10-d9，用异丙醇溶解制成辅酶Q10-d9储备液，用甲醇稀释制成内标工作溶液。

所述预处理方式为：取血浆样品，加入内标工作溶液，加入体积比9:1的异丙醇：乙酸乙酯，涡旋混匀；离心取上清液加入甲醇混匀后置于进样管中。

色谱条件：流动相B：0.1％甲酸甲醇，洗脱方式：等度洗脱，流速0.6mL·min^-1，进样量1μL，色谱柱为ACQUITY UPLC-BEH C₁₈柱，柱温40℃，自动进样器清洗溶液：甲醇：异丙醇：乙腈：水的体积比为1:1：1:1。

质谱条件：采用电喷雾离子源，正离子模式，扫描方式为多反应监测(MRM)；离子源参数：毛细管电压2.5kV，锥孔电压20V，离子源温度150℃，去溶剂温度：400℃，锥孔气流速150L·h^-1，去溶剂气流速800L·h^-1，雾化气体压力6.0Bar，碰撞气流速0.15mL·min^-1，数据采集时间3.60min；辅酶Q10的定量离子对为[M+H]⁺m/z 863.75→197.00，碰撞能为40eV，内标辅酶Q10-d9的定量离子对为[M+H]⁺m/z 872.70→205.90，碰撞能40eV。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明采用正常基质去配制标曲和质控，更好地模拟实际生物样品的真实状况，利用标准加入法的原理计算得出配制标曲和质控中正常基质中内源性物质(辅酶Q10)的本底，同时用本底与加入内源性对照品的浓度去回算标准曲线测定待测样品中内源性物质(辅酶Q10)的浓度，相比传统方法无基质效应、回收率高且不存在回收率差异、无干扰、采样量少。

2.本发明研究建立了一种峰形好，灵敏度高、专属性强、分析范围广、稳定性好、测定周期短、操作简便、成本低的大鼠血浆中内源性物质辅酶Q10血药浓度UPLC-MS/MS测定法。

3.本发明采用异丙醇溶解甲醇稀释制作工作溶液，并将血浆样品经异丙醇：乙酸乙酯(9:1，v:v)蛋白沉淀处理，以辅酶Q10-d9为内标，流动相为0.1％甲酸甲醇溶液，等度洗脱，流速为0.60mL·min^-1，进样量仅为1μL，数据采集时间仅为3.6min，检测用血浆体积少，且回收率高，没有基质效应，采集时间短，可为该物质体内药代动力学研究提供基础。

附图说明

图1为辅酶Q10和辅酶Q10-d9的色谱图(A.空白血浆B.空白试剂C.空白血浆中加入辅酶Q10对照品和内标辅酶Q10-d9 D.灌胃血浆样品加内标处理后色谱图)；

图2大鼠灌胃给与5％辅酶Q10自微乳和10％辅酶Q10微粒后的平均药时曲线图(n＝6)。

图3为Y2＝A+BX2标准曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所使用的材料：

动物：雄性SD大鼠，SPF级，12只，体重180～220g，由湖北省实验动物研究中心提供。

试剂：异丙醇：色谱纯，默克，批号：K53060340107；甲酸：色谱纯，阿拉丁，批号：E2022005；乙腈：色谱纯，Fisher Scientific，批号：186350；甲醇：色谱纯，FisherScientific，批号：211769；乙酸乙酯：色谱纯，Fisher Scientific，批号：179268；辅酶Q10对照品，纯度99.1％，批号：1120070107，5％辅酶Q10自微乳和10％辅酶Q10微粒，均由浙江新和成股份有限公司提供；辅酶Q10-d9对照品，纯度98.2％，批号：MBBD0885。

仪器：Waters ACQUITY UPLC I-Class型超高效液相色谱仪(美国Waters公司)、Waters Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪及配备的UNIFI数据处理软件(美国Waters公司)。

