CN101307358A - 一种预示和鉴定鸡体重和跖骨性状的单倍体型标记方法 - Google Patents
一种预示和鉴定鸡体重和跖骨性状的单倍体型标记方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种预示和鉴定鸡体重和跖骨性状的单倍体型标记方法。根据鸡1号染色体基因组序列，查找到在173196313bp、173239127bp、173306996bp和173492453bp处存在四个SNP，根据这四个SNP两侧基因组序列分别设计四对引物，用这四对引物对鸡基因组DNA进行PCR扩增；分别用限制性内切酶MspI、MboI、XbaI和Eco72I消化扩增的PCR产物；用2％的琼脂糖凝胶对消化后的PCR产物进行电泳分离，获得基因型后构建单倍型。结果发现所有12只F1公鸡来自母源的染色单体共享一个单倍体型即A－C－F－H，相关分析表明，具有共享单倍体型个体的体重和跖骨性状显著低于其他单倍体型个体。
Description
(一)技术领域
本发明涉及动物分子遗传学，具体说就是一种预示和鉴定鸡体重和跖骨性状的单倍体型标记方法。
(二)背景技术
养鸡生产对国民经济的发展以及人民生活水平的提高都有着重要的战略意义。中国具有悠久的养鸡历史，肉鸡的年饲养量以及鸡肉产出量近些年来都位居世界前列。据***农粮组织(FAO)统计，2005年我国鸡的存栏数为43.60亿只，占世界的26.07％；鸡肉产量为1015万吨，占世界总产量的14.92％。鸡肉在全国肉类总产量中的比重为13.33％。由此可见，鸡肉生产在我国畜牧业经济中占有举足轻重的地位。进一步提高肉鸡的出栏体重，降低饲养成本，仍是今后肉鸡育种和生产的重点。
在肉鸡育种过程中，对体重的选择取得了一定的成果，并且仍然会是今后育种工作的重点。过去的半个世纪以来，肉鸡育种取得了巨大的成功，但其育种进展，尤其是受多基因控制的数量性状遗传改良，还是比较缓慢的。过去的15年来，伴随着人类基因组计划的开展，家畜基因组计划也得到了高速发展，分子生物学和数量遗传学的结合，使得标记辅助选择(MAS)的可操作性大大加强。选择与数量性状位点(Quantitative Trait Loci，QTL)相连锁的分子遗传标记(基因或非基因标记)即可实现对QTL基因型的直接选择，这将大大加快育种进程。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种分子生物学技术，即采用PCR-RFLP来检测鸡基因型并构建单倍体型，从而预示和鉴定鸡体重和跖骨性状的单倍体型标记方法。
本发明的目的是这样实现的：
1、根据鸡SNP1、SNP2、SNP3和SNP4附近的基因组序列分别设计四对引物：
SNP1F：5’-GTGTTTATCAGCACGAGCC-3’
SNP1R：5’-CAGGAACTGTCAAGGTGGG-3’；
SNP2F：5’-AGAAAGCCACTATCAAGAAC-3’
SNP2R：5’-TTGGGTGTCAACAAGGAT-3’；
SNP3F：5’-GAAGTGAGGGTGTTGGAGAC-3’
SNP3R：5’-GAGCAGGTGAGTTTCAAATAGG-3’；
SNP4F：5’-CTTCAAAGTGCTCCTATCCC-3’
SNP4R：5’-GTGGTATTACTTGTGGGAGC-3’；
2、利用这四对引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增片段长度分别依次为658bp、403bp、481bp和582bp；
3、利用限制性内切酶MspI、MboI、XbaI和Eco72I分别消化扩增的PCR产物；
4、使用2％的琼脂糖凝胶对消化后的PCR产物进行电泳分离，检测出SNP1的G＞A变异位点、SNP2的A＞G变异位点、SNP3的T＞C变异位点和SNP4的C＞T变异位点；
