CN113980894B - 制备骨髓浓缩细胞的方法及其用于治疗卵巢早衰的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备骨髓浓缩细胞的方法及其用于治疗卵巢早衰的用途。制备骨髓浓缩细胞的方法步骤为：(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于无菌袋中；(2)取下细胞自动分离***输入管的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；(3)将一次性分离杯放入控制模块中，放置于可编程的离心机中，并按照规定程序设定离心机的参数，(5)离心完成后，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞。本发明方法呈现如说明书所述优良技术效果。

Description

制备骨髓浓缩细胞的方法及其用于治疗卵巢早衰的用途
技术领域
本发明属于生物技术和生物医药领域，涉及使用细胞治疗剂治疗卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)的方法。具体地说，本发明涉及从骨髓穿刺液(Bonemarrow aspirate)中快速分离制备骨髓浓缩细胞(Bone marrow aspirate concentrate，骨髓浓缩物，BMAC)的细胞治疗剂，进而使用此种骨髓浓缩细胞治疗早发性卵巢功能不全和卵巢早衰的方法。使用本发明方法可以有效的提高从骨髓穿刺液中分离骨髓浓缩细胞的效率，提供一种安全、高效、简捷获得骨髓浓缩细胞制剂用于治疗卵巢早衰和卵巢功能不全例如早发性卵巢功能不全的方法。通过使用PXP®自动细胞快速处理***为本发明目的得以实现。
背景技术
卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)，是指由于卵巢功能衰竭，导致女性40岁之前闭经、***的现象。POF是一种以闭经、***、***缺乏、卵泡减少和***增高为特征的疾病，并伴有一系列低***症状如：潮热多汗、面部潮红、***低下等，严重影响女性的身心健康。此外，POF的女性，患骨质疏松症、心血管疾病和老年痴呆的风险增加。POF是导致女性***的重要原因之一。育龄女性POF的发病率约1-3%，且呈上升和年轻化趋势。
根据欧洲人类生殖与胚胎学学会的指南(ESHRE)，POF的诊断标准：少经或闭经至少4个月，间隔4周以上的两次FSH水平升高>40IU/L。卵巢早衰病因不明，可能与遗传和自身免疫性疾病、环境因素以及医源性和特发性情况有关，尚无有效的治疗方法。激素替代疗法(HRT)是POF最常见的治疗方法之一，但效果并不理想，而且已被证明会增加静脉血栓、乳腺癌和卵巢癌的风险。POF除了少经、闭经、***等症状，还可出现潮热、多汗、焦虑、抑郁、心悸、失眠等更年期症状，可能加快女性衰老，导致骨质疏松、心血管疾病、痴呆症等绝经后疾病，影响女性生活质量和寿命。
POF病因复杂，尚未完全阐明，可能与自身免疫应答、感染、遗传因素、化疗、放疗、手术等治疗效果及内分泌功能障碍有关，尚无有效的治疗方法。目前，POF的最常用的治疗方法是激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)。该疗法虽然对POF的临床症状具有一定的缓解作用，然而，HRT不能从根本上修复受损的卵巢，恢复卵巢功能。此外，研究表明，长期HRT治疗增加心脏病和中风的风险，可能会增加乳腺癌和卵巢癌的风险。因此，需要新的治疗策略来恢复POF患者的卵巢功能。
骨髓(bone marrow)是人体主要的造血器官，由造血细胞、脂肪组织和基质细胞组成。骨髓中的造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)，可以分化为血液循环中的红细胞、白细胞和血小板。骨髓中的间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群，MSCs通过旁分泌多种生长因子，对HSCs起到支持的作用，维持骨髓造血微环境的稳定。
骨髓浓缩细胞(BMAC)是将骨髓经过离心、分离后获得的有核细胞的浓缩物。骨髓浓缩细胞(BMAC)中包含富集的造血干细胞(HSCs)和间充质干细胞(MSCs)，以及大量的多种细胞生长因子。HSCs可以分化为血液循环中的红细胞、白细胞和血小板。MSCs是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。BMAC中含有血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、***I(IGF-I)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、骨形态发生蛋白(BMP-2，BMP-7)和白细胞介素(IL-1，IL-6，IL-8)等多种生长因子和细胞因子。
骨髓浓缩细胞具有抗炎、免疫调节特性、促血管生成、促进组织再生修复等作用。临床前和初步临床研究证实，BMAC通过改善卵巢微环境，促进血管生成，促进卵泡发育，增加窦状卵泡数量，促进***，从而改善卵巢功能，是治疗POF患者潜在的治疗方法。