本发明UPLC-MS/MS测定大鼠血浆中辅酶Q10浓度的方法，具体如下：

1试验

1.1色谱与质谱条件

色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC-BEH C₁₈柱(2.1mm*50mm，1.7μm)，等度洗脱，流动相：0.1％甲酸甲醇，流速0.6mL·min^-1，柱温箱温度40，℃进样体积1μL。

质谱条件：ESI离子源，正离子模式，多反应监测(MRM)模式；离子源参数：毛细管电压(Capillary Voltage)：2.5Kv；锥孔电压(Sample Cone)：20V；离子源温度(Sourcetemperature)：150℃；去溶剂温度(Desolvation temperature)：400℃；锥孔气流速(Conegas flow)：150L/h；去溶剂气流速(Desolvation gas flow)：800L/h；雾化气体压力(Nebulizer gas pressure)：6.0Bar；一级质谱碰撞能量(MS collision energy)：4eV；二级质谱碰撞能量(MSMS collision energy)：40eV；碰撞气流速(Collision gas flow)：0.15mL/min；数据采集时间3.60min，辅酶Q10和辅酶Q10-d9的离子对为[M+H]⁺分别为m/z863.75→197.00和m/z 872.70→205.90，碰撞能均为40eV。

1.2工作溶液的配制

分析物对照品工作溶液的配制：分别称取一定量的辅酶Q10并放置于两个棕色玻璃瓶中，记录重量，分别标记为S01、S02。根据辅酶Q10的纯度、水分、是否成盐等信息来计算该分析物的真实重量，加入适量的异丙醇，配得储备液的最终浓度为0.60mg/mL，涡旋混合。取辅酶Q10储备液S01适量，用甲醇依次稀释得到浓度为1.60、3.20、8.00、16.0、32.0、64.0、128、160μg/mL的系列标准曲线工作溶液；取辅酶Q10储备液S02适量，用甲醇依次稀释得到浓度为1.60、4.80、24.0、120μg/mL的质控工作溶液。

内标溶液的配制：称取辅酶Q10-d9对照品1mg，加入适量体积的异丙醇，配制成最终浓度为0.60mg/mL的内标储备液。精密量取内标储备液适量，用甲醇稀释成浓度为1μg/mL的内标工作溶液。

1.3动物实验方法

12只雄性Sprague Dawley大鼠。随机分为2组，每组6只。给药前禁食12h(不禁水)，给药4h后允许大鼠自由进食。第一组按照21mg/kg的给药剂量灌胃给与5％辅酶Q10自微乳和第二组按照同样的给药剂量灌胃给与10％辅酶Q10微粒。按照0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h的采血时间点从颈静脉丛采血0.3mL，抗凝剂为EDTA-K2，3000rpm/min的条件下离心10min，取上清血浆，-80℃±10℃保存。

1.4血浆样品处理

取血浆样品40μL，加入25μL内标工作溶液(1μg/mL)，然后加入400μL异丙醇：乙酸乙酯(9:1，v:v)进行蛋白沉淀处理，涡旋混匀。在4℃的离心机中以12000rpm的速度离心10min；，取上清液100μL加入200μL甲醇混匀后进行UPLC-MS/MS上机分析。

