CN115536735B

CN115536735B - OsRBL1突变蛋白及其在平衡水稻抗病和产量中的应用

Info

Publication number: CN115536735B
Application number: CN202111041400.3A
Authority: CN
Inventors: 李国田; 沙干; 韩欣雨
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-09-07
Filing date: 2021-09-07
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2041-09-07
Also published as: CN115536735A

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及OsRBL1突变蛋白及其在平衡水稻抗病和产量中的应用。所述的OsRBL1突变蛋白为SEQ ID NO.1所示，通过在野生型水稻中敲除OsRBL1基因中序列4所示12bp位点，突变后的基因表达SEQ ID NO.1所示蛋白，获得的水稻突变株可在增强水稻广谱抗病性的基础上保证水稻的产量。本发明为利用基因工程手段通过优化OsRBL1基因来增强作物抗病性，同时保证作物产量，为未来分子育种的发展奠定了基础，在培养优质水稻材料上具有应用前景。

Description

OsRBL1突变蛋白及其在平衡水稻抗病和产量中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及OsRBL1突变蛋白及其在平衡水稻抗病和产量中的应用。

背景技术

植物病虫害严重影响农业生产，往往造成农作物的大规模减产及品质降低，严重威胁世界粮食安全。仅水稻稻瘟病在世界范围内每年造成的水稻损失足以养活6000万人[Nalley,L.,et al.,Economic and environmental impact of rice blast pathogen(Magnaporthe oryza e)alleviation in the United States.PLoS One,2016.11:p.e0167295.]。而水稻稻曲病不仅造成水稻减产，稻曲病菌还产生黑粉毒素而影响水稻生产和食用安全性[Sun,W.,et al.,Ustilaginoidea virens:insights into an emergingrice pathogen.Annu Rev Phytopathol,2020.58.]。培育和种植抗病品种是防治植物病虫害最经济有效和环保的措施。然而病原菌群体不断演化、新的病原菌小种不断出现[Fisher,M.C.,et al.,Emerging fungal threats to animal,plant and ecosystemhealth.Nature,2012.484(7393):p.186-194.]，特别是单一抗性品种大规模种质，多数品种在种植数年后抗性逐渐被克服，抗病育种面临着不断挑战。因此，不断挖掘和创制新的广谱抗病种质资源显得尤为重要。

植物类病变突变体(lesion mimic mutant)是在没有病原物侵染或逆境胁迫的情况下就能自发产生病斑的突变体。类病斑突变体的表型和植物防卫反应中过敏反应(hypersensitive response,HR)相似，一般表现出广谱抗病性[Zhu,X.,et al.,Deciphering rice lesion mim ic mutants to understand molecular networkgoverning plant immunity and growth.Rice Sci.,2020.27(4):p.278-288]。如最近发表的类病斑突变体nbl3(目的基因为OsNBL3)和sp l-D(目的基因为OsRBL1)对稻瘟病和白叶枯病表现较强抗性Qiu,[T.,et al.,OsNBL3,a mitochondrion-localizedpentatricopeptide repeat protein,is involved in splicing nad5 intron4and itsdisruption causes lesion mimic phenotype with enhanced resistance to bioticand abiotic stresses.Plant Biotechnol.J.,2021.Zhao,X.,et al.,A novel glycine-rich domain protein,GRDP1,functions as a critical feedback regulator forcontrolling cell death and disease resistance in rice.J.Exp.Bot.,2021.72(2):p.608-622.]。另外，类病斑突变体spl 28表现对8个稻瘟菌小种和4个白叶枯菌株的广谱抗性[Qiao,Y.,et al.,SPL28 encodes a clathrin-associated adaptor protein complex1,medium subunit micro 1(AP1M1)and is responsible for spotted leaf and earlysenescence in rice(Oryza sativa).New Phytol,2010.185(1):p.258-74.]；而spl33表现对12个稻瘟菌小种和11个白叶枯菌株的广谱抗性[Wang,S.,et al.,SPL33,encoding aneEF1A-like protein,negatively regulates cell death and def ense responses inrice.J Exp Bot,2017.68(5):p.899-913.]。总之，多数水稻的类病斑突变体对稻瘟病和白叶枯病都表现很好的抗性[Qiu,T.,et al.,OsNBL3,a mitochondrion-local izedpentatricopeptide repeat protein,is involved in splicing nad5 intron 4and itsdisrupti on causes lesion mimic phenotype with enhanced resistance to bioticand abiotic stresses.Plant Biotechnol.J.,2021.]。在其他作物中，大麦广谱抗白粉病基因mlo和小麦中广谱抗锈病基因Lr34来源于类病斑或叶尖坏死突变体[Lagudah,E.S.,etal.,Gene-specific markers for the wheat gene Lr34/Yr18/Pm38 which confersresistance to multiple fungal pathogens.Theor.Appl.Genet.,2009.119(5):p.889-898.Büschges,R.,et al.,The barley mlo gene:a novel control element of plantpathogen resistance.Cell,1997.88(5):p.695-705.]，但是类病斑较弱、出现较晚，对产量没影响，因此广泛应用于抗病育种。但是，多数植物类病变突变体产量显著降低，即植物免疫与生长发育的拮抗，如何改造类病斑相关广谱抗病基因创制平衡抗病与生长发育新种质既是植物病理学研究中的难点，也很有应用价值，特别是目前对尚未克隆优良抗病基因的病害，如稻曲病等[Sun,W.,et al.,Ustilaginoidea vire ns:insights into anemerging rice pathogen.Annu Rev Phytopathol,2020.58.]。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种OsRBL1突变蛋白，所述蛋白为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了OsRBL1突变蛋白在平衡水稻抗病和产量中的应用。

