CN115537353A - 一种高效复合降解菌剂及对含油土壤生物修复工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及土壤修复领域，公开了一种高效复合降解菌剂，包括铜绿假单胞菌、洪城红球菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌。本发明所构建出的高效微生物菌群能够以石油烃为唯一碳源代谢生物表面活性剂，能够大幅度降低含油污泥(土壤)中的石油类物质的含量，同时具有降解周期短，成本低和不造成二次污染等优点。本发明公开的高效微生物菌群具有良好的共生关系，对石油烃降解具有明显的协同效应。本发明修复工艺在含油污泥堆土下方设置了良好的通风环境，而表面覆盖的材料具有良好的保湿和透气效果，不仅有效增加了微生物处理效果，大大缩短处理时间，而且能有效降低处理成本。

Description

一种高效复合降解菌剂及对含油土壤生物修复工艺

技术领域

本发明涉及土壤修复领域，具体是涉及一种高效复合降解菌剂及对含油土壤生物修复工艺。

背景技术

在石油开采、运输、储存及炼制过程中都不可避免地出现原油泄露问题，当其洒落到地面上后会造成土壤的污染。一方面，石油中含有大量胶质、沥青质以及苯系物、蒽、酚、芘等有毒有害物质，甚至还含有放射性物质和重金属，其中很多物质具有“三致”效应(如多环芳烃(PAHs))，若处理不当会对周围生态环境和人类健康造成严重威胁。另一方面，当泄漏的石油渗入到土壤中的量超过土壤的自净容量后，积累的油类物质将长期残留其中，破坏土壤结构，影响土壤通透性，同时还会损害植物根部，阻碍根的呼吸与吸收，最终导致植物死亡，严重影响土壤生产力和农作物产量。

目前，含油土壤修复技术可以分为传统的物理修复、化学修复和新兴的生物修复这三大方法。其中物理化学法研究时间较长，而且相对比较成熟，但成本较高，而且处理不彻底，容易造成二次污染。生物修复法的原理是将石油烃类作为微生物新陈代谢的碳源，利用微生物的代谢活动将含油污泥中的有害物质进行同化降解，使其最终完全转化为无害的CO₂和H₂O等物质，实现对含油土壤的无害化处理，同时，处理过程中能够增加土壤腐殖质含量。国外在石油污染土壤微生物修复方面的研究起步较早，目前已经开始推广应用，并且技术日趋成熟。我国在该方面的研究起步较晚，到90年代末才开始对微生物修复含油土壤技术进行研究，对该技术的研究普遍停留在高效降解菌种的筛选和室内评价基础上，现场试验较少，而且存在现场应用规模较小、实施工艺繁琐以及处理时间长等问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高效复合降解菌剂及对含油土壤修复工艺。本发明复合降解菌剂对石油烃具有良好的降解效果，采用本发明提供的处理工艺可以有效提高微生物修复含油土壤效果，缩短修复时间。

为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种高效复合降解菌剂，包括铜绿假单胞菌、洪城红球菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌。

所述高效复合降解菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将铜绿假单胞菌、洪城红球菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌分别接种到肉汤培养基中进行摇瓶培养，分别获得铜绿假单胞菌、洪城红球菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌种子液；

2)将步骤1)得到的铜绿假单胞菌、洪城红球菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌种子液，混合，然后加入到种子培养基中进行放大发酵培养，得到复合降解菌剂。

优选的，所述铜绿假单胞菌、洪城红球菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌种子液，按体积比2:2:1:4混合。

优选的，混合的种子液，按5wt％-10wt％的接种量加入到种子培养基中进行放大发酵培养。

优选的，进行放大发酵培养，当活菌数>10⁹CFU/mL时停止发酵。

优选的，种子培养基的组成为：葡萄糖10g/L、尿素2g/L、酵母膏0.5g/L、K₂HPO₄0.5g/L、KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、 CaCl₂·2H₂O 0.2g/L、柠檬酸钠0.1g/L，pH＝6～8。

所述高效复合降解菌剂应用于含油土壤修复。

进一步地，所述高效复合降解菌剂应用于含油土壤修复，含油土壤修复工艺包括：将含油土壤经过机械粉碎后，添加氮肥、磷肥、膨松剂和复合降解菌剂，再翻搅均匀，所述膨松剂的添加量为土壤总质量的2％～5％，复合降解菌剂的添加量为土壤总质量的5％。