1.5方法学考察

专属性：取空白试剂、零浓度样品(仅添加内标的空白样品)、不加内标的定量上限血浆样品按步骤处理后进行分析，以考察空白试剂中的干扰峰对分析物和内标峰面积积分的影响程度。标准曲线与定量下限：取系列标准曲线工作溶液10μL分别和190μL空白大鼠血浆混合制得浓度分别为80、160、400、800、1600、3200、6400、8000ng/mL的标准曲线血浆样品(校正标样)，按“血浆样品处理”方法处理后进行分析。先用加入的校正标样中的辅酶Q10浓度为横坐标，将以分析物(CoQ10)与内标(辅酶Q10-d9)的色谱峰面积比为纵坐标，用加权(W＝1/x²)最小二乘法以校正标样中加入辅酶Q10对照品的浓度(X₁)与峰面积比(Y₁)进行线性回归，所得的回归方程(Y₁＝a+bX₁)即为，由此方程可得用于配制该标准曲线的空白基质的本底值为c＝∣-a/b∣，再用校正标样中辅酶Q10的总浓度(配制该标曲的基质的本底值+校正标样的浓度)为横坐标，分析物(CoQ10)与内标(辅酶Q10-d9)的色谱峰面积比为纵坐标，用加权(W＝1/x²)最小二乘法以校正标样中辅酶Q10的总浓度(X2)与峰面积比(Y₂)进行线性回归，所得的回归方程(Y₂＝A+BX₂)即为标准曲线。并根据标准曲线对校正标样的浓度进行回算待测大鼠血浆中辅酶Q10的浓度。精密度与准确度：分别取质控工作溶液各10μL和190μL空白大鼠血浆混合制得浓度80ng/mL的定量下限质控(LLOQ QC)、240ng/mL的低浓度质控(LQC)、1200ng/mL的中浓度质控(MQC)和6000ng/mL的低浓度质控(HQC)。质控样品按照血浆样品处理方式处理后进样分析，在至少2天内处理3个精密度和准确度分析批中，每个分析批中各浓度质控样品均配制6个平行样。以考察批内、批间精密度与准确度。

提取回收率：在一个分析批中，采用空白血浆配制成的低、中、高浓度的质控样品提取后的峰面积与在提取后的空白血浆中分别加入由配制低、中、高质控样品的工作溶液和内标工作溶液配制成的纯溶液中的峰面积比较来评价。具体如下：精密吸取浓度分别为4.80、24.0、120μg/mL的辅酶Q10工作溶液和内标工作溶液I03(1000ng/mL)，用甲醇稀释，分别配制成分析物浓度为10.32、51.61、258.06ng/mL，内标浓度均为26.88ng/mL的三种浓度的复溶液，用以配制回收率评价样品。空白基质按照血浆样品处理方法处理(将内标用25μL甲醇替代)处理，最后一步不加200μL甲醇，而是分别加入上述3种复溶液，每个浓度配制3个平行样，即得回收率评价样品REC样品，进样测得各浓度回收率评价样品中分析物峰面积(A1)和内标的峰面积(A2)。同时测得空白基质中辅酶Q10的峰面积(A3)同时分别测定低、中、高浓度质控样品中的分析物的峰面积(A4)和内标的峰面积(A5)，则分析物回收率为(A4-A3)/A1*100％；内标回收率为A5/A2*100％。

基质效应：分别采用6个不同来源的基质，进行样品处理后，加入由用于配制低、中、高质控样品的工作溶液和内标工作溶液配制成的纯溶液，配制基质效应评价样品(MER)，同时配制不含基质提取物的同浓度的纯溶液对照样品(MEP)，通过计算各样品中的内标归一化的基质因子，以评价基质效应对分析物准确定量分析的影响。具体如下：精密吸取浓度分别为4.80、24.0、120μg/mL的辅酶Q10工作溶液和内标工作溶液I03(1000ng/mL)，用甲醇稀释，分别配制成分析物浓度为10.32、51.61、258.06ng/mL，内标浓度均为26.88ng/mL的三种浓度的复溶液。含基质样品取6个不同来源的空白基质按照血浆样品处理方法处理(将内标用25μL甲醇替代)，最后一步不加200μL甲醇，而是分别加入200μL上述三种复溶液，每个浓度采用6个不同来源的基质配制1个平行样。不含基质样品取空白试剂按照血浆样品处理(将内标用25μL甲醇替代)，最后一步不加200μL甲醇，而是分别加入200μL上述三种复溶液，每个浓度配制3个平行样。基质效应的评价通过计算分析物和内标的基质因子完成。通过计算基质存在下的峰面积与不含基质的相应峰面积的比值，分别计算分析物和内标的基质因子。基质因子的计算公式如下：