5、当鸡SNP1中变异位点为G碱基时，会产生限制性内切酶MspI的酶切位点(C/CGG)，MspI消化PCR产物后会产生2个片段(423bp和235bp)，将其命名为BB基因型；该位点为A碱基时(CCGA)，则不存在MspI酶切位点，MspI消化PCR产物后只有1个片段(658bp)，将其命名为AA基因型；该位点为G/A杂合时，MspI消化PCR产物后会产生3个片段(658bp、423bp和235bp)，将其命名为AB基因型。与此类似，将SNP2变异位点的三种基因型分别命名为CC、CD和DD；SNP3的基因型命名为EE、EF和FF；SNP4的基因型命名为GG、GH和HH。
本发明还包括：
1、其中分析标记多态性的方法是通过检测碱基的突变而分类的基因型。
2、其中用于分析标记多态性的部位是鸡1号染色体173196313bp、173239127bp、173306996bp和173492453bp处。
3、其中用于分析标记多态性的部位是由SNP1F和SNP1R、SNP2F和SNP2R、SNP3F和SNP3R、SNP4F和SNP4R表示的引物扩增区。
4、其中用于分析多态性的SNP1位点选自鸡基因组序列表1中第236位的G＞A的碱基突变；
其中用于分析多态性的SNP2位点选自鸡基因组序列表2中第188位的A＞G的碱基突变；
其中用于分析多态性的SNP3位点选自鸡基因组序列表4中第230位的T＞C的碱基突变；
其中用于分析多态性的SNP4位点选自鸡基因组序列表5中第390位的C＞T的碱基突变；
5、其中鸡体重是鸡的4-12周龄体重及12周龄屠体重，鸡的跖骨性状是鸡的2、4、6、8、10、12周龄跖骨长和跖骨围。
6、其中用于消化PCR产物的限制性内切酶分别是MspI、MboI、XbaI和Eco72I。
7、其中用于琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶浓度为2％。
实验证明具有A-C-F-H单倍体型个体的体重显著低于其他单倍体型个体(P＜0.05)；具有A-C-F-H单倍体型个体的跖骨长显著短于其他单倍体型个体(P＜0.05)；具有A-C-F-H单倍体型个体的跖骨围显著小于其他单倍体型个体(P＜0.05)。
本发明采用PCR-RFLP的方法检测鸡1号染色体上的4个SNP标记，通过构建标记的单倍体发现具有A-C-F-H单倍体型个体的体重和跖骨性状显著低于其他单倍体型个体。
本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行快速检测。利用本发明的单倍体型标记方法对体重及跖骨性状进行选择，不仅为鸡育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的单倍体型标记方法，同时为鸡的体重及跖骨性状的改良提供了一种有效的单倍体型标记育种手段，可以加速鸡的育种进程。
(四)附图说明
图1为12只F1公鸡单倍体型图。
(五)具体实施方式
下面举例对本发明做进一步说明。
一、实验材料
1.实验动物和性状测定
本发明建立的鸡的F2资源家系(NEAURP)，F0代以4只肉鸡高低脂双向选择品系高脂系公鸡为父本，24只白耳蛋鸡为母本；F0代杂交后产生F1代，F1代避免全同胞半同胞交配产生F2代，公母配种比例为1∶6，F2代出雏后按常规商品肉鸡饲养程序统一进行饲养管理。本发明选取12个F1公鸡家系，共计F033只，F181只，F21004只用于单倍体型研究。
F2代群体测定出生重(g)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12周龄体重(g)，测量4、6、8、10、12周龄跖骨长(cm)、跖骨围(cm)；12周龄时翅静脉采血，EDTA抗凝，称量12周龄活重(g)之后屠宰，测定屠体重(g)，
2.实验药品
三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma Chemicals Co；Tris饱和酚，北京鼎国生物技术发展中心；蛋白酶K(Proteinase K)，MMERCK Co；DL 2000、dNTP(dATP；dTTP；dCTP；dGTP)、Taq酶，大连宝生物公司；琼脂糖(Agarose)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺，原平皓公司。