然而，骨髓穿刺液在传统上采用手工操作方式以密度梯度离心法进行分离，存在操作复杂、耗时长、易污染、结果重复性差等非常棘手的问题。为此，本领域技术人员期待有一种操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好等一个或者多个方面有益效果的处理骨髓穿刺液以获得骨髓浓缩物即骨髓浓缩细胞的方法。本领域技术人员还期待提供一种治疗卵巢早衰的方法例如使用骨骼浓缩细胞治疗剂治疗卵巢早衰的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备骨髓浓缩细胞的方法，期待该种方法具有操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好等一个或者多个方面的有益效果。已经出人意料地发现，本发明通过使用封闭式的PXP细胞自动分离***能够实现上述一个或者多个目的，本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种制备骨髓浓缩细胞的方法，其包括如下步骤：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
(2)取下细胞自动分离***的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离***是封闭式的PXP分离***，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理***；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20~200ml。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得。
根据本发明第一方面的方法，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据。
进一步的，本发明第二方面提供了一种骨髓浓缩细胞，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
(2)取下细胞自动分离***的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离***是封闭式的PXP分离***，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理***；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
Figure 533627DEST_PATH_IMAGE001
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20~200ml。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得。
根据本发明第二方面的骨髓浓缩细胞，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据。
进一步的，本发明第三方面提供了骨髓浓缩细胞在制备用于治疗卵巢早衰的细胞治疗剂中的用途，所述骨髓浓缩细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
(2)取下细胞自动分离***的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离***是封闭式的PXP分离***，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理***；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
Figure 372139DEST_PATH_IMAGE001
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20~200ml。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得。
根据本发明第三方面的用途，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据。
进一步的，本发明第四方面提供了治疗卵巢早衰的方法，该方法包括给予有需要的受试者施用包含治疗有效量的骨髓浓缩细胞的细胞治疗剂，所述骨髓浓缩细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
(2)取下细胞自动分离***的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离***是封闭式的PXP分离***，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理***；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
Figure 683034DEST_PATH_IMAGE001
