CN115531521A - 细胞治疗剂及其制法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞治疗剂及其制法和用途。一方面，本发明的细胞组合物包含骨髓浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子、上清浓缩液和任选的赋形剂；其中，所述浓缩细胞与粒细胞巨噬细胞刺激因子、上清浓缩液的比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计4x10^6个细胞：10~15ng粒细胞巨噬细胞刺激因子：75~125µL上清浓缩液。还涉及所述细胞组合物的制备方法，以及这些细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰的药物中的用途。本发明包含包含骨髓浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子、上清浓缩液的组合治疗剂呈现优良的生物学效果。

Description

细胞治疗剂及其制法和用途
技术领域
本发明属于生物技术和生物医药领域，涉及使用细胞治疗剂治疗卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)的方法。
背景技术
卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)，是指由于卵巢功能衰竭，导致女性40岁之前闭经、***的现象。POF是一种以闭经、***、***缺乏、卵泡减少和***增高为特征的疾病，并伴有一系列低***症状如：潮热多汗、面部潮红、***低下等，严重影响女性的身心健康。此外，POF的女性，患骨质疏松症、心血管疾病和老年痴呆的风险增加。POF是导致女性***的重要原因之一。育龄女性POF的发病率约1-3%，且呈上升和年轻化趋势。
根据欧洲人类生殖与胚胎学学会的指南(ESHRE)，POF的诊断标准：少经或闭经至少4个月，间隔4周以上的两次FSH水平升高>40IU/L。卵巢早衰病因不明，可能与遗传和自身免疫性疾病、环境因素以及医源性和特发性情况有关，尚无有效的治疗方法。激素替代疗法(HRT)是POF最常见的治疗方法之一，但效果并不理想，而且已被证明会增加静脉血栓、乳腺癌和卵巢癌的风险。POF除了少经、闭经、***等症状，还可出现潮热、多汗、焦虑、抑郁、心悸、失眠等更年期症状，可能加快女性衰老，导致骨质疏松、心血管疾病、痴呆症等绝经后疾病，影响女性生活质量和寿命。
POF病因复杂，尚未完全阐明，可能与自身免疫应答、感染、遗传因素、化疗、放疗、手术等治疗效果及内分泌功能障碍有关，尚无有效的治疗方法。目前，POF的最常用的治疗方法是激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)。该疗法虽然对POF的临床症状具有一定的缓解作用，然而，HRT不能从根本上修复受损的卵巢，恢复卵巢功能。此外，研究表明，长期HRT治疗增加心脏病和中风的风险，可能会增加乳腺癌和卵巢癌的风险。因此，需要新的治疗策略来恢复POF患者的卵巢功能。
骨髓(bone marrow)是人体主要的造血器官，由造血细胞、脂肪组织和基质细胞组成。骨髓中的造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)，可以分化为血液循环中的红细胞、白细胞和血小板。骨髓中的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群，MSCs通过旁分泌多种生长因子，对HSCs起到支持的作用，维持骨髓造血微环境的稳定。
骨髓浓缩细胞(BMAC)是将骨髓经过离心、分离后获得的有核细胞的浓缩物。骨髓浓缩细胞(BMAC)中包含富集的造血干细胞(HSCs)和间充质干细胞(MSCs)，以及大量的多种细胞生长因子。HSCs可以分化为血液循环中的红细胞、白细胞和血小板。MSCs是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。BMAC中含有血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、***I(IGF-I)、骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-7)和白细胞介素(IL-1，IL-6，IL-8)等多种生长因子和细胞因子。
骨髓浓缩细胞具有抗炎、免疫调节特性、促血管生成、促进组织再生修复等作用。临床前和初步临床研究证实，BMAC通过改善卵巢微环境，促进血管生成，促进卵泡发育，增加窦状卵泡数量，促进***，从而改善卵巢功能，是治疗POF患者潜在的治疗方法。
然而，骨髓穿刺液在传统上采用手工操作方式以密度梯度离心法进行分离，存在操作复杂、耗时长、易污染、结果重复性差等非常棘手的问题。本领域技术人员期待有一种操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好等一个或者多个方面有益效果的处理骨髓穿刺液以获得骨髓浓缩物即骨髓浓缩细胞的方法。此一技术进步已在本研究团队的中国专利申请号2021116067849中得以实现。
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)主要由T细胞和巨噬细胞产生，能够诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体细胞呈集落生长，故简称为粒-巨细胞集落刺激因子。GM-CSF在体内的主要生物学作用是维持粒细胞系和单核细胞系细胞的存活、促进生长、诱导分化和增强吞噬功能和杀菌作用；诱导树突状细胞成熟和功能分布。临床上使用的粒细胞巨噬细胞刺激因子通常为重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子，其通常适用于癌症化疗和在用骨髓抑制疗法时所引起的白细胞减少症，亦适用于治疗骨髓衰竭患者的白细胞低下，也可预防白细胞减少时可能潜在的感染并发症，还能使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快。
现有的治疗卵巢早衰的方法仍然有待改进。因此，本领域技术人员还期待提供一种治疗卵巢早衰的方法例如使用骨髓浓缩细胞治疗剂治疗卵巢早衰的方法，例如期待提供一种使用骨髓浓缩细胞和GM-CSF的组合治疗剂来治疗卵巢早衰的方法，该种方法的该组合治疗剂中还可以进一步包含制备浓缩细胞所得旁产物上清浓缩液。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种制备骨髓浓缩细胞的方法，期待该种方法具有操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好等一个或者多个方面的有益效果；或者，本发明的一个目的在于提供一种新的治疗卵巢早衰的方法，该新的方法通过使骨髓浓缩细胞和GM-CSF配制成组合治疗剂得以实现。已经出人意料地发现，本发明通过使用封闭式的PXP细胞自动分离***制备骨髓浓缩细胞，和/或通过使获得的骨髓浓缩细胞与GM-CSF配制成组合治疗剂来治疗卵巢早衰，该组合治疗剂中还可以进一步包含制备浓缩细胞所得旁产物上清浓缩液，能够实现上述一个或者多个目的，本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种制备骨髓浓缩细胞的方法，其包括如下步骤：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