3.主要仪器
PTC-200PCR仪(PERKIN ELMER)、Biometra梯度PCR仪、UVP多功能成像***、Ultrospec 1000紫外分光光度计、BECKMAN冷冻离心机、Milli-Q超纯水仪、DYY-III2稳压电泳仪及配套电泳槽。
二、实验方法
1.缓冲液与常用试剂的配制
1M Tris·Cl：121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。
TE缓冲液：10mM Tris·Cl，1mM EDTA，pH8.0，高压灭菌。
20×SET缓冲液：3MNaCl，1M Tris·Cl(pH 8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，高压灭菌。
5×TBE缓冲液：54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5M EDTA(pH8.0)，加水至1L。
50×TAE缓冲液：242g Tris碱，57.1ml冰乙酸，100ml0.5MEDTA(pH8.0)，加水至1L。
1M Tris·Cl：121.14g Tris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。
0.5M EDTA：186.1g EDTA溶于800ml双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高压灭菌。
3M NaAc(pH5.2)：408.1g NaAc·3H2O溶于800ml双蒸水中，用冰乙酸调pH至7.0，定容至1000ml。
200ml银染液：NH3·H2O 2ml；3.6％NaOH 4.2ml；20％AgNO33.6ml，加去离子水至200ml。
200ml显色液：1％柠檬酸钠1ml；甲醛100μL；加去离子水至200ml。
禽血裂解液：10mM Tris·Cl(pH8.0)，0.1M EDTA(pH8.0)，0.5％SDS。
2.引物的设计与合成
以下引物由上海英骏生物技术有限公司合成：
SNP1F：5’-GTGTTTATCAGCACGAGCC-3’
SNP1R：5’-CAGGAACTGTCAAGGTGGG-3’；
SNP2F：5’-AGAAAGCCACTATCAAGAAC-3’
SNP2R：5’-TTGGGTGTCAACAAGGAT-3’；
SNP3F：5’-GAAGTGAGGGTGTTGGAGAC-3’
SNP3R：5’-GAGCAGGTGAGTTTCAAATAGG-3’；
SNP4F：5’-CTTCAAAGTGCTCCTATCCC-3’
SNP4R：5’-GTGGTATTACTTGTGGGAGC-3’；
3.鸡基因组DNA的小量提取
方法一：
(1)取20μL抗凝血液，加入500μL禽裂解液，加入蛋白酶K至终浓度为100-200μg/ml，混匀55℃消化12hr，直至溶液中不再有粘稠的团块。
(2)将溶液冷却至室温，加入5M NaCl至终浓度1.5M，混匀10min。加入等体积酚/氯仿，反复颠倒离心管混匀10min。
(3)12,000rpm，室温离心10min。取上清，加等体积氯仿混匀10min。
(4)12,000rpm，室温离心10min。取上清2倍体积无水乙醇沉淀DNA。
(5)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。
(6)7,500rpm，室温离心5min，弃上清。
(7)将DNA干燥后(注意不能太干)溶于200μL TE中。
方法二：
(1)将20μL全血加入装有700μL 1×SET的1.5ml离心管中，轻轻混匀。
(2)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度100-200μg/μL和10％的SDS至终浓度0.5％，55℃消化12h。
(3)待消化完全后，加入等体积的Tris饱和酚，来回颠倒，使其混匀
(4)12,000rpm离心10min，用剪去尖端的吸头将上层水相小心移入另一个离心管中，弃去有机相。重复第三和第四步骤一次。