内标归一化的基质因子的计算公式如下：

计算归一化的基质因子，若其值越接近1，说明内标与分析物的基质效应越接近，可以补偿任何样品中分析物可能出现的基质效应，则基质效应不影响最终的准确定量分析。稳定性：按上述方法配制得到低浓度质控和高浓度质控样品。分别考察其在室温存放27h、预处理后进样器温度存放8d、80℃存放77d、反复冻融5次的稳定性。

2结果

2.1方法学验证

专属性：辅酶Q10和内标辅酶Q10-d9的保留时间分别为3.02min和2.98min，由于辅酶Q10是内源性化合物，其在空白血浆中含有一定量的辅酶Q10。空白试剂样品中未检出辅酶Q10和内标Q10-d9，表明空白试剂对分析物和内标无干扰，同时零浓度样品(CTL-0)中未检测出辅酶Q10，表明内标Q10-d9对分析物辅酶Q10的出峰无干扰；不加内标的定量上限样品中未检测出辅酶Q10-d9，表明分析物辅酶Q10对内标Q10-d9出峰无干扰，结果见附图1。

标准曲线与定量下限：每条标准曲线至少75％并且至少6个校正标样的回算浓度和标示浓度的准确度偏差不超过±15％(LLOQ不超过±20％)，每条标准曲线的相关系数R2≥0.990261。表明，标准曲线80.0～8000ng/mL范围内线性良好。结果见附图3。

精密度与准确度：LQC、MQC、HQC质控样品的批内/批间平均准确度偏差范围为-2.5％～11.0％/0.1％～8.4％，精密度为最大值分别为8.7％，6.1％；定量下限质控样品(LLOQ QC)的批内平均准确度偏差为3.3％～13.3％，批间准确度偏差为7.7％，批内/批间精密度最大值为3.3％、5.9％，以上各浓度质控样品偏差均不超过±15％，且RSD也均≤15％。表明，各浓度质控样品的批内、批间精密度和准确度良好。结果见表1。

表1辅酶Q10在大鼠血浆中的批内、批间精密度、准确度的考察结果

提取回收率：低、中、高浓度质控样品中辅酶Q10的平均提取回收率为88.3％，RSD为8.1％，内标的平均提取回收率为96.0％，RSD为3.7％。详细结果见表2，各浓度质控样品的平均回收率未出现与浓度相关的趋势。结果表明，分析物和内标的回收率不影响定量分析的准确性。

基质效应：6个不同来源基质计算的低、中、高浓度的分析物经内标归一化的基质因子均值/相对标准偏差(RSD)分别为0.997/1.3％、0.995/0.8％和0.996/0.01％。详细结果见表2，6个不同来源基质中内标归一化的基质因子的相对标准偏差不超过15％，表明，基质效应不影响分析物的定量分析。

表2辅酶Q10在大鼠血浆中的回收率和基质效应(n＝6)

稳定性：结果见表3所示，样品在上述条件下稳定，满足分析测定要求。

表3稳定性研究表-3大鼠血浆中辅酶Q10的稳定性(n＝6)

2.2方法学应用

采用5％辅酶Q10自微乳和10％辅酶Q10微粒后辅酶Q10分别给大鼠灌胃后的平均血药浓度-时间曲线，见图2。药代动力学主要参数结果见表4，根据药代参数计算出5％辅酶Q10自微乳相对于10％辅酶Q10微粒口服相对生物利用度为127.16％。结果表明所建方法可以应用于辅酶Q10在大鼠体内的药动学研究及不同制剂(如自微乳和微粒)的相对生物利用度的研究。

表4大鼠灌胃5％辅酶Q10自微乳和10％辅酶Q10微粒后药代动力学参数(n＝6)