为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案实现：

OsRBL1突变蛋白的获得：

申请人通过快中子诱变技术，获得了一株类病斑突变体水稻，突变体表现出对稻瘟病、稻曲病及白叶枯的广谱抗病性，然而种子结实受到严重影响。将该水稻基因组进行测序，发现基因为OsRBL1有了实质性的突变导致，为了在生产上应用该发现，打破突变体中植物免疫和生长发育的拮抗，申请人利用多种CRISPR/Cas基因编辑***对目的基因编码区进行饱和编辑。最终通过温室抗病综合筛选鉴定出一个保持广谱抗病的新突变株，该突变株的OsRBL1蛋白突变为了SEQ ID NO.1所示蛋白，田间试验显示此株系产量不受影响。

所述OsRBL1蛋白在野生型水稻中的LOC号：LOC_Os01g55360。

含有所述突变蛋白的水稻也属于本发明的保护范围。

编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

OsRBL1突变蛋白在制备抗病水稻中的应用，包括将水稻中的编码SEQ ID NO.3所示蛋白的基因，通过本领域的常规手段，替换为编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因。

OsRBL1突变蛋白在制备抗病同时保持产量的水稻中的应用，包括将水稻中的编码SE Q ID NO.3所示蛋白的基因，通过本领域的常规手段，替换为编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因。

以上所述的应用中，优选的，所述的抗病为抗稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)病，白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和/或稻曲菌(Ustilaginoidea virens)病。

与现有技术相比，本发明的优点如下：

申请人通过构建该基因的CRISPR载体，并转化水稻粳稻品种Kitaake，得到的一个转基因株系材料在RBL1基因的第二个外显子上整码缺失12bp(TCTGGGCCATGG)，使其在生长上与正常野生型没有差异，但对稻瘟菌，白叶枯菌和稻曲菌的抗性显著强于野生型材料；在大田实验中突变体相对野生型产量没有显著差异，在病圃中野生型材料几乎绝产，而突变体材料则保持了一定的产量。

本发明申请人通过快中子诱变技术，获得了一株类病斑突变体水稻，突变体表现出对稻瘟病、稻曲病及白叶枯的广谱抗病性，然而种子结实受到严重影响。将该水稻基因组进行测序，发现基因为OsRBL1有了实质性的突变导致，为了在生产上应用该发现，打破突变体中植物免疫和生长发育的拮抗，申请人利用多种CRISPR/Cas基因编辑***对目的基因编码区进行饱和编辑。最终通过温室抗病综合筛选鉴定出一个保持广谱抗病的新突变株，该突变株的OsRBL1蛋白突变为了SEQ ID NO.1所示蛋白，田间试验显示此株系产量不受影响；本发明的技术方案，对于创制广谱抗病高产优异新种质有重要意义。

附图说明

图1 OsRBL1 gRNA编辑位点及CRISPR载体示意图

其中，A为OsRBL1基因结构图，红星标注gRNA设计位点；B为载体组装示意图；C为载体构建片段组装及空载酶切结果；D为RBL12编辑位点测序结果图。

图2 RBL1编辑材料温室表型鉴定

A为OsRBL1所有编辑株系温室中的生长表型；

WT是野生型，1-19是编辑株其他19个株系，RBL12拍了2片叶子；

B图为RBL12株系与野生型温室生长表型；

RBL12与Kitaake在温室盆栽的生长表型，因为生长表型基本一致，只拍摄一株材料表型作为示意图；

C图为RBL12株系对不同小种的稻瘟菌抗性鉴定结果，左图接菌14天表型，右图病斑长度统计；

D为RBL12株系对不同小种的白叶枯菌抗病性鉴定结果，左图接菌14天后表型，右图为病斑长度统计；

E为RBL12株系对不同小种的稻曲菌抗性鉴定结果，左图为接菌18天后表型，右图为稻曲菌球数目统计；生长没有显著差异，抗病性显著增强。

图3 RBL12编辑材料农艺性状分析及田间表型鉴定示意图；

A显示正常栽培田间农艺性状统计结果，突变体株高降低，但是野生型与突变体产量没有显著差异；

B为在湖北恩施病圃中野生型与突变体稻瘟菌发病的病穗率统计鉴定结果，突变体病穗率显著低于野生型；

C为RBL12编辑株系和野生型Kitaake材料在病圃和正常稻作区田间生长表型鉴定。

图4为实施例5中的病圃设计示意图。

图5为实施例6中的病圃设计示意图。

图6为实施例1中的rbl1突变体表型及抗病性鉴定示意图。

图7为实施例1中rbl1突变体产量鉴定示意图。

具体实施方式

根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。本发明所述技术方案，如无特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