(5)向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇混合液(体积比为24∶23∶1)，混合10min。12,000rpm.，离心10min，移出水相到另一个离心管。
(6)向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇混合液(23∶1)，来回颠倒混合10min，12,000rpm，离心10min，移出水相到另一个离心管。
(7)向水相中加入1/10体积NaAc(3M，pH5.2)和2倍体积的无水乙醇，来回颠倒，沉淀DNA。
(8)将DNA挑出放到1.5ml离心管中，用70％乙醇洗1次。
(9)7,500rpm离心5min。小心倒掉管中乙醇，将倒置在滤纸上，让乙醇流尽，置于空气中干燥。
(10)加入200μL的TE，置50℃水浴中过夜溶解DNA。溶解后贮存于-20℃备用。
4.PCR反应
(1)以鸡DNA为模板进行PCR扩增，10μL反应体系中包含以下溶液或试剂：
10×PCR reaction buffer 1μL
dNTP Mixture(各2.5mM) 0.8μL
引物1(10μM) 0.2μL
引物2(10μM) 0.2μL
EX-Taq(5U/μL) 0.1μL
去离子水 6.7μL
基因组DNA(50ng/μL) 1.0μL
(2)将上述溶液混合并按以下条件进行PCR反应。
SNP1：94℃变性7min；94℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，35个循环；72℃延伸10min。
SNP2：94℃变性7min；94℃30sec，51.2℃30sec，72℃45sec，35个循环；72℃延伸10min。
SNP3：94℃变性7min；94℃30sec，60℃30sec，72℃45sec，35个循环；72℃延伸10min。
SNP4：94℃变性7min 94℃30sec，53.6℃30sec，72℃45sec，35个循环；72℃延伸10min。
(3)反应结束后，取PCR反应液(3μL)进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。
5.PCR-RFLP反应体系及条件。
酶切体系如下：
内切酶10U/μL 1μL
10×Buffer： 2μL
PCR Production 5μL
加去离子水至 20μL
将上述反应液混匀，于37℃水域中消化过夜。
6.琼脂糖凝胶电泳检测
将消化之后的全部反应液进行2％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物酶切片段多态性。
7.统计模型建立
表型数据整理：
表型数据收集整理采用Excel软件，用JMP4.0(SAS Institute，Cary，NC)计算表型均值、标准差及相关系数。
单倍型构建：
采用SAS9.1进行F1代公鸡、F2代全部个体单倍型的构建。
相关分析：
根据F2资源群体的特点，构建的线性模型如下：
Y＝μ+h+S+H+F+D(F)+h*S+h*H+BW0+e
Y为性状观察值，μ为群体均值，h单倍体型固定效应，S为性别固定效应，H为批次固定效应，h*S为单倍体型与性别的互作效应，h*H为单倍体型与批次的互作效应，F家系的随机效应，D(F)为家系内母鸡的随机效应，BW0作为协方差变量，e为剩余值。使用统计软件JMP 4.0检验单倍体型与性状间的相关程度，并估计性状的最小二乘均值。
实施例1，鸡四个SNP标记单倍体型式共享分析。利用本发明的四对引物(SNP1F和SNP1R、SNP2F和SNP2R、SNP3F和SNP3R、SNP4F和SNP4R)对F0、F1、F2群体的所有个体的基因组DNA进行PCR扩增，然后利用限制性内切酶MspI、MboI、XbaI和Eco72I分别消化扩增的PCR产物，最后使用2％的琼脂糖凝胶对消化后的PCR产物进行电泳分离，检测四个变异位点的基因型。每个SNP位点在F2资源群体中都检测到了两种等位基因，分别命名为A和B、C和D、E和F、G和H，构成的三种基因型分别为AA、AB和BB；CC、CD和DD；EE、EF和FF；GG、GH和HH。