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20~200ml。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得。
根据本发明第四方面的方法，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据。
在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
本发明使用PXP自动化细胞快速处理***，应用自动分离和浓缩的封闭式***，安全、高效、简捷获得BMAC的方法，为BMAC用于治疗POF患者的临床应用奠定了基础。本发明提供的快速分离获得骨髓浓缩细胞的方法，该方法将取自人的骨髓穿刺液，使用封闭式自动化细胞分离***，分离获得骨髓浓缩细胞。本发明获得的骨骼浓缩细胞作为治疗卵巢损伤的活性成分，能够促进血管生成、卵泡发育，从而改善卵巢功能。
现有的研究业已证实，污染性红细胞与干细胞/祖细胞功能的下降有关，红细胞污染细胞浓缩物被认为会降低细胞治疗的效果。为了更好地发挥细胞治疗的潜力，行业迫切需要能提高靶细胞纯度和污染性红细胞去除率的新处理***。
本发明具体实验中使用的细胞分离***为PXP®自动分离***，其型号为80065-01，供应商为无锡博雅感知医疗科技有限公司，生产商为美国ThermoGenesis公司。创新的PXP***解决了当前市场上现有***的许多缺陷。PXP***使临床医生能够在几乎没有红细胞污染的情况下，通常少于起始样本的5%，迅速获得很高的干细胞和祖细胞回收率。
PXP***针对开发和使用细胞治疗技术的临床机构在手术室环境下快速、高效、无菌的细胞处理需求，是一种相当高效的手术室即时***(Point-of-Care)产品。作为前沿的自动化细胞快速处理***，PXP***不需要细胞分离介质或沉淀剂，可以同时处理多个样本，MNC和CD34+、CD45+细胞回收率高，能够让临床医生在医院外科中心或者诊所实现30分钟之内从生物样品(例如骨髓)中高效提取干细胞，并且红细胞的去除率超过90%。此外，该PXP***还配备了专利的DataTrak软件来追踪捕获数据，以方便为客户提供GMP流程控制和报告信息。
PXP***目前已经通过多国***的医疗器械产品注册，这套设备***的临床应用场景广泛，多用于骨科疾病的细胞疗法，有机构通过PXP***实现了手术室环境的高效、高质量的自体骨髓干细胞制备，将治疗中心的骨科疾病细胞疗法带上了新的台阶，也为治疗中心争取了长足的竞争力。PXP***用于处理骨髓提取物，能够实时快速自动化处理骨髓细胞，确保单个核细胞(MNC)的回收率，能够同时处理多个骨髓单元，并且不需要细胞分离介质或沉淀剂。
本发明具体试验中使用的PXP***的优点包括但不限于：稳定优异的MNC(单核细胞)和CD34+、CD45+细胞回收率、30分钟内快速处理骨髓样本、95%以上的红细胞去除率、自动化封闭式无菌***、快速准确的数据追踪和文档记录、样本处理数据可以通过DataTrak软件上传到计算机，提供符合GMP要求的生产记录和报告信息。
骨髓浓缩物因富含大量的干细胞和生长因子而被广泛应用于骨科、重症下肢缺血等相关学科的临床中。根据全球市场情报公司TMR(透明度市场研究机构)发布的最新报告，2016年全球骨髓浓缩物市场值约为1.3亿美元，在2017年至2025年期间预计将以5.0%左右的复合年增长率稳定增长。近年来，骨科疾病和运动损伤的患病率及发病率增加、骨科行业的高速发展以及骨髓浓缩物产品在骨科领域的广泛应用，再加上细胞处理及制备技术的进步，推动了全球骨髓浓缩物市场的发展。
骨髓浓缩物是将骨髓经过离心、分离后获得的有核细胞的浓缩物，其内富含间充质干细胞。众所周知，全球骨髓浓缩物市场应用领域可分为骨外科、伤口愈合、慢性疼痛、周围性血管疾病、皮肤病变及其他。由于全球老龄化的加剧以及骨关节炎发病率的上升，未来骨科疾病的应用将主导整个骨髓浓缩物市场。随着行业的蓬勃发展、技术的进步以及可支配收入的增加，未来皮肤病学领域预计将以最高的复合年增长率增长(6.0%)。人皮肤中的成纤维细胞和角化细胞的再生能力已经被用来开发细胞疗法，同时科学家们正在研究骨髓源性皮外细胞在皮肤再生中的可塑性，这些都将加速细胞疗法在皮肤病学领域的应用。骨髓浓缩物被认为是骨替代材料的“铂金标准”。研究发现，骨髓浓缩物中的细胞、前体细胞、生长因子、血小板等对骨再生发挥重要的作用。例如骨髓浓缩物中的内皮细胞在血管再生中扮演重要的角色；骨髓浓缩物中含有的大量生长因子能作用于成骨细胞和破骨细胞，调节骨改建过程，促进新骨生成；骨髓浓缩物中的血小板能为间充质干细胞提供更快更有效的骨再生环境。
根据***和世界卫生组织的调查结果，全球超过4亿人患有关节炎，如此庞大的患者群体背景推动着骨科领域的发展。骨髓来源干细胞治疗被认为是一种有前途的先进疗法，可以将骨科疾病的伤口愈合时间从手术治疗所需的4到6个月缩短到5到6周。愈合时间的缩短是推动骨髓浓缩物市场发展的因素之一。近年来，骨髓浓缩物处理及制备技术的进步为医院及诊所提高骨科治疗临床效果提供了有效选择。
