CN115443150A - 新型ddr1抗体和其用途 - Google Patents

新型ddr1抗体和其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN115443150A
CN115443150A CN202080094867.1A CN202080094867A CN115443150A CN 115443150 A CN115443150 A CN 115443150A CN 202080094867 A CN202080094867 A CN 202080094867A CN 115443150 A CN115443150 A CN 115443150A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
variable region
chain variable
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080094867.1A
Other languages
English (en)
Inventor
张宁彦
安志强
邓辉
孙秀杰
李�荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
George Washington University
University of Texas System
Original Assignee
George Washington University
University of Texas System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by George Washington University, University of Texas System filed Critical George Washington University
Publication of CN115443150A publication Critical patent/CN115443150A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本公开涉及与肿瘤盘状蛋白结构域受体1(DDR1)结合的抗体以及所述抗体在检测和治疗癌症中的用途。因此，一方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与DDR1特异性结合。在某些实施例中，所述抗体或抗原结合片段在与DDR1结合时调节DDR1的活性，即，抑制DDR1。

Description

新型DDR1抗体和其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年12月17日提交的美国临时申请序列号62/949,300的优先权的权益，所述美国临时申请的全部内容据此通过引用并入。
关于政府资助研究的声明
本发明是根据美国国立卫生研究院(U.S.National Institutes of Health)授予的授权号CA220578在政府支持下进行的。政府拥有本发明的某些权利。
序列表的引用
序列表作为ASCII格式的文本文件与本说明书同时提交，文件名为P0362WO_ST25.txt，创建日期为2020年12月17日并且大小为127千字节。序列表的电子格式中的信息是本说明书的一部分并特此通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及医学、肿瘤学和免疫学领域。更具体地，本公开涉及与DDR1结合并且可以治疗包含乳腺癌的癌症的抗体。
背景技术
肿瘤盘状蛋白结构域受体1(DDR1)和2(DDR2)蛋白的异常表达与包含乳腺癌的多种实体癌类型的进展相关(Valiathan等人，2012；Rammal等人，2016；Gao等人，2016；Bayer等人，2019)。已公开的数据支持DDR蛋白在促进肿瘤进展和转移潜能中的作用(Gao等人，2016；Bayer等人，2019；Hidalgo-Carcedo等人，2011；Marcotte等人，2012)。然而，MMTV-PyMT小鼠中Ddr1的基因消融促进了自发肿瘤发生(Takai等人，2018)，表明癌症发展和进展中的阶段依赖性肿瘤DDR1功能。
发明内容
因此，一方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与DDR1特异性结合。在某些实施例中，所述抗体或抗原结合片段在与DDR1结合时调节DDR1的活性，即，抑制DDR1。在某些实施例中，所述抗体或抗原结合片段在与DDR1结合时特异性阻断配体与DDR1的结合。
一方面，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链(LC)可变区(VL)和重链(HC)可变区(VH)以及其变体，所述轻链可变区和重链可变区包括分别在表1和表2中所示的克隆配对的CDR氨基酸序列；在所述变体中LC-CDR中的一个或多个LC-CDR和/或HC-CDR中的一个或多个HC-CDR具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。在一些实施例中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是鼠类抗体、啮齿动物抗体、兔抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施例中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以具有VL链和VH链，所述VL链和VH链的氨基酸序列分别与表3和表4的克隆配对的序列具有至少90％或95％同一性。在一些实施例中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以具有VL链和VH链，所述VL链和VH链由分别与表8和表9的克隆配对的序列具有至少80％或90％同一性的核酸序列编码。在一些实施例中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段具有VL链和VH链，所述VL链和VH链的氨基酸序列分别与表3和表4的克隆配对的序列相同。在一些实施例中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以具有VL链和VH链，所述VL链和VH链由分别与表8和表9的克隆配对的序列相同的核酸序列编码。
所述变体可以是其中HC-CDR或LC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合的变体。在某些实施例中，每个CDR是根据Kabat定义、Chothia定义、IMGT定义、Kabat定义和Chothia定义的组合、AbM定义或CDR的接触定义定义的。
另一方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与分别具有来自表1和表2的克隆配对的轻链和重链CDR氨基酸序列的抗体竞争相同的表位。
在某些实施例中，本文所描述的分离的单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在某些实施例中，本文所描述的分离的单克隆抗体属于IgG1类型、IgG2类型、IgG3类型或IgG4类型。在某些实施例中，本文所描述的抗原结合片段是重组ScFv(单链片段可变)抗体、Fab片段、F(ab′)2片段或Fv片段。
另一方面，提供了一种药物组合物，其包括如本文提供的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及至少一种药学上可接受的载体。
另一方面，提供了一种分离的核酸，其编码如本文提供的所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
另一方面，提供了一种载体，其包括如本文提供的所述分离的核酸。
另一方面，提供了一种宿主细胞，其包括如本文提供的所述载体。所述宿主细胞可以是哺乳动物细胞。所述宿主细胞可以是CHO细胞。
另一方面，提供了一种杂交瘤，其编码或产生如本文提供的所述分离的单克隆抗体。
另一方面，提供了一种产生抗体的方法。所述方法可以包括在适于表达所述抗体和回收所述抗体的条件下培养如本文提供的所述宿主细胞。
另一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)蛋白，其包括如本文提供的抗原结合片段。
另一方面，提供了一种分离的核酸，其编码如本文提供的CAR蛋白。
另一方面，提供了一种工程化细胞，其包括如本文提供的所述分离的核酸。在某些实施例中，所述细胞是T细胞、NK细胞或髓样细胞。另一方面，提供了一种治疗受试者的癌症或改善受试者的癌症的作用或用于治疗纤维化或改善纤维化(例如，器官纤维化)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所定义的抗体或其抗原结合片段。在癌症的治疗中，所述方法可以减少或根除所述受试者的肿瘤负荷，可以减少肿瘤细胞的数量，可以减小肿瘤大小，可以根除受试者的肿瘤。在一些实施例中，所述治疗的癌症是乳腺癌。
所述抗体或其抗原结合片段可以局部、静脉内、动脉内、肿瘤内或皮下施用。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括向所述受试者施用一种或多种药物，所述一种或多种药物选自由以下组成的组：拓扑异构酶抑制剂、蒽环类拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素(anthracycline)、柔红霉素(daunorubicin)、核苷代谢抑制剂、阿糖胞苷(cytarabine)、低甲基化剂、低剂量阿糖胞苷(LDAC)、柔红霉素和阿糖胞苷的组合、用于注射的柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、
Figure BPA0000324724060000031
氮杂胞苷、
Figure BPA0000324724060000032
地西他滨(decitabine)、全反式视黄酸(ATRA)、砷、三氧化二砷、组胺二盐酸盐、
Figure BPA0000324724060000033
白介素-2(interleukin-2)、阿地白介素(aldesleukin)、
Figure BPA0000324724060000034
吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、
Figure BPA0000324724060000035
FLT-3抑制剂、米哚妥林(midostaurin)、
Figure BPA0000324724060000036
氯法拉滨(clofarabine)、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨、IDH1抑制剂、艾伏尼布(ivosidenib)、
Figure BPA0000324724060000037
IDH2抑制剂、依那昔布(enasidenib)、
Figure BPA0000324724060000038
平滑(SMO)抑制剂、格拉吉布(glasdegib)、精氨酸酶抑制剂、IDO抑制剂、艾卡哚司他(epacadostat)、BCL-2抑制剂、维奈托克(venetoclax)、
Figure BPA0000324724060000039
铂复合物衍生物、奥沙利铂(oxaliplatin)、激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、BTK抑制剂、依鲁替尼(ibrutinib)、
Figure BPA00003247240600000310
阿卡替尼(acalabrutinib)、
Figure BPA00003247240600000311
赞布替尼(zanubrutinib)、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG3抗体、ICOS抗体、TIGIT抗体、TIM3抗体、CD40抗体、4-1BB抗体、CD47抗体、SIRP1α抗体或融合蛋白、E-选择蛋白的拮抗剂、与肿瘤抗原结合的抗体、与T细胞表面标志物结合的抗体、与髓样细胞或NK细胞表面标志物结合的抗体、烷化剂、亚硝基脲剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、来源于植物的生物碱、激素疗法药物、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。
在一些实施例中，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以包括与其连接的抗肿瘤药物。所述抗肿瘤药物可以通过光不稳定接头与所述抗体连接。所述抗肿瘤药物可以通过酶促切割接头与所述抗体连接。所述抗肿瘤药物可以是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
在另一个实施例中，提供了一种检测样品或受试者中癌细胞或纤维化组织的方法，所述方法包括(a)使受试者或来自所述受试者的样品与如本文定义的所述抗体或其抗原结合片段接触；以及(b)检测所述抗体与所述受试者或样品中的癌细胞或纤维化组织的结合。所述样品可以是体液或活检、或血液、骨髓、痰、眼泪、唾液、粘液、血清、尿液或粪便。检测可以包括免疫组织化学、流式细胞术、FACS、ELISA、RIA或蛋白质印迹。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括第二次执行步骤(a)和(b)以及确定相较于第一次的检测水平的变化。所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以进一步包括标记，如肽标签、酶、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以与脂质体或纳米颗粒缀合。
在权利要求书和/或说明书中，当结合术语“包括(comprising)”使用时，词语“一个”或“一种”的使用可以指“一个/一种(one)”，但是还与“一个或多个/一种或多种(one ormore)”、“至少一个/至少一种(at least one)”、以及“一个或多于一个/一种或多于一种(one or more than one)”一致。术语“约”意指所陈述的数字的加或减5％。
经考虑本文所描述的任何方法或组合物可以关于本文所描述的任何其它方法或组合物实施。本公开的其它目的、特征和优点将从以下详细描述中变显而易见。然而，应当理解尽管详细描述和具体实例表示本发明的特定实施例，然而它们仅以说明的方式给出，因为根据此详细描述，处于本公开的精神和范围内的不同变化和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见的。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且包含在内以进一步展示本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文呈现的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1A-M：DDR1赋予免疫活性宿主乳腺肿瘤生长。(图1a)DDR1 WT/KO乳腺肿瘤E0771细胞中DDR1、DDR2和上样对照GAPDH的免疫印迹。(图1b)如通过MTT测定测量的WT/KO E0771细胞的细胞增殖(n＝6)。(图1c-d)DDR1 WT/KO M-Wnt细胞迁移(c)和侵袭(d)的定量(n＝6个随机场)。(图1e)Rag1-/-(n＝6，e)宿主中DDR1 WT/KO E0771肿瘤的生长。(图1f-h)C57BL/6小鼠中WT/KO E0771(n＝6，f)、M-Wnt(n＝7，g)和AT-3(n＝7，h)肿瘤的生长。(图1i-j)从Rag1-/-移植到C57BL/6宿主(n＝8)的E0771 DDR1 WT/KO肿瘤的终点处的肿瘤生长动力学(i)和重量(j)。(图1k)肿瘤重新激发图。在第一轮接种中，小鼠在腹股沟乳腺一侧上用盐水缓冲液或DDR1 KO E0771细胞进行激发。30天后，在小鼠腹股沟乳腺两侧上用DDR1 WTE0771肿瘤细胞重新激发。L，左；R，右。(图1l-m)来自重新激发的小鼠(n＝6)的肿瘤曲线(图1l)和体重(图1m)。值表示平均值±SEM，p值如所指示的。
图2A-M：DDR1排除抗肿瘤免疫细胞浸润。(图2a)肿瘤边缘(顶部图，用红色虚线表示)处和肿瘤核心(底部图)(n＝3)中的CD8+和CD4+T细胞染色的代表性图像。比例尺：50μm。(图2b-g)通过每克肿瘤重量归一化的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)细胞数。CD8+(图2b)和CD4+(图2c)T细胞、细胞因子IFN-γ+CD8+细胞(图2d)和CD4+(图2e)T细胞，以及CD44hiCD62Llo活化的CD8+(图2f)和CD4+(图2g)T细胞的细胞数。(图2h-j)C57BL/6宿主中的WT/KO E0771肿瘤生长，其中之前使用抗IgG或抗CD8抗体治疗(n＝5)。示出了终点处的肿瘤体积(图2h)、图像(图2i)和重量(图2j)。比例尺：1cm。(图2k-m)过继性转移CD8+T细胞或培养基(假手术)到携带DDR1 WT/KO E0771肿瘤的Rag1-/-(n＝6)小鼠。(图2k)中的箭头表示第17天CD8+T细胞的转移。示出了肿瘤图像(图2l)和重量(图2m)。比例尺：1cm。值表示平均值±SEM，p值如所指示的。
图3A-P：DDR1依赖性ECM重塑阻止抗肿瘤免疫浸润。(图3a)DDR1 KO E0771肿瘤细胞与各种DDR1表达载体的全长DDR1(顶部)和肿瘤曲线图：野生型(WT)、空载体(EV)、激酶结构域(ΔKD)缺失和仅细胞外结构域(ECD)。所有p值与KO组相比。TM：跨膜结构域。(图3b)由Jmol软件生成的由DS和DS样(DSL)结构域(顶部)和小鼠DDR1 DS结构域的晶体结构(底部)组成的ECD图。示出了突变分析中靶向的氨基酸残基。(图3c)通过ELISA(n＝4)评估的在KOE0771细胞中表达的WT和点突变体ECD的胶原蛋白结合。(图3d-k)具有异位表达的ECD WT或点突变体的KO E0771肿瘤细胞的个体肿瘤生长曲线。每张图的肿瘤发病率在括号中示出。(图3l)体外培养的WT/KO E0771肿瘤细胞的代表性SEM图像。(图3m)来自E0771细胞的脱细胞ECM以ECD依赖性方式抑制T细胞迁移。左侧示出了transwell迁移测定的图。(图3n)通过SHG(灰色)、CD3染色(绿色)、To-pro-3染色(红色)和胶原蛋白纤维个体化(最右侧图)分析从Rag1-/-移植到C57BL/6宿主的WT/KO E0771肿瘤。方框箭头表示肿瘤边缘。比例尺：50μm。(图3o-p)通过CT Fire软件对肿瘤纤维排列(o)和纤维长度(p)的定量。值表示平均值±SEM，p值如所指示的。
图4A-N：DDR1作为用于增强抗肿瘤免疫力的潜在治疗靶标。(图4a)异位人(hu)DDR1和内源性小鼠DDR1在E0771衍生细胞的细胞裂解物和培养基中的免疫印迹。(图4b-c)E0771衍生的DDR1 WT、KO、KO+huDDR1细胞(n＝6)的肿瘤生长曲线(图4b)和重量(图4c)。肿瘤图像在顶部示出。(图4d-e)用同种型IgG(图4d)或抗huDDR1抗体#9(图4e)处理的C57BL/6宿主中单个KO+huDDR1肿瘤的生长曲线。箭头表示抗体施用的开始日期。(图4f)同种型IgG和抗huDDR1治疗组的存活曲线。(图4g)通过SHG(灰色)、CD3染色(绿色)、To-pro-3染色(红色)和胶原蛋白纤维个体化(最右侧图)分析KO+huDDR1肿瘤。方框箭头表示肿瘤边缘。比例尺：50μm。(图4h-i)肿瘤纤维参数的定量。纤维排列(系数变化的角度，图4h)、纤维长度(图4i)。(图4j)huDDR1 mRNA与1,093份乳腺癌患者样品(TIMER)中肿瘤浸润CD8+T的丰度之间的相关性。(图4k-m)37份TNBC患者样品(GSE88847)中DDR1 mRNA水平与抗肿瘤免疫标志物IFNG(图4k)、CD8A(图4l)和GZMB(图4m)的相关性。(图4n)形成屏障以防止免疫细胞浸润的ECD(红色圆圈)重塑的胶原蛋白纤维(曲线)的模型图。值表示平均值±SEM，p值如所指示的。
图5A-K：肿瘤DDR1消融抑制免疫活性宿主中的肿瘤生长。(图5a)TCGA数据库中正常(N)组织和乳腺肿瘤(T)样品中的DDR1表达。使用威尔科克森检验(wilcoxon test)分析P值。(图5b)源自鼠乳腺肿瘤细胞M-Wnt和AT-3的WT/KO细胞的DDR1免疫印迹。(图5c-d)小鼠Ddr1基因座的sgRNA靶向位点的基因组DNA测序。AT-3和E0771 KO克隆都含有一个碱基对***(图5c)(SEQ ID NO：312；SEQ ID NO：313；SEQ ID NO：314)。M-Wnt DDR1 KO克隆携带8bp缺失(图5d)。切割发生在PAM序列的上游。(图5e)DDR1 WT/KO M-Wnt和AT-3细胞的迁移和侵袭的代表性图像。(SEQ ID NO：315；SEQ ID NO：316)。(图5f)WT/KO M-Wnt肿瘤细胞的体外细胞增殖。(图5g)裸鼠(n＝4)中的M-Wnt肿瘤生长。(图5h)在C57BL/6小鼠中以不同数量接种的DDR1 KO E0771细胞的个体肿瘤生长曲线(每只小鼠0.5、5、10和20×106，n＝4)。(图5i-k)接种时M-Wnt DDR1 WT、KO和1∶1混合物(n＝8)的肿瘤体积(图5i)、图像(图5j)和重量(图5k)。值表示平均值±SEM，p值如所指示的。
图6A-I：CD8+细胞的免疫消耗和过继性转移。(图6a-d)Ki67(a中的CD4+和图6b中的CD8+)、IFNγ(图6c中的CD8+)或Gzmb(图6d中的CD8+)为阳性的来自KO和亲本对照的T细胞百分比。(图6e-f)来自抗IgG 2b处理的或抗CD8抗体处理的C57BL/6小鼠(e)的脾细胞的CD4+和CD8+T细胞的流式细胞术，以及血液中CD3+T细胞中CD8+的百分比(f，n＝5)。(图6g)通过Rag1-/-小鼠(n＝6)中的肿瘤重量归一化的TIL中的CD8+T细胞数。(图6h-i)从Rag1-/-移植到C57BL/6宿主的DDR1 WT/KO E0771肿瘤的T细胞归巢基因和趋化因子基因的RNA-seq热图。***，p＜0.001。值表示平均值±SEM，p值如所指示的。