根据各SNP标记基因型，使用SAS9.1构建所有个体的单倍型，并且将12只F1公鸡的单倍体分为两组，一组来源于F0公鸡(+)，另一组来源于F0母鸡(-)(如图1)，从图1中可以看到，所有母源(-)的单倍体共享同一个单倍体型即A-C-F-H，该单倍体型来自母源的白耳鸡；父源(+)的单倍体型比较多样化，没有类似母源(-)的共享单倍型。
将F2个体按照其是否从F0白耳鸡那里继承了共享单倍体型(A-C-F-H)分为两组，一组是从F0白耳鸡继承了共享单倍体型，即A-C-F-H组；另一组没有继承共享单倍体型，即非A-C-F-H组。两种单倍体型与体重及跖骨性状显著相关(P＜0.05)，并且从F0白耳鸡继承共享单倍体型(A-C-F-H组)的个体体重和跖骨围(长)显著低于非A-C-F-H组。
以上结果说明单倍体型A-C-F-H与低体重及小跖骨围(长)相关。
表1共享单倍型与F2群体体重跖骨性状相关分析
注：1BW＝体重，随后的数字表示相应的周龄；CW＝屠体重；ML＝跖骨长，随后的数字表示相应的周龄；MC＝跖骨围，随后的数字表示相应的周龄；2两组单倍体型间的P值；AB同行无相同字母表示差异显著(P＜0.05)。
表2鸡基因组序列表
1
GTGTTTATCAGCACGAGCCATGTGATAGAGATGCTATCTGATTGT
CTCTG
51
CGCTGTCTCTGTCACTTGCCGATAAGATGCAGATAAGATTGGAT
GGGGCC
101
CTAGGCAGCCTGATCTAGTGGGTGGCAGCCCTGCCCACAGCAG
GGGGGTT
151
GCAACTGGATGATCTTTTAGATCCCTTCCAACCATAAGCCCTTCT
ATGAT
201
TCTATGGTTGTATGATAAGATGCCGTCTCGGTGGCCGGAGCATCT
CAAAA
251
GCCACAGCCTTCCTCTGGCCACGACTTTGCTGTCTGAAGTGGTA
GTTCCC
301
ATGCTGCTCCTTGTTGCACACCACTGCTTCCTCCCAGAAGGCTC
TGACAC
351
TGAAAGCTGCCCTCCAAGCCACTCATGGGATCATTTCCTACTCT
GCTTCC
401
ATCCAAAGGGAATGAGCTAAGACCTCCTGTTTCAGGTGTCTGG
AGTGAAT
451
GTCTCCATGTCTGAATAGGGTCTGAGAGCACACACTCGAGCAG
CTTTGCT
501
GGCAGACTTTGGACTGGGGCAGTAAGCAAAGCAGCTGGAAGAT
ATACACC
551
TATGTACAGCCCTCAGTGCCACGAGAGCTGGCGAGGTCTGAGT
TAGGAAC
601
CGCTGGAGTGGCCTCAGCTGGGTCCTAGTTCACAGTCACCCCA
CCTTGAC
651AGTTCCTG
表3鸡基因组序列表
1
AGAAAGCCACTATCAAGAACAAGCAACTCACAACAGTCCCAGT
GTGTTTA
51
TCACCTTGTAAACATGCCCTGGGAGAGAAAGCTGGGAACAAGC
TCAAGTC
101
ATGTGTTGCACAGTCCAGCTTGAGGAAACAGTGCCATCCACAC
ATTGCTG
151
CTCTCCATTGGGATGGCAGCCAAGGCTGAGGTGGAGATCAGAA
AACCTCA
201
GTATCTTGAATGGGGCTGTAGGAAGGAAGGGGACAAACTCTTT
AGCAGAA
251
TCTGTTGAGACAGGACAAGGGGAAATGGTTTCACACTCGAACA
GAGGAGA
301
TTAGATTGGATATGAGGAAAAAGTTTTTTACTGTATGGGTGCAG
TGGTTC
351
TGGCGCAGGTTGCCCAGCGAGGGGACAGATACCCCATCCTTGT
TGACACC
401CAA
表4鸡基因组序列表