骨髓浓缩物市场是一个新兴市场，经过30年至40年的研究与发展，各种干细胞治疗及相关技术设备渐渐走向商业化。骨髓浓缩物、富血小板血浆及干细胞衍生物的出现，正在成为未来医疗的新趋势。随着个性化医学的发展，全球对细胞治疗的临床需要越来越显著，细胞治疗临床应用的放开趋势也愈加明显。随着细胞治疗临床应用的逐渐覆盖，医疗机构对基于自动化技术的新一代细胞处理及制备解决方案的需求会日益剧增，而这些技术平台也将对细胞疗法走向成功产生重要的影响。
本发明通过使用PXP***进行细胞分离获得了令人满意的效果。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
在本发明中，如未另外说明，具体实验中使用的细胞分离***为PXP®自动分离***，其在本发明中亦可简称为PXP***、PXP细胞自动分离***、PXP自动分离***、PXP分离***等。实验中使用的该PXP***的型号为80065-01，供应商为无锡博雅感知医疗科技有限公司，生产商为美国ThermoGenesis公司。
实施例1：快速分离制备骨髓浓缩细胞(BMAC)
(1)提供生物样本骨髓穿刺液(可以处理20~200ml体积的样本)，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用，另抽取1ml样本以备检测；
(2)取下细胞自动分离***的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离***是封闭式的PXP分离***，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理***；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
Figure 750347DEST_PATH_IMAGE001
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的骨髓浓缩细胞。
可选的步骤(6)：使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据。本实施例1步骤(1)所用抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱，抗凝剂与生物样本的体积比为1：12；抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得。本实施例1对收集的10份生物样本人骨髓穿刺液(通过本领域公知的方法获取，例如本发明的生物样本是照宋建华文献(宋建华，等，自体骨髓浓缩干细胞治疗股骨颈骨析,实用骨科杂志，2008,14(8):467)所载方法获得的)进行细胞分离制备骨髓浓缩细胞(BMAC)。
试验例1：分析骨髓穿刺液(BMA)和骨髓浓缩细胞(BMAC)中MNC回收率
使用实施例1的方法，对收集的10份人骨髓穿刺液进行细胞分离，对各分离级分进行细胞检测，分析结果汇总见下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
结果显示，平均而言，输入骨髓穿刺液均值为86.79ml，输出BMAC均值为12.62ml；单个核细胞(MNC)回收率高达96.8%，红细胞(RBC)去除率高达98.6%；MNC浓度提升6.88倍。可见，使用PXP动分离***能够以操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好的方式富集骨髓中的MNC，同时去除大部分红细胞。
实施例1a：参考实施例1操作制备骨髓浓缩细胞，不同的仅是在抗凝剂中不添加组氨酸，处理5份生物样本得到5份BMAC。实施例1b：参考实施例1操作制备骨髓浓缩细胞，不同的仅是在抗凝剂中不添加磷脂酰胆碱，处理5份生物样本得到5份BMAC。实施例1c：参考实施例1操作制备骨髓浓缩细胞，不同的仅是在抗凝剂中既不添加组氨酸也不添加磷脂酰胆碱，处理5份生物样本得到5份BMAC。对实施例1、实施例1a、实施例1b、实施例1c操作中所得到的血浆层用双蒸水稀释1倍，用分光光度计在540nm处测定吸收度，结果：实施例1=0.024±0.008(n=10)、实施例1a=0.214±0.035(n=5)、实施例1b=0.196±0.041(n=5)、实施例1c=0.232±0.028(n=5)；另外，平均的红细胞去除率方面，实施例1a=90.3%、实施例1b=93.5%、实施例1c=89.6%，这些结果表明，实施例1a等操作中可能有红细胞破裂导致血浆层颜色变深，进而另外造成红细胞去除率变低，而通过在抗凝剂中添加组氨酸和磷脂酰胆碱能够明显地避免上述问题，这一发现是完全出人意料的。
试验例2：BMA和BMAC样本中的细胞活率
针对试验例1涉及的10个样本进行考察。细胞活率是表示细胞是否具有生物学功能的最直观的指标。骨髓样本采集24-36小时内(T<36小时)，使用FC500流式细胞仪，应用7-AAD染色法，分析BMA、BMAC中的细胞活率。结果汇总见下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
注：BMA为PXP处理前的骨髓穿刺液样本，BMAC为PXP处理后的骨髓浓缩细胞样本。