图7A-E：免疫排斥需要DDR1介导的胶原蛋白重塑。(图7a-b)C57BL/6宿主(n＝10)中E0771 DDR1 KO+ECD、KO、KO+DS、KO+DSL肿瘤的生长曲线(图7a)和肿瘤重量(图7b)。(图7c)I型胶原蛋白和Flag标记的ECD WT和突变体的Co-IP。(图7d)来自鼠(左)和各种人(右)乳腺癌细胞系的细胞中的全长DDR1和条件培养基中的可溶性ECD的免疫印迹。(图7e)基于从Rag1-/-移植到C57BL/6宿主的E0771 DDR1 WT和KO肿瘤的RNA-seq数据的基因本体分析的前10个生物过程(BP)。值表示平均值±SEM，p值如所指示的。
图8A-I：筛选huDDR1中和抗体。(图8a)在存在含有内源性DDR1 WT、DDR1 KO、DDR1KO和huDDR1的异位表达的E0771细胞的条件培养基的情况下，对纯化的CD8+T细胞进行Transwell迁移测定。(图8b)使用来自KO或KO+huDDR1 E0771细胞的条件培养基通过CD8+T细胞迁移测定筛选代表性中和抗体。对照：同种型IgG；抗huDDR1抗体：#3、#9、#14和#33。(图8c)用对照(α-IgG)和抗huDDR1抗体#9(n＝5)处理的小鼠的体重测量。(图8d-e)用同种型IgG或抗huDDR1#33抗体处理的C57BL/6(图8d)和Rag1-/-宿主(图8e)中的KO+huDDR1 E0771肿瘤。(图8f)通过SHG(灰色)、CD3染色(绿色)、To-pro-3染色(红色)和胶原蛋白纤维个体化(最右侧图)分析KO+huDDR1肿瘤核心。比例尺：50μm。(图8g-i)TIMER数据库中1,093个乳腺癌肿瘤中huDDR1 mRNA水平与免疫细胞毒性标志物基因IFNG(图8g)、GZMB(图8h)和PRF1(图8i)之间的相关性。值表示平均值±SEM，p值如所指示的。
图9：通过ELISA测定的DDR1-mAb与DDR1的结合。
图10A-B：使用滴定ELISA确定抗体与人DDR1和小鼠DDR1的结合亲和力。
图11：使用Octet仪器测量的抗DDR1抗体的动力学结合曲线。
图12A-C：抗hECD抗体抑制自发性肿瘤生长。为了证明抗DDR1抗体治疗对不同阶段乳腺肿瘤发生的影响，当平均肿瘤大小达到100mm3时(“肿瘤后”)，将MMTV-PyMT小鼠(C57BL/6菌株背景)用对照IgG或抗DDR1抗体治疗两周。(图12A-B)使用对照(n＝7)或人源化抗DDR1#9抗体(n＝8)以“肿瘤后”方案处理的C57BL/6遗传背景的MMTV-PyMT自发性乳腺肿瘤模型中的肿瘤生长动力学(每只小鼠，图12A)和肿瘤发生率(每只小鼠，图12B)。(图12C)通过SHG(灰色)、CD3染色(绿色)、To-pro-3染色(红色)和胶原蛋白纤维个体化(最右侧图)分析的来自肿瘤后治疗组的肿瘤的代表性图像。比例尺：50μm。
图13A-E：抗hECD抗体与DDR1激酶抑制剂的比较。用抗hECD抗体处理E0771乳腺肿瘤并评估肿瘤生长(图13A)和宿主体重(图13B)。先前公开的小分子DDR1激酶抑制剂7rh并未减少肿瘤生长(图13C)。这与DDR1依赖性抗肿瘤免疫排斥与其激酶活性无关的断言是一致的。(图13D)7rh不影响宿主体重。(图13E)用7rh处理的肿瘤具有显著降低的DDR1自身磷酸化，即DDR1酪氨酸激酶活性的标志物(Gao等人，《药物化学杂志(J Med Chem)》2013)。
图14A-C：DDR1是一些肿瘤类型生长所必需的。(图14A)基于CRISPR的肿瘤Ddr1的基因消融显著提高了携带ID8agg卵巢肿瘤的免疫活性宿主的存活率。(图14B-C)B16黑色素瘤或MC38结直肠肿瘤中的Ddr1 KO不影响同基因免疫活性宿主中的肿瘤生长。
图15A-C：DDR1与抗肿瘤免疫标志物的相关性。(图15A)多种癌症中的DDR1 mRNA水平与如颗粒酶B(GZMB)等细胞毒性免疫标志物呈负相关，这表明DDR1可能在许多癌症类型中拮抗抗肿瘤免疫。(图15B-C)对TCGA乳腺癌蛋白质组数据集(NCI CPTAC)的分析表明，DDR1蛋白水平也与CD8和细胞溶解效应子通路中的蛋白呈负相关。
图16：高肿瘤DDR1蛋白与TNBC中的免疫排斥相关。(左)使用未经处理的DDR1高(n＝7)和DDR1低(n＝5)TNBC肿瘤样品对DDR1、CD8和肿瘤特异性panCK进行多重IHC的图像。比例尺：200mm。在多重IHC中使用未经处理的TNBC队列表明，与分布在整个肿瘤中的CD8+细胞百分比较高的DDR1低肿瘤相比，DDR1高肿瘤显示肿瘤内的CD8+T细胞百分比降低，并且肿瘤边缘处的CD8+T细胞百分比更高(右)。
图17：用于在HEK293细胞中表达的DDR1细胞外(ECD)蛋白的结构域的重组构建示意图。DS：N末端盘状蛋白结构域；DSL：DS样结构域；JM：近膜结构域。
图18A-C：使用ELISA方法确定DDR1抗体与ECD和DS或DSL结构域的结合。重组DDR1细胞外(ECD)蛋白和结构域蛋白以2μg/ml的浓度包被在高结合96孔板上。(图18A)DDR1-9Hu抗体滴定用于确定结合曲线和EC50。DDR1 ECD的DS或DSL结构域的缺失导致人源化DDR1-9hu抗体的结合减少。DS结构域的单独缺失减少了结合，其中EC50为168ng/ml对83ng/ml，而DSL结构域的缺失完全消除了DDR1-9(图18B)和DDR1-14抗体结合。(图18C)
图19：使用ELISA方法测定一组单克隆抗体对人DDR2的交叉反应性。DDR1或DDR2ECD蛋白包被在高结合板上并以1ug/ml浓度添加单克隆抗体中的每种单克隆抗体，用于与HRP缀合的抗兔抗体(宾夕法尼亚州的杰克逊免疫研究实验室有限公司(JacksonImmuneResearch，PA))的结合检测。
具体实施方式
发明人确定肿瘤盘状蛋白结构域受体1(DDR1)在调节宿主免疫中起关键作用。DDR1是一种具有酪氨酸激酶活性的胶原蛋白受体。发明人发现DDR1诱导肿瘤防御，所述肿瘤防御防止宿主免疫细胞浸润肿瘤组织和以不依赖激酶的方式攻击肿瘤本身。发明人分离了一组识别DDR1蛋白的新型单克隆抗体，其可以用于癌症的治疗。抗人DDR1抗体是DDR1功能的拮抗剂，并且防止DDR1诱导肿瘤防御。
本公开的以下描述仅旨在说明本公开的各个实施例。如此，所讨论的具体修改不应被解释为对本公开的范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本公开的范围的情况下，可以做出各种等同物、改变和修改，并且应当理解，此类等同实施例将被包含在本文中。在本文中引用的所有文献，包含公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。
I.定义
应理解，前述一般描述和下述详细描述两者均仅为示例性和说明性的，并不是所要求保护的本发明的限制。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包含复数。在本申请中，除非另外说明，否则“或者”的使用是指“和/或”。此外，术语“包含(including)”以及如“包含(includes)”和“包含(included)”等其它形式的使用不是限制性的。此外，除非另外特别说明，否则如“元件”或“组件”等术语涵盖包括一个单元的元件和组件以及包括多于一个亚单元的元件和组件两者。此外，术语“部分”的使用可以包含部分的一部分或整个部分。
如本文所使用的，除非上下文清楚地另外指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述”包含复数指示物。
如本文所使用的术语“约”在提及如量、持续时间等可测量值时，意在涵盖所指定值的最大±10％的变化。除非另外指明，否则本说明书和权利要求中使用的表示成分的量、特性(如分子量、反应条件)等的所有数字应理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。因此，除非有相反地指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中所阐述的数值参数是可以根据寻求通过所公开主题获得的期望特性而改变的近似值。至少，并且不是试图将等同原则的应用限制到权利要求的范围，每个数值参数至少应该根据所报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实例中阐述的数值是尽可能精确地报告的。然而，任何数值固有地含有必然由在其相应测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。
术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其可以与完整抗体竞争与靶抗原特异性结合的片段，并且包含例如嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体和双特异性抗体。“抗体”是一种抗原结合蛋白。完整抗体将通常包括至少两条全长重链和两条全长轻链，但在一些情况下可以包含更少的链，如骆驼科中天然存在的抗体，其可以仅包括重链。抗体可以仅源自单一来源，或者可以是“嵌合的”，即，抗体的不同部分可以源自两种不同的抗体，如下文进一步描述的。抗原结合蛋白、抗体或结合片段可以在杂交瘤中通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。除非另有指示，否则术语“抗体”包含除了包括两条全长重链和两条全长轻链的抗体以外的其衍生物、变体、片段以及突变蛋白，所述抗体的实例如下描述。此外，除非明确排除，抗体分别包含单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体(在本文中有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合(在本文中有时称为“抗体缀合物”)和其片段。在一些实施例中，所述术语也涵盖肽体。
天然存在的抗体结构单位通常包括四聚体。每个此类四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对具有一条全长“轻”链(在某些实施例中，约25kDa)和一条全长“重”链(在某些实施例中，约50kDa到70kDa)。每条链的氨基末端部分通常包含通常负责抗原识别的具有约100到110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端部分通常限定了可以负责效应子功能的恒定区。人轻链通常被分类为κ和λ轻链。重链通常被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干个亚类，包含但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包含但不限于IgM1和IgM2。IgA类似地分为亚类，包含但不限于IgA1和IgA2。在全长轻链和重链中，可变区和恒定区通常通过约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链还包含约10个更多氨基酸的“D”区。参见例如《基础免疫学(Fundamental Immunology)》，第7章(Paul，W.，编辑，第2版.纽约雷文出版社(RavenPress，N.Y.)(1989))(所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文)。每个轻/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的轻链和/或重链的一部分，通常包含重链中大约120个到130个氨基酸的氨基末端以及轻链中约100个到110个氨基末端。在某些实施例中，不同抗体的可变区在氨基酸序列上存在很大差异，甚至在相同物种的抗体中也是如此。抗体的可变区通常决定特定抗体对其靶标的特异性。
可变区通常展现出由三个超可变区(也称为互补性决定区或CDR)接合的相对保守的框架区(FR)的相同一般结构。来自每对的两条链的CDR通常由框架区比对，所述框架区可以与特定表位结合。从N末端到C末端，轻链可变区和重链可变区两者通常都包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对每个结构域的氨基酸的指配通常符合免疫学相关蛋白的卡巴特序列(Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest)定义(马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，Bethesda，Md.)(1987和1991))，Chothia和Lesk，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》，196：901-917(1987)或Chothia等人，《自然(Nature)》，342：878-883(1989)。
在某些实施例中，抗体重链在不存在抗体轻链的情况下与抗原结合。在某些实施例中，抗体轻链在不存在抗体重链的情况下与抗原结合。在某些实施例中，抗体结合区在不存在抗体轻链的情况下与抗原结合。在某些实施例中，抗体结合区在不存在抗体重链的情况下与抗原结合。在某些实施例中，单个可变区在不存在其它可变区的情况下与抗原特异性结合。
在某些实施例中，通过解析抗体的结构和/或解析抗体-配体复合物的结构来完成CDR的明确描绘和包括抗体结合位点的残基的鉴定。在某些实施例中，这可以通过本领域技术人员已知的多种技术中的任何技术来完成，如X射线晶体学。在某些实施例中，可以采用各种分析方法来识别或模拟CDR区。此类方法的实例包含但不限于Kabat定义、Chothia定义、AbM定义、IMGT定义和接触定义。
Kabat定义是用于对抗体中的残基进行编号的标准，并且通常用于鉴定CDR区。参见例如，Johnson和Wu，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》，28：214-8(2000)。Chothia定义类似于Kabat定义，但Chothia定义考虑了某些结构环区的位置。参见例如，Chothia等人，《分子生物学杂志》，196：901-17(1986)；Chothia等人，《自然》，342：877-83(1989)。AbM定义使用由牛津分子集团(Oxford Molecular Group)生产的对抗体结构进行建模的计算机程序的集成套件(integrated suite)。参见例如，Martin等人，《美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad Sci(USA))》，86：9268-9272(1989)；“AbMTM，用于对抗体可变区进行建模的计算机程序(AbMTM，A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies)”，英国牛津牛津分子有限公司(Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd.)。AbM定义使用知识数据库和从头算方法的组合，对来自一级序列的抗体的三级结构进行建模，如以下文献所描述的那些：Samudrala等人，“使用组合分层方法的从头算蛋白质结构预测(Ab InitioProtein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach)”，《蛋白质，结构、功能、和基因学(PROTEINS，Structure，Function and Genetics)》增刊3：194-198(1999)。接触定义是基于对可用的复杂晶体结构的分析。参见例如，MacCallum等人，《分子生物学杂志》，5：732-45(1996)。IMGT定义使用独特的编号***，所述编号***组合了框架(FR)和CDR区的定义、X射线衍射研究中的结构数据以及超可变环的表征，如以下文献中描述的：Lefranc M-P等人，“IMGT免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域的唯一编号(IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptorvariable domains and Ig superfamily V-like domains)”，《发育与比较免疫学(DevComp Immunol)》27：55-77(2003)。在一个优选实施例中，CDR序列基于IMGT定义。
按照惯例，重链中的CDR区通常称为H1、H2和H3，并按从氨基末端到羧基末端的方向顺序编号。轻链中的CDR区通常称为L1、L2和L3，并按从氨基末端到羧基末端的方向顺序编号。在本公开中，轻链可变区的CDR区也表示为LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，而重链可变区的CDR区表示为HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3。
术语“轻链”包含具有足够可变区序列以赋予结合特异性的全长轻链和其片段。全长轻链包含可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端处。轻链包含κ链和λ链。
术语“重链”包含具有足够可变区序列以赋予结合特异性的全长重链和其片段。全长重链包含可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端处，并且CH结构域位于羧基末端处，其中CH3最接近多肽的羧基末端。重链可以是任何同种型，包含IgG(包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包含IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。
“双特异性”或“双官能抗体”通常是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包含但不限于融合杂交瘤或连接Fab′片段。参见例如，Songsivilai等人，《临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)》，79：315-321(1990)；Kostelny等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》148：1547-1553(1992)。
术语“抗原”是指能够诱导适应性免疫应答的物质。具体而言，抗原是用作适应性免疫应答受体的靶标的物质。通常，抗原是与抗原特异性受体结合但自身不能在体内诱导免疫应答的分子。抗原通常是蛋白质和多糖，不太常见的也有脂质。合适的抗原包含但不限于细菌的部分(外壳、荚膜、细胞壁、鞭毛、菌毛和毒素)、病毒和其它微生物。抗原还包含肿瘤抗原，例如，由肿瘤中的突变生成的抗原。如本文所使用的，抗原还包含免疫原和半抗原。
如本文所使用的，术语“抗原结合蛋白”(“ABP”)意指与特定靶抗原结合的任何蛋白质。在本申请中，特定的靶抗原是DDR1蛋白或其片段。“抗原结合蛋白”包含但不限于抗体和其抗原结合片段。肽体是抗原结合蛋白的另一个实例。
如本文所使用的，术语“抗原结合片段”是指能够与抗原特异性结合的蛋白质的一部分。在某些实施例中，抗原结合片段源自包括一个或多个CDR的抗体，或与抗原结合但不包括完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。在某些实施例中，抗原结合片段不是源自抗体而是源自受体。抗原结合片段的实例包含但不限于双抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv′)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、骆驼抗体或纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。在某些实施例中，抗原结合片段能够与亲本抗体所结合的相同抗原结合。在某些实施例中，抗原结合片段可以包括来自特定人抗体的一个或多个CDR，其移植到来自一种或多种不同人抗体的框架区。在某些实施例中，抗原结合片段源自受体并且含有一个或多个突变。在某些实施例中，抗原结合片段不与抗原结合片段来源的受体的天然配体结合。
术语“Fab片段”包括一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
术语“Fab′片段”包括一条轻链和一条重链的一部分，使得可以在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab′)2分子，所述一条重链的一部分含有VH结构域和CH1结构域以及还含有位于CH1结构域与CH2结构域之间的区域。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条重链，使得在两条重链之间形成链间二硫键，所述两条重链含有位于CH1结构域与CH2结构域之间的恒定区的一部分。因此，F(ab′)2片段由两个Fab′片段构成，所述两个Fab′片段由位于两条重链之间的二硫键保持在一起。
“Fc”区域包括两个重链片段，所述重链片段包括抗体的CH1结构域和CH2结构域。两个重链片段由两个或更多个二硫键并且通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
“Fv区域”包括来自重链和轻链两者的可变区但是缺乏恒定区。
“单链抗体”是Fv分子，其中重链可变区和轻链可变区通过柔性接头连接以形成单个多肽链，所述单个多肽链形成抗原结合区。单链抗体在国际专利申请公开第WO 88/01649号和美国专利第4,946,778号和第5,260,203号中进行了详细讨论，所述文献的公开内容通过引用并入。
“结构域抗体”是仅含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。
