CN115478111A

CN115478111A - 一种与绵羊免疫性状相关的分子标记、其检测方法和应用

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Publication number: CN115478111A
Application number: CN202210640815.0A
Authority: CN
Inventors: ***; 张德印; 李发弟; 张小雪; 李晓龙; 赵源; 张煜坤
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2022-06-07
Filing date: 2022-06-07
Publication date: 2022-12-16

Abstract

本发明提供了一种与绵羊免疫性状相关的分子标记、检测方法及其应用。所述分子标记根据IL18基因序列设计引物，从绵羊血液中提取DNA，通过PCR扩增、DNA测序和序列分析，发现再扩增片段的第381位存在一个A/G多态性位点，进一步使用KASPar引物对790只湖羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与免疫性状指标进行关联分析，发现该位点与绵羊的红细胞计数、红细胞平均体积和平均红细胞血红蛋白浓度呈显著相关。通过检测本发明的分子标记，可用于绵羊的标记辅助育种上，加速绵羊育种进程。

Description

一种与绵羊免疫性状相关的分子标记、其检测方法和应用

技术领域

本发明属于绵羊分子标记筛选与制备技术领域，具体涉及IL18基因多态性作为影响绵羊免疫性状的分子标记、其检测方法和应用。

背景技术

在养羊生产中，疾病严重影响羊只的健康以及企业或养殖户的经济效益。尽管通过加强饲养管理、改善环境卫生和实施严格的免疫程序等措施可预防疾病，但不能有效的控制传染病的流行，同时随着生活水平的提高以及人们消费观念的转变，营养、绿色、健康的食品已逐渐成为行业发展的主向标，使得减少疫苗和药物使用的呼声越来越高。因此筛选与免疫性状相关的分子标记，从遗传角度提高羊只对病原的抗性，增强其免疫力是从根本上解决这一问题的有效手段。随着分子生物学技术的发展，分子标记辅助选择(marker-assisted selection,MAS)被广泛应用于畜禽的选种选育工作中。

绵羊作为主要的草食动物，其抗病育种工作也越来越被重视，目前已鉴定出的主要抗病候选基因有：绵羊天然抗性巨噬结合蛋白1(Natural resistance-associatedmacrophage protein 1，Nramp1)基因多态性与伤寒沙门氏菌易感性和抗性有关(姚菊霞，王光华，马利青.羊主要抗病候选基因的研究进展.青海畜牧兽医杂志，2014,44(5)：40～43.)绵羊的主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)，又称为绵羊白细胞抗原(Ovine Lymphocyte Antigen，OLA)其结构与牛的MHC(BoLA)相似，具有高度的多态性和连锁不平衡，其多态性和遗传性对保护其机体组织对抗疾病，引起机体免疫应答具有重要作用(冉晓炜.OLA基因在绵羊抗病育种中的研究进展[J].科技视界，2015(12):291～303.)。此外其它有研究的与抗病力有关的基因是RPS23(ribosomal proteinS23,核糖体蛋白S23)、TLR (Toll-like receptor，Toll样受体)、IL1(Interleukins 1，白细胞介素1)、PPARG(Peroxisome proliferator activated receptor gamma，过氧化物酶体增殖激活受体γ)等基因。

白细胞介素18(Interleukin 18,IL18)是IL-1家族中的一员，最早发现其具有诱导干扰素-γ的特性(Lee JH,Cho DH,Park HJ.IL-18and Cutaneous InflammatoryDiseases.Int J Mol Sci.2015Dec 9；16(12):29357-69)。而白细胞介素是多数源于白细胞并主要在白细胞间起免疫调节作用的蛋白，因为白细胞介素成员较多，因此成为免疫学领域中庞大的、重要的一类细胞因子(李琦涵，施海晶.免疫学概览(原著第二版)[M].北京:现代生物技术与医药科技出版中心,2005)。在抗病毒、免疫应答和免疫调节中发挥着重要的作在调节先天和后天免疫反应中起着关键作用。但是IL18基因与免疫性状是否有关，有什么关系并不清楚。因此本发明以IL18基因作为候选基因，通过PCR扩增、DNA测序和序列分析，探讨其不同基因型与绵羊免疫相关性状的关联性，以期为提高绵羊的抗病性提供一个新的分子标记。

发明内容

针对现在养羊业使用大量药物和疫苗等问题，本发明的目的在于提供一种与绵羊免疫性状相关的分子标记、其检测方法和应用的技术方案。为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