(2)取下细胞自动分离***的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离***是封闭式的PXP分离***，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理***；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞；
任选的
(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据；
和/或任选的，继续如下步骤以制备(血浆)上清浓缩液：
(7)用注射器分取中央舱室内的上清液(即血浆层)，2000g离心20min除去细胞碎片，再经0.22μm无菌滤膜过滤；
(8)用超纯水冲洗切向流超滤***(仕必纯KR2i型切向流超滤***)的管路，安装100kD 100cm2的MidiKros过滤器，对步骤(7)所得滤液超滤浓缩至初始生物样本量的1/15体积，得到上清浓缩液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20~200ml。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得。
根据本发明第一方面的方法，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据。
进一步的，本发明第二方面提供了一种骨髓浓缩细胞，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
(2)取下细胞自动分离***的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离***是封闭式的PXP分离***，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理***；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞；
任选的
(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据；
和/或任选的，继续如下步骤以制备(血浆)上清浓缩液：
(7)用注射器分取中央舱室内的上清液(即血浆层)，2000g离心20min除去细胞碎片，再经0.22μm无菌滤膜过滤；
(8)用超纯水冲洗切向流超滤***(仕必纯KR2i型切向流超滤***)的管路，安装100kD 100cm2的MidiKros过滤器，对步骤(7)所得滤液超滤浓缩至初始生物样本量的1/15体积，得到上清浓缩液。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20~200ml。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据。
进一步的，本发明第三方面提供了骨髓浓缩细胞在制备用于治疗卵巢早衰的细胞治疗剂中的用途，所述骨髓浓缩细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
(2)取下细胞自动分离***的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离***是封闭式的PXP分离***，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理***；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞；
任选的
(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据；
和/或任选的，继续如下步骤以制备(血浆)上清浓缩液：
(7)用注射器分取中央舱室内的上清液(即血浆层)，2000g离心20min除去细胞碎片，再经0.22μm无菌滤膜过滤；
(8)用超纯水冲洗切向流超滤***(仕必纯KR2i型切向流超滤***)的管路，安装100kD 100cm2的MidiKros过滤器，对步骤(7)所得滤液超滤浓缩至初始生物样本量的1/15体积，得到上清浓缩液。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20~200ml。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得。
根据本发明第三方面的用途，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据。
进一步的，本发明第四方面提供了治疗卵巢早衰的方法，该方法包括给予有需要的受试者施用包含治疗有效量的骨髓浓缩细胞的细胞治疗剂，所述骨髓浓缩细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
(2)取下细胞自动分离***的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离***是封闭式的PXP分离***，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理***；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞；
任选的
(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据；
和/或任选的，继续如下步骤以制备(血浆)上清浓缩液：
(7)用注射器分取中央舱室内的上清液(即血浆层)，2000g离心20min除去细胞碎片，再经0.22μm无菌滤膜过滤；
(8)用超纯水冲洗切向流超滤***(仕必纯KR2i型切向流超滤***)的管路，安装100kD 100cm2的MidiKros过滤器，对步骤(7)所得滤液超滤浓缩至初始生物样本量的1/15体积，得到上清浓缩液。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20~200ml。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得。
根据本发明第四方面的方法，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据。