“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包括两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。二价抗原结合蛋白和二价抗体可以是双特异性的，参见下文。在某些实施例中，除“多特异性”或“多官能”抗体之外的二价抗体通常被理解为其结合位点中的每个结合位点相同。
“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是一种靶向多于一个抗原或表位的抗体。
“双特异性(bispecific)”、“双特异性(dual-specific)”或“双官能”抗原结合蛋白或抗体分别是杂合抗原结合蛋白或抗体，具有两个不同的抗原结合位点。双特异性抗原结合蛋白和抗体是一种多特异性抗原结合蛋白抗体，并且可以通过多种方法产生，包含但不限于杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。参见例如，Songsivilai和Lachmann，1990，《临床与实验免疫学》79：315-321；Kostelny等人，1992，《免疫学杂志》148：1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将与两个不同的表位结合，所述两个不同的表位可以驻留在相同或不同的蛋白质靶标上。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所使用的，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法来测量，包含本文所描述的那些方法。低亲和力抗体通常会缓慢与抗原结合并倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地与抗原结合并倾向于保持更长的结合。多种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本发明的目的。以下描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性实施例和示范性实施例。
与特定多肽或特定多肽上的表位“特异性结合”或对其“具有特异性”的抗体是与所述特定多肽或特定多肽上的表位结合而不与任何其它多肽或多肽表位实质性结合的抗体。例如，本发明的DDR1特异性抗体对DDR1具有特异性。在一些实施例中，与DDR1结合的抗体的解离常数(Kd)≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如，10-8M到10-13M，例如，10-9M到10-13M)。
术语“竞争”在用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)的上下文时，意指由测定确定的抗原结合蛋白之间的竞争，在所述测定中，被测抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)阻止或抑制(例如，减少)参考抗原结合蛋白(例如，配体或参考抗体)与共同抗原(例如，DDR1或其片段)的特异性结合。可以使用多种类型的竞争性结合测定来确定一种抗原结合蛋白是否与另一种抗原结合蛋白竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如，Stahli等人，1983，《酶学方法(Methods in Enzymology)》9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如，Kirkland等人，1986，《免疫学杂志》137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如，Harlow和Lane，1988，《抗体：实验室手册(Antibodies，A Laboratory Manual)》，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press))；使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见例如，Morel等人，1988，《分子免疫学(Molec.Immunol.)》25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如，Cheung等人，1990，《病毒学(Virology)》176：546-552)；以及直接标记RIA(Moldenhauer等人，1990，《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》32：77-82)。通常，此类测定涉及使用与固体表面结合的纯化抗原或携带这些中的任何一种的细胞、未标记的测试抗原结合蛋白和标记的参考抗原结合蛋白。通过在存在测试抗原结合蛋白的情况下确定与固体表面或细胞结合的标记量来测量竞争抑制。通常，过量存在测试抗原结合蛋白。通过竞争测定鉴定的抗原结合蛋白(竞争抗原结合蛋白)包含和参考抗原结合蛋白一样与相同表位结合的抗原结合蛋白，以及与相邻表位结合的抗原结合蛋白，所述相邻表位与所述参考抗原结合蛋白结合的表位足够近，以发生空间位阻。本文的实例提供了有关用于确定竞争性结合的方法的另外的详细信息。通常，当过量存在竞争抗原结合蛋白时，所述竞争抗原结合蛋白将抑制(例如，减少)参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合至少40％到45％、45％到50％、50％到55％、55％到60％、60％到65％、65％到70％、70％到75％或75％或更多。在一些情况下，结合至少被抑制80％到85％、85％到90％、90％到95％、95％到97％或97％或更多。
如本文所使用的术语“表位”是指与抗体结合的抗原上的特定的一组原子或氨基酸。表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由抗原的连续氨基酸序列形成并基于其一级结构与抗体相互作用。另一方面，构象表位由抗原氨基酸序列的不连续区段组成并基于抗原的3D结构与抗体相互作用。通常，表位的长度大约为五个或六个氨基酸。如果两种抗体对抗原展现出竞争性结合，则它们可以与抗原内的相同表位结合。
如本文所使用的“细胞”可以是原核或真核。原核细胞包含，例如，细菌。真核细胞包含，例如，真菌、植物细胞和动物细胞。动物细胞的类型(例如，哺乳动物细胞或人细胞)包含，例如，来自循环/免疫***或器官的细胞，例如，B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调控T细胞，T辅助细胞)、自然杀伤细胞、粒细胞(例如，嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和分叶过多中性粒细胞)、单核细胞或巨噬细胞、红细胞(例如，网织红细胞)、肥大细胞、血小板或巨核细胞以及树突状细胞；来自内分泌***或器官的细胞，例如，甲状腺细胞(例如，甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺细胞(例如，甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞)、肾上腺细胞(例如，嗜铬细胞)，以及松果体细胞(例如，松果腺细胞)；来自神经***或器官的细胞，例如，成胶质细胞(例如，星形胶质细胞和少突胶质细胞)、小胶质细胞、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、伯特歇尔细胞(boettcher cell)和垂体细胞(例如，***细胞、促肾上腺皮质激素细胞、促甲状腺激素细胞、促生长激素细胞和催乳激素细胞)；来自呼吸***或器官的细胞，例如，肺细胞(I型肺细胞和II型肺细胞)、克拉拉细胞(clara cell)、杯状细胞和肺泡巨噬细胞；来自循环***或器官的细胞(例如，心肌细胞和周细胞)；来自消化***或器官的细胞，例如，胃粘膜主细胞、壁细胞、杯状细胞、潘氏细胞(paneth cell)，G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞以及肝细胞(例如，肝细胞和库普弗细胞(Kupffer cell))；来自皮肤***或器官的细胞，例如，骨细胞(例如，成骨细胞、骨细胞和破骨细胞)、齿细胞(例如，成牙骨质细胞和造釉细胞)、软骨细胞(例如，成软骨细胞和软骨细胞)、皮肤/毛发细胞(例如，毛细胞、角化细胞和黑色素细胞(痣细胞)、肌肉细胞(例如，肌细胞)、脂肪细胞、成纤维细胞以及肌腱细胞；来自泌尿***或器官的细胞(例如，足细胞、球旁细胞、球内系膜细胞、球外系膜细胞、肾近端刷状缘细胞和致密斑细胞)；以及来自生殖***或器官的细胞(例如，***、塞尔托利氏细胞(Sertoli cell)、莱氏细胞(leydig cell)、卵子、***)。细胞可以是正常的、健康的细胞；或患病或不健康的细胞(例如，癌细胞)。细胞进一步包含哺乳动物受精卵或干细胞，其中包含胚胎干细胞、胎儿干细胞、诱导的多能干细胞和成体干细胞。干细胞是能够进行多个周期的细胞***，同时保持未分化的状态并分化成特化细胞类型的细胞。干细胞可以是全能干细胞、多能干细胞(pluripotent stem cell)、多能干细胞(multipotent stemcell)、寡能干细胞和单能干细胞，其中的任何一种可能是由体细胞诱导的。干细胞还可能包含癌症干细胞。哺乳动物细胞可以是啮齿动物细胞，例如，小鼠、大鼠、仓鼠细胞。哺乳动物细胞可以是兔类细胞，例如，兔细胞。哺乳动物细胞也可以是灵长类动物细胞，例如，人细胞。
术语“嵌合抗原受体”或如本文所使用的“CAR”是指人工构建的杂合蛋白或多肽，其含有与激活免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)的结构域或信号传导(例如，T细胞信号传导或T细胞激活结构域)连接的抗体的抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scFv))，(参见例如，Kershaw等人，同上；Eshhar等人，《美国国家科学院院刊》，90(2)：720-724(1993)以及Sadelain等人，《当前免疫学观点(Curr.Opin.Immunol.)》21(2)：215-223(2009))。CAR能够利用单克隆抗体的抗原结合特性，以非MHC限制性方式将免疫细胞特异性和对所选靶标的反应性重定向。非MHC限制性抗原识别使表达CAR的免疫细胞能够识别独立于抗原处理的抗原，从而绕开了肿瘤逃逸的主要机制。另外，当在T细胞中表达时，有利地，CAR不会与内源性T细胞受体(TCR)α和β链发生二聚。
如本文所使用的，就指定组分而言，“本质上不含”在本文中用于意指指定组分没有被故意调配成组合物和/或仅作为污染物或以微量存在。因此，由组合物的任何非预期污染产生的特定组分的总量远低于0.05％，优选地低于0.01％。最优选的是其中使用标准分析方法检测不到指定组分的量的组合物。
术语“宿主细胞”意指已经被核酸序列转化或能够被转化并由此表达所关注的基因的细胞。所述术语包含亲本细胞的后代，无论后代与原始亲本细胞在形态上或遗传构成上是否一致，只要存在所关注的基因即可。
术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列确定的。“同一性百分比”意指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并且是基于比较的分子中的最小分子的大小来计算的。对于这些计算，优选地通过特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)来解决比对中的空位(如果有的话)。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包含以下文献中描述的那些方法：《计算分子生物学(Computational Molecular Biology)》，(Lesk，A.M.，编辑)，1988，纽约：牛津大学出版社(New York：Oxford University Press)；《生物计算信息学和基因组计划(Biocomputing Informatics and Genome Projects)》，(Smith，D.W.，编辑)，1993，纽约：学术出版社(New York：Academic Press)；《序列数据的计算机分析(Computer Analysisof Sequence Data)》，第I部分，(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编辑)，1994，新泽西州：胡马纳出版社(New Jersey：Humana Press)；von Heinje，G.，1987，《分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)》，纽约：学术出版社；《序列分析引物(Sequence Analysis Primer)》，(Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑)，1991，纽约：米斯托克顿出版社(New York：M.Stockton Press)；以及Carillo等人，1988，《工业与应用数学学会应用数学杂志(SIAM J.Applied Math.)》48：1073。
在计算同一性百分比时，进行比较的序列通常以使序列之间的匹配最大的方式比对。可以用于确定同一性百分比的计算机程序的一个实例是GCG程序包，所述程序包包含GAP(Devereux等人，1984，《核酸研究》12：387；威斯康星州麦迪逊威斯康星大学遗传学计算机组(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，Wis.))。计算机算法GAP用于比对要确定百分比序列同一性的两个多肽或多核苷酸。对序列进行比对，以实现其相应氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配范围”，如由算法确定的)。空位开放罚分(其计算为3×平均对角线，其中“平均对角线”是使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是特定比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的评分或数字)和空位延伸罚分(其通常是空位开放罚分的1/10倍)以及如PAM 250或BLOSUM 62等比较矩阵与算法一起使用。在某些实施例中，标准比较矩阵(参见Dayhoff等人，1978，《蛋白序列和结构图谱学(Atlas of ProteinSequence and Structure)》5：345-352中关于PAM 250比较矩阵的内容；Henikoff等人，1992，《美国国家科学院院刊》89：10915-10919中关于BLOSUM 62比较矩阵的内容)也被算法使用。
可以用于使用GAP程序确定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的参数的实例可以见于以下文献中：Needleman等人，1970，《分子生物学杂志》48：443-453。
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可能仅导致两个序列中的一个短区域匹配，并且此小的比对区域可能具有很高的序列同一性，尽管两个全长序列之间没有显著关系。因此，如果期望，可以调整选择的比对方法(GAP程序)以产生跨越靶多肽的至少50个或其它数量的连续氨基酸的比对。
如本文所使用的术语“连接”是指通过分子内相互作用例如，共价键、金属键和/或离子键或分子间相互作用例如，氢键或非共价键缔合。
术语“可操作地连接”是指其中如此描述的组件被配置成执行其常用功能的元件布置。因此，与多肽可操作地连接的给定信号肽可以从细胞中指导多肽的分泌。在启动子的情况下，与编码序列可操作地连接的启动子将指导编码序列的表达。启动子或其它控制元件不必与编码序列毗连，只要其起到指导其表达的作用。例如，中间的未翻译但仍被转录的序列可以存在于启动子序列与编码序列之间，并且仍然可以认为启动子序列“可操作地连接”到编码序列。
除非明确指示仅指替代方案或替代方案相互排斥，否则在权利要求书中使用术语“或”用于意指“和/或”，但本公开支持仅指代替代方案以及指代“和/或”的定义。如本文所使用的，“另一个”可以意指至少第二个或更多个。
术语“多核苷酸”或“核酸”包含单链和双链核苷酸聚合物。包括多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一种核苷酸类型的经修饰形式。所述修饰包含碱基修饰，如溴尿嘧啶核苷和肌苷衍生物、核糖修饰，如2′，3′-二脱氧核糖以及核苷酸间键合修饰，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。
术语“多肽”或“蛋白质”意指具有天然蛋白质的氨基酸序列的大分子，即，由天然存在的和非重组细胞产生的蛋白质；或者所述蛋白质是由基因工程化或重组细胞产生的，并且包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子或具有天然序列的一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代的分子。所述术语还包含氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸是对应天然存在的氨基酸的化学类似物以及聚合物。术语“多肽”和“蛋白质”具体地涵盖DDR1抗原结合蛋白、抗体或具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。术语“多肽片段”是指与全长天然蛋白相比，具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。与天然蛋白相比，此类片段还可以含有经修饰的氨基酸。在某些实施例中，片段约为五到500个氨基酸长。例如，片段可以是至少5个、6个、8个、10个、14个、20个、50个、70个、100个、110个、150个、200个、250个、300个、350个、400个或450个氨基酸长。有用的多肽片段包含抗体的免疫功能性片段，包含结合结构域。在DDR1结合抗体的情况下，有用的片段包含但不限于CDR区、重链和/或轻链的可变结构域、抗体链的一部分或仅包含两个CDR的其可变区等。
在本发明中有用的药学上可接受的载体是常规的。E.W.Martin，《雷明顿氏药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Co.，Easton，PA)，第15版(1975)描述了适用于本文所公开的融合蛋白的药物递送的组合物和调配物。通常，载体的性质将取决于所采用的特定施用模式。例如，肠胃外调配物通常包括可注射流体，其包含药学和生理学可接受的流体，如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为媒剂。对于固体组合物(粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包含，例如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体之外，要施用的药物组合物可以含有少量无毒的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如，乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
如本文所使用的，术语“受试者”是指人类或任何非人类动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人类包含出生前形式和出生后形式。在许多实施例中，受试者是人类。受试者可以是患者，所述患者是指呈现给医疗提供者以进行疾病的诊断或治疗的人类。术语“受试者”在本文中与“个体”或“患者”可互换地使用。受试者可以患有或易于患上疾病或病症，但是可以或可以不展示出疾病或病症的症状。
如本文所用的术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指有效治疗疾病或病状的药物的剂量或浓度。例如，关于本文所公开的单克隆抗体或其抗原结合片段治疗癌症的用途，治疗有效量是能够减少肿瘤体积，根除全部或部分肿瘤，抑制或减缓肿瘤生长或癌细胞向其它器官的浸润，抑制介导癌症状况的细胞的生长或增殖，抑制或减缓肿瘤细胞转移，改善与肿瘤或癌性病状相关的任何症状或标志物，防止或延缓肿瘤或癌性病状的发展或其一些组合的单克隆抗体或其抗原结合片段的剂量或浓度。
如本文所使用的，“治疗(treating或treatment)”病状包含预防或减轻病状、减缓病状的发作或发展速率、降低罹患病状的风险、预防或延迟与病状相关的症状的发展、减轻或结束与病状相关的症状、产生病状的完全或部分消退、治愈病状或其某种组合。
如本文所使用的，“载体”是指引入到宿主细胞中由此产生经转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞(如复制起点)中进行复制的核酸序列。载体还可以包含一个或多个治疗基因和/或可选标志物基因以及本领域中已知的其它基因元件。载体可以转导、转化或感染细胞，由此使细胞表达除对细胞来说天然的核酸和/或蛋白质之外的核酸和/或蛋白质。载体任选地包含有助于实现核酸进入细胞中的材料，如病毒颗粒、脂质体、蛋白质包衣等。
II.DDR1和DDR1抗体
A.DDR1
受体酪氨酸激酶(RTK)在细胞与其微环境的连通中起关键作用。这些分子参与细胞生长、分化和代谢的调节。DDR1基因编码的DDR1蛋白是在正常和转化的上皮细胞中广泛表达，并被各种类型的胶原蛋白激活的RTK。DDR1蛋白属于酪氨酸激酶受体的亚家族，在其细胞外结构域中与盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)蛋白盘状蛋白I具有同源区。迄今已测试的所有胶原蛋白(I型到VI型)都可以实现其自身磷酸化。密切相关的家族成员是DDR2蛋白。原位研究和Northern印迹分析表明，DDR1编码的蛋白的表达限于上皮细胞，尤其是在肾、肺、胃肠道和脑中。另外，在来自乳腺、卵巢、食管和小儿脑的若干种人肿瘤中，DDR1蛋白明显过表达。此基因定位于染色体6p21.3上，与若干个HLAI类基因接近。此基因的替代性剪接会导致多个转录变体。DDR1的代表性mRNA序列是NM_001202521(SEQ ID NO：1)，并且代表性氨基酸序列是NP_001189450(SEQ ID NO：2)。