本发明提供了一种与绵羊免疫性状相关的分子标记，该分子标记对通过对绵羊IL18基因进行扩增而获得，具体的，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第381bp位的R表示A或G，由于上述序列在第381位碱基处有一个A/G突变，从而导致了绵羊IL18基因在该位点的A/G多态性。

本发明提供了一种检测上述分子标记的引物对，所述检测分子标记的 PCR引物对包括正向引物和反向引物，正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的序列如SEQID NO.3所示。

本发明还提供了检测上述分子标记的KASPar引物对，所述KASPar引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列。

一种检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了检测上述分子标记的引物对或KASPar引物对。

本发明提供了一种检测与绵羊免疫性状相关的分子标记的方法，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第381bp位的R表示A或G，所述方法包括利用上述的引物对或试剂盒对绵羊全血基因组DNA进行检测。

如上所述的方法，其包括如下步骤：

a)使用如上所述的引物对或KASPar引物对，或者如上所述的试剂盒，对绵羊全血基因组DNA进行扩增；

b)对步骤a)获得扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。

优选地，所述步骤b)中的分型鉴定方法为直接测序法、探针法、基因芯片法和KASP基因分型技术。

具体地，本发明中利用上述引物对检测与绵羊免疫性状相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用引物对如SEQ ID NO.2和 SEQ ID NO.3所示的引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，

b)对上述PCR扩增产物进行测序和序列分析，从而通过多态性位点的碱基类型确定基因型。

此外，本发明还涉及利用KASPar引物对检测与绵羊免疫性状相关的分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5 和SEQ IDNO.6所示的引物进行高通量水浴PCR扩增；

b)扩增结束后，采用KASP基因分型技术，通过BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。

本发明还提供了上述分子标记、引物对或试剂盒或检测方法在绵羊免疫性状相关检测中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对IL18基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育出免疫力较好的绵羊品种。

如上所述的应用，优选在绵羊育种中的应用。其育种目的是为挑选出免疫力好的绵羊品种。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的与绵羊免疫性状相关的分子标记，还提供了检测该分子标记的引物对或试剂盒或检测方法在绵羊免疫性状相关检测中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对IL18基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育出具有强免疫力的绵羊品种，为有强免疫力，健康型绵羊的选育提供有效的检测手段。本发明通过对分子标记及导致多态性位点的检测，可用于选留AA纯合型绵羊作为种羊用于育种，用以提高绵羊的免疫力，有助于提高绵羊养殖业的经济效益。

附图说明

图1为对绵羊IL18基因片段扩增的凝胶电泳结果图。

图2为本发明中绵羊IL18基因突变位点的测序结果。

图3为本发明中绵羊IL18基因g.381A>G突变位点KASPar SNP分型结果。

具体实施方式

本发明通过对IL18基因进行PCR扩增、测序和分析，选择790只湖羊为试验群体分析IL18基因不同基因型与免疫性状指标的关联性，筛选出对免疫性状有利的基因型，开发一种与绵羊免疫性状相关的分子标记，为绵羊免疫性状相关的分子标记辅助育种提供依据，为促进绵羊遗传改良提供基因素材，加速优质肉羊的培育进程。结果发现在扩增片段的第381位存在一个A/G 多态性位点，并通过检测790只湖羊的多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与绵羊免疫性状相关的分子标记，该分子标记可以为绵羊性状发育方面的遗传改良提供有效的基因工程手段，具有一定的实际应用价值。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。本发明要求保护的范围不受所述具体实施方式的限制，本发明提供的具体实例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员参照说明书的描述对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本发明所用试剂均为分析纯或以上规格。

实施例1

(1)引物设计

以绵羊IL18基因DNA(GenBank收录号：NC_040266.1)为模板，利用 Oligo7.0软件设计一对引物包括正向引物：M-F和反向引物：M-R，引物序列如下

M-F(SEQ ID NO.2)：5＇-CTGGCCTTTCTAACACTCC-3＇，

M-R(SEQ ID NO.3)：5＇-AAGAATGAGAACTGTTGCCTA-3＇

(2)IL18基因的扩增和测序

配制PCR反应体系采用总体积为25μL体系，其中包括DNA模板1μL， M-F(浓度为10μmol/L)0.8μL，M-R(浓度为10μmol/L)0.8μL，2×PCR Master Mix 12.4μL，ddH₂O 10μL。取绵羊的血液进行提取的基因组DNA，将获得的基因组DNA作为DNA模板进行PCR扩增。