本发明的引物及测序服务由武汉天一辉远生物科技有限公司完成。

实施例1：

抗病突变体水稻的获得：

申请人在前期研究中通过快中子诱变技术创建了一个水稻突变群体，对1504个突变系进行了深度测序。申请人在对突变体群体的田间抗性筛选过程中(实施例5所示方法)，获得一个类病斑突变体rbl1，该突变体表现出对稻瘟病和白叶枯病的抗性显著增强。接种稻瘟菌后野生型病斑面积为接种叶片面积的20％左右，突变体病斑面积小于5％；接种白叶枯后野生型病斑长度为20cm左右，而突变体为5cm左右(图6)，但是该突变体产量极低，籽粒变小(图7)，通过全基因组测序比对，发现该突变体表型为OsRBL1基因(LOC号：LOC_Os01g55360)的内含子剪切位点突变，导致该基因功能丧失所致。

实施例2：

OsRBL1突变蛋白的获得：

1)申请人构建OsRBL1基因CRISPR敲除载体：

CRISPR载体构建方法来源于文章Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editingcapability with the endogenous tRNA-processing system.(Xie,K.,Minkenberg,B.,and Yang,Y.(2015).Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with theendogenous tRNA-process ing system.Proc Natl Acad Sci USA 112,3570-3575.)

下述步骤中的引物的序列若无特别标注，均与该公开文章中相同：

(1)引物设计：

OsRBL1蛋白(SEQ ID NO.3所示，编码其的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示)对应的OsRBL1基因LOC号：LOC_Os01g55360，设计编辑靶点序列为gRNA-21：CCTCTATATCTGGGCCATGGTGG，该靶点位于基因第二个外显子上(图1中A)，脱靶率低；在靶点后接上gRNA scaffold序列GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC；

以靶点为参考设计引物如下所示：

RBL1-F：5’-TAGGTCTCCGGAAGCAAAAGGgttttagagctagaa-3’

RBL1-R：5’-CGGGTCTCAGGCCCTTGGCGAtgcaccagccggg-3’

(2)一轮PCR：引物配对方式为：L5AD5-F和RBL1-R,RBL1-F和L3AD3-R，以gRNA(CCTCTATATCTGGGCCATGGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC)为模板进行PCR扩增。反应条件为：95℃预变性5min；95℃30sec，50℃30sec，72℃30sec，32个循环；72℃延伸5min。

(3)GG反应：将扩增获得的PCR产物纯化后进行GG反应(产物共7ul(25-50ng)；2*T4连接酶Buffer(NEB)10ul；BSA 2ul；BsaI(10U/ul,NEB)0.5ul；T4 DNA连接酶0.5ul)，反应条件为：37℃5min，20℃10min，40个循环；20℃1h。

(4)GG PCR：反应产物加入180ul双蒸水稀释后进行利用S5AD5-F和S3AD3-R对目的片段进行扩增，纯化PCR产物。

(5)酶切酶连：将片段和pRGEB32载体分别用FOKI和BSAI进行酶切(图1中C)，37℃反应1.5h。酶切完毕后，用包含OsRBL1基因的酶切片段和酶切的pRGEB32载体做连接反应，其后转化大肠杆菌Top10。通过酶切筛选阳性克隆，获得的重组CRISPR载体被命名为KORBL1(图1中B)。

2)质粒载体的转化及转基因植株基因型检测

(1)水稻Kitaake愈伤组织的诱导：用0.1％的HgCl₂处理水稻Kitaake种子，利用N₆诱导培养基诱导愈伤组织。

(2)农杆菌侵染愈伤及共培养：将上述CRISPR载体转入农杆菌后挑取单克隆扩大培养至OD₆₀₀＝0.6，然后进行农杆菌侵染，最后将愈伤组织在含0.1％AS的共培养基上暗培养3天。

(3)筛选抗性愈伤：将暗室共培养的愈伤用含有0.1％Cn及0.1％Hyg的ddH₂O反复清洗后置于筛选培养基上光照培养7-14天，期间更换一次筛选培养基，直至长出新的抗性愈伤组织。

(4)抗性愈伤分化：将新长出的抗性愈伤挑至分化培养基中，在25℃光照培养30天左右，观察愈伤是否开始分化。适时更换新的分化培养基，促进愈伤组织的分化。

(5)炼苗及移栽：将分化出来的T₀代幼苗转移至生根培养基中，置于25℃光照培养室。待幼苗生长至三叶期后开始加水炼苗，炼苗7-10天后将其移栽至温室繁种。

(6)CTAB法提取基因组DNA小样

(7)转基因植株的PCR鉴定：用特异性引物进行PCR检测，所获得的目的片段大小为636bp,PCR产物进行sanger测序，鉴定阳性转基因植株编辑位点。

PCR检测引物如下：

SeqRBL1F：AAGTCAATGCTTATCCGTACATAT

SeqRBL1R：GCAGGGGGCCATAGATG。

从所获得的所有转基因植株中，筛选到高抗稳产株系RBL12，经测序，发现在该株系中，在OsRBL1基因的第二个外显子上敲除掉了12bp，敲除的序列为TCTGGGCCATGG，测序结果如图1中D所示，高抗稳产株系RBL12(即图1中D中的RBL1-12)其中的突变后的OsRBL1蛋白为SEQ ID NO.1所示，编码该蛋白的基因为SEQ ID NO.2所示。