B.DDR1蛋白的抗体
根据本公开的抗体或其抗原结合片段可以首先通过其结合特异性来定义，在此情况下，所述结合特异性是针对DDR1的。本领域技术人员通过使用本领域技术人员熟知的技术评估给定抗体的结合特异性/亲和力，可以确定此类抗体是否落入本权利要求书的范围内。
一方面，提供了与DDR1特异性结合的抗体和抗原结合片段。在一些实施例中，当与DDR1结合时，此类抗体调节DDR1的激活。在某些实施例中，当与DDR1结合时，抗体或抗原结合片段激活DDR1。在某些实施例中，当与DDR1结合时，抗体或抗原结合片段抑制DDR1的激活。在某些实施例中，当与DDR1结合时，抗体或抗原结合片段可以特异性地干扰、阻断或减少DDR1与其结合配偶体之间的相互作用。在某些实施例中，本文提供的抗体或抗原结合片段特异性地或选择性地与人DDR1结合。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段特异性地与人DDR1结合和/或基本上抑制人DDR1与其结合配偶体的结合至少约20％到40％、40％到60％、60％到80％、80％到85％或更多(例如，通过实例中公开的测定)。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段的Kd小于(结合更紧密)10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M。
尽管本公开的抗体是作为IgG生成的，但修饰恒定区以改变其功能可能很有用。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，包含免疫***的不同细胞(例如，效应子细胞)以及经典补体***的第一组分(Clq)。因此，术语“抗体”包含IgA、IgG、IgE、IgD、IgM类型(以及其亚型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ类型。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链还包含约10个更多氨基酸的“D”区。通常参见《基础免疫学》第7章(Paul，W.，编辑，第2版.纽约雷文出版社(1989)。
在一些实施例中，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与DDR1蛋白特异性结合，其中所述抗体包括表3中所示的轻链可变区序列中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3以及表4中所示的重链可变区序列中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；或其变体，其中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括表3中所示的轻链可变区序列中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3以及表4中所示的重链可变区序列中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3；或其变体，其中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个，两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合，其中所述轻链可变区序列和所述重链可变区序列分别是表3中和表4中所示的克隆配对的(例如，具有相同的mAb名称)轻链可变区序列和重链可变区序列。轻链可变区序列的“克隆配对的”LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3以及重链可变区序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3的示例性实施例分别是mAb DDR1-1的轻链可变区序列和重链可变区序列的LC-CDR和HC-CDR。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有选自表1中所示的每个mAb的LC-CDR1序列、LC-CDR2序列和LC-CDR3序列的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；所述重链可变区具有选自表2中所示的每个mAb的HC-CDR1序列、HC-CDR2序列和HC-CDR3序列的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，所述重链可变区具有分别在表1和表2中所示的克隆配对的LC-CDR和HC-CDR的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
表1.DDR1抗体的轻链氨基酸可变区序列的CDR
mAb名称 CDR1 SEQ ID NO CDR2 CDR3 SEQ ID NO
DDR1-1 QNIYSN 3 GAS QSGYYSSSTDIA 4
DDR1-3 QTISSW 5 YAF QQGISSSNVDNV 6
DDR1-5 QTISSW 7 YAF QCTYGSGSSSSYGCA 8
DDR1-6 QSVYSNY 9 ETS QGGYSEIIENT 10
DDR1-9 QSIGSV 11 GVF QYIPYGSSP 12
DDR1-11 QSIGSTY 13 KAS LYGGFGSSTGDA 14
DDR1-12 QTIYSN 15 QAS QSYYGADDYT 16
DDR1-13 KSVYNNNA 17 GVS AGDYSDISDNN 18
DDR1-14 QSISSY 19 EAS QNNNGFSGSNFNN 20
DDR1-15 QTIYSS 21 KAS QQGSSISNVDKNA 22
DDR1-17 QSIGSY 23 EAS QNNNGMTVSDFNA 24
DDR1-20 QIIDHDH 25 RAS QNNNGMTVSDFNA 26
DDR1-21 QSVVDKNW 27 EAS AGDFESGVSG 28
DDR1-22 KNIYNNNA 29 GAS AADYSDISDNN 30
DDR1-23 QSVYSNNY 31 AAS LGGYNDDAN 32
DDR1-26 ESVYSNNH 33 AAS LGGYNDDAN 34
DDR1-28 QSIDNND 35 RTS QSYCVNTYGYT 36
DDR1-29 QSISNH 37 RAS QSYYIINRSNYANS 38
DDR1-32 ESINSW 39 DAS QSYYIINRSNYGNS 40
DDR1-33 ETISSR 41 QAS QGCYYGGGSFYDSA 42
DDR1-34 ENLYKDNY 43 GAS AGGYDSVVD 44
表2.DDR1抗体的重链氨基酸可变区序列的CDR
Figure BPA0000324724060000231
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QNIYSN(SEQ ID NO：3)的LC-CDR1、包括氨基酸序列GAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列QSGYYSSSTDIA(SEQ ID NO：4)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSLSRYA(SEQ ID NO：45)的HC-CDR1、包括氨基酸序列IGSSGLT(SEQ ID NO：46)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARGMWYDDSDDYEDYFNL(SEQ ID NO：47)(DDR1-1)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QTISSW(SEQ ID NO：5)的LC-CDR1、包括氨基酸序列YAF的LC-CDR2和包括氨基酸序列QQGISSSNVDNV(SEQ ID NO：6)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GIDLSSYA(SEQ ID NO：48)的HC-CDR1、包括氨基酸序列INIGGGT(SEQ ID NO：49)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARDVDAHTLTYFTL(SEQ ID NO：50)(DDR1-3)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QTISSW(SEQ ID NO：7)的LC-CDR1、包括氨基酸序列YAF的LC-CDR2和包括氨基酸序列QCTYGSGSSSSYGCA(SEQ ID NO：8)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFTLSNNA(SEQ ID NO：51)的HC-CDR1、包括氨基酸序列IYASGRT(SEQ ID NO：52)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARGDTETDYGIPYFDL(SEQ ID NO：53)(DDR1-5)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QSVYSNY(SEQ ID NO：9)的LC-CDR1、包括氨基酸序列ETS的LC-CDR2和包括氨基酸序列QGGYSEIIENT(SEQ ID NO：10)的LC-CDR3，以及重链可变区，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSFSSSYY(SEQ ID NO：54)的HC-CDR1、包括氨基酸序列IYASSGST(SEQ ID NO：55)的HC-CDR2和包括氨基酸序列AILGADYRLTRLDL(SEQID NO：56)(DDR1-6)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QSIGSV(SEQ ID NO：11)的LC-CDR1、包括氨基酸序列GVF的LC-CDR2和包括氨基酸序列QYIPYGSSP(SEQ ID NO：12)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSLNRYY(SEQ ID NO：57)的HC-CDR1、包括氨基酸序列ISYGDTT(SEQ ID NO：58)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARADTGDNGYLGLQL(SEQ ID NO：59)(DDR1-9)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QSIGSTY(SEQ ID NO：13)的LC-CDR1、包括氨基酸序列KAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列LYGGFGSSTGDA(SEQ ID NO：14)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSFSSGYY(SEQ ID NO：60)的HC-CDR1、包括氨基酸序列IYTGRTDFT(SEQ ID NO：61)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARGDYSGGVGGNYWLDL(SEQ ID NO：62)(DDR1-11)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QTIYSN(SEQ ID NO：15)的LC-CDR1、包括氨基酸序列QAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列QSYYGADDYT(SEQ ID NO：16)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GIDLSNTW(SEQ ID NO：63)的HC-CDR1、包括氨基酸序列ITDSGTT(SEQ ID NO：64)的HC-CDR2和包括氨基酸序列GRDPGDITSGTNDL(SEQ ID NO：65)(DDR1-12)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列KSVYNNNA(SEQ ID NO：17)的LC-CDR1、包括氨基酸序列GVS的LC-CDR2和包括氨基酸序列AGDYSDISDNN(SEQ ID NO：18)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列SGFSLNNY(SEQ ID NO：66)的HC-CDR1、包括氨基酸序列IFNNGDI(SEQ ID NO：67)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARTGYRTGGWL(SEQ ID NO：68)(DDR1-13)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QSISSY(SEQ ID NO：19)的LC-CDR1、包括氨基酸序列EAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列QNNNGFSGSNFNN(SEQ ID NO：20)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GIDLSYYA(SEQ ID NO：69)的HC-CDR1、包括氨基酸序列INGRGDT(SEQ ID NO：70)的HC-CDR2和包括氨基酸序列AREDSAIPFIVGNYYGMDL(SEQ ID NO：71)(DDR1-14)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QTIYSS(SEQ ID NO：21)的LC-CDR1、包括氨基酸序列KAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列QQGSSISNVDKNA(SEQ ID NO：22)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列TFSFNSRYW(SEQ ID NO：72)的HC-CDR1、包括氨基酸序列INNGDIS(SEQ ID NO：73)的HC-CDR2和包括氨基酸序列AKGGNLAGDCYGL(SEQ ID NO：74)(DDR1-15)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QSIGSY(SEQ ID NO：23)的LC-CDR1、包括氨基酸序列EAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列QNNNGMTVSDFNA(SEQ ID NO：24)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSLNRYA(SEQ ID NO：75)的HC-CDR1、包括氨基酸序列IGSSGST(SEQ ID NO：76)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARDLDDSYGYTYATGMDIRLDL(SEQ IDNO：77)(DDR1-17)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QIIDHDH(SEQ ID NO：25)的LC-CDR1、包括氨基酸序列RAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列QNNNGMTVSDFNA(SEQ ID NO：26)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSLSDYA(SEQ ID NO：78)的HC-CDR1、包括氨基酸序列INSRDDT(SEQ ID NO：79)的HC-CDR2和包括氨基酸序列AREDSSIPFIVGNYYGMDL(SEQ ID NO：80)(DDR1-20)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QSVVDKNW(SEQ ID NO：27)的LC-CDR1、包括氨基酸序列EAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列AGDFESGVSG(SEQ ID NO：28)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSLSSYG(SEQ ID NO：81)的HC-CDR1、包括氨基酸序列IYPSGSI(SEQ ID NO：82)的HC-CDR2和包括氨基酸序列VRYLTGSSDLHL(SEQ ID NO：83)(DDR1-21)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列KNIYNNNA(SEQ ID NO：29)的LC-CDR1、包括氨基酸序列GAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列AADYSDISDNN(SEQ ID NO：30)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSLSDYA(SEQ ID NO：84)的HC-CDR1、包括氨基酸序列INNGDIY(SEQ ID NO：85)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARPGYRTGIWL(SEQ ID NO：86)(DDR1-22)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QSVYSNNY(SEQ ID NO：31)的LC-CDR1、包括氨基酸序列AAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列LGGYNDDAN(SEQ ID NO：32)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFDLRSYYY(SEQ ID NO：87)的HC-CDR1、包括氨基酸序列IHGGEGNT(SEQ ID NO：88)的HC-CDR2和包括氨基酸序列RGGWTNYF(SEQ ID NO：89)(DDR1-23)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列ESVYSNNH(SEQ ID NO：33)的LC-CDR1、包括氨基酸序列AAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列LGGYNDDAN(SEQ ID NO：34)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFDLSSNYY(SEQ ID NO：90)的HC-CDR1、包括氨基酸序列IYSSNTRT(SEQ ID NO：91)的HC-CDR2和包括氨基酸序列RGGWTNYL(SEQ ID NO：92)(DDR1-26)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QSIDNND(SEQ ID NO：35)的LC-CDR1、包括氨基酸序列RTS的LC-CDR2和包括氨基酸序列QSYCVNTYGYT(SEQ ID NO：36)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSLSSHD(SEQ ID NO：93)的HC-CDR1、包括氨基酸序列IISSGNT(SEQ ID NO：94)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARDVYSGASP(SEQ ID NO：95)(DDR1-28)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QSISNH(SEQ ID NO：37)的LC-CDR1、包括氨基酸序列RAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列QSYYIINRSNYANS(SEQ ID NO：38)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列TFSFNSRYW(SEQ ID NO：96)的HC-CDR1、包括氨基酸序列INNGDIT(SEQ ID NO：97)的HC-CDR2和包括氨基酸序列AKGGNLAGDCYGL(SEQ ID NO：98)(DDR1-29)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列ESINSW(SEQ ID NO：39)的LC-CDR1、包括氨基酸序列DAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列QSYYIINRSNYGNS(SEQ ID NO：40)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSLSSYY(SEQ ID NO：99)的HC-CDR1、包括氨基酸序列ITTAGPL(SEQ ID NO：100)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARGHAGSIYYSYFDL(SEQ ID NO：101)(DDR1-32)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列ETISSR(SEQ ID NO：41)的LC-CDR1、包括氨基酸序列QAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列QGCYYGGGSFYDSA(SEQ ID NO：42)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSLSSYD(SEQ ID NO：102)的HC-CDR1、包括氨基酸序列SWNSGFV(SEQ ID NO：103)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARLGADDIYYFNL(SEQ ID NO：104)(DDR1-33)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列ETISSR(SEQ ID NO：41)的LC-CDR1、包括氨基酸序列QAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列QGCYYGGGSFYDSA(SEQ ID NO：42)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSLSSYD(SEQ ID NO：102)的HC-CDR1、包括氨基酸序列SWNSGFV(SEQ ID NO：103)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARLGADDIYYFNL(SEQ ID NO：104)(DDR1-33)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列ENLYKDNY(SEQ ID NO：43)的LC-CDR1、包括氨基酸序列GAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列AGGYDSVVD(SEQ ID NO：44)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFDLSSYYY(SEQ ID NO：105)的HC-CDR1、包括氨基酸序列SIYTSSGAT(SEQ ID NO：106)的HC-CDR2和包括氨基酸序列RGGWCDFNL(SEQ ID NO：107)(DDR1-34)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，表1中的LC-CDR和表2中的HC-CDR分别由表6和表7中的多核苷酸编码，如下文进一步讨论的。