PCR扩增反应的条件是：

94℃预变性3min；

94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；

最后72℃延伸10min。

PCR扩增的反应产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果显示得到 605bp大小的扩增片段如图1所示。将扩增得到的特异性片段进行测序，测序的结果：具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中在该381bp片段中存在一个多态性位点，具体在第381bp位点的R是A或G，即扩增该GLP2R 基因片段在第381bp位点存在A/G多态性(结果见图2)。

其中，SEQ ID NO.1：

CTGGCCTTTCTAACACTCCATATTCCAACTGCCTTCCTAATGGGCCTGC TTCTCCCATTAGAACTGTGTTTTGCTCACCACTGTATCGGAGTGCCTAA CATAGTGCCAGAGATACAAATGCCAGTACTTGCTGAATCAAGTAAATA GGTGTAGAGCAATCTTCCAGAAACATGAGGAGCTATATGGCAATAGT ATCGCAATAAATCTAGAGAAAGAAACCTAAAGGAATAGTATTTTTCAA AAGTCCCTGTTTTCTATTTTTGGTCTAGTAGGAATCACACTACGAATGGGGAAAGTGCTATTTTTAAGGAAAAGTATGAGAAACTGGTGACCTTTAA TAATTCGGGGGTCTGTTAGGAGATCATAGGCTTTATATGGGTRTGAGC CTCTCTGAATGCCAGAGGGACAAGGGTTGGGTACATTCACTTCTTAGG AAGACTTACTGACTCAACCTCACTGGTCTGTTTGCTCTACCCTCTCCCT TCTCCACTACTTCCAGAATTGCCTGCACCCTGGGAACCTGCCAGGCTTC TTTCCAGACCATTCTGAAGGGGAGGGTTGAAGAAGGAAGATGTTCCTGATTTTAGGCAACAGTTCTCATTC。

DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 网站的BLAST软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊IL18基因DNA(GenBank收录号： NC_040266.1)的部分序列同源性达99％。

实施例2基因分型检测方法的建立

(1)引物序列设计

针对实施例1中扩增片段的A/G多态性位点设计KASPar引物对，从而用于该多态性位点的特异性检测，所述KASPar引物对的核苷酸序列为：

用于检测AlleleA的正向引物A1，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，

SEQ ID NO.4：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGGAGATCATAGGCTTTATATGGGTA；

用于检测AlleleG的正向引物A2，如SEQ ID NO.5所示，

SEQ ID NO.5：

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGAGATCATAGGCTTTATATGGGTG；

通用反向引物C，如SEQ ID NO.6所示，

SEQ ID NO.6：CAACCCTTGTCCCTCTGGCATTC。

以上引物委托北京生工生物工程有限公司合成，将KASPar引物对中各组引物均稀释成10μmol/L，并按照引物A1：引物A2：引物C的体积比为 12:12:30的比例混匀备用。

(2)DNA质控

对绵羊的全血提取得到的基因组DNA的质量进行检测，分别采用1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100进行检测，合格的DNA要求：一、琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；二、Nanodrop2100检测A260/280介于 1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；三、A260/230介于1.8-2.0之间 (DNA样品盐离子浓度低)；四、270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)。

根据英国LGC公司的KASP检测技术和基因组大小换算出DNA用量为10～20ng/每样品，稀释DNA模板浓度为10～20ng/μL备用。

(3)基因分型

首先利用K-pette分液工作站，将稀释好的待测DNA模板取1.5μL和空白对照(以水为模板记为NTC)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min (干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。然后在Kraken操作***下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(1536微孔板货号Part No.KBS-1016-011)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。PCR反应在高通量水浴***Hydrocycler中进行，具体程序为：

94℃预变性，15分钟；

94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down 序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；

94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。

扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况，具体结果如图3所示，图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧的深灰色圆点表示该位点是纯合基因型“GG”；靠近右侧的深灰色圆点表示该位点是纯合基因型“AA”；靠近中间的浅灰色圆点表示该位点是杂合基因型“AG”或“GA”；黑色圆点表示NTC(图3中未能显示出来)，即是水为模板的空白对照。