所述膨松剂包括锯末、粉碎的秸秆或稻草等。

进一步地，控制待修复的含油土壤中C:N:P＝90:5:1。

进一步地，在地面铺上防渗布，防渗布的四周高于地面8～10cm，在防渗布上面摆放一排直径4～6cm的钢管，钢管间的距离为20～30cm，在钢管上面放上不锈钢或铁丝支撑网，网眼孔径2～3cm，然后在支撑网上将翻搅均匀的含油土壤堆放至80～120cm厚，在含油土壤表面覆盖一层厚度为2～4cm的膨松剂进行保温及防止水分快速蒸发，当土壤含水率低于20％时需要补充水分，水分补充方式为在锯末上方喷洒水使水分均匀渗透到土壤中，直到总体含水率为20％-30％，在自然条件下发酵处理45～60天，处理过程中不需要翻耕透气操作，同时，在处理过程中不要把土壤压实。

进一步地，在发酵处理过程中，每隔5-7天补充一次水分，补充水分的方式为从含油污泥上分喷洒；当所处理的含油土壤含油量大于 5wt％时需要每隔15～20天补加一次复合降解菌剂，补加量为土壤总质量的2wt％～5wt％，补加方式为从含油污泥上方喷洒。

进一步地，在发酵处理过程中，每隔一周监测一次菌浓和含油率变化，取样方式为：从含油污泥表面以下5～10cm处取样，选择5个样点采集等量样品，将五个样点样品合并一个样品，然后分别采用平板计数法和红外测油仪对菌浓和含油率进行测定，当土壤中的含油率达到3000mg/kg以下时处理结束。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明所构建出的高效微生物菌群能够以石油烃为唯一碳源代谢生物表面活性剂，能够大幅度降低含油污泥(土壤)中的石油类物质的含量，同时具有降解周期短，成本低和不造成二次污染等优点，尤其适用于野外油田井场分散、交通不便的自然环境下解决井场含油泥污染的问题。

(2)本发明铜绿假单胞菌、洪城红球菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌组成的高效微生物菌群具有良好的共生关系，对石油烃降解具有明显的协同效应。

(3)本发明含油污泥堆土下方设置了良好的通风环境，而表面覆盖的锯末具有良好的保湿和透气效果，而且水分补充是采用从上方喷洒的方式，水分可均匀从表面渗入到土壤中，从而可保持土壤中具有良好的空隙结构，透气性良好，这样便可保在不用经常翻耕和补充水分的条件下也可满足微生物在好氧条件下对石油烃进行快速降解，不仅有效增加了微生物处理效果，大大缩短处理时间，而且能有效降低处理成本。

(4)针对初始含油率低于6％的含油土壤，采用本发明方法可在 30～45天内使其含油率降低到0.3％以下。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为不同菌株对原油的降解效果；

图2不同菌株组合对原油的降解效果；

图3不同菌株对原油中的四组分降解效果；

图4不同菌株发酵液的表面张力值；

图5为复合菌群对含油土壤修复效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

高效复合降解菌群的构建。

将绿脓假单胞菌(A1)、铜绿假单胞菌(A2)恶臭假单胞菌(A3)、枯草芽孢杆菌(B1)地衣芽孢杆菌(B 2)、洪城红球菌(C1)、红平球菌(C2)、热带假丝酵母菌(D1)和解脂假丝酵母(D2)别接种到肉汤培养基中进行摇瓶培养48小时，分别获得不同菌株的种子液。

本发明中所有菌株均可以通过市购得到，其中铜绿假单胞菌、洪城红球菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌均够买自北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心。

分别移取10mL活化的种子液至100mL原油液体培养基中(原油20g、NH₄NO₃2.0 g、KH₂PO₄0.5 g、K₂HPO₄1.0 g、CaCl₂·2H₂O 0.02 g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000mL，pH 7.0～7.2，121℃下灭菌20min)，置于恒温摇床，在35℃、150r/min下培养7d。

然后向发酵液中加入20mL石油醚超声萃取残余原油，共4次，利用分液漏斗收集所有萃取液，用无水硫酸钠脱水，过滤后定容至 100mL，最后以石油醚为参比，在最大吸收波长下测定吸光度值，根据标准曲线计算降解率^[53]，公式为：