进一步的，本发明第五方面提供了一种由骨髓浓缩细胞制成的细胞组合物，其包含浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子和任选的赋形剂。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中所述浓缩细胞与粒细胞巨噬细胞刺激因子的比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计5x10^6个细胞：10~15ng粒细胞巨噬细胞刺激因子；例如比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计5x10^6个细胞：12.5ng粒细胞巨噬细胞刺激因子。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中所述赋形剂为生理盐水或5%葡萄糖溶液。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中所述赋形剂为生理盐水，粒细胞巨噬细胞刺激因子在组合物中的浓度为10~15ng/ml，例如为12.5ng/ml。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中所述粒细胞巨噬细胞刺激因子是人粒细胞巨噬细胞刺激因子。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中所述粒细胞巨噬细胞刺激因子是重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中所述浓缩细胞如本发明第二方面任一实施方案所述。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和***钠。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和***钠，粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和***钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.1~0.5mg：5~20µg。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和***钠，粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和***钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.2~0.3mg：10~15µg。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和***钠，粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和***钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.2mg：15µg。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数4~6x10^6的浓缩细胞、10~15ng的gmCSF、0.1~0.5mg谷氨酰胺、5~20µg***钠、生理盐水适量至1mL。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数4~6x10^6的浓缩细胞、10~15ng的gmCSF、0.2~0.3mg谷氨酰胺、10~15µg***钠、生理盐水适量至1mL。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数5x10^6的浓缩细胞、12.5ng的gmCSF、0.2~0.3mg谷氨酰胺、10~15µg***钠、生理盐水适量至1mL。
根据本发明第五方面的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数5x10^6的浓缩细胞、12.5ng的gmCSF、0.2mg谷氨酰胺、15µg***钠、生理盐水适量至1mL。
进一步的，本发明第六方面提供了一种由骨髓浓缩细胞制成的细胞组合物，其包含浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子、上清浓缩液和任选的赋形剂。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其中所述浓缩细胞与粒细胞巨噬细胞刺激因子的比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计4x10^6个细胞：10~15ng粒细胞巨噬细胞刺激因子；例如比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计4x10^6个细胞：12.5ng粒细胞巨噬细胞刺激因子。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其中所述浓缩细胞与上清浓缩液的比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计4x10^6个细胞：75~125µL上清浓缩液；例如比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计4x10^6个细胞：100µL上清浓缩液。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其中所述赋形剂为生理盐水或5%葡萄糖溶液。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其中所述赋形剂为生理盐水，粒细胞巨噬细胞刺激因子在组合物中的浓度为10~15ng/ml，例如为12.5ng/ml。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其中所述粒细胞巨噬细胞刺激因子是人粒细胞巨噬细胞刺激因子。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其中所述粒细胞巨噬细胞刺激因子是重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其中所述浓缩细胞和上清浓缩液是如本发明第一方面任一实施方案所述方法制备得到的。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和***钠。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和***钠，粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和***钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.1~0.5mg：5~20µg。