本发明所建立的灵敏度高、专属性强、分析范围广、稳定性好、测定周期短、快速简便的大鼠血浆中内源性物质辅酶Q10血药浓度UPLC-MS/MS测定法，通过了方法学验证的各项指标要求，可准确定量复杂生物基质中辅酶Q10的浓度，检测用血浆体积少，且回收率高，没有基质效应，进线性范围宽，操作简单，采集时间短，可为该物质体内药代动力学研究提供基础，有利于临床高通量检测的推广。同时用同一套处理标准曲线样品得到基质中内源性辅酶Q10的浓度，进而算出实际样品中辅酶Q10的总浓度。

本发明方法克服了以下几个技术难点：①辅酶Q10是脂溶性大的内源性化合物，内源性化合物由于空白基质的获取难以及内源性或其他来源的干扰，没有空白基质，就无法模拟实际样品，各种风险(如回收率不同、基质效应等)，可能导致检测结果的不可靠。而常用的四种检测内源性化合物的方法均存在各自的缺点，本发明采用独特的方法较好的克服了常规的四种检测内源性化合物的方法的缺点，解决了内源性物质定量的难题。②血浆中辅酶Q10的浓度一般较低，对高效液相色谱串联质谱方法的灵敏度要求较高，本发明方法的定量下限为80ng/mL，将助力辅酶Q10的临床治疗。②本发明采用异丙醇溶解、甲醇稀释制备工作溶液并采用异丙醇：乙酸乙酯作为血浆样本前处理的方式，显著降低了临床未知样本定量测定的复杂性、可以实现高通量生物样本定量分析，同时也最大限度降低可能存在的***误差。③常规而言，样品进样量大可以提高检测的灵敏度和准确度，进样量小受噪音影响太大，但是药代动力学试验，采用小鼠进行试验，采血样非常有限，本发明需要的样本量少只有40微升，样品进样量仅为1uL，既能确保检测的准确度，也最大限度地减少了大鼠甚至临床有创采血环节。④本发明采用体积比为1:1：1:1的甲醇：异丙醇：乙腈：水作为自动进样器清洗溶液，可以有效消除残留效应。

另外，发明人在建立本发明方法的过程中，将血浆样品采用常规方法处理，发现常规方法存在各种问题，不能满足高效液相质谱检测辅酶Q10浓度的要求，简单列举如下：

MD1：取40μL血浆中加入25μL内标后加入ACN 200μL和600μL正己烷，取400μL上层氮气吹干，加入200μL 10％异丙醇乙腈溶液复溶后进样。

存在的问题：提取回收率为13％-18.9％回收率低。

MD2：取40μL血浆中加入25μL内标后加入200μL甲醇：异丙醇(1:1，v:v)沉淀后离心取上清液100μL加入100μL甲醇混合后进样；

存在的问题：提取回收率为20％左右，回收率低。

MD3：取40μL血浆中加入25μL内标后加入200μL甲醇和600μL正己烷，取200μL上层氮气吹干，加入200μL甲醇溶液复溶后进样。

存在问题：回收率在30％-49.5％之间，回收率低。

MD4：取40μL血浆中加入25μL内标后加入600μL正己烷，取200μL上层氮气吹干，加入200μL异丙醇：甲醇(1:9，v:v)溶液复溶后进样。

存在问题：内标在实际样品中波动很大，存在基质效应。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims

1.基于液质联用技术测定生物样本中内源性物质浓度的方法，其特征在于，包括定量分析步骤，在含有内源性物质的真实基质中添加内源性对照品后制成校正标样，先用加入的校正标样中的内源性对照品的浓度X1为横坐标，将以分析物与内标的色谱峰面积比Y1为纵坐标，用加权最小二乘法以校正标样中加入内源性对照品的浓度X1与峰面积比Y1进行线性回归，得到回归方程Y1＝a+bX1，由此方程得到用于配制校正标样曲线的真实基质的本底值为c＝∣-a/b∣；再用校正标样中内源性物质的总浓度X2为横坐标，所述内源性物质的总浓度＝配制校正标样曲线的真实基质的本底值+加入的内源性对照品的浓度，分析物与内标的色谱峰面积比Y2为纵坐标，用加权最小二乘法以校正标样中内源性物质的总浓度X2与峰面积比Y2进行线性回归，所得的回归方程Y2＝A+BX2，即为标准曲线，以此计算待测生物样本中内源性物质的浓度。