降解率(％)＝(C₀-C_d)/C₀×100％ 式中：C₀—初始原油浓度，mg/L；

C_d—降解后剩余原油浓度，mg/L。

不同菌株对石油烃的降解效果见图1。从实验结果可以看出，这 9株菌对石油烃对具有良好的降解效果，降解率都达到50％以上。为了进一步构建复合菌群，将这9株菌按种属不同分为4类，并按等比例进行复配，然后按10％接种量加入到原油培养基中培养7天，并测定不同组合对原油的降解效果，结果见图2，从图2可以看出，复合菌株的对原油的降解效果要明显优于单菌株，说明多菌株之间的协同作用更有利于原油降解。从不同菌株组合的降解效果来看，菌株组合 A2B1C1D1对原油的降解效果要明显高于其他组合，说明株菌铜绿假单胞菌(A2)、枯草芽孢杆菌(B1)、洪城红球菌(C1)和热带假丝酵母菌(D1)间的协同作用最显著。

实验测得这4株菌对原油中的四组分降解效果见图3，从图3可以看出，这4株菌对原油中的四组分降解效果差异显著，其中铜绿假单胞菌对饱和烃的降解效果最好，洪城红球菌对这四种组分都有较好的降解效果，枯草芽孢杆菌对芳烃的降解效果突出，而热带假丝酵母菌对胶质和沥青质的降解效果显著。通过将这4株菌复配后可以进一步增加复合菌株对其对原油中不同组分的降解效果。

为了进一步对这4株菌的复配比例进行优化，采用正交实验对不同复配比例的复合菌群降解效果进行了测定，结果见表1。从表1可以看出，当菌株A2、B1、C1、D1按比例2:2:1:4进行复配时效果最佳，降解率可以达到92.96％。

表1菌株复配正交实验表

实验对这4株发酵液的表面张力值进行测定，结果见图4，从图中可以看出，这四株菌的发酵液都能明显降低表面张力，表明其都能代谢表面活性剂，而且通过菌株复配得到的混合菌群能够进一步降低发酵液的表面张力，说明这四株菌在产生表面活性剂方面具有良好的协同效应。在微生物降解石油烃过程中，表面活性剂起到非常重要的媒介作用。由于石油烃具有很强的疏水性，尤其是原油中的多环芳烃疏水性极强，而菌体自身又是亲水性的，二者很难相互接触而发生作用，因此，在用微生物强化处理含油污泥过程中，往往需要额外加入表面活性剂，通过其降低油水界面张力，增强菌体与原油的相互接触，从而提高微生物对石油烃的降解效率。

实施例2

复合降解菌剂的制备。

将铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、洪城红球菌和热带假丝酵母菌在肉汤培养基中进行摇瓶培养活化48h后，按体积比2:2:1:4混合，然后再按5wt％-10wt％的接种量加入到种子培养基中进行放大发酵培养，当活菌数>10⁹CFU/mL时停止发酵，得到复合降解菌剂。种子培养基的组成为：葡萄糖10g/L、尿素2g/L、酵母膏0.5g/L、K₂HPO₄0.5g/L、 KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、CaCl₂·2H₂O 0.2g/L、柠檬酸钠 0.1g/L，pH＝6～8。

实施例3

复合降解菌剂对含油土壤的生物修复。

将含油土壤(含油率5.68wt％)经过机械粉碎后，添加尿素0.5 wt％、磷酸二氢钾0.2wt％、膨松剂2wt％的和液体复合降解菌剂5 wt％，用翻耕机将其搅拌均匀。wt％均是指占土壤总质量的质量百分比。

在地面铺上防渗布，防渗布的四周高于地面8～10cm，在防渗布上面摆放一排直径4～6cm钢管，钢管间的距离为20～30cm，在钢管上面放上不锈钢或铁丝支撑网，网眼孔径2～3cm，然后在支撑网上将已经添加过尿素、磷酸二氢钾、膨松剂的和液体复合降解菌剂并搅拌均匀的含油土壤堆放80-120cm厚，在含油土壤表面覆盖一层厚度为2～4 cm的锯末进行保温及防止水分快速蒸发，在锯末上方喷洒水使水分均匀渗透到土壤中，控制含油土壤中的含水率为25wt％左右，然后在自然条件下发酵处理60天，处理过程中不需要翻耕透气操作，同时，在处理过程中不要把土壤压实。

在发酵处理过程中，每隔3～5天补充一次水分，补充水分的方式为从含油污泥上分喷洒。当所处理的含油土壤含油量大于5wt％时需要每隔15～20天补加一次液体菌剂，补加量为土壤总量的2wt％～5 wt％，补加方式同水分补充，即从含油污泥上方喷洒。在发酵处理过程中，每隔一周监测一次菌浓和含油率变化，取样方式为：从含油污泥表面以下5～10cm处取样，选择5个样点采集等量样品，将五个样点样品合并一个样品，然后分别采用平板计数法和红外测油仪对菌浓和含油率进行测定，当土壤中的含油率达到0.3wt％以下时处理结束。修复过程中含油土壤中的菌浓及含油率变化见图5。