(4)本发明的分子标记在绵羊内脏器官重量标记性状关联分析中的应用

试验共检测了790只湖羊的多态性，确定其基因型，并进行基因型与免疫性状(红细胞计数(RBC)，血红蛋白(HGB)，红细胞压积(HCT)，红细胞平均体积(MCV)，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)，平均红细胞血红蛋白浓度 (MCHC)和白细胞计数(WBC))的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与免疫性状进行关联分析。

Y_ijkl＝μ+Genotype_i+P_j+F_k+M_l+ε_ijkl

其中，Y_ijkl是免疫性状指标的观察值，μ为总体均数，Genotype_i为基因型效应，P_j为批次效应，F_k为父系效应，M_l为母系效应，ε_ijkl为随机误差，假定ε_ijkl相互独立，服从N(0，σ²)分布。

基因型检测结果表明在790个个体中GG基因型有543个，AG基因型有221个个体，AA基因型有26个个体，基因型与性状关联分析的结果见下表1。

表1绵羊IL18基因多态性与部分免疫性状关联分析

注：同行数据间角标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

由上表的结果显示，IL18 g.381A>G突变位点与红细胞计数、红细胞平均体积和平均红细胞血红蛋白浓度呈显著相关(P<0.05)，其中AA基因型个体的红细胞计数和平均红细胞血红蛋白浓度显著显著高于AG和GG基因型个体，而AA基因型个体的红细胞平均体积显著低于AG和GG基因型个体。红细胞作为血液中为数最多的一类血细胞，具有识别携带抗原、清除循环中免疫复合物、增强T细胞依赖反应等作用。寻找免疫相关的分子标记可加速绵羊在生长发育等方面的育种进程。因此L18 g.381A>G突变位点可作为影响绵羊免疫性状的潜在分子标记，选留AA纯合型个体进入核心群，用于提高绵羊的免疫力，并为在育种中鉴别是否为高免疫性能的绵羊提供检测技术手段。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 一种与绵羊免疫性状相关的分子标记、其检测方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 603

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctggcctttc taacactcca tattccaact gccttcctaa tgggcctgct tctcccatta 60

gaactgtgtt ttgctcacca ctgtatcgga gtgcctaaca tagtgccaga gatacaaatg 120

ccagtacttg ctgaatcaag taaataggtg tagagcaatc ttccagaaac atgaggagct 180

atatggcaat agtatcgcaa taaatctaga gaaagaaacc taaaggaata gtatttttca 240

aaagtccctg ttttctattt ttggtctagt aggaatcaca ctacgaatgg ggaaagtgct 300

atttttaagg aaaagtatga gaaactggtg acctttaata attcgggggt ctgttaggag 360

atcataggct ttatatgggt rtgagcctct ctgaatgcca gagggacaag ggttgggtac 420

attcacttct taggaagact tactgactca acctcactgg tctgtttgct ctaccctctc 480

ccttctccac tacttccaga attgcctgca ccctgggaac ctgccaggct tctttccaga 540

ccattctgaa ggggagggtt gaagaaggaa gatgttcctg attttaggca acagttctca 600

ttc 603

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctggcctttc taacactcc 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagaatgaga actgttgcct a 21

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc taggagatca taggctttat atgggta 47

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tggagatcat aggctttata tgggtg 46

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caacccttgt ccctctggca ttc 23

Claims

1.一种与绵羊免疫性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其第381bp处的R表示A或G，该突变导致分子标记的A/G多态性。

2.一种检测权利要求1所述的分子标记的PCR引物对，其特征在于，其包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种检测权利要求1所述的分子标记的KASPar引物对，其特征在于，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列。

4.一种检测权利要求1所述的分子标记的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求2所述的PCR引物对或/和权利要求3所述的KASPar引物对。

5.一种检测权利要求1所述的分子标记的方法，其包括如下步骤：

a)使用权利要求2所述的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或者使用权利要求4所述的试剂盒，对绵羊全血基因组DNA进行扩增；

b)对步骤a)获得扩增产物的多态性位点进行分型鉴定。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b)中的分型鉴定方法为测序法和KASP基因分型技术。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的KASPar引物对进行PCR扩增，扩增结束后，再通过检测荧光信号确定分型结果。

8.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊免疫性状相关检测中的应用。

9.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的PCR引物对或权利要求3所述的KASPar引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊育种中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其育种目的是为挑选出免疫性状较好的绵羊品种。