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和***钠，粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和***钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.2~0.3mg：10~15µg。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和***钠，粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和***钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.2mg：15µg。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数3~5x10^6的浓缩细胞、10~15ng的gmCSF、75~125µL上清浓缩液、0.1~0.5mg谷氨酰胺、5~20µg***钠、生理盐水适量至1mL。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数3~5x10^6的浓缩细胞、10~15ng的gmCSF、80~120µL上清浓缩液、0.2~0.3mg谷氨酰胺、10~15µg***钠、生理盐水适量至1mL。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数4x10^6的浓缩细胞、12.5ng的gmCSF、100µL上清浓缩液、0.2~0.3mg谷氨酰胺、10~15µg***钠、生理盐水适量至1mL。
根据本发明第六方面的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数4x10^6的浓缩细胞、12.5ng的gmCSF、100µL上清浓缩液、0.2mg谷氨酰胺、15µg***钠、生理盐水适量至1mL。
本发明在使用PXP***制备浓缩细胞后，分离出来的上清液即血浆部分再通过切向流超滤***处理可获得上清浓缩液，将此上清浓缩液与浓缩细胞、gmCSF组合制成的细胞组合物具有优良的治疗卵巢早衰的效果，例如使用较低剂量的浓缩细胞达到期望的效果，这一出人意料的发现是现有技术不可预期的。
进一步的，本发明第七方面提供了本发明第五方面或者第六方面任一项所述细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰的药物中的用途。
进一步的，本发明第八方面提供了制备本发明第六方面任一项所述细胞组合物的方法，其包括使规定量的浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子、上清浓缩液、谷氨酰胺、***钠、和任选的赋形剂混合配制成无菌制剂的步骤。
本文所述的短语“CD45+细胞数5x10^6的浓缩细胞”中的5x10^6是指5乘以10的6次方，其余类似表述亦具有相同含义。
本发明使用PXP自动化细胞快速处理***，应用自动分离和浓缩的封闭式***，安全、高效、简捷获得BMAC的方法，为BMAC用于治疗POF患者的临床应用奠定了基础。本发明提供的快速分离获得骨髓浓缩细胞的方法，该方法将取自人的骨髓穿刺液，使用封闭式自动化细胞分离***，分离获得骨髓浓缩细胞。本发明获得的骨髓浓缩细胞作为治疗卵巢损伤的活性成分，能够促进血管生成、卵泡发育，从而改善卵巢功能。
现有的研究业已证实，污染性红细胞与干细胞/祖细胞功能的下降有关，红细胞污染细胞浓缩物被认为会降低细胞治疗的效果。为了更好地发挥细胞治疗的潜力，行业迫切需要能提高靶细胞纯度和污染性红细胞去除率的新处理***。
本发明具体实验中使用的细胞分离***为PXP®自动分离***，其生产商为美国ThermoGenesis公司。创新的PXP***解决了当前市场上现有***的许多缺陷。PXP***使临床医生能够在几乎没有红细胞污染的情况下，通常少于起始样本的5%，迅速获得很高的干细胞和祖细胞回收率。
PXP***针对开发和使用细胞治疗技术的临床机构在手术室环境下快速、高效、无菌的细胞处理需求，是一种相当高效的手术室即时***(Point-of-Care)产品。作为前沿的自动化细胞快速处理***，PXP***不需要细胞分离介质或沉淀剂，可以同时处理多个样本，MNC和CD34+、CD45+细胞回收率高，能够让临床医生在医院外科中心或者诊所实现30分钟之内从生物样品(例如骨髓)中高效提取干细胞，并且红细胞的去除率超过90%。此外，该PXP***还配备了专利的DataTrak软件来追踪捕获数据，以方便为客户提供GMP流程控制和报告信息。
本发明将PXP***用于处理骨髓提取物，能够实时快速自动化处理骨髓细胞，确保单个核细胞(MNC)的回收率，能够同时处理多个骨髓单元，并且不需要细胞分离介质或沉淀剂。
本发明PXP***用于具体试验，其优点包括但不限于：稳定优异的MNC(单核细胞)和CD34+、CD45+细胞回收率、30分钟内快速处理骨髓样本、95%以上的红细胞去除率、自动化封闭式无菌***、快速准确的数据追踪和文档记录、样本处理数据可以通过DataTrak软件上传到计算机，提供符合GMP要求的生产记录和报告信息。
骨髓浓缩物因富含大量的干细胞和生长因子而被广泛应用于骨科、重症下肢缺血等相关学科的临床中。骨髓浓缩物是将骨髓经过离心、分离后获得的有核细胞的浓缩物，其内富含间充质干细胞。众所周知，全球骨髓浓缩物市场应用领域可分为骨外科、伤口愈合、慢性疼痛、周围性血管疾病、皮肤病变及其他。由于全球老龄化的加剧以及骨关节炎发病率的上升，未来骨科疾病的应用将主导整个骨髓浓缩物市场。随着行业的蓬勃发展、技术的进步以及可支配收入的增加，未来皮肤病学领域预计将以最高的复合年增长率增长(6.0%)。人皮肤中的成纤维细胞和角化细胞的再生能力已经被用来开发细胞疗法，同时科学家们正在研究骨髓源性皮外细胞在皮肤再生中的可塑性，这些都将加速细胞疗法在皮肤病学领域的应用。骨髓浓缩物被认为是骨替代材料的“铂金标准”。研究发现，骨髓浓缩物中的细胞、前体细胞、生长因子、血小板等对骨再生发挥重要的作用。例如骨髓浓缩物中的内皮细胞在血管再生中扮演重要的角色；骨髓浓缩物中含有的大量生长因子能作用于成骨细胞和破骨细胞，调节骨改建过程，促进新骨生成；骨髓浓缩物中的血小板能为间充质干细胞提供更快更有效的骨再生环境。
根据***和世界卫生组织的调查结果，全球超过4亿人患有关节炎，如此庞大的患者群体背景推动着骨科领域的发展。骨髓来源干细胞治疗被认为是一种有前途的先进疗法，可以将骨科疾病的伤口愈合时间从手术治疗所需的4到6个月缩短到5到6周。愈合时间的缩短是推动骨髓浓缩物市场发展的因素之一。近年来，骨髓浓缩物处理及制备技术的进步为医院及诊所提高骨科治疗临床效果提供了有效选择。