在一些实施例中，将LC-CDR和HC-CDR置于框架区(FR)序列的适当上下文中，以形成定义抗体的结合特异性的轻链可变区和重链可变区。在某个实施例中，具有鉴定的LC-CDR和HC-CDR的抗体的框架区序列是原始抗体分离物的框架序列。在一些实施例中，LC-CDR和HC-CDR与来自不同哺乳动物物种例如灵长类的框架区序列一起使用。在一些实施例中，框架序列是用于形成与DDR1蛋白特异性结合的抗体的人源化框架序列或人框架序列。在一些实施例中，轻链可变区包括四个轻链框架区，例如，指定为FRLC1、FRLC2、FRLC3和FRLC4以及根据以下从NH2到COOH方向的组织的LC-CDR：FRLC1-LC-CDR1-FRLC2-LC-CDR2-FRLC3，-LC-CDR3-FRLC4。在一些实施例中，重链可变区包括四个重链框架区，例如，指定为FRHC1、FRHC2、FRHC3和FRHC4以及根据以下从NH2到COOH方向的组织的HC-CDR：FRHC1-HC-CDR1--FRHC2-HC-CDR2-FRHC3，-HC-CDR3-FRHC4。在一些实施例中，将亲本轻链可变区的框架区替换为人轻链可变区的框架区以形成人源化轻链可变区。在一些实施例中，将亲本重链可变区的框架区替换为人重链可变区的框架区以形成人源化重链可变区。
在一些实施例中，与DDR1蛋白特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区，所述轻链可变区具有选自表3中所示的序列的轻链可变区氨基酸序列，即，SEQID NO：108-128。在一些实施例中，与DDR1蛋白特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区具有选自表4中所示的序列的重链可变区氨基酸序列，即，SEQ ID No：129-149。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有轻链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列选自SEQ ID NO：108-128，所述重链可变区具有重链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列选自SEQ ID NO：129-149。在各个实施例中，对应于SEQ ID NO：108-128的可变轻链氨基酸序列中的任何一种可变轻链氨基酸序列可以与对应于SEQ ID NO：129-149的可变重链氨基酸序列中的任何一种可变重链氨基酸序列一起使用。
在一些实施例中，分离的抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有轻链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列选自SEQ ID NO：108-128，所述重链可变区具有重链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列选自SEQ ID NO：129-149。在各个实施例中，对应于SEQ ID NO：108-128的可变轻链氨基酸序列中的任何一种可变轻链氨基酸序列可以与对应于SEQ ID NO：129-149的可变重链氨基酸序列中的任何一种可变重链氨基酸序列一起使用。在一些实施例中，与DDR1蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段包括分别在表3和表4中所示的克隆配对的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列的轻链可变区和重链可变区。
表3.抗DDR1抗体的轻链可变区氨基酸序列
Figure BPA0000324724060000301
Figure BPA0000324724060000311
表4.抗DDR1抗体的重链可变区氨基酸序列
Figure BPA0000324724060000312
Figure BPA0000324724060000321
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：108(DDR1-1K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：129(DDR1-1H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：109(DDR1-3K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：130(DDR1-3H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：110(DDR1-5K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：131(DDR1-5H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：111(DDR1-6K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：132(DDR1-6H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：112(DDR1-9K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：133(DDR1-9H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：113(DDR1-11K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：134(DDR1-11H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：114(DDR1-12K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：135(DDR1-12H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：115(DDR1-13K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：136(DDR1-13H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：116(DDR1-14K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：137(DDR1-14H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：117(DDR1-15K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：138(DDR1-15H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：118(DDR1-17K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：139(DDR1-17H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：119(DDR1-20K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：140(DDR1-20H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：120(DDR1-21K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：141(DDR1-21H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：121(DDR1-22K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：142(DDR1-22H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：122(DDR1-23K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：143(DDR1-23H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：123(DDR1-26K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：144(DDR1-26H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：124(DDR1-28K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：145(DDR1-28H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：125(DDR1-29K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：146(DDR1-29H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：126(DDR1-32K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：147(DDR1-32H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：127(DDR1-33K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：148(DDR1-33H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：128(DDR1-34K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：149(DDR1-34H)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是亲本抗体DDR1-9的人源化抗体，如实例中所描述的。表5中提供了轻链可变区和重链可变区。下方表10中提供了编码人源化可变区的多核苷酸序列。
表5.人源化DDR1-9hu抗体氨基酸序列
Figure BPA0000324724060000351
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区，所述轻链可变区具有在SEQ ID NO：150(DDR1-9hu_Lv1)的轻链可变区氨基酸序列中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区，所述轻链可变区具有在SEQ ID NO：151(DDR1-9hu_Lc2)的轻链可变区氨基酸序列中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区具有在SEQ ID NO：151(DDR1-9hu_Lc2)的重链可变区氨基酸序列中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有在SEQ ID NO：150(DDR1-9hu_Lv1)或SEQ ID NO：151(DDR1-9hu_Lc2)的轻链可变区氨基酸序列中的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，所述重链可变区具有在SEQ ID NO：151(DDR1-9hu_Lc2)的重链可变区氨基酸序列中的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：150(DDR1-9hu_Lv1)或SEQ ID NO：151(DDR1-9hu_Lc2)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：152(DDR1-9hu_Hv)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：150(DDR1-9hu_Lv1)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：152(DDR1-9hu_Hv)的氨基酸序列。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：151(DDR1-9hu_Lc2)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQID NO：152(DDR1-9hu_Hv)的氨基酸序列。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是变体，其中与亲本轻链可变区序列或重链可变区序列相比，所述变体的轻链可变区序列和/或重链可变区序列具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸取代、添加、缺失或其组合，其中所述变体保留与DDR1蛋白的结合特异性和/或其它功能特性。在一些实施例中，变体的轻链可变区序列和/或重链可变区序列具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个保守或非保守氨基酸取代。在一些实施例中，与亲本LC-CDR或HC-CDR相比，变体具有在变体轻链可变区或变体重链可变区的LC-CDR和/或HC-CDR中的一者或多者中的1个、2个或3个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。在一些实施例中，与亲本轻链可变区序列或重链可变区序列相比，变体抗体或其抗原结合片段具有在轻链可变区和/或重链可变区的框架区序列中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段具有在轻链可变区和/或重链可变区的框架区序列中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个保守或非保守氨基酸取代。前述变化适于表3和表5中的轻链可变区中的每个轻链可变区，以及表4和表5中的重链可变区中的每个重链可变区。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列与选自表3中的SEQ ID NO：108-128和表5中的SEQ ID NO：150和151的轻链可变区氨基酸序列中的任何一个轻链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括重链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与选自表4中的SEQID NO：129-149和表5中的SEQ ID NO：152的重链可变区氨基酸序列中的任何一个重链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列与选自表3中的SEQ ID NO：108-128和表5中的SEQ ID NO：150和151的轻链可变区氨基酸序列中的任何一个轻链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，所述重链可变区氨基酸序列与选自表4中的SEQ ID NO：129-149和表5中的SEQ ID NO：152的重链可变区氨基酸序列中的任何一个重链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO：112的轻链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括重链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO：133的重链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO：112的轻链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，所述重链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO：133的重链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO：127的轻链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括重链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO：148的重链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO：127的轻链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，所述重链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO：148的重链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO：150或151的轻链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括重链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO：152的重链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列，所述轻链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO：150或151的轻链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，所述重链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO：152的重链可变区氨基酸序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施例中，包括本文所描述的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3(例如，表1)或指定的轻链可变区(例如，表3和表5)，并且存在于抗体或其抗原结合片段中的轻链可变区附加或连接到轻链恒定区的全部或部分以形成抗体或其抗原结合片段的轻链。在一些实施例中，轻链恒定区是从中分离抗体的物种，例如，兔轻链恒定区。在一些实施例中，附加或连接到轻链可变区的轻链恒定区是κ(κ)或λ(λ)恒定区，如本文所描述的。在一些实施例中，当存在时，轻链恒定区可以是已知的λ亚型中的任何一种，例如，λ1、λ2、λ3或λ4。在一些实施例中，轻链恒定区是λ轻链恒定区序列。在一些实施例中，轻链恒定区是κ轻链恒定区序列。在一优选实施例中，λ或κ恒定区是人λ或人κ恒定区序列的λ或κ恒定区。