实施例3：

温室鉴定高抗稳产株系RBL12的广谱抗病性

在温室条件下筛选RBL12不含Cas9的纯合编辑株系材料进行抗病性鉴定，接种稻瘟菌(M agnaporthe oryzae)，白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻曲菌(Ustilaginoidea virens)后观察其抗病表型，结果显示突变体对不同的病原菌小种均表现为高抗病性，温室抗病性鉴定结果如图2所示，纯合鉴定及抗性鉴定标准如下述步骤：

(1)编辑株系基因型鉴定：首先利用CTAB法提取DNA，然后利用PCR对T1代进行分析，鉴定T1代RBL1-12位点纯合编辑材料。

根据敲除位点确定其基因型纯合鉴定引物信息如下所示：

如果编辑位点基因型为野生型Kitaake，则引物组合正向引物1+反向引物能扩增得到559bp，正向引物2+反向引物无法扩增；

如果编辑位点为纯合RBL12，则引物组合正向引物2+反向引物能扩增得到547bp，正向引物1+反向引物无法扩增。

正向引物1：CTATATCTGGGCCATGGTGGTT

正向引物2：GGTCACCTCTATATGGTTGTTATTCA

反向引物1：GCAGGGGGCCATAGATG

(2)编辑株系广谱抗病性鉴定

纯合及双等位缺失突变的纯合T1植株在温室或盆栽场对不同病害抗性检测方法如下：

a.稻瘟病叶瘟抗性鉴定：将参试菌株燕麦培养基光照培养10天后收集新鲜孢子，过滤后，用含有0.01％Tween-20蒸馏水将孢子悬液浓度调至2×10⁵/ml，用于接种四叶期水稻幼苗。在幼苗最新伸展叶片上用鼠耳打孔器在倒二叶上人为制造一个潜在的圆形伤口，并用移液器吸取10μl孢子悬液于伤口处并用透明胶带密封液滴；28℃高湿条件下继续生长14天后调查发病情况。每株系接种10株，独立重复3次接种。病叶拍照，用ImageJ计算病斑面积，与对照组相比，鉴定编辑株系抗病性，用Graph pad软件可视化接种结果。

结果显示：野生型Kitaake接种稻瘟菌ZB25后平均病斑长度为2.8cm左右，而突变体RBL12平均长度为1.2cm左右；接种稻瘟菌ZE-1后,野生型Kitaake平均病斑长度为2.3cm左右,而突变体RBL12平均长度为0.7cm左右；接种稻瘟菌0755后,野生型Kitaake平均病斑长度为1.8cm左右,而突变体RBL12平均长度为0.4cm左右，综上，突变体RBL12对稻瘟菌不同小种均表现极高的抗性。如图2中C所示。

上述所有稻瘟菌小种在四川农业大学陈学伟老师处获得，参考文献[Zhou X,LiaoH,Chern M,Yin J,Chen Y,Wang J,Zhu X,Chen Z,Yuan C,Zhao W,Wang J,Li W,He M,MaB,Wang J,Qin P,Chen W,Wang Y,Liu J,Qian Y,Wang W,Wu X,Li P,Zh u L,Li S,RonaldPC,Chen X.Loss of function of a rice TPR-domain RNA-binding pro tein confersbroad-spectrum disease resistance.Proc Natl Acad Sci U S A.2018 Mar 20；115(12):3174-3179.doi:10.1073/pnas.1705927115.Epub 2018 Feb 5.PMID:29432165；PMCID:PMC5866533.]。

b.稻曲病室内抗性鉴定：稻曲病菌株在PSA平板28℃培养5d后，将新鲜菌饼转入PSB液体培养基于28℃振荡培养7d，过滤、离心收集分生孢子，用新的PSB液体培养基将孢子悬浮液浓度调至10⁶/mL，用于侵染生长至破口前5-7d(幼穗分化7-8期)的水稻材料。侵染时，用注射器吸取2mL孢子悬浮液注射接种水稻穗苞，清水作为对照，25℃高湿条件下继续生长，接种14天后调查发病情况。每株系注射10穗，重复3次。结果处理，取下所有接种过稻曲病菌的稻穗，于实验室内调查病穗数和每穗发病的病粒数，以有稻曲球出现的穗为病穗，有稻曲球出现的谷粒为病粒，统计穗粒发病率(表1)，并拍照记录。

表1水稻稻曲病分级标准

结果显示：野生型Kitaake接种稻曲菌HWD2(Chen,X.,Tang,J.,Pei,Z.,Liu,H.,Huang,J.,Luo,C.,Tom,H.,and Zheng,L.(2020).The'pears and lemons'protein UvPal1regulates development and virulence of Ustilaginoidea virens.EnvironMicrobiol 22,5414-5432.)后，平均染病稻曲球个数约为8个左右，而突变体RBL12平均染病稻曲球个数约为2个左右；接种稻曲菌JS60-2(屈劲松,王毓富,王睿,刘月冉,谷丽凡,周鹏,阴伟晓,罗朝喜.稻曲病菌bZIP转录因子UvbZIP12的功能研究[J/OL].植物病理学报:1-13[2021-09-03)后,野生型Kitaake平均染病稻曲球个数约为5个左右,而突变体RBL12平均染病稻曲球个数约为1个左右。综上，突变体RBL12对稻曲菌不同小种表现出具有极高的抗性。如图2中E所示。

c.白叶枯病抗性鉴定：NB培养基于28℃培养参试白叶枯病菌，2-3天后，收集菌体，用蒸馏水稀释至OD600＝0.5。白叶枯病菌接种采用剪叶法，用剪刀蘸取菌液剪切孕穗期最新伸展水稻叶片叶尖5cm处，每株系接种10株，重复3次，接种14天后调查病斑长度，鉴定编辑株系抗性。