骨髓浓缩物市场是一个新兴市场，经过30年至40年的研究与发展，各种干细胞治疗及相关技术设备渐渐走向商业化。骨髓浓缩物、富血小板血浆及干细胞衍生物的出现，正在成为未来医疗的新趋势。随着个性化医学的发展，全球对细胞治疗的临床需要越来越显著，细胞治疗临床应用的放开趋势也愈加明显。随着细胞治疗临床应用的逐渐覆盖，医疗机构对基于自动化技术的新一代细胞处理及制备解决方案的需求会日益剧增，而这些技术平台也将对细胞疗法走向成功产生重要的影响。
本发明通过使用PXP***进行细胞分离获得了令人满意的效果。
GM-CSF可以是人粒细胞巨噬细胞刺激因子，亦可以是重组粒细胞巨噬细胞刺激因子，其已载入多个版本的中国药典并有诸多品牌的产品被批准用于临床。在本发明中，若未另外说明，试验所用GM-CSF是市售注射用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(S19991012，规格750000IU/75μg，10IU/ng)的产品，配制组合物时若有必要可以预先用0.9%氯化钠注射液稀释至适宜浓度。GM-CSF (Granulocyte- macrophage Colony Stimulating Factor，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，或粒细胞巨噬细胞刺激因子)，其作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。GM-CSF是临床上用于各种原因引起的白细胞或粒细胞减少症的药物，其能兴奋骨髓的造血功能、刺激粒细胞、单核细胞、T细胞的增殖，并能促进单核细胞和粒细胞的成熟。此外，GM-CSF还能克服放疗和化疗引起的骨髓毒性，缩短肿瘤化疗时中性粒细胞减少时间，使患者易于耐受化疗。GM-CSF能够通过增强单核细胞、粒细胞、嗜酸性细胞和巨噬细胞功能，进而提高机体抗肿瘤及抗感染免疫力。
本发明通过使经PXP***分离获得的骨髓浓缩细胞与GM-CSF组合，使用卵巢早衰模型进行验证，获得了积极的效果。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
在本发明中，如未另外说明，具体实验中使用的细胞分离***为PXP®自动分离***，其在本发明中亦可简称为PXP***、PXP细胞自动分离***、PXP自动分离***、PXP分离***等。实验中使用的该PXP***的型号为80065-01，供应商为深圳博雅感知医疗科技有限公司，生产商为美国ThermoGenesis公司。在本发明中，术语“骨髓浓缩细胞”亦可称为“骨髓浓缩细胞制剂”，如无特别的语境，二者具有相同含义。
实施例1：快速分离制备骨髓浓缩细胞(BMAC)
(1)提供生物样本骨髓穿刺液(可以处理20~200ml体积的样本)，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用，另抽取1ml样本以备检测；所述抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱，抗凝剂与生物样本的体积比为1：12；抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得；
(2)取下细胞自动分离***的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离***是封闭式的PXP分离***，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理***；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞；
(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据。
继续以下步骤以制备(血浆)上清浓缩液：
(7)用注射器分取中央舱室内的上清液(即血浆层)，2000g离心20min除去细胞碎片，再经0.22μm无菌滤膜过滤；
(8)用超纯水冲洗切向流超滤***(仕必纯KR2i型切向流超滤***)的管路，安装100kD 100cm2的MidiKros过滤器，对步骤(7)所得滤液超滤浓缩至初始生物样本量的1/15体积，得到上清浓缩液。
在本发明中，如未另外说明，所用切向流超滤***是仕必纯KR2i型切向流超滤***；当然其它品牌的切向流超滤***亦是可以使用的。
本实施例1对收集的10份生物样本人骨髓穿刺液(通过本领域公知的方法获取，例如本发明的生物样本是照宋建华文献(宋建华，等，自体骨髓浓缩干细胞治疗股骨颈骨析,实用骨科杂志，2008,14(8):467)所载方法获得的)进行细胞分离和上清浓缩液的制备，获得10份骨髓浓缩细胞(BMAC)和10份上清浓缩液，均分别标记为No.1~ No.10。
试验例1：分析骨髓穿刺液(BMA)和骨髓浓缩细胞(BMAC)中MNC回收率
使用实施例1的方法，对收集的10份人骨髓穿刺液(分离前体积在79~97ml范围内)进行细胞分离；接着，参考中国专利申请号2021116067849记载的方法，对各分离级分进行细胞检测，10份样品的结果：输入骨髓穿刺液均值为88.26ml、输出BMAC均值为12.74ml、红细胞(RBC)去除率均值为97.9%、单个核细胞(MNC)回收率均值为97.2%、MNC浓度平均提升6.93倍。例如某一份穿刺液(No.2)的结果：分离前体积=91.34ml、终体积=12.97ml、红细胞去除率=98.3%、MNC回收率=97.6%、MNC浓缩倍数=7.04。
结果表明，使用PXP动分离***能够以操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好的方式富集骨髓中的MNC，同时去除大部分红细胞。
试验例2：BMA和BMAC样本中的细胞活率
针对试验例1涉及的10个样本进行考察。细胞活率是表示细胞是否具有生物学功能的最直观的指标。骨髓样本采集24-36小时内(T<36小时)，使用FC500流式细胞仪，应用7-AAD染色法，分析BMA、BMAC中的细胞活率。
PXP处理前的10份骨髓穿刺液样本(BMA)细胞活率=88.17±3.14%、PXP处理后的10份骨髓浓缩细胞样本(BMAC)细胞活率=97.42±1.24%，例如某一份穿刺液样本(No.2)的结果：BMA细胞活率=89.64%、BMAC细胞活率=98.27%。显示BMAC样本中的细胞活率显著高于BMA细胞活率。
试验例3：BMA和BMAC样本中CD45+、CD34+细胞计数
针对试验例1涉及的10个样本进行考察。在FC500流式细胞仪上，应用7-AAD染色法，对所有处理前、处理后的骨髓样本中的CD45+和CD34+细胞数量进行了分析，结果：
CD45+活细胞数量方面，骨髓穿刺液样本(BMA)=(15.08±2.84) x10^6/mL、骨髓浓缩细胞样本(BMAC)=(106.41±6.94) x10^6/mL，增加7.1倍；
CD34+活细胞数量方面，骨髓穿刺液样本(BMA)=(127.42±10.36) x10^3/mL、骨髓浓缩细胞样本(BMAC)=(882.63±16.41) x10^3/mL，增加6.9倍。
试验例4：骨髓样本无菌检测