在一些实施例中，包括本文所描述的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3(例如，表2)或本文所描述的指定的重链可变区中的每个指定的重链可变区(例如，表4和表5)，并且存在于抗体或其抗原结合片段中的重链可变区中的每个重链可变区附加或连接到重链恒定区的全部或部分以形成抗体或其抗原结合片段的重链。在一些实施例中，重链恒定区结构域是啮齿动物、灵长类动物或其它哺乳动物重链恒定区。在一些实施例中，连接或附加到重链可变区的重链恒定区是人重链恒定区。在一些实施例中，人重链恒定区包括以下至少一项或全部：人CH1、人铰链、人CH2和人CH3结构域。在一些实施例中，重链恒定区包括Fc部分，其中所述Fc部分是人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型。在一些实施例中，人重链恒定区可以具有一个或多个突变以改变Fc恒定区的特性，如稳定性、糖基化和Fc受体结合，如下文进一步讨论的。在一些实施例中，在一些实施例中，抗DDR1抗体可以被修饰成相对于未经修饰的抗体降低至少一种恒定区介导的生物效应子功能，例如，减少与Fc受体(FcγR)中的一种或多种Fc受体的结合，如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIIIB。FcγR结合可以通过在FcγR相互作用所必需的特定区域处使抗体的免疫球蛋白恒定区区段突变来减少(参见例如，Canfield和Morrison，1991，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》173：1483-1491；和Lund等人，1991，《免疫学杂志》147：2657-2662)。抗体的FcγR结合能力的降低也可以降低依赖FcγR相互作用的其它效应子功能，如调理作用、吞噬作用和抗原依赖性细胞毒性(“ADCC”)。
在一些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段包含已经被修饰成相对于未经修饰的抗体获得或改善至少一种恒定区介导的生物效应子功能的抗体，例如，以增强FcγR相互作用(参见例如，美国公开第2006/0134709号)。例如，本公开的抗体可以具有以比对应的野生型恒定区更高的亲和力与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和/或FcγRIIIB结合的恒定区。
因此，本公开的抗体可能具有导致调理作用、吞噬作用或ADCC提高或降低的生物活性改变。例如，降低ADCC活性的抗体修饰在美国专利第5,834,597号中进行了描述。示例性ADCC降低变体对应于美国专利第5,834,597号中的“突变体3”(也称为“M3”)，其中残基234和237(使用EU编号)被丙氨酸取代。突变体3(也称为“M3”)变异可以用于多种抗体同种型，例如，IgG2。可以改变FcγR结合和/或ADCC效应子功能的另外的取代包含Fc区中的K322A取代或L234A和L235A双取代(参见例如，Hezareh等人《病毒学杂志(J.Virol.)》，2001，75(24)：12161-12168)。在一些实施例中，本公开的抗体具有低水平的或缺乏岩藻糖。缺乏岩藻糖的抗体与ADCC活性增强相关，尤其是在低剂量的抗体下(参见例如，Shields等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》，2002，277：26733-26740；Shinkawa等人，《生物化学杂志》，2003，278：3466-73)。制备无岩藻糖抗体的方法包含在大鼠骨髓瘤YB2/0中生长。
在一些实施例中，本公开的抗体可以包括经修饰的(或变体)CH2结构域或完整的Fc结构域，所述结构域包含与对应的野生型CH2或Fc区的结合相比，增加与FcγRIIB的结合和/或减少与FcγRIIIA的结合的氨基酸取代。变体CH2或变体Fc结构域已经在美国专利公开2014/0377253中进行了描述，所述美国专利公开整体并入本文。变体CH2或变体Fc结构域通常包含在位置263、位置266、位置273和位置305处的一个或多个取代，其中Fc结构域中的残基的编号是如Kabat中的EU索引的编号。在一些实施例中，相对于野生型CH2结构域，抗DDR1抗体包括一个或多个选自V263L、V266L、V273C、V273E、V273F、V273L、V273M、V273S、V273Y、V305K和V305W的取代。在具体实施例中，相对于人IgG1的CH2结构域，CH2结构域的一个或多个取代选自V263L、V273E、V273F、V273M、V273S和V273Y。例如，CH2结构域的一个或多个取代可以是V273E。在另一个具体实施例中，本公开的抗DDR1抗体包括变体CH2结构域，所述结构域包括氨基酸取代V263L。与对应的野生型CH2或Fc区域的结合相比，可以增加与FcγRIIB的结合和/或减少与FcγRIIIA的结合的变体CH2或变体Fc结构域的其它实例包含见于以下文献中的那些：Vonderheide等人《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》，19(5)，1035-1043(2013)，如人IgG1中的S267E或S267E/L328F。
在一些实施例中，抗DDR1抗体包含增加或减少其对胎儿Fc受体FcRn的结合亲和力的修饰，例如，通过在涉及FcRn相互作用的特定区域处使免疫球蛋白恒定区区段突变(参见例如，WO 2005/123780)。在特定实施例中，IgG类的抗DDR1抗体被突变，使得重链恒定区的氨基酸残基250、314和428中的至少一个被单独取代，或以其任何组合取代，如在位置250和428处、或在位置250和314处、或在位置314和428处、或在位置250、314和428处，位置250和428是特定组合。对于位置250，取代氨基酸残基可以是除苏氨酸以外的任何氨基酸残基，包含但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置314，取代氨基酸残基可以是除亮氨酸以外的任何氨基酸残基，包含但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。对于位置428，取代氨基酸残基可以是除甲硫氨酸以外的任何氨基酸残基，包含但不限于丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸。已知修饰Fc效应子功能的示例性取代是Fc取代M428L，其可以与Fc取代T250Q组合发生。合适的氨基酸取代的特定组合在美国专利第7,217,797号的表1中鉴定，所述美国专利通过引用并入本文。此类突变增加了与FcRn的结合，其保护抗体免于降解并延长其半衰期。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是包括本文所公开的LC-CDR和HC-CDR的单链抗体。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是包括本文所公开的轻链可变区和重链可变区的单链抗体。在特定实施例中，单链抗体包括本文所公开的克隆配对的轻链可变区和重链可变区。
在一些实施例中，包括本公开的LC-CDR和HC-CDR、或轻链可变区和重链可变区的抗原结合片段是双抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv′)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双抗体)、多特异性抗体、单结构域抗体(sdAb)、骆驼抗体或纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体，如本文所描述的。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是包括本文所公开的LC-CDR和HC-CDR、或轻链可变区和重链可变区的嵌合抗体，其中Fc重链恒定区来自与本文所公开的LC-CDR和HC-CDR或轻链可变区和重链可变区的来源不同的物种。在一些实施例中，嵌合抗体包括人Fc区。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段，其中包括LC-CDR的轻链可变区和包括本公开的HC-CDR的重链可变区的框架区域被人框架序列取代。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段，其中选自SEQ ID NO：108-128和SEQ ID NO：150和151的轻链可变区的框架区被人轻链可变区框架序列取代。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段，其中选自SEQ ID NO：129-140和SEQ ID NO：152的重链可变区的框架区被人重链可变区框架序列取代。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段，其中选自SEQ ID NO：108-128和SEQ ID NO：150和151的轻链可变区的框架区被人轻链可变区框架序列取代，并且选自SEQ ID NO：129-140和SEQ ID NO：152的重链可变区的框架区被人重链可变区框架序列取代。
C.示例性表位和竞争抗原结合蛋白
另一方面，本公开提供了抗DDR1抗体结合的表位。在一些实施例中，由本文所描述的抗体结合的表位是有用的。在某些实施例中，本文提供的表位可以用于分离与DDR1结合的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施例中，本文提供的表位可以用于生成与DDR1结合的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施例中，表位或包括本文提供的表位的序列可以用作免疫原以生成与DDR1结合的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施例中，本所文描述的表位或包括本文所描述的表位的序列可以用于干扰DDR1的生物活性。
在一些实施例中，与表位中的任何表位结合的抗体或其抗原结合片段是特别有用的。在一些实施例中，本文提供的表位在被抗体结合时干扰或抑制DDR1的生物活性。在一些实施例中，本文提供的表位在被抗体结合时阻断DDR1与其结合配偶体之间的相互作用。
在一些实施例中，含有与抗体接触或被抗体掩埋的残基的结构域/区可以通过使DDR1中的特定残基突变并确定抗体是否可以与突变的DDR1蛋白结合来鉴定。通过进行许多单独的突变，可以鉴定在结合中起直接作用或与抗体足够接近以致突变可以影响抗体与抗原之间的结合的残基。根据这些氨基酸的知识，可以阐明含有与抗原结合蛋白接触或被抗体覆盖的残基的抗原结构域或区。此类结构域可以包含抗原结合蛋白的结合表位。
另一方面，本公开提供抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白和与本文所描述的表位结合的例示的抗体或抗原结合片段之一竞争与DDR1的特异性结合。此类抗原结合蛋白还可以与和本文例示的抗体之一相同的表位或抗原结合片段或重叠性表位结合。预期与如例示的抗体竞争或结合相同表位的抗原结合蛋白示出类似的功能特性。例示的抗体包含上文描述的抗体，包含分别具有表1和表2中所示的轻链和重链可变区CDR；表3和表4中所示的轻链和重链可变区以及表8和表9中所示的轻链和重链编码区的抗体。
III.多核苷酸、载体和宿主细胞
另一方面，本公开提供了编码与DDR1蛋白特异性结合的抗体及其抗原结合片段的多核苷酸，如本文所公开的；包含表达载体的载体，所述表达载体包括多核苷酸；以及包括多核苷酸的宿主细胞，例如用于表达抗体或其抗原结合片段。
特别地，多核苷酸是分离的多核苷酸。多核苷酸可以与一种或多种控制基因表达的异源控制序列可操作地连接，以产生能够表达所关注的多肽的重组多核苷酸。可以将含有编码相关多肽或蛋白质的异源多核苷酸的表达构建体引入合适的宿主细胞以表达对应的多肽。
正如对本领域技术人员应该是显而易见的那样，因为对应于各种氨基酸的所有可能的密码子的知识，蛋白质序列的知识提供了对能够编码主题蛋白质序列的所有多核苷酸的描述。可以通过基于可能的密码子选择来选择组合来制备极大量的编码前述多肽的核酸，并且所有此类变化都被认为是针对本文所描述的多肽中的任何和所有多肽具体公开的。
在一些实施例中，多核苷酸编码本文所公开的轻链可变区的LC-CDR1、LC-CDR2和/或LC-CDR3，包含表1中描述的LC-CDR。在一些实施例中，多核苷酸编码本文所公开的轻链可变区的LC-CDR1、LC-CDR2和/或LC-CDR3的变体，包含表1中描述的LC-CDR，其中与亲本LC-CDR相比，变体的LC-CDR中的一个或多个LC-CDR具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，多核苷酸编码本文所公开的重链可变区的HC-CDR1、HC-CDR2和/或HC-CDR3，包含表2中描述的HC-CDR。在一些实施例中，多核苷酸编码本文所公开的重链可变区的HC-CDR1、HC-CDR2和/或HC-CDR3的变体，包含表2中描述的LC-CDR，其中与亲本HC-CDR相比，变体的HC-CDR中的一个或多个HC-CDR具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
在一些实施例中，编码轻链可变区的LC-CDR1、LC-CDR2和/或LC-CDR3的多核苷酸选自表6中所示的多核苷酸。
表6.编码DDR1抗体的轻链可变区的CDR的DNA序列
Figure BPA0000324724060000421
Figure BPA0000324724060000431
在一些实施例中，编码重链可变区的HC-CDR1、HC-CDR2和/或HC-CDR3的多核苷酸选自表7中所示的多核苷酸。
表7.编码DDR1抗体的重链可变区的CDR的DNA序列
Figure BPA0000324724060000441
Figure BPA0000324724060000451
在一些实施例中，多核苷酸编码SEQ ID NO：108-128或SEQ ID NO：150或151的氨基酸序列的轻链可变区中的LC-CDR中的至少1个、2个或3个LC-CDR。在一些实施例中，多核苷酸编码SEQ ID NO：129-149或SEQ ID NO：153的氨基酸序列的重链可变区中的HC-CDR中的至少1个、2个或3个HC-CDR。
在一些实施例中，多核苷酸编码SEQ ID NO：108-128或SEQ ID NO：150或151的氨基酸序列的轻链可变区中的LC-CDR中的至少1个、2个或3个LC-CDR；以及SEQ ID NO：129-149或SEQ ID NO：153的氨基酸序列的重链可变区中的HC-CDR中的至少1个、2个或3个HC-CDR。在一些实施例中，选择的LC-CDR和HC-CDR是克隆配对的LC-CDR和HC-CDR。
在一些实施例中，多核苷酸包括表6中所示的每种mAb的LC-CDR的多核苷酸序列中的至少1个、2个或3个多核苷酸序列。
在一些实施例中，多核苷酸包括表7中所示的每种mAb的HC-CDR的多核苷酸序列中的至少1个、2个或3个多核苷酸序列。
在一些实施例中，多核苷酸包括表6中所示的每种mAb的LC-CDR的多核苷酸序列中的至少1个、2个或3个多核苷酸序列；表7中指定的每种mAb的HC-CDR的多核苷酸序列中的至少1个、2个或3个多核苷酸序列，其中选择的LC-CDR和HC-CDR分别是表6和表7中所示的克隆配对的LC-CDR和HC-CDR的那些LC-CDR和HC-CDR。
在一些实施例中，多核苷酸编码轻链可变区，所述轻链可变区与选自表3的SEQ IDNO：108-128和表5的SEQ ID NO：150和151的轻链可变区氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。
在一些实施例中，多核苷酸编码重链可变区，所述重链可变区与选自表4的SEQ IDNO：129-149和表5的SEQ ID NO：153的重链可变区氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。
在一些实施例中，多核苷酸编码轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区与选自表3的SEQ ID NO：108-128或表5的SEQ ID NO：150和151的轻链可变区氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，所述重链可变区与选自表4的SEQ ID NO：129-149和表5的SEQ ID NO：153的重链可变区氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。
在一些实施例中，多核苷酸编码抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括选自以下的轻链可变区和重链可变区对：
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：108(DDR1-1K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：129(DDR1-1H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：109(DDR1-3K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：130(DDR1-3H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：110(DDR1-5K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：131(DDR1-5H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：111(DDR1-6K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：132(DDR1-6H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：112(DDR1-9K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：133(DDR1-9H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：113(DDR1-11K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：134(DDR1-11H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：114(DDR1-12K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：135(DDR1-12H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：115(DDR1-13K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：136(DDR1-13H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：116(DDR1-14K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：137(DDR1-14H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：117(DDR1-15K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：138(DDR1-15H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：118(DDR1-17K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：139(DDR1-17H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：119(DDR1-20K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：140(DDR1-20H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：120(DDR1-21K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：141(DDR1-21H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：121(DDR1-22K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：142(DDR1-22H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：122(DDR1-23K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：143(DDR1-23H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：123(DDR1-26K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：144(DDR1-26H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：124(DDR1-28K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：145(DDR1-28H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：125(DDR1-29K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：146(DDR1-29H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：126(DDR1-32K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：147(DDR1-32H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：127(DDR1-33K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：148(DDR1-33H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：128(DDR1-34K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：149(DDR1-34H)的氨基酸序列；