2.根据权利要求1所述的基于液质联用技术测定生物样本中内源性物质浓度的方法，其特征在于，还包括，质控样品的理论浓度值也应为配制该质控样品的真实基质的本底浓度加上质控样品中加入内源性对照品的浓度的总和，来计算质控样品的准确度。

3.基于液质联用技术测定血浆中辅酶Q10浓度的方法，其特征在于，包括：取系列辅酶Q10标准曲线工作溶液分别与空白血浆混合得到校正标样，经预处理后注入液相质谱仪中进行分析；向待测血浆中加入内标工作溶液、预处理后注入液相质谱仪中进行分析；先用校正标样中加入的辅酶Q10的浓度X1为横坐标，将以辅酶Q10与内标的色谱峰面积比Y1为纵坐标，用加权最小二乘法以校正标样中加入辅酶Q10的浓度X1与峰面积比Y1进行线性回归，得到回归方程Y1＝a+bX1，由此方程得到用于配制校正标样的空白血浆的本底值为c＝∣-a/b∣；再用校正标样中辅酶Q10的总浓度为横坐标，所述辅酶Q10的总浓度＝配制校正标样的空白血浆的本底值+加入的辅酶Q10的浓度，分析物与内标的色谱峰面积比Y2为纵坐标，用加权最小二乘法以校正标样中辅酶Q10的总浓度X2与峰面积比Y2进行线性回归，所得的回归方程Y2＝A+BX2，即为标准曲线，以此标准曲线计算待测血浆中辅酶Q10的浓度。

4.根据权利要求3所述的基于液质联用技术测定血浆中辅酶Q10浓度的方法，其特征在于，

5.根据权利要求3所述的基于液质联用技术测定血浆中辅酶Q10浓度的方法，其特征在于，所述预处理方式为：取血浆样品，加入内标工作溶液，加入体积比9:1的异丙醇：乙酸乙酯，涡旋混匀；离心取上清液加入甲醇混匀后置于进样管中。

6.根据权利要求3所述的基于液质联用技术测定血浆中辅酶Q10浓度的方法，其特征在于，色谱条件：流动相B：0.1％甲酸甲醇，洗脱方式：等度洗脱，流速0.6mL·min^-1，进样量1μL。

7.根据权利要求4所述的基于液质联用技术测定血浆中辅酶Q10浓度的方法，其特征在于，向系列质控工作溶液分别与空白血浆混合得到质控样品、预处理后注入液相质谱仪中进行分析，质控样品中辅酶Q10的理论浓度值为配制质控样品的空白血浆的本底浓度加上质控样品中加入辅酶Q10浓度的总和。

8.根据权利要求6所述的基于液质联用技术测定血浆中辅酶Q10浓度的方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：色谱柱为ACQUITY UPLC-BEH C₁₈柱，柱温40℃，自动进样器清洗溶液：甲醇：异丙醇：乙腈：水的体积比为1:1：1:1。

9.根据权利要求3所述的基于液质联用技术测定血浆中辅酶Q10浓度的方法，其特征在于，质谱条件：采用电喷雾离子源，正离子模式，扫描方式为多反应监测(MRM)；离子源参数：毛细管电压2.5kV，锥孔电压20V，离子源温度150℃，去溶剂温度：400℃，锥孔气流速150L·h^-1，去溶剂气流速800L·h^-1，雾化气体压力6.0Bar，碰撞气流速0.15mL·min^-1，数据采集时间3.60min。

10.根据权利要求9所述的基于液质联用技术测定血浆中辅酶Q10浓度的方法，其特征在于，辅酶Q10的定量离子对为[M+H]⁺m/z 863.75→197.00，碰撞能为40eV，内标辅酶Q10-d9的定量离子对为[M+H]⁺m/z 872.70→205.90，碰撞能40eV。