表2水稻白叶枯病抗性鉴定评价标准

结果显示：野生型Kitaake接种白叶枯菌PXO99后平均病斑长度为13cm左右，而突变体RBL12平均长度为3cm左右；接种白叶枯菌PXO71后,野生型Kitaake平均病斑长度为17cm左右,而突变体RBL12平均长度为8cm左右；接种白叶枯菌PXO341后,野生型Kitaake平均病斑长度为15cm左右,而突变体RBL12平均长度为7cm左右；接种白叶枯菌ZHE173后,野生型Kitaake平均病斑长度为8cm左右,而突变体RBL12平均长度为2cm左右；接种白叶枯菌GXO1后,野生型Kitaake平均病斑长度为15cm左右,而突变体RBL12平均长度为6cm左右。综上，突变体RBL12对白叶枯菌不同小种均表现极高的抗性。如图2中D所示。

上述白叶枯小种在华中农业大学袁猛老师处获得，参考文献Liu,Qinsong,Yuan,Meng,Zhou,Yan,Li,Xianghua,Xiao,Jinghua,and Wang,Shiping."A paralog of theMtN3/sal iva family recessively confers race-specific resistance toXanthomonas oryzae in rice."Plan t,Cell and Environment 34,no.11(2011):1958-1969.。

实施例4：

高抗稳产株系RBL12关键农艺性状测定：

准备对照组Kitaake和RBL12编辑处理组两组材料，成熟期(萌发后95天)分别选取20株苗子，进行农艺性状的统计，主要包括株高、有效分蘖数、有效穗数、结实率、单株产量等农艺性状。将40株备选材料(20株对照株系，20株突变株系)进行标记，拍照记录同一时期的两组材料的表型，如图2中A和B。

各农艺性状测定标准如下：

a.株高：分别测量40株植株从主穗顶端到地面的距离，记录数据，求其平均数。

b.有效分蘖数：选取40株植株的有效分蘖进行统计，记录数据，求其平均数。

c.有效穗数：选取的水稻植株中，结实超过5粒的穗数，均做为有效穗，然后求其平均数。

d.单株产量：分别测量每组(20株)材料的实粒的重量，然后求其平均数。

e.结实率：统计每株植株的实粒数和颖花数，其中白穗、空粒及半枯穗不计在其中，具体公式如下，记录数据，求其平均值。

f.千粒重：样品脱粒后，去除空粒，随机取1000粒进行称重，重复三次求其平均值。

将上述统计数据统一使用Graph pad软件可视化温室农艺性状考察结果。

不含转基因株系筛选：针对***水稻基因组的编辑载体片段设计引物，PCR检测筛选不含转基因株系，扩繁种子(>2500粒种子)，进行大田试验。

统计结果如下：野生型材料株高72cm左右，RBL12株高65cm左右，突变体株高减少5-8cm；野生型有效分蘖数和有效穗数平均为27个分蘖，突变体为26个分蘖，没有显著差异；结实率均为80％-90％左右，没有显著差异；单株产量温室统计结果，野生型为18g每株，突变体为16.8g每株，没有显著差异；千粒重均为20-25g左右，种子粒型没有显著差异；

实施例5：

高抗稳产株系RBL12广谱抗病性和重要农艺性状田间评估

a.编辑株系广谱抗病性田间评估：采用病圃自然诱发评估编辑材料对稻瘟病、稻曲病的抗性，地点为湖北恩施咸丰县自然诱发试验点和江西省农科院井冈山抗性育种基地国家级农作物品种审定区域试验站。进行两年评估。依据当地气候，一般5月份前后插秧。

病圃设计如图4所示。在对照组和测试组四周栽插易感品种LTH(四川农业大学陈学伟老师处获得，参文同上述稻瘟菌小种参文)诱发接种。每种材料各种植60m²，大约共种植1500株苗子，苗距为18cm×18cm。每块种植两组材料125m²,独立重复四次。培养条件与管理措施均符合田间管理要求，实验区***种植保护行。

b.抗叶瘟鉴定：于水稻分蘖末期进行调查，此时叶瘟病发病最重，共调查25株，逐株调查，每株统计各个叶片的病情级别，将最高病情级别认定为本株叶瘟最终病情级别，分别记录每丛水稻叶瘟病发病的病情级别后，利用加权平均值法计算25株水稻植株发病等级。