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：150(DDR1-9hu_Lv)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：153(DDR1-9hu_Hv)的氨基酸序列；以及
轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：151(DDR1-9hu_Lc2)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：153(DDR1-9hu_Hv)的氨基酸序列。
在一些实施例中，编码轻链可变区的多核苷酸选自表8中所示的多核苷酸：
表8.编码抗DDR1抗体的轻链可变区的DNA序列
Figure BPA0000324724060000481
Figure BPA0000324724060000491
Figure BPA0000324724060000501
Figure BPA0000324724060000511
在一些实施例中，编码重链可变区的多核苷酸选自表9中所示的多核苷酸。
表9.编码抗DDR1抗体重链可变区的DNA序列
Figure BPA0000324724060000512
Figure BPA0000324724060000521
Figure BPA0000324724060000531
Figure BPA0000324724060000541
在一些实施例中，编码抗体DDR1-9(DDR1-9hu)的人源化轻链可变区和/或人源化重链可变区的多核苷酸选自表10中所示的多核苷酸。
表10.人源化DDR1-9hu抗体序列——核酸
Figure BPA0000324724060000542
Figure BPA0000324724060000551
在一些实施例中，多核苷酸在核苷酸水平上与选自SEQ ID NO：258-278和SEQ IDNO：301和302的参考核苷酸序列具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的序列同一性，并且编码选自SEQ IDNO：108-128或SEQ ID NO：150-151的对应的轻链可变区。
在一些实施例中，多核苷酸在核苷酸水平上与选自SEQ ID NO：279-299和SEQ IDNO：300的参考核苷酸序列具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的序列同一性，并且编码选自SEQ ID NO：129-149或SEQ ID NO：152的对应的重链可变区。
在一些实施例中，多核苷酸在核苷酸水平上与SEQ ID NO：262或276的参考核苷酸序列具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的序列同一性，并且编码SEQ ID NO：112或126的对应的轻链可变区。
在一些实施例中，多核苷酸在核苷酸水平上与SEQ ID NO：283或297的参考核苷酸序列具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的序列同一性，并且编码SEQ ID NO：133或147的对应的重链可变区。
在一些实施例中，多核苷酸在核苷酸水平上与SEQ ID NO：301或302的参考核苷酸序列具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的序列同一性，并且编码SEQ ID NO：150或151的对应的轻链可变区。
在一些实施例中，多核苷酸在核苷酸水平上与SEQ ID NO：300的参考核苷酸序列具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的序列同一性，并且编码SEQ ID NO：152的对应的重链可变区。
在另外的实施例中，本公开的核酸包括与编码本文所公开的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸与选自SEQ ID NO：258-278和SEQ ID NO：301和302的多核苷酸杂交并编码与DDR1蛋白质特异性结合的抗体的轻链可变区。在一些实施例中，多核苷酸与选自SEQ ID NO：279-299和SEQ ID NO：300的多核苷酸杂交并编码与DDR1蛋白质特异性结合的抗体的重链可变区。
通常，核酸在中等或高严格条件下与编码本文所公开的抗体并且还编码保持与DDR1蛋白特异性结合能力的抗体的核酸杂交。当第一核酸分子的单链形式可以在适当的温度和溶液离子强度条件下退火到第二核酸分子时，第一核酸分子与第二核酸分子是“可杂交”(参见Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL)》，第3版，纽约冷泉港冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N.Y.)2001)。温度和离子强度的条件确定了杂交的“严格性”。典型的中等严格性杂交条件是40％甲酰胺，与5X或6X SSC和0.1％SDS，在42℃下。高严格性杂交条件是50％甲酰胺，5X或6X SSC(0.15M NaC1和0.015M柠檬酸钠)，在42℃下，或任选地在更高温度(例如，57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)下。杂交要求两个核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，并且碱基之间的错配是可能的。用于杂交核酸的适当严格性取决于核酸的长度和互补的程度，本领域众所周知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，核酸可以杂交的严格性越高。对于长度大于100个核苷酸的杂合体，已经得出用于计算熔解温度的方程(参见Sambrook等人，同上)。为了与较短的核酸(例如，寡核苷酸)杂交，错配的位置变得更加重要，并且寡核苷酸的长度确定了其特异性(参见Sambrook等人，同上)。
在一些实施例中，可以以多种方式操作本文的多核苷酸以提供编码的多肽的表达，如本文所公开的轻链可变区或重链可变区。在一些实施例中，多核苷酸与控制序列可操作地连接，其中包含转录启动子、前导序列、转录增强子、核糖体结合或进入位点、终止序列和用于表达多核苷酸和/或对应的多肽的聚腺苷酸化序列。取决于表达载体，在将分离的多核苷酸***载体之前对其进行操作可能是期望的或必要的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸和核酸序列的技术是本领域众所周知的。以下提供了指导：Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第3版，纽约冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York)(2001)；以及《当代分子生物学实验指南(Current Protocols inMolecular Biology)》，Ausubel.F.编辑，格林出版协会(Greene Pub.Associates)(1998)，更新到2020。
在一些实施例中，多核苷酸可以是表达载体的一部分，其中载体和多核苷酸包含一个或多个可操作地连接的控制序列，用于控制多核苷酸的表达和/或经编码的多肽的表达。重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地进行重组DNA程序并且可以引起多核苷酸序列的表达。载体的选择通常将取决于载体与要引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。示例性表达载体其中包含基于T7或T7lac启动子的载体(pACY：诺瓦根公司(Novagen)；pET)；基于杆状病毒启动子的载体(例如，pBAC)；基于Ef1-α和HTLV启动子的载体(例如，pFUSE2；美国加利福尼亚州英杰公司(Invitrogen，CA，USA))；基于CMV增强子和人铁蛋白轻链基因启动子的载体(例如，pFUSE：美国加利福尼亚州英杰公司)；基于CMV启动子的载体(例如，pFLAG：美国西格玛公司(Sigma，USA))；以及基于二氢叶酸还原酶启动子的载体(例如，pEASE：美国安进公司(Amgen，USA))。各种载体可以用于所关注的多肽的瞬时表达或稳定表达。
另一方面，编码多肽的多核苷酸与一个或多个控制序列可操作地连接，用于在宿主细胞中表达多肽。用于表达多肽的宿主细胞在本领域中是众所周知的并且包含但不限于如大肠杆菌(E.coli)、酵母细胞等细菌细胞；如果蝇S2和灰翅夜蛾属Sf9细胞等昆虫细胞；动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)、非洲绿猴肾(COS)、幼仓鼠肾(BHK)、小鼠骨髓瘤(例如，NS0和Sp2/0)和人胚胎肾(HEK)；以及植物细胞。上文所描述的宿主细胞的合适培养基和生长条件在本领域是众所周知的。在一些实施例中，宿主细胞和表达载体用于表达所关注的多肽。
在一些实施例中，包括本文所描述的表达载体和多核苷酸的宿主细胞在合适的培养基中和在适合表达经编码的多肽的培养条件下培养，例如包括选自SEQ ID NO：108-128；SEQ ID NO：150和151；SEQ ID NO：129-149；以及SEQ ID NO：152的氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，体外表达***可以与表达载体一起使用以表达多肽。体外表达***包含基于大肠杆菌、兔网织红细胞、小麦胚芽、昆虫细胞和人细胞的***。如本文进一步描述的，无论是在宿主细胞中还是在体外表达，所表达的多肽都可以被分离或纯化。
IV.用于制备抗体的方法和其修饰
在一些实施例中，本文所描述的单克隆抗体可以使用标准方法制备，随后进行筛选、表征和功能评估。例如，可以对可变区进行测序，然后将其亚克隆到人表达载体中以产生嵌合抗体基因，然后对所述嵌合抗体基因进行表达和纯化。这些嵌合抗体可以经测试用于抗原结合、信号传导阻断和异种移植实验。
A.通用方法
应当理解，与DDR1结合的单克隆抗体将具有若干种应用。这些应用包含生产用于检测和诊断癌症以及用于癌症疗法的诊断试剂盒。在这些上下文中，可以将此类抗体与诊断或治疗剂联系起来，将它们用作竞争性测定中的捕获剂或竞争剂，或单独使用它们而无需附加另外的试剂。抗体可以被突变或修饰，如下文进一步讨论的。用于制备和表征抗体的方法在本领域中是众所周知的(参见例如，《抗体：实验室手册》，冷泉港实验室，1988；美国专利4,196,265)。
用于生成单克隆抗体(MAb)的方法通常与用于制备多克隆抗体的方法开始沿着相同的路线。这两种方法的第一步骤都是使合适的宿主免疫。如本领域众所周知的，用于免疫的给定组合物的免疫原性可能不同。因此，通常需要增强宿主免疫***，如可以通过将肽或多肽免疫原与载体耦接来实现。示例性和优选的载体是钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。如卵清蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白等其它白蛋白也可以用作载体。用于将多肽与载体蛋白缀合的方法在本领域中是众所周知的，并且包含戊二醛、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳化二亚胺和双重氮化联苯胺。如本领域众所周知的，可以通过使用免疫应答的被称为佐剂的非特异性刺激剂来增强特定免疫原组合物的免疫原性。示例性和优选的佐剂包含完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant)(含有被杀死的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的免疫应答的非特异性刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于产生多克隆抗体的免疫原组合物的量因免疫原的性质以及用于免疫的动物而不同。多种途径可以用于施用免疫原(皮下、肌肉内、皮内、静脉内和腹膜内)。多克隆抗体的产生可以通过在免疫后的不同点处对免疫的动物的血液进行采样来监测。也可以给予第二次加强注射。重复加强和滴度测定的过程，直到达到合适的滴度。当获得期望水平的免疫原性时，可以对免疫的动物取血，并且分离血清并储存，和/或动物可以用于生成MAb。
免疫后，选择具有产生抗体潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)用于MAb生成方案。这些细胞可以从活检的脾脏或***中获得，或者从循环血液中获得。然后将来自免疫的动物的产生抗体的B淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞的细胞融合，所述细胞通常是与被免疫的动物或人或人/小鼠嵌合细胞相同的物种之一。适用于产生杂交瘤的融合程序的骨髓瘤细胞系优选地不产生抗体，具有高融合效率并且缺乏酶，使得然后无法在仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基中生长。可以使用多种骨髓瘤细胞中的任何一种，如本领域技术人员已知的(Goding，第65-66页，1986；Campbell，第75-83页，1984)。用于生成产生抗体的脾脏或***细胞与骨髓瘤细胞的杂合体的方法通常包括将体细胞与骨髓瘤细胞以2∶1的比例混合，但是在存在促进细胞膜融合的一种或多种试剂(化学或电)的情况下比例可以分别从约20∶1到约1∶1变化。Kohler和Milstein(1975；1976)描述了使用仙台病毒(Sendai virus)的融合方法，并且Gefter等人(1997)描述了使用聚乙二醇(PEG)的融合方法，如37％(v/v)PEG。电感应融合方法的使用也是合适的(Goding，第71-74页，1986)。融合程序通常以低频率产生可存活的杂合体，约1×10-6到1×10-8。然而，这不会造成问题，因为通过在选择性培养基中培养，可存活的融合杂合体与亲本的、注入的细胞(特别是通常会继续无限期***的注入的骨髓瘤细胞)分化。选择性培养基通常是一种含有阻断组织培养基中核苷酸的从头合成的药剂的培养基。示例性和优选的药剂是氨基蝶呤(aminopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤的合成。在使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤的情况下，培养基中补充有次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源(HAT培养基)。在使用重氮丝氨酸的情况下，培养基补充有次黄嘌呤。如果B细胞来源是爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barrvirus，EBV)转化的人B细胞系，则添加哇巴因(ouabain)，以消除未与骨髓瘤融合的EBV转化系。
在一些实施例中，优选的选择培养基是HAT或含哇巴因的HAT。只有能够操作核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶，例如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)中存在缺陷，因此所述骨髓瘤细胞无法存活。B细胞可以操作此途径，但它们在培养中的寿命有限，并且通常会在约两周内死亡。因此，唯一能在选择性培养基中存活的细胞是由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂合体。当用于融合的B细胞来源是EBV转化的B细胞系时，如在此的，哇巴因也用于杂合体的药物选择，因为EBV转化的B细胞容易被药物杀死，而所用的骨髓瘤配偶体被选择为对哇巴因具有抗性。
培养提供了从中选择特定杂交瘤的杂交瘤群体。通常，杂交瘤的选择是通过在微量滴定板中通过单克隆稀释培养细胞，随后测试单个克隆上清液(约两到三周后)的期望的反应性来进行的。测定应灵敏、简单且快速，如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、点免疫结合测定等。然后将选择的杂交瘤连续稀释或通过流式细胞术分选单细胞并克隆到单个产生抗体的细胞系中，然后所述克隆可以无限期增殖以提供mAb。细胞系可以用于以两种基本方式进行MAb产生。可以将杂交瘤的样品注射(通常注射到腹膜腔)到动物(例如，小鼠)中。任选地，动物在注射前用烃，特别是如姥鲛烷(四甲基十五烷)等油进行致敏。当以此方式使用人杂交瘤时，最好对如SCID小鼠等免疫受损的小鼠进行注射，以防止肿瘤排斥。注射的动物产生分泌由融合的细胞杂合体产生的特异性单克隆抗体的肿瘤。然后可以提取如血清或腹水等动物的体液，以提供高浓度的MAb。单个细胞系也可以在体外培养，其中MAb自然分泌到培养基中，从所述培养基中可以很容易地以高浓度获得MAb。可替代地，人杂交瘤细胞系可以用于体外以在细胞上清液中产生免疫球蛋白。细胞系可以适于在无血清培养基中生长，以优化回收高纯度人单克隆免疫球蛋白的能力。
如果需要，可以使用过滤、离心和如FPLC或亲和色谱等各种色谱方法进一步纯化通过任一方式产生的MAb。可以通过包含用如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等酶消化和/或通过化学还原切割二硫键的方法从纯化的单克隆抗体获得本公开的单克隆抗体片段。可替代地，本公开所涵盖的单克隆抗体片段可以使用自动化肽合成仪来合成。
还考虑可以使用分子克隆方法来生成单克隆。为此，可以从杂交瘤细胞系中分离RNA，并且通过RT-PCR获得抗体基因，并将所述抗体基因克隆到免疫球蛋白表达载体中。可替代地，组合免疫球蛋白噬菌粒文库由分离自细胞系的RNA制备，并且通过使用病毒抗原淘选来选择表达合适抗体的噬菌粒。与常规杂交瘤技术相比，此方法的优势在于在单个轮次中可以产生和筛选大约104倍的抗体，并且通过H链和L链组合生成新的特异性，这进一步增加了找到合适抗体的机会。
教导了在本公开中有用的抗体的产生的其它美国专利(每个都通过引用并入本文)包含描述了使用组合方法产生嵌合抗体的美国专利5,565,332；描述了重组免疫球蛋白制剂的美国专利4,816,567；以及描述了抗体治疗剂缀合物的美国专利4,867,973。
B.抗体序列的工程化
在各个实施例中，可以出于各种原因，如表达改善、交叉反应性改善或脱靶结合减少来选择对鉴定的抗体的序列进行工程化。以下是抗体工程化的相关技术的一般讨论。
可以培养杂交瘤，然后裂解细胞并提取总RNA。随机六聚体可以与RT一起使用以生成RNA的cDNA拷贝，然后使用预期扩增所有人可变基因序列的PCR引物的多重混合物进行PCR。PCR产物可以克隆到pGEM-T Easy载体中，然后使用标准载体引物通过自动化DNA测序进行测序。结合和中和的测定可以使用从杂交瘤上清液中收集并通过使用蛋白G柱的FPLC纯化的抗体来进行。可以通过将来自克隆载体的重链和轻链Fv DNA亚克隆到IgG质粒载体中，转染到293Freestyle细胞或CHO细胞中来生成重组全长IgG抗体，并从293或CHO细胞上清液中收集纯化的抗体。
在与最终cGMP制造过程相同的宿主细胞和细胞培养过程中产生的抗体的快速可用性有可能减少过程开发计划的持续时间。龙沙公司(Lonza)开发了一种使用在CDACF培养基中生长的汇集的转染子在CHO细胞中快速生产少量(最多50g)的抗体的通用方法。虽然比真正的瞬时***稍慢，但优势包含更高的产物浓度和使用与产生细胞系相同的宿主和过程。在一次性生物反应器中表达模型抗体的GS-CHO池的生长和生产力实例：在以分批进料模式操作的一次性袋式生物反应器培养物(5L工作体积)中，在转染的9周内达到2g/L的采集抗体浓度。
抗体分子可以包括例如通过mAb的蛋白水解切割产生的片段(如F(ab′)、F(ab′)2)或例如通过重组方式可产生的单链免疫球蛋白。此类抗体衍生物是单价的。在一个实施例中，此类片段可以彼此组合，或与其它抗体片段或受体配体组合以形成“嵌合”结合分子。重要的是，此类嵌合分子可能含有能够与同一分子的不同表位结合的取代基。
1.抗原结合修饰
在相关实施例中，抗体是公开的抗体的衍生物，例如，包括与公开的抗体中的CDR序列相同的CDR序列的抗体(例如，嵌合或CDR移植抗体)。可替代地，可能希望进行修饰，如将保守改变引入抗体分子。在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予蛋白质交互性生物功能方面的重要性在本领域中是被普遍理解的(Kyte和Doolittle，1982)。可以理解的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的次级结构，这又定义了蛋白质与其它分子，例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。