结果表明，PXP***处理后，BMA和BMAC样品平均细胞活率方面，(单因素方差分析显示)BMAC样本中的细胞活率显著高于BMA细胞活率。另外，实施例1a、实施例1b、实施例1c操作所得BMAC细胞活率(%)分别为89.18±0.83、90.51±1.24、88.63±1.17，它们的结果明显比实施例1更差。
试验例3：BMA和BMAC样本中CD45+、CD34+细胞计数
针对试验例1涉及的10个样本进行考察。在FC500流式细胞仪上，应用7-AAD染色法，对所有处理前、处理后的骨髓样本中的CD45+和CD34+细胞数量和细胞活率进行了分析，结果见下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
从表中结果可见，PXP***能够有效富集CD45+和CD34+细胞，不论是CD45+活细胞数量还是CD34+活细胞数量，BMA与BMAC方面均呈现显著差异，与BMA相比，BMAC终产物中的CD45+和CD34+细胞增加倍数分别为6.9倍和6.4倍，统计学有显著差异(p<0.05)。
试验例4：骨髓样本无菌检测
针对试验例1涉及的10个样本进行考察。使用革兰氏染色法进行无菌检测，制备BMA、BMAC样本的涂片，用甲醇固定，染色后测试，结果见下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
本发明使用PXP***制备BMAC的过程具有快速、封闭、全程无菌的特点。
试验例5：细胞水平有效性研究
本发明使用PXP***制备的BMAC是一种细胞制剂的注射液，其中含有多种干细胞成分，包括造血干细胞(HSCs)，间充质干细胞(MSCs)，内皮祖细胞(EPCs)，以及多种细胞因子，如血管内皮生长因子(VEGF)，基质细胞衍生因子(SDF-1)，内皮抑素(Entostatin)等，促进新血管生成和内皮细胞迁移。
本试验例针对试验例1涉及的10个样本进行考察，通过CFU集落形成能力评价BMAC的干细胞生物学效力，ELISA定量检测BMAC中富含的细胞因子。
5.1、骨髓干细胞生物学效力—CFU集落形成实验
骨髓干细胞生物学效力(Potency Assays)，通过体外CFU集落形成实验，鉴定分析祖/干细胞的集落形成能力，表征BMAC混合细胞中的细胞干性。采用CFU-H(造血祖/干细胞)，CFU-F(基质祖细胞)对BMA和BMAC样本中多种干细胞的效能进行了分析，结果见下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
上述结果显示，BMAC集落形成能力与BMA相比，CFU-H集落数增加了6.09倍，CFU-F集落数增加了6.93倍。结果表明，PXP***能够有效地富集骨髓干细胞，同时维持骨髓干细胞的生物学效力。
5.2、细胞因子定量分析
PXP***制备的BMAC注射液中含有多种细胞因子。酶联免疫吸附实验(ELISA)定量检测分析BMA和BMAC样品中，转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)水平，结果见下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
结果显示，BMAC中的TGF-β、VEGF和HGF，显著高于BMA中的TGF-β、VEGF和HGF水平(p<0.01)，表明PXP***能够有效地浓缩富集细胞生长因子。
试验例6：BMAC治疗卵巢早衰(POF)的有效性
(1)建立POF小鼠模型
给8周龄雌性C57BL/6小鼠腹腔注射50mg/kg/day环磷酰胺(CTX)，连续腹腔注射15d，每天同一时间注射，建立卵巢早衰(POF)小鼠模型。对照组不做任何处理。POF造模完成后进行BMAC细胞移植。
(2)通过激素水平、卵泡数和生育测试等指标来评估卵巢的储备功能。
A.激素水平
60只8周龄雌性C57BL/6小鼠，随机分为对照组(n=20)、POF模型组(n=20)、BMAC治疗组(n=20)。治疗组小鼠，分别于POF建模后第1天，尾静脉注射给予BMAC浓缩液200µl(该浓缩液为试验例1涉及的ID1号浓缩液样本，必要时用无菌生理盐水稀释制成以CD45+细胞计浓度为2x10^7细胞/mL的浓度)；POF模型组注射等体积生理盐水。
经BMAC移植后14天和28天，每组分别取10只小鼠，眼眶采血，分离血清，-20℃保存。酶联免疫吸附试验(ELISA)分析***(E2)、促卵泡素(FSH)的水平(具体方法参考相丽论文(相丽，等，人胎盘间充质干细胞移植通过降低超氧化物歧化酶1和解耦联蛋白-2的表达提高卵巢功能，中华生殖与避孕杂志，2018年02期)方法进行)，结果见下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
结果显示：与POF模型组相比，BMAC组小鼠血清中E2水平在28d升高，FSH水平下降，均具有显著性差异(P<0.05)。
B.小鼠卵巢组织的卵泡计数
BMAC移植后移植后28天，每组分别取10只小鼠，处死，取小鼠左侧卵巢组织于4%多聚甲醛固定，将固定后的组织进行系列酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，切片厚度5um，进行HE染色，显微镜下观察。