野生型Kitaake材料全部发生较严重叶瘟，突变体材料RBL12约20％植株发病，我们同时分离了Kitaake的80个亲和稻瘟菌小种，公众均可从华中农业大学申请人处获得，用于科学研究用途。

c.抗穗瘟鉴定：于水稻黄熟期进行调查，共调查100穗。记录水稻穗瘟病穗率的病情级别，计算出穗瘟损失率指数。田间发病标准接种病级调査标准按照中华人民共和国农业行业标准(NY/T3685-2020)进行。

表3水稻穗瘟损失率单穗分级标准

病穗率统计：田间病圃中野生型Kitaake病穗率约为90％左右，出现大量白穗，为高感水稻材料，而突变体RBL12平均病穗率约为18％左右；综上，田间病圃中的抗病性鉴定为RBL12编辑株系对稻瘟菌抗性显著增强，病穗率显著低于野生型，如图3中B和C中病圃栽培所示。

d.抗稻曲病鉴定：病情调查在收获水稻约一周前进行。总共调查100穗，记录水稻病穗率的病情级别。发病数据处理标准参考稻曲病抗性评价分级标准(表4)，并计算其病情指数。

表4水稻稻曲病抗性评价分级标准

野生型病穗率为30％左右，属于感病材料，而RBL12病穗率4％左右，属于中抗材料。

e.编辑株系重要农艺性状田间评估：南方稻区湖北武汉、湖南浏阳及海南三亚南繁基地等三地进行，

田块设计如图5所示(为简化，只显示一个测试株系)。对照组和编辑株系，每个测试地点每种材料各种植60m²，苗距为18cm×18cm。每块种植两组材料125m²，重复四次。随机每种材料随机选取10块(2.5m×2.5m)大小的面积，测定产量。

待至成熟期后，在种植区域中央随机选取100株植株，进行主要农艺性状的统计，主要包括株高、有效分蘖数、结实率、千粒重，单株产量等主要农艺性状。将100株备选材料进行标记，分别进行单独脱粒(主穗为单穗脱粒)，统计其产量因子性状，计算每份材料的千粒重、结实率等表现值。各农艺性状测定标准如下(实施例4已说明参数，此处不再赘述)：

每穗粒数：统计每个植株的实粒数，其中白穗、空粒及半枯穗不计在其中，采用5点法，重复三次。

病圃中的抗病性鉴定发现RBL12编辑株系对稻瘟菌抗性显著增强，如图3所示，在恩施病圃中野生型株系几乎绝产，RBL12株系保持了一定产量，病穗率显著低于野生型。

结果显示：田间农艺性状考察评估如下，在正常未发病栽培情况下，a.株高降低：野生型Kitaake平均单株株高为65.8cm左右，而突变体RBL12平均高度为58.3cm左右；b.结实率：野生型Kitaake结实率约为81.5％,而突变体RBL12结实率约为81.2％；c.千粒重：野生型Kitaake千粒重约为25g,而突变体RBL12结实率约为24.5g；d.百株产量：野生型Kitaake百株产量约为1.47Kg,而突变体RBL12百株产量约为1.45Kg；综上，在田间鉴定RBL12编辑株系株高低于野生型，但其他农艺性状没有显著差异，产量没有显著降低。如图3中A和C图正常栽培田所示。而在病圃栽培中，Kitaake约80—90％的白穗，几乎绝产，RBL12突变体仅有15％左右发病，仍然可以维持一定产量，如图3中B和C中病圃栽培所示。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> OsRBL1突变蛋白及其在平衡水稻抗病和产量中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Arg Asp Thr Ser Ser Ser Asp Val Ser Ala Ser His Val Gly

1 5 10 15

Arg Ala Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr Glu Ala Thr Ala Asp Gly Asn