针对试验例1涉及的10个细胞浓缩液样本和10个上清浓缩液样本进行考察。使用革兰氏染色法进行无菌检测，制备BMA、BMAC样本的涂片，用甲醇固定，染色后测试，结果：10个BMA样本的革兰氏染色分析样本涂片均未见微生物，10个BMAC样本的革兰氏染色分析样本涂片均未见微生物，10个上清浓缩液样本的革兰氏染色分析样本涂片均未见微生物。
本发明使用PXP***制备BMAC的过程具有快速、封闭、全程无菌的特点。
试验例5：细胞水平有效性研究
本发明使用PXP***制备的BMAC是一种细胞制剂的注射液，其中含有多种干细胞成分，包括造血干细胞(HSCs)，间充质干细胞(MSCs)，内皮祖细胞(EPCs)，以及多种细胞因子，如血管内皮生长因子(VEGF)，基质细胞衍生因子(SDF-1)，内皮抑素(Entostatin)等，促进新血管生成和内皮细胞迁移。
本试验例针对试验例1涉及的10个样本进行考察，通过CFU集落形成能力评价BMAC的干细胞生物学效力，ELISA定量检测BMAC中富含的细胞因子。
5.1、干细胞生物学效力—CFU集落形成实验
骨髓干细胞生物学效力(Potency Assays)，通过体外CFU集落形成实验，鉴定分析祖/干细胞的集落形成能力，表征BMAC混合细胞中的细胞干性。采用CFU-H(造血祖/干细胞)，CFU-F(基质祖细胞)对BMA和BMAC样本中多种干细胞的效能进行了分析，结果：
CFU-H(造血祖/干细胞)方面，骨髓穿刺液样本(BMA)=(34.3±4.1) x10^3/mL、骨髓浓缩细胞样本(BMAC)=(213.6±19.3) x10^3/mL，增加6.2倍；
CFU-F(基质祖细胞)方面，骨髓穿刺液样本(BMA)=(41.7±5.3) x10^3/mL、骨髓浓缩细胞样本(BMAC)=(302.4±28.1) x10^3/mL，增加7.3倍。
结果表明，PXP***能够有效地富集骨髓干细胞，同时维持骨髓干细胞的生物学效力。
5.2、细胞因子定量分析
PXP***制备的BMAC注射液中含有多种细胞因子。酶联免疫吸附实验(ELISA)定量检测分析BMA和BMAC样品中，转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)水平，结果：
BMA和BMAC的TGF-β分别为34.1±3.1pg/ml和218.3± 17.2pg/ml，
BMA和BMAC的VEGF分别为17.4±2.6pg/ml和151.6± 13.4pg/ml，
BMA和BMAC的HGF分别为194.3±24.2pg/ml和1312.4± 44.7pg/ml。
结果显示，BMAC中的TGF-β、VEGF和HGF，显著高于BMA中的TGF-β、VEGF和HGF水平(p<0.01)，表明PXP***能够有效地浓缩富集细胞生长因子。
试验例6：BMAC治疗卵巢早衰(POF)的有效性
中国专利申请号2021116067849中使用BMAC浓缩液进行了治疗卵巢早衰(POF)的有效性研究。本试验例使用上文制备的BMAC浓缩液配合GM-CSF(本文亦记作gmCSF)进行POF的有效性研究。
(1)建立POF小鼠模型
给8周龄雌性C57BL/6小鼠腹腔注射50mg/kg/day环磷酰胺(CTX)，连续腹腔注射15d，每天同一时间注射，建立卵巢早衰(POF)小鼠模型。对照组不做任何处理。POF造模完成后进行BMAC细胞移植治疗，模型动物随机分组。
(2)通过激素水平、卵泡数和生育测试等指标来评估卵巢的储备功能。
A.激素水平
动物分组：
对照组(n=20)、
POF模型组(n=20)、
BMAC治疗组(n=20)、
BMAC+gmCSF治疗组(n=20)、
BMAC+上清浓缩液+gmCSF治疗组(n=20)。
BMAC治疗组小鼠，分别于POF建模后第1天，每只动物尾静脉注射给予BMAC浓缩细胞组合物200µl(该200µl的BMAC浓缩细胞组合物为实施例1涉及的No.2号浓缩液样本，用无菌生理盐水稀释制成以CD45+细胞计浓度为4x10^6细胞/200µl的溶液)；
BMAC+gmCSF治疗组小鼠，分别于POF建模后第1天，每只动物尾静脉注射给予BMAC浓缩液gmCSF组合物200µl；
BMAC+上清浓缩液+gmCSF治疗组小鼠，分别于POF建模后第1天，每只动物尾静脉注射给予BMAC+上清浓缩液+gmCSF组合物200µl；
POF模型组注射等体积生理盐水；对照组不作注射处理；
细胞移植后各组同等正常给予饮食和饮水。
注：以上BMAC+gmCSF治疗组给予的BMAC浓缩液gmCSF组合物(其可简称为BMAC-gmCSF组合物)，其每200µL中包含：实施例1所得No.2号浓缩液样本适量以CD45+细胞数计为1x10^6、2.5ng的gmCSF、无菌生理盐水定容，即得组合物；
以上BMAC+上清浓缩液+gmCSF治疗组给予的BMAC+上清浓缩液+gmCSF组合物，其每200µL中包含：实施例1所得No.2号浓缩液样本适量以CD45+细胞数计为0.8x10^6、2.5ng的gmCSF、实施例1所得No.2号上清浓缩液20µL、无菌生理盐水定容，即得组合物；
上述组合物在配制后2~4°C温度条件下保存并在4小时内完成注射给药，gmCSF为市售冻干粉针剂。
经BMAC移植后14天和28天，每组分别取10只小鼠，眼眶采血，分离血清，-20℃保存。酶联免疫吸附试验(ELISA)分析***(E2)、促卵泡素(FSH)的水平(具体方法参考相丽论文(相丽，等，人胎盘间充质干细胞移植通过降低超氧化物歧化酶1和解耦联蛋白-2的表达提高卵巢功能，中华生殖与避孕杂志，2018年02期)方法进行)，结果见下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
结果显示：与POF模型组相比，BMAC组小鼠血清中E2水平在28d升高，FSH水平下降，均具有显著性差异(P<0.05)；另外，已经发现，通过与GM-CSF和/或上清浓缩液组合使用，可以显著地减少BMAC的用量并且可以获得基本相同的效果。
B.小鼠卵巢组织的卵泡计数
BMAC移植后28天，每组分别取10只小鼠，处死，取小鼠左侧卵巢组织于4%多聚甲醛固定，将固定后的组织进行系列酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，切片厚度5um，进行HE染色，显微镜下观察。
结果显示：相比于对照组，POF模型组小鼠初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量明显减少，闭锁卵泡数量明显增加；BMAC治疗后28天，各级卵泡数均有不同程度的恢复，颗粒细胞生长增加，凋亡减少，卵巢上皮细胞形态稳定，初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量明显增加，闭锁卵泡数量明显减少。BMAC移植后28天各级卵泡计数，与POF组比较有显著差异，具体结果见下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE010
C.小鼠生育能力观察