1
GAAGTGAGGGTGTTGGAGACAAAGCTTGTTAAATTGTTACAGT
AGAGCTC
51
CAATTTATTTGCAGCCAAAGGCTGGAAAAATATTGTCCTTGTTG
CTAAAT
101
GAGGTTCTCTTGTGGATGTAACTCATTAACAGTTTTTTGGGGGG
AGCTTG
151
TGCTTTTCTGGCTGTCCACTTCTATTATATTTTCCTTCGAAGAATC
AGCC
201
CTTCACAGGATTTAGTTAATCTTTCTTTCTAGAAAGAATAGCTTT
ACCTT
251
TATGTATTTAAAACGTTTCGTTATGCCTAGCTCTTTAAAAATATAT
ATTT
301
TGAACTATTGATGCTATTTTAGTACAGTAAAATGACAAAGTCTTT
TATCA
351
CTGTTCTGGTTTGTCATTTCCAGACTTCCTTCTAACTTCCTTTTC
ATTTT
401
ATCCTGAGAATGAAGTTAAAAACATCTACAATGAGAAGCCTAG
GACTAAT
451CCTTCTCATCCTATTTGAAACTCACCTGCTC
表5鸡基因组序列表
1
CTTCAAAGTGCTCCTATCCCAACTTTGTATATTCAACCAATTTCA
CAGCT
51
TGCTTTTTTTTTTCTTAATAATGAAAATAAATGTTTGTTCTATTCA
TAGA
101
AATGAAAATGTGAAAAGGAAAGTTCATTTCAGAAGGAACTAAA
AAAAGGC
151
CTTTGCTGAAGATCTAAAATTTAACCTCTCTTCACAGAATTACCA
TGGGA
201
CACTCTATTTTATAGCTCATAGCACAGCACACACACAAAAATCA
TCTACC
251
ATAACAGCAACCAAACTTCCTACTAATGCTCTAAGCTGAAAAGC
CTGTTC
301
ATGCATATTCATCTTACTCTAATGCTGATTTGTCATATAAGTATTA
AGAC
451
ACTTTTCCTCTACTGACCACTTCTACAGAAGTCTAAAACATTTTT
CATCA
501
CATGCTCTCAAGATGATTTGCAAGCAAACAAAATTAAGCTTAAT
TTAAAC
551CAAAAGTTAAATGCTCCCACAAGTAATACCAC
Claims (8)
1、一种预示和鉴定鸡体重和跖骨性状的单倍体型标记方法，步骤如下：
(1)根据鸡SNP1、SNP2、SNP3和SNP4附近的基因组序列分别设计四对引物：
SNP1F：5’-GTGTTTATCAGCACGAGCC-3’
SNP1R：5’-CAGGAACTGTCAAGGTGGG-3’；
SNP2F：5’-AGAAAGCCACTATCAAGAAC-3’
SNP2R：5’-TTGGGTGTCAACAAGGAT-3’；
SNP3F：5’-GAAGTGAGGGTGTTGGAGAC-3’
SNP3R：5’-GAGCAGGTGAGTTTCAAATAGG-3’；
SNP4F：5’-CTTCAAAGTGCTCCTATCCC-3’
SNP4R：5’-GTGGTATTACTTGTGGGAGC-3’；
(2)利用这4对引物对鸡的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增片段长度依次分别为658bp、403bp、481bp和582bp；
(3)利用限制性内切酶MspI、MboI、XbaI和Eco72I分别消化扩增的PCR产物；
(4)使用2％的琼脂糖凝胶对消化后的PCR产物进行电泳分离，检测出SNP1的G＞A变异位点、SNP2的A＞G变异位点、SNP3的T＞C变异位点和SNP4的C＞T变异位点；