20 25 30

Arg Thr Asn Gly Pro Ala Leu Leu Val Asn Asp Gln Asn Lys Tyr Lys

35 40 45

Ser Met Leu Ile Arg Thr Tyr Ser Thr Val Trp Met Ile Gly Gly Phe

50 55 60

Val Leu Ile Val Tyr Met Gly His Leu Tyr Val Val Val Ile Gln Ile

65 70 75 80

Phe Met Ala Lys Glu Leu Phe Asn Leu Leu Arg Lys Ser Ser Glu Glu

85 90 95

Lys Gln Leu Pro Gly Phe Arg Leu Leu Asn Trp His Phe Phe Phe Thr

100 105 110

Ala Met Leu Phe Thr Tyr Gly Arg Phe Leu Ser Arg Gln Leu Val Asn

115 120 125

Thr Val Thr Ser Asp His Leu Leu Tyr Lys Val Val Ser Gly Leu Ile

130 135 140

Lys Tyr Gln Met Phe Ile Cys Tyr Phe Leu Tyr Ile Ala Gly Phe Val

145 150 155 160

Trp Phe Ile Leu Thr Leu Lys Lys Lys Thr Tyr Lys Tyr Gln Phe Lys

165 170 175

Gln Tyr Ala Trp Thr His Met Ile Leu Leu Thr Val Phe Ala Gln Ser

180 185 190

Ser Phe Thr Val Ala Asn Ile Phe Glu Gly Met Phe Trp Phe Leu Leu

195 200 205

Pro Ala Ser Leu Ile Val Ile Asn Asp Ile Ala Ala Tyr Leu Phe Gly

210 215 220

Phe Phe Leu Gly Arg Thr Pro Leu Ile Lys Leu Ser Pro Lys Lys Thr

225 230 235 240

Trp Glu Gly Phe Ile Gly Ala Ser Val Thr Thr Ile Ile Ser Ala Phe

245 250 255

Val Leu Ala Asn Val Met Gly Arg Phe Gln Trp Leu Thr Cys Pro Arg

260 265 270

Lys Asp Leu Ser Thr Gly Trp Leu Arg Cys Asp Pro Gly Pro Met Phe

275 280 285

Lys Pro Glu His Tyr Ser Leu Gly Glu Trp Val Pro Lys Gly Phe Pro

290 295 300

Trp Lys Glu Val Val Leu Leu Pro Val Gln Trp His Ala Leu Ala Leu

305 310 315 320

Gly Leu Phe Ala Ser Ile Ile Ala Pro Phe Gly Gly Phe Phe Ala Ser

325 330 335

Gly Phe Lys Arg Ala Phe Lys Ile Lys Asp Phe Gly Asp Ser Ile Pro

340 345 350

Gly His Gly Gly Ile Thr Asp Arg Met Asp Cys Gln Met Val Met Ala

355 360 365

Val Phe Ala Tyr Ile Tyr His Gln Ser Phe Ile Ser Pro Gln Asn Tyr

370 375 380

Ser Val Glu Leu Ile Leu Glu Gln Ile Leu Arg Asn Leu Thr Phe Glu

385 390 395 400

Glu Gln Lys Phe Leu Tyr Gln Gln Leu Gly Glu Ile Tyr Arg Glu Arg

405 410 415

Gln Leu Met Gln Ser

420

<210> 2

<211> 1266

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaaaggg acacaagctc tagtgatgtt tctgcttctc atgtaggacg tgccaggcag 60

cgaagacgtc ctactgaggc tactgcagat gggaatagaa ccaatggacc agctttgctt 120

gtcaatgatc agaataagta caagtcaatg cttatccgta catattctac agtatggatg 180

attggaggct ttgtgttgat agtttatatg ggtcacctct atgtggttgt tattcaaata 240

ttcatggcca aagagctttt taacctactc agaaaatcca gtgaagaaaa acaactacca 300

ggtttcaggc tactgaattg gcacttcttt ttcacagcaa tgttgtttac ttatgggcgt 360

tttcttagtc gacagcttgt taacacagta acttcagatc acttattgta taaggttgtc 420

agtggtctca taaagtatca gatgttcatt tgctattttc tttacattgc tggatttgtc 480

tggtttattt tgactctgaa gaaaaagaca tacaagtatc agttcaaaca atatgcctgg 540

acgcacatga tccttttaac ggtttttgca caatcttctt ttaccgtggc aaatatattt 600

gaagggatgt tctggtttct gttgcctgct tctctcattg tgattaacga cattgctgcc 660

tatctatttg ggttctttct tgggagaaca cctctgatca agttatctcc aaagaaaact 720

tgggaaggtt ttattggtgc atctgtgaca actatcatat ctgcttttgt gttagcaaat 780

gtaatgggcc gtttccaatg gttgacatgc ccaagaaaag acctgtcgac agggtggctt 840

cgttgtgacc ctggtcctat gtttaagcca gaacattatt ctttgggaga atgggtgcca 900

aaggggttcc cttggaagga agttgttctt ttgcctgtgc agtggcatgc tttagcacta 960

ggtttgtttg catcaataat agcacctttt ggaggtttct ttgcaagtgg cttcaagagg 1020

gcctttaaaa taaaggattt tggagacagc atacctgggc atggtgggat tactgaccga 1080

atggattgtc agatggttat ggcagttttt gcatacatat atcaccaatc attcatatcg 1140

ccccaaaact actctgttga gctaatcttg gaacagattc taagaaatct aacctttgag 1200

gagcagaaat tcttatatca gcagcttggg gaaatctacc gtgaaaggca attaatgcag 1260

agctga 1266

<210> 3

<211> 425

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Arg Asp Thr Ser Ser Ser Asp Val Ser Ala Ser His Val Gly

1 5 10 15

Arg Ala Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr Glu Ala Thr Ala Asp Gly Asn

20 25 30

Arg Thr Asn Gly Pro Ala Leu Leu Val Asn Asp Gln Asn Lys Tyr Lys

35 40 45

Ser Met Leu Ile Arg Thr Tyr Ser Thr Val Trp Met Ile Gly Gly Phe

50 55 60

Val Leu Ile Val Tyr Met Gly His Leu Tyr Ile Trp Ala Met Val Val

65 70 75 80

Val Ile Gln Ile Phe Met Ala Lys Glu Leu Phe Asn Leu Leu Arg Lys

85 90 95

Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu Pro Gly Phe Arg Leu Leu Asn Trp His