从监测结果来看，随着处理时间的增加，土壤中的微生物数量明显增加，2周后达到10⁹CFU/g以上，并能够稳定在该数量，说明加入的复合菌群能够在土壤中以石油烃为碳源进行快速增值。同时土壤中的石油烃含量也随着处理时间的增加而逐渐降低，其中在前7天降解最快，随着石油烃含量的减小，降解率逐渐降低，到第49天时土壤中的含油率降低到了0.29％，达到我国农用土地标准。可见，本发明所构建的复合降解菌群及处理工艺对含油土壤修复具有良好的应用效果和广阔的应用前景。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种高效复合降解菌剂，其特征在于，包括铜绿假单胞菌、洪城红球菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌。

2.根据权利要求1所述的高效复合降解菌剂，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

1)将铜绿假单胞菌、洪城红球菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌分别接种到肉汤培养基中进行摇瓶培养，分别获得铜绿假单胞菌、洪城红球菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌种子液；

2)将步骤1)得到的铜绿假单胞菌、洪城红球菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌种子液，混合，然后加入到种子培养基中进行放大发酵培养，得到复合降解菌剂。

3.根据权利要求2所述的高效复合降解菌剂，其特征在于，所述铜绿假单胞菌、洪城红球菌、枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母菌种子液，按体积比2:2:1:4混合。

4.根据权利要求2所述的高效复合降解菌剂，其特征在于，混合的种子液，按5wt％-10wt％的接种量加入到种子培养基中进行放大发酵培养，当活菌数>10⁹CFU/mL时停止发酵。

5.根据权利要求2所述的高效复合降解菌剂，其特征在于，种子培养基的组成为：葡萄糖10g/L、尿素2g/L、酵母膏0.5g/L、K₂HPO₄0.5g/L、KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2g/L、CaCl₂·2H₂O 0.2g/L、柠檬酸钠0.1g/L，pH＝6～8。

6.权利要求1～5任一项所述的高效复合降解菌剂应用于含油土壤修复。

7.根据权利要求6所述的高效复合降解菌剂应用于含油土壤修复，其特征在于，含油土壤修复工艺包括：将含油土壤经过机械粉碎后，添加氮肥、磷肥、膨松剂和复合降解菌剂，再翻搅均匀，所述膨松剂的添加量为土壤总质量的2％～5％，复合降解菌剂的添加量为土壤总质量的5％。

8.根据权利要求7所述的高效复合降解菌剂应用于含油土壤修复，其特征在于，所述膨松剂包括锯末、粉碎的秸秆和粉碎的稻草中的任意一项及两项以上的组合；控制待修复的含油土壤中C:N:P＝90:5:1。

9.根据权利要求7所述的高效复合降解菌剂应用于含油土壤修复，其特征在于，在地面铺上防渗布，防渗布的四周高于地面8～10cm，在防渗布上面摆放一排直径4～6cm的钢管，钢管间的距离为20～30cm，在钢管上面放上不锈钢或铁丝支撑网，网眼孔径2～3cm，然后在支撑网上将翻搅均匀的含油土壤堆放至80～120cm厚，在含油土壤表面覆盖一层厚度为2～4cm的膨松剂进行保温及防止水分快速蒸发，当土壤含水率低于20％时需要补充水分，水分补充方式为在锯末上方喷洒水使水分均匀渗透到土壤中，直到总体含水率为20％-30％，在自然条件下发酵处理45～60天，处理过程中不需要翻耕透气操作，同时，在处理过程中不要把土壤压实。

10.根据权利要求9所述的高效复合降解菌剂应用于含油土壤修复，其特征在于，在发酵处理过程中，每隔5-7天补充一次水分，补充水分的方式为从含油污泥上分喷洒；当所处理的含油土壤含油量大于5％时需要每隔15～20天补加一次复合降解菌剂，补加量为土壤总质量的2％～5％，补加方式为从含油污泥上方喷洒；每隔一周监测一次菌浓和含油率变化，取样方式为：从含油污泥表面以下5～10cm处取样，选择5个样点采集等量样品，将五个样点样品合并一个样品，然后分别采用平板计数法和红外测油仪对菌浓和含油率进行测定，当土壤中的含油率达到3000mg/kg以下时处理结束。

Images