(5)当鸡SNP1中变异位点为G碱基时，会产生限制性内切酶MspI的酶切位点C/CGG，MspI消化PCR产物后会产生2个片段423bp和235bp，将其命名为BB基因型；该位点为A碱基时CCGA，则不存在MspI酶切位点，MspI消化PCR产物后只有1个片段658bp，将其命名为AA基因型；该位点为G/A杂合时，MspI消化PCR产物后会产生3个片段658bp、423bp和235bp，将其命名为AB基因型；与此类似将SNP2变异位点的三种基因型分别命名为CC、CD和DD；SNP3的基因型命名为EE、EF和FF；SNP4的基因型命名为GG、GH和HH。
2、根据权利要求1所述的一种预示和鉴定鸡体重和跖骨性状的单倍体型标记方法，其中分析标记多态性的方法是通过检测碱基的突变而分类的基因型。
3、根据权利要求2所述的一种预示和鉴定鸡体重和跖骨性状的单倍体型标记方法，其中用于分析标记多态性的部位分别是鸡1号染色体173196313bp、173239127bp、173306996bp和173492453bp处。
4、根据权利要求3所述的一种预示和鉴定鸡体重和跖骨性状的单倍体型标记方法，其中用于分析标记多态性的部位分别是由SNP1F和SNP1R、SNP2F和SNP2R、SNP3F和SNP3R、SNP4F和SNP4R分别表示的引物扩增区。
5、根据权利要求4所述的一种预示和鉴定鸡体重和跖骨性状的单倍体型标记方法，其中用于分析多态性的SNP1位点选自鸡基因组如下序列中第236位的G＞A的碱基突变；
1
GTGTTTATCAGCACGAGCCATGTGATAGAGATGCTATCTGATTGT
CTCTG
51
CGCTGTCTCTGTCACTTGCCGATAAGATGCAGATAAGATTGGAT
GGGGCC
101
CTAGGCAGCCTGATCTAGTGGGTGGCAGCCCTGCCCACAGCAG
GGGGGTT
151
GCAACTGGATGATCTTTTAGATCCCTTCCAACCATAAGCCCTTCT
ATGAT
201
TCTATGGTTGTATGATAAGATGCCGTCTCGGTGGCCGGAGCATCT
CAAAA
251
GCCACAGCCTTCCTCTGGCCACGACTTTGCTGTCTGAAGTGGTA
GTTCCC
301
ATGCTGCTCCTTGTTGCACACCACTGCTTCCTCCCAGAAGGCTC
TGACAC
351
TGAAAGCTGCCCTCCAAGCCACTCATGGGATCATTTCCTACTCT
GCTTCC
401
ATCCAAAGGGAATGAGCTAAGACCTCCTGTTTCAGGTGTCTGG
AGTGAAT
451
GTCTCCATGTCTGAATAGGGTCTGAGAGCACACACTCGAGCAG
CTTTGCT
501
GGCAGACTTTGGACTGGGGCAGTAAGCAAAGCAGCTGGAAGAT
ATACACC
551
TATGTACAGCCCTCAGTGCCACGAGAGCTGGCGAGGTCTGAGT
TAGGAAC
601
CGCTGGAGTGGCCTCAGCTGGGTCCTAGTTCACAGTCACCCCA
CCTTGAC
651 AGTTCCTG
其中用于分析多态性的SNP2位点选自鸡基因组如下序列中第188位的A＞G的碱基突变；
1
AGAAAGCCACTATCAAGAACAAGCAACTCACAACAGTCCCAGT
GTGTTTA
51
TCACCTTGTAAACATGCCCTGGGAGAGAAAGCTGGGAACAAGC
TCAAGTC
101
ATGTGTTGCACAGTCCAGCTTGAGGAAACAGTGCCATCCACAC
ATTGCTG
151
CTCTCCATTGGGATGGCAGCCAAGGCTGAGGTGGAGATCAGAA
AACCTCA
201
GTATCTTGAATGGGGCTGTAGGAAGGAAGGGGACAAACTCTTT
AGCAGAA
251
TCTGTTGAGACAGGACAAGGGGAAATGGTTTCACACTCGAACA
GAGGAGA
301
TTAGATTGGATATGAGGAAAAAGTTTTTTACTGTATGGGTGCAG
TGGTTC
351
TGGCGCAGGTTGCCCAGCGAGGGGACAGATACCCCATCCTTGT