在BMAC移植后第28天，将雌雄小鼠按2：1比例合笼饲养，统计小鼠的生育率，并对小鼠的产仔数进行比较，观察BMAC移植对小鼠卵巢功能的修复作用，结果显示BMAC组与POF组比较有显著差异。小鼠产仔数比较结果如下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE012
根据上文结果可见，BMAC移植治疗可明显改善POF小鼠受损卵巢的储备功能，卵泡数增加，雌孕激素升高，小鼠生育力得到恢复，为BMAC应用于POF的临床治疗提供了实验依据。
试验例7：BMAC-gmCSF组合物
以上试验例6所用BMAC-gmCSF组合物在配制后尽快完成注射给药，本发明人发现，该呈液体状态的组合物在4°C条件下放置12小时和24小时后，GM-CSF的生物学活性呈现下降的趋势，并且通过向该液体组合物中添加微量谷氨酰胺和***钠能够显著缓解这种生物学活性下降的趋势，具体试验如下。
配方a：使用实施例1所得No.1~No.5的5种BMAC，照如下配方制成5种呈液体状态的组合物分别记为组合物aNo.1~组合物aNo.5：包含CD45+细胞数5x10^6的BMAC、12.5ng(即125IU)的gmCSF、无菌生理盐水适量至1mL；
配方a1：使用实施例1所得No.1~No.5的5种BMAC和5种上清浓缩液，照如下配方制成5种呈液体状态的组合物分别记为组合物a1No.1~组合物a1No.5：包含CD45+细胞数4x10^6的BMAC、12.5ng(即125IU)的gmCSF、上清浓缩液100µL、无菌生理盐水适量至1mL；
配方b：照上述配方a但不添加BMAC，制成呈液体状态的组合物，记为组合物b；
配方b1：照上述配方a1使用No.1上清浓缩液但不添加BMAC，制成呈液体状态的组合物，记为组合物b1；
配方c：使用实施例1所得No.1~No.5的5种BMAC，照上述配方a但还添加谷氨酰胺(至终浓度0.2mg/ml)和***钠(至终浓度15µg/ml)，制成5种呈液体状态的组合物，分别记为组合物cNo.1~组合物cNo.5；
配方c1：使用实施例1所得No.1~No.5的5种BMAC和5种上清浓缩液，照上述配方a1但还添加谷氨酰胺(至终浓度0.2mg/ml)和***钠(至终浓度15µg/ml)，制成5种呈液体状态的组合物，分别记为组合物c1No.1~组合物c1No.5；
配方d：使用实施例1所得No.1~No.5的5种BMAC，照上述配方a但还添加谷氨酰胺(至终浓度0.2mg/ml)，制成5种呈液体状态的组合物，分别记为组合物dNo.1~组合物dNo.5；
配方d1：使用实施例1所得No.1~No.5的5种BMAC和5种上清浓缩液，照上述配方a1但还添加谷氨酰胺(至终浓度0.2mg/ml)，制成5种呈液体状态的组合物，分别记为组合物d1No.1~组合物d1No.5；配方e：使用实施例1所得No.1~No.5的5种BMAC，照上述配方a但还添加***钠(至终浓度15µg/ml)，制成5种呈液体状态的组合物，分别记为组合物eNo.1~组合物eNo.5；
配方e1：使用实施例1所得No.1~No.5的5种BMAC和5种上清浓缩液，照上述配方a1但还添加***钠(至终浓度15µg/ml)，制成5种呈液体状态的组合物，分别记为组合物e1No.1~组合物e1No.5。
上述各种组合物的配制方法为本领域技术人员熟知的常规方法，例如，在无菌操作条件下，将规定量冻干粉状态的gmCSF及任选的谷氨酰胺和任选的***钠用无菌生理盐水定量溶解至规定体积，另外将BMAC用无菌生理盐水稀释至以CD45+细胞计的适宜浓度，按配方比例将两种溶液用无菌生理盐水稀释至规定浓度，用玻璃瓶分装，即得。
将上述10种配方的各组合物置4°C条件下放置，分别于0h、12h、24h取样，照中国药典2015年版四部附录之“3526 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法”，测定各组合物在规定时间的生物学活性(IU/ml)；对于某一组合物，以其12h或24h的生物学活性除以0h的生物学活性再乘以100%所得百分数，即为该组合物在该时间点gmCSF生物学活性的残余百分数。
结果：
配方a至配方e以及配方a1至配方e1的全部组合物在0h的生物学活性均在121.3~129.6IU/ml范围内例如组合物aNo.1在0h的生物学活性为126.4IU/ml；
配方b和配方b1组合物12h残余百分数分别为97.4%和96.8%，
配方c和配方c1的全部组合物12h残余百分数均在97~102%范围内例如组合物cNo.1之12h残余百分数为98.6%，
配方a和配方a1、配方d和配方d1、配方e和配方e1的全部组合物12h残余百分数均在81~88%范围内例如组合物aNo.1在12h的残余百分数为85.3%；
配方b和配方b1组合物24h残余百分数分别为94.7%和95.4%，
配方c和配方c1的全部组合物24h残余百分数均在91~95%范围内例如组合物cNo.1之24h残余百分数为93.6%，
配方a和配方a1、配方d和配方d1、配方e和配方e1的全部组合物24h残余百分数均在64~73%范围内例如组合物aNo.1在24h的残余百分数为70.4%。
这些结果表明，包含有细胞的组合中gmCSF生物学活性下降较快，当向该种组合物中添加微量谷氨酰胺和***钠后可以显著克服这种生物学活性下降的现象。
另外，照上文试验例3方法测定CD45+活细胞数量，结果：
配方a和配方c、配方d、配方e的全部组合物在0h的CD45+活细胞数量均在472~524x10^4/ml范围内例如组合物aNo.1在0h的CD45+活细胞数量为511.7 x10^4/ml，
配方a1和配方c1、配方d1、配方e1的全部组合物在0h的CD45+活细胞数量均在387~416 x10^4/ml范围内例如组合物a1No.1在0h的CD45+活细胞数量为394.5 x10^4/ml，
配方a和配方c、配方d、配方e的全部组合物在24h的CD45+活细胞数量均在144~212x10^4/ml范围内例如组合物aNo.1在24h的CD45+活细胞数量为196.7 x10^4/ml；
配方a1和配方c1、配方d1、配方e1的全部组合物在24h的CD45+活细胞数量均在121~158 x10^4/ml范围内例如组合物a1No.1在24h的CD45+活细胞数量为142.2 x10^4/ml。
这些结果表明，各组合物在不同时间点的CD45+活细胞数量无明显差异，进而可以预期谷氨酰胺和***钠不会影响细胞的生物学活性。因此，尽管配方a的BMAC+gmCSF组合物以及配方a1的BMAC+上清浓缩液+gmCSF组合物能够呈现优良的治疗卵巢早衰的生物学效果，然而当增补添加少量谷氨酰胺和***钠后能够显著改善组合物中gmCSF生物学活性的稳定性，并且组合物中的活细胞无明显差异，这种gmCSF生物学活性稳定性的改善对于治疗应用来讲将是极其有意义的。
另外，由于gmCSF廉价易得，通过与可获得性差的BMAC组合可以显著降低细胞的用量但仍然能够获得优良的治疗卵巢早衰的生物学效果。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (10)