100 105 110

Phe Phe Phe Thr Ala Met Leu Phe Thr Tyr Gly Arg Phe Leu Ser Arg

115 120 125

Gln Leu Val Asn Thr Val Thr Ser Asp His Leu Leu Tyr Lys Val Val

130 135 140

Ser Gly Leu Ile Lys Tyr Gln Met Phe Ile Cys Tyr Phe Leu Tyr Ile

145 150 155 160

Ala Gly Phe Val Trp Phe Ile Leu Thr Leu Lys Lys Lys Thr Tyr Lys

165 170 175

Tyr Gln Phe Lys Gln Tyr Ala Trp Thr His Met Ile Leu Leu Thr Val

180 185 190

Phe Ala Gln Ser Ser Phe Thr Val Ala Asn Ile Phe Glu Gly Met Phe

195 200 205

Trp Phe Leu Leu Pro Ala Ser Leu Ile Val Ile Asn Asp Ile Ala Ala

210 215 220

Tyr Leu Phe Gly Phe Phe Leu Gly Arg Thr Pro Leu Ile Lys Leu Ser

225 230 235 240

Pro Lys Lys Thr Trp Glu Gly Phe Ile Gly Ala Ser Val Thr Thr Ile

245 250 255

Ile Ser Ala Phe Val Leu Ala Asn Val Met Gly Arg Phe Gln Trp Leu

260 265 270

Thr Cys Pro Arg Lys Asp Leu Ser Thr Gly Trp Leu Arg Cys Asp Pro

275 280 285

Gly Pro Met Phe Lys Pro Glu His Tyr Ser Leu Gly Glu Trp Val Pro

290 295 300

Lys Gly Phe Pro Trp Lys Glu Val Val Leu Leu Pro Val Gln Trp His

305 310 315 320

Ala Leu Ala Leu Gly Leu Phe Ala Ser Ile Ile Ala Pro Phe Gly Gly

325 330 335

Phe Phe Ala Ser Gly Phe Lys Arg Ala Phe Lys Ile Lys Asp Phe Gly

340 345 350

Asp Ser Ile Pro Gly His Gly Gly Ile Thr Asp Arg Met Asp Cys Gln

355 360 365

Met Val Met Ala Val Phe Ala Tyr Ile Tyr His Gln Ser Phe Ile Ser

370 375 380

Pro Gln Asn Tyr Ser Val Glu Leu Ile Leu Glu Gln Ile Leu Arg Asn

385 390 395 400

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405 410 415

Tyr Arg Glu Arg Gln Leu Met Gln Ser

420 425

<210> 4

<211> 1278

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggaaaggg acacaagctc tagtgatgtt tctgcttctc atgtaggacg tgccaggcag 60

cgaagacgtc ctactgaggc tactgcagat gggaatagaa ccaatggacc agctttgctt 120

gtcaatgatc agaataagta caagtcaatg cttatccgta catattctac agtatggatg 180

attggaggct ttgtgttgat agtttatatg ggtcacctct atatctgggc catggtggtt 240

gttattcaaa tattcatggc caaagagctt tttaacctac tcagaaaatc cagtgaagaa 300

aaacaactac caggtttcag gctactgaat tggcacttct ttttcacagc aatgttgttt 360

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tataaggttg tcagtggtct cataaagtat cagatgttca tttgctattt tctttacatt 480

gctggatttg tctggtttat tttgactctg aagaaaaaga catacaagta tcagttcaaa 540

caatatgcct ggacgcacat gatcctttta acggtttttg cacaatcttc ttttaccgtg 600

gcaaatatat ttgaagggat gttctggttt ctgttgcctg cttctctcat tgtgattaac 660

gacattgctg cctatctatt tgggttcttt cttgggagaa cacctctgat caagttatct 720

ccaaagaaaa cttgggaagg ttttattggt gcatctgtga caactatcat atctgctttt 780

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acagggtggc ttcgttgtga ccctggtcct atgtttaagc cagaacatta ttctttggga 900

gaatgggtgc caaaggggtt cccttggaag gaagttgttc ttttgcctgt gcagtggcat 960

gctttagcac taggtttgtt tgcatcaata atagcacctt ttggaggttt ctttgcaagt 1020

ggcttcaaga gggcctttaa aataaaggat tttggagaca gcatacctgg gcatggtggg 1080

attactgacc gaatggattg tcagatggtt atggcagttt ttgcatacat atatcaccaa 1140

tcattcatat cgccccaaaa ctactctgtt gagctaatct tggaacagat tctaagaaat 1200

ctaacctttg aggagcagaa attcttatat cagcagcttg gggaaatcta ccgtgaaagg 1260

caattaatgc agagctga 1278

<210> 5

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgggtctcag gcccttggcg atgcaccagc cggg 34

<210> 8

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcagggggcc atagatg 17

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctatatctgg gccatggtgg tt 22

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggtcacctct atatggttgt tattca 26

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcagggggcc atagatg 17

Claims

1. 一种突变蛋白，其为SEQ ID NO.1所示。

2. 编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因。

3.权利要求1所述的突变蛋白或权利要求2所述的基因在制备抗病水稻中的应用，其特征在于：将水稻中的编码SEQ ID NO.3所示蛋白的基因替换为编码SEQ ID NO.1所示蛋白的基因。

4. 权利要求1所述的突变蛋白或权利要求2所述的基因在制备抗病同时稳定产量的水稻中的应用，其特征在于：将水稻中的编码SEQ ID NO.3所示蛋白的基因替换为编码SEQ IDNO.1所示蛋白的基因。

5.根据权利要求3或4所述的应用，所述的抗病为抗稻瘟菌病，白叶枯菌和/或稻曲菌病。