TGACACC
401 CAA
其中用于分析多态性的SNP3位点选自鸡基因组如下序列中第230位的T＞C的碱基突变；
1
GAAGTGAGGGTGTTGGAGACAAAGCTTGTTAAATTGTTACAGT
AGAGCTC
51
CAATTTATTTGCAGCCAAAGGCTGGAAAAATATTGTCCTTGTTG
CTAAAT
101
GAGGTTCTCTTGTGGATGTAACTCATTAACAGTTTTTTGGGGGG
AGCTTG
151
TGCTTTTCTGGCTGTCCACTTCTATTATATTTTCCTTCGAAGAATC
AGCC
201
CTTCACAGGATTTAGTTAATCTTTCTTTCTAGAAAGAATAGCTTT
ACCTT
251
TATGTATTTAAAACGTTTCGTTATGCCTAGCTCTTTAAAAATATAT
ATTT
301
TGAACTATTGATGCTATTTTAGTACAGTAAAATGACAAAGTCTTT
TATCA
351
CTGTTCTGGTTTGTCATTTCCAGACTTCCTTCTAACTTCCTTTTC
ATTTT
401
ATCCTGAGAATGAAGTTAAAAACATCTACAATGAGAAGCCTAG
GACTAAT
451 CCTTCTCATCCTATTTGAAACTCACCTGCTC
其中用于分析多态性的SNP4位点选自鸡基因组如下序列中第390位的C＞T的碱基突变；
1
CTTCAAAGTGCTCCTATCCCAACTTTGTATATTCAACCAATTTCA
CAGCT
51
TGCTTTTTTTTTTCTTAATAATGAAAATAAATGTTTGTTCTATTCA
TAGA
101
AATGAAAATGTGAAAAGGAAAGTTCATTTCAGAAGGAACTAAA
AAAAGGC
151
CTTTGCTGAAGATCTAAAATTTAACCTCTCTTCACAGAATTACCA
TGGGA
201
CACTCTATTTTATAGCTCATAGCACAGCACACACACAAAAATCA
TCTACC
251
ATAACAGCAACCAAACTTCCTACTAATGCTCTAAGCTGAAAAGC
CTGTTC
301
ATGCATATTCATCTTACTCTAATGCTGATTTGTCATATAAGTATTA
AGAC
351
AGACCAGCTGATCTCTGATGACAATAATTACATGTAACACGTGG
CTCTAT
401
TTCTGAGAAGAGAGAAGATGGGTTGGGAAAATAAAAAACAATG
GATTGAG
451
ACTTTTCCTCTACTGACCACTTCTACAGAAGTCTAAAACATTTTT
CATCA
501
CATGCTCTCAAGATGATTTGCAAGCAAACAAAATTAAGCTTAAT
TTAAAC
551 CAAAAGTTAAATGCTCCCACAAGTAATACCAC
6、根据权利要求1-5任何一项所述的一种预示和鉴定鸡体重和跖骨性状的单倍体型标记方法，其中鸡体重是鸡的4-12周龄体重及12周龄屠体重，鸡的跖骨性状是鸡的2、4、6、8、10、12周龄跖骨长和跖骨围。
7、根据权利要求1-5任何一项所述的一种预示和鉴定鸡体重和跖骨性状的单倍体型标记方法，其中用于消化PCR产物的限制性内切酶分别是MspI、MboI、XbaI和Eco72I。
8、根据权利要求1-6任何一项所述的一种预示和鉴定鸡体重和跖骨性状的单倍体型标记方法，其中用于琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶浓度为2％。
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- 2008-06-20 CN CNA2008100647872A patent/CN101307358A/zh active Pending
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