1.一种细胞组合物，其包含骨髓浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子、上清浓缩液、谷氨酰胺、***钠和任选的赋形剂；其中，
所述浓缩细胞与粒细胞巨噬细胞刺激因子的比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计4x10^6个细胞：10~15ng粒细胞巨噬细胞刺激因子；
所述浓缩细胞与上清浓缩液的比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计4x10^6个细胞：75~125µL上清浓缩液；
所述粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和***钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.1~0.5mg：5~20µg；
所述骨髓浓缩细胞和上清浓缩液是由包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
(2)取下细胞自动分离***的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离***是封闭式的PXP分离***，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理***；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞；
(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据；
(7)用注射器分取中央舱室内的上清液即血浆层，2000g离心20min除去细胞碎片，再经0.22μm无菌滤膜过滤；
(8)用超纯水冲洗切向流超滤***的管路，安装100kD 100cm2的MidiKros过滤器，对步骤(7)所得滤液超滤浓缩至初始生物样本量的1/15体积，得到上清浓缩液。
2.根据权利要求1所述的细胞组合物，其中所述浓缩细胞与粒细胞巨噬细胞刺激因子的比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计4x10^6个细胞：12.5ng粒细胞巨噬细胞刺激因子；所述浓缩细胞与上清浓缩液的比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计4x10^6个细胞：100µL上清浓缩液；和/或，粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和***钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.2~0.3mg：10~15µg。
3.根据权利要求1所述的细胞组合物，所述赋形剂为生理盐水或5%葡萄糖溶液，粒细胞巨噬细胞刺激因子在组合物中的浓度为10~15ng/ml。
4.根据权利要求1所述的细胞组合物，所述粒细胞巨噬细胞刺激因子是人粒细胞巨噬细胞刺激因子。
5.根据权利要求1所述的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数3~5x10^6的浓缩细胞、10~15ng的粒细胞巨噬细胞刺激因子、75~125µL上清浓缩液、0.1~0.5mg谷氨酰胺、5~20µg***钠、生理盐水适量至1mL；或者，其包含：CD45+细胞数3~5x10^6的浓缩细胞、10~15ng的粒细胞巨噬细胞刺激因子、80~120µL上清浓缩液、0.2~0.3mg谷氨酰胺、10~15µg***钠、生理盐水适量至1mL。
6.根据权利要求1所述的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数4x10^6的浓缩细胞、12.5ng的粒细胞巨噬细胞刺激因子、100µL上清浓缩液、0.2~0.3mg谷氨酰胺、10~15µg***钠、生理盐水适量至1mL。
7.根据权利要求1所述的细胞组合物，其包含：CD45+细胞数4x10^6的浓缩细胞、12.5ng的粒细胞巨噬细胞刺激因子、100µL上清浓缩液、0.2mg谷氨酰胺、15µg***钠、生理盐水适量至1mL。
8.根据权利要求1所述的细胞组合物，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱。
9.制备细胞组合物的方法，其包括使规定量的骷髅浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子、上清浓缩液、谷氨酰胺、***钠、和任选的赋形剂混合配制成无菌制剂的步骤；其中，
所述浓缩细胞与粒细胞巨噬细胞刺激因子的比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计4x10^6个细胞：10~15ng粒细胞巨噬细胞刺激因子；
所述浓缩细胞与上清浓缩液的比例为，浓缩细胞以CD45+细胞数计4x10^6个细胞：75~125µL上清浓缩液；
所述粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和***钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.1~0.5mg：5~20µg；
所述骨髓浓缩细胞和上清浓缩液是由包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
(2)取下细胞自动分离***的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离***是封闭式的PXP分离***，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理***；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
Figure 278419DEST_PATH_IMAGE001
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞；
(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据；
(7)用注射器分取中央舱室内的上清液即血浆层，2000g离心20min除去细胞碎片，再经0.22μm无菌滤膜过滤；
(8)用超纯水冲洗切向流超滤***的管路，安装100kD 100cm2的MidiKros过滤器，对步骤(7)所得滤液超滤浓缩至初始生物样本量的1/15体积，得到上清浓缩液。
10.权利要求1~8任一项所述细胞组合物或者权利要求9所述方法制得的细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰的药物中的用途。
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