结果显示：相比于对照组，POF模型组小鼠初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量明显减少，闭锁卵泡数量明显增加；BMAC治疗后28天，各级卵泡数均有不同程度的恢复，颗粒细胞生长增加，凋亡减少，卵巢上皮细胞形态稳定，初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量明显增加，闭锁卵泡数量明显减少。BMAC移植后28天各级卵泡计数，与POF组比较有显著差异，具体结果见下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
与POF模型组比较，**p<0.01。
C.小鼠生育能力观察
在BMAC移植后第28天，将雌雄小鼠按2：1比例合笼饲养，统计小鼠的生育率，并对小鼠的产仔数进行比较，观察BMAC移植对小鼠卵巢功能的修复作用，结果显示BMAC组与POF组比较有显著差异。小鼠产仔数比较结果如下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE011
根据上文结果可见，BMAC移植治疗可明显改善POF小鼠受损卵巢的储备功能，卵泡数增加，雌孕激素升高，小鼠生育力得到恢复，为BMAC应用于POF的临床治疗提供了实验依据。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (8)

1.制备骨髓浓缩细胞的方法，其包括如下步骤：
(1)提供生物样本骨髓穿刺液，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；所述抗凝剂为3.2%枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.1mg/ml磷脂酰胆碱；
(2)取下细胞自动分离***的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本骨髓穿刺液转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合生物样本骨髓穿刺液；所述细胞自动分离***是封闭式的PXP分离***，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)DataTrak软件处理***；
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
程序P1：加速9、减速9、相对离心力2000、时间8.5min，
程序P2：加速9、减速9、相对离心力50、时间2min，
程序P3：加速9、减速9、相对离心力500、时间2min，
程序P4：加速9、减速9、相对离心力50、时间1min，
程序P5：加速9、减速9、相对离心力250、时间0.5min，
程序P6：加速9、减速9、相对离心力50、时间1min；
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
4a)P1期使生物样本骨髓穿刺液中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
4b)P2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
4c)P3期进一步将处理室中的细胞分层，P4期降低离心力以进一步除去红细胞；
4d)P5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至P6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“P”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到骨髓浓缩细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)提供的生物样本骨髓穿刺液的体积为20~200ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中另外抽取1ml生物样本骨髓穿刺液以备检测。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本骨髓穿刺液的体积比为1：12。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60°C搅拌使溶解，加水至全量，0.22µm微孔滤膜过滤，121°C热压灭菌，即得。
6.根据权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用DataTrak软件处理***处理离心过程中所捕获的数据。
7.一种骨髓浓缩细胞，其是通过权利要求1~6任一项所述方法制备得到的。
8.骨髓浓缩细胞在制备用于治疗卵巢早衰的细胞治疗剂中的用途，所述骨髓浓缩细胞是通过权利要求1~6任一项所述方法制备得到的。
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