在本领域中还应理解，可以基于亲水性来有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利4,554,101(通过引用并入本文)指出，由蛋白质相邻氨基酸的亲水性支配的其最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学性质相关。如美国专利4,554,101中所详述的，已经为氨基酸残基分配了以下亲水性值：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性、非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)；含硫氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和甲硫氨酸(-1.3)；疏水性、非芳香族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水性、芳香族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。
应当理解的是，氨基酸可以取代具有相似亲水性的另一种氨基酸，并且产生生物学上或免疫学上经修饰的蛋白质。在此类改变时，优选亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，特别优选亲水性值在±1以内的氨基酸的取代，并且更特别优选亲水性值在±0.5以内的氨基酸的取代。
如上文所概述的，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特性的示例性取代是本领域的技术人员众所周知的，并且包含：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本公开还考虑了同种型修饰。通过修饰Fc区使其具有不同的同种型，可以实现不同的功能。例如，改为IgG1可以增加抗体依赖性细胞毒性，改为A类可以改善组织分布，并且改为M类可以改善效价。
经修饰的抗体可以通过本领域技术人员已知的任何技术制备，包含通过标准分子生物技术的表达或多肽的化学合成。用于重组表达的方法在本文档的其它地方进行了讨论。
2.Fc区修饰
如上文所讨论的，本文所公开的抗体还可以被工程化成包含Fc区内的修饰，通常用于改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或效应子功能(例如，抗原依赖性细胞毒性)。此外，本文所公开的抗体可以被化学修饰(例如，一种或多种化学部分可以附接到抗体)或被修饰成改变其糖基化，以再一次改变抗体的一种或多种功能特性。下文进一步详细描述了这些实施例中的每个实施例。Fc区中的残基的编号为Kabat的EU索引的编号。本文所公开的抗体还包含具有经修饰的(或阻断的)Fc区以提供改变的效应子功能的抗体。参见例如，美国专利5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。此类修饰可以用于增强或抑制免疫***的各种反应，可能对诊断和疗法产生有益的影响。Fc区的改变包含氨基酸变化(取代、缺失和***)、糖基化或去糖基化以及添加多个Fc。Fc的变化还可以改变治疗性抗体中抗体的半衰期，实现更低的给药频率，从而增加便利性并减少材料的使用。据报道，此突变消除了铰链区重链间二硫键的异质性。
在一些实施例中，对CH1的铰链区进行修饰，使得绞链区中的半胱氨酸残基的数量增加或减少。在美国专利5,677,425中进一步描述了示例性方法。改变CH1的绞链区中的半胱氨酸残基的数量以例如促进轻链和重链的组装或以增加或降低抗体的稳定性。在另一个实施例中，对抗体进行修饰以提高其生物学半衰期。不同的途径是可能的。例如，可以引入以下突变中的一种或多种突变：T252L、T254S、T256F，如美国专利6,277,375中所描述的。可替代地，为了增加生物学半衰期，可以在CH1或CL区内对抗体进行改变以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如在美国专利5,869,046和6,121,022中所描述的。在又其它实施例中，通过用不同的氨基酸残基取代至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应子功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸残基取代，使得抗体具有针对效应子配体的经过改变的亲和力，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力被改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。在美国专利5,624,821和5,648,260中对此方法进行了进一步的详细描述。
在另一个实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基以由此改变抗体固定补体的能力。在PCT公开WO 94/29351中进一步描述了此方法。在又另一个实例中，通过在以下位置处修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区以提高或降低抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高或降低抗体对Fcγ受体的亲和力：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。在PCT公开WO 00/42072中进一步描述了此方法。此外，已经绘制出人IgG1上针对FcγR1、FcγRII、FcγRIII以及FcRn的结合位点，并且已经描述具有改善的结合的变体。示出位置256、290、298、333、334和339处的特异性突变会改善与FcγRIII的结合。另外，示出以下组合突变体会改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在一个实施例中，Fc区被修饰成通过修饰残基243和264来降低抗体介导效应子功能的能力和/或增加抗炎特性。在一个实施例中，通过将位置243和264处的残基改变为丙氨酸来修饰抗体的Fc区。在一个实施例中，Fc区被修饰成通过修饰残基243、264、267和328来降低抗体介导效应子功能的能力和/或增加抗炎特性。在仍另一个实施例中，抗体包括特定的糖基化模式。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变抗体的糖基化模式以例如增加抗体对抗原的亲和力或亲合力。此类修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，这导致可变区框架糖基化位点中的一个或多个可变区框架糖基化位点的去除，以由此在所述位点处消除糖基化。此类去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力或亲合力。参见例如，美国专利5,714,350和6,350,861。
还可以制备其中糖基化模式包含低岩藻糖基化或无岩藻糖基化聚糖的抗体，如低岩藻糖基化抗体或无岩藻糖基化抗体在聚糖的岩藻糖基残基量减少。抗体还可以包含具有增加量的二等分GlcNac结构的聚糖。已经证实此类经过改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。此类修饰可以通过例如在宿主细胞中表达抗体来完成，其中糖基化途径被基因工程化成产生具有特定糖基化模式的糖蛋白。这些细胞已在本领域中进行了描述，并且可以用作宿主细胞，在所述宿主细胞中表达本发明的重组抗体，以由此产生具有经过改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，使得在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709FUT8-/-细胞系是通过使用两种替代载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因而产生的(参见美国专利公开第20040110704号)。作为另一个实例，EP 1 176 195描述了具有功能上被破坏的FUT8基因的细胞系，所述FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得通过减少或消除α-1，6键相关的酶，在此类细胞系中所表达的抗体展现出低岩藻糖基化。EP 1 176 195还描述了具有低酶活性的细胞系，用于将岩藻糖添加到与抗体的Fc区结合或不具有酶活性的N-乙酰氨基葡萄糖，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系，即Lec13细胞，所述细胞系具有将岩藻糖附接到Asn(297)连接的碳水化合物的降低的能力，也导致在所述宿主细胞中所表达的抗体的低岩藻糖基化。如PCT公开WO 06/089231中所描述的，也可以在鸡蛋中产生具有经修饰的糖基化谱的抗体。可替代地，可以在如浮萍属(Lemna)等植物细胞中产生具有经修饰的糖基化谱的抗体(美国专利7,632,983)。在美国专利6,998,267和7,388,081中公开了用于在植物***中产生抗体的方法。PCT公开WO 99/54342描述了被工程化成表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在经过工程化的细胞系中所表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性增加。
可替代地，可以使用岩藻糖苷酶将抗体的岩藻糖残基切除；例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中除去岩藻糖基残基。本文所公开的抗体进一步包含在低等真核宿主细胞中产生的抗体，特别是真菌宿主细胞，如酵母和丝状真菌，已被基因工程化成产生具有哺乳动物或人样糖基化模式的糖蛋白。与目前使用的哺乳动物细胞系相比，这些经基因修饰的宿主细胞的特定优势是能够控制细胞中产生的糖蛋白的糖基化谱，使得可以产生糖蛋白的组合物，其中特定的N-聚糖结构占主导地位(参见例如，美国专利7,029,872和7,449,308)。这些经基因修饰的宿主细胞已被用于产生主要具有特定的N-聚糖结构的抗体。
另外，由于如酵母或丝状真菌等真菌缺乏产生岩藻糖基化糖蛋白的能力，因此在此类细胞中产生的抗体将缺乏岩藻糖，除非将细胞进一步修饰成包含用于产生岩藻糖基化糖蛋白的酶促途径(参见例如，PCT公开WO 2008112092)。在特定实施例中，本文所公开的抗体进一步包含在低等真核宿主细胞中产生的抗体，并且其包括岩藻糖基化和非岩藻糖基化的杂合和复合N-聚糖，包含二等分和多触角种类，包含但不限于N-聚糖，如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。在特定实施例中，本文提供的抗体组合物可以包括具有至少一种杂合N-聚糖的抗体，所述杂合N-聚糖选自以下组成的组：GlcNAcMan5GlcNAc2；GalGlcNAcMan5GlcNAc2；以及NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。在特定方面，杂合N-聚糖是组合物中主要的N-聚糖种类。在另外的方面，杂合N-聚糖是在组合物中包括约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的杂合N-聚糖的特定的N-聚糖种类。
在特定实施例中，本文提供的抗体组合物包括具有至少一种复合N-聚糖的抗体，所述复合N-聚糖选自以下组成的组：GlcNAcMan3GlcNAc2；GalGlcNAcMan3GlcNAc2；NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2；GlcNAc2Man3GlcNAc2；GalGlcNAc2Man3GlcNAc2；Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；以及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在特定方面，复合N-聚糖是组合物中主要的N-聚糖种类。在另外的方面，复合N-聚糖是在组合物中包括约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的复合N-聚糖的特定的N-聚糖种类。在特定实施例中，N-聚糖是岩藻糖基化的。通常，岩藻糖通过α1，3-键与N-聚糖的还原端处的GlcNAc连接；通过α1，6-键与N-聚糖的还原端处的GlcNAc连接；通过α1，2-键与N-聚糖的非还原端处的Gal连接；通过α1，3-键与N-聚糖的非还原端处的GlcNac连接；或通过α1，4-键与N-聚糖的非还原端处的GlcNAc连接。
因此，在上述糖蛋白组合物的特定方面，糖型处于α1，3-键或α1，6-键岩藻糖中以产生选自由以下组成的组的糖型：Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；处于α1，3-键或α1，4-键岩藻糖中以产生选自由以下组成的组的糖型：GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；或处于α1，2-键岩藻糖中以产生选自由以下组成的组的糖型：Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fucl-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在另外的方面，抗体包括高甘露糖N-聚糖，包含但不限于Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2，或由Man3GlcNAc2N-聚糖结构组成的N-聚糖。在上述另外的方面，复合N-聚糖进一步包含岩藻糖基化和非岩藻糖基化的二等分和多触角种类。如本文所使用的，术语“N-聚糖”和“糖型”可互换使用并且指N-连接的寡糖，例如，通过天冬酰胺-N-乙酰氨基葡萄糖键连接到多肽的天冬酰胺残基的寡糖。N-连接的糖蛋白含有与蛋白质中天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰氨基葡萄糖残基。
C.单链抗体
单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合，通过短(通常是丝氨酸、甘氨酸)接头连接在一起。此嵌合分子保留了原始免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒定区并引入了接头肽。此修饰通常使特异性保持不变。这些分子在历史上是为了促进噬菌体展示而产生的，其中将抗原结合结构域表达为单个肽非常方便。可替代地，可以由源自杂交瘤的亚克隆的重链和轻链直接产生scFv。单链可变片段缺少可见于完整抗体分子中的恒定Fc区，并且因此缺少用于纯化抗体的常见结合位点(例如，蛋白A/G)。这些片段通常可以使用蛋白L进行纯化/固定，因为蛋白L与κ轻链的可变区相互作用。
柔性接头通常包含促进螺旋和转角的氨基酸残基，如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。然而，其它残基也可以发挥作用。Tang等人(1996)使用噬菌体展示作为从蛋白质接头文库中快速选择单链抗体(scFv)定制接头的一种手段。构建了随机接头文库，其中重链和轻链可变结构域的基因通过编码可变组合物的18个氨基酸多肽的区段连接。scFv库(大约5×106个不同成员)展示在丝状噬菌体上，并且与半抗原进行亲和力选择。选择的变体的群体展现出结合活性的显著增加，但保留了相当大的序列多样性。筛选1054个单独的变体随后产生了催化活性的scFv，所述scFv以可溶形式有效地产生。序列分析揭示了接头中在VH C末端后的两个残基中的保守脯氨酸以及在其它位置处的大量精氨酸和脯氨酸作为所选系链的唯一共同特征。
本公开的重组抗体还可以涉及允许受体的二聚化或多聚化的序列或部分。此类序列包含源自IgA的序列，所述序列允许与J链一起形成多聚体。另一个多聚化结构域是Gal4二聚化结构域。在其它实施例中，可以用如生物素/亲和素等药剂修饰链，所述药剂允许两种抗体的组合。
在单独的实施例中，可以通过使用非肽接头或化学单元接合受体轻链和重链来产生单链抗体。通常，轻链和重链将在不同的细胞中产生、纯化，然后以适当的方式连接在一起(即，重链的N末端通过适当的化学桥与轻链的C末端连接)。
交联剂用于形成绑定两个不同分子的官能团的分子桥，例如，稳定剂和凝结剂。然而，经考虑可以产生相同类似物或包含不同类似物的异源复合物的二聚体或多聚体。为了以逐步的方式连接两种不同的化合物，可以使用异型双官能交联剂来消除不需要的均聚物形成。
示例性异型双官能交联剂含有两个反应性基团：一个与伯胺基(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)反应，并且另一个与硫醇基(例如，吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)反应。通过伯胺反应性基团，交联剂可以与一种蛋白质(例如，选择的抗体或片段)的赖氨酸残基反应，并且通过硫醇反应性基团，已经与第一种蛋白质连接的交联剂与其它蛋白质(例如，选择剂)的半胱氨酸残基(游离巯基)反应。
优选的是使用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知多种类型的含有二硫键的接头可以成功用于缀合靶向剂和治疗剂/预防剂。含有空间位阻二硫键的接头可能会在体内提供更大的稳定性，从而防止靶向肽在到达作用位点之前释放。因此，这些接头是一组连接剂。
另一种交联剂是SMPT，其是含有被相邻苯环和甲基“空间位阻”的二硫键的双官能交联剂。据信，二硫键的空间位阻起到保护键免受如可以存在于组织和血液中的如谷胱甘肽等硫醇根阴离子攻击的作用，从而有助于在将所附药剂递送到靶位点之前防止缀合物的解耦。
与许多其它已知的交联剂一样，SMPT交联剂具有交联官能团的能力，如半胱氨酸的SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基)。另一种可能类型的交联剂包含含有可切割二硫键的异型双官能光活性苯基叠氮化物，如磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨酰氨基)乙基-1，3′-二硫代丙酸酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯氨基反应，并且苯叠氮化物(在光解时)与任何氨基酸残基非选择性反应。
除了受阻的交联剂之外，也可以根据本文使用非受阻的交联剂。不被认为含有或生成受保护的二硫化物的其它有用的交联剂包含SATA、SPDP和2-亚氨基硫烷(Wawrzynczak和Thorpe，1987)。此类交联剂的使用在本领域中是众所周知的。另一个实施例涉及使用灵活的接头。
美国专利4,680,338描述了可用于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的缀合物的双官能接头，特别是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物。美国专利5,141,648和5,563,250公开了含有在各种温和条件下可切割的不稳定键的可切割缀合物。此接头特别有用，因为所关注的药剂可以直接与接头键合，其中切割导致活性剂的释放。具体用途包含将游离氨基或游离巯基添加到蛋白质，如抗体或药物。
美国专利5,856,456提供了用于连接多肽成分以制备融合蛋白，例如，单链抗体的肽接头。接头的长度至多约50个氨基酸，含有至少一次出现的带电荷的氨基酸(优选地，精氨酸或赖氨酸)，后跟脯氨酸，并且其特征在于更高的稳定性和减少的聚集。美国专利5,880,270公开了在多种免疫诊断和分离技术中有用的含氨氧基的接头。
D.纯化
在某些实施例中，本公开的抗体可以是纯化的。如本文所使用的，术语“纯化的”旨在指可从其它组分中分离的组合物，其中蛋白质相对于其天然可获得状态被纯化到任何程度。因此，纯化的蛋白质也指一种蛋白质，所述蛋白质不受其可能天然存在的环境的影响。当使用术语“基本上纯化的”时，此名称将指一种组合物，其中蛋白质或肽形成所述组合物的主要组分，如构成所述组合物中蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
蛋白质纯化技术对于本领域的技术人员来说是众所周知的。这些技术在一个水平上涉及将细胞环境粗分级为多肽和非多肽级分。将多肽与其它蛋白质分离后，可以使用色谱和电泳技术进一步纯化所关注的多肽以实现部分或完全纯化(或纯化到均质)。特别适合制备纯肽的分析方法是离子交换色谱法、排阻色谱法；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。用于蛋白质纯化的其它方法包含用硫酸铵、PEG、抗体等或通过热变性来进行沉淀，随后离心；凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱法；以及此类和其它技术的组合。
在纯化本公开的抗体时，可能需要在原核或真核表达***中表达多肽并使用变性条件提取蛋白质。可以使用与多肽的标记部分结合的亲和柱从其它细胞组分中纯化多肽。如本领域通常已知的，据信可以改变进行各种纯化步骤的顺序，或者可以省略某些步骤，并且仍然产生用于制备基本上纯化的蛋白质或肽的合适方法。
通常，使用与抗体的Fc部分结合的药剂(即，蛋白A)对完整抗体进行分馏。可替代地，抗原可以用于同时纯化和选择合适的抗体。此类方法通常利用与支持物结合的选择剂，如柱、过滤器或珠粒。抗体与支持物结合，去除污染物(例如，洗掉)，并且通过施加条件(盐、热等)释放抗体。
根据本公开内容，本领域技术人员将知道用于对蛋白质或肽的纯化程度进行定量的各种方法。这些包含例如确定活性级分的比活性或通过SDS/PAGE分析评估级分内多肽的量。用于评估级分纯度的另一种方法是计算级分的比活性，以将所述比活性与初始提取物的比活性进行比较，从而计算纯度。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于选择用于纯化之后的特定测定技术以及所表达的蛋白质或肽是否展现出可检测的活性。
已知多肽的迁移可以随着SDS/PAGE的不同条件而变化，有时甚至是显著变化(Capaldi等人，1977)。因此应当理解，在不同的电泳条件下，纯化或部分纯化的表达产物的表观分子量可能不同。
V.抗DDR1抗体的用途和组合物
A.治疗方法和用途
1.癌症的治疗
虽然过度增殖性疾病可能与导致细胞开始不受控制地繁殖的任何疾病相关，但典型的实例是癌症。癌症的关键要素之一是细胞的正常凋亡周期被中断，因此中断细胞生长的药剂作为用于治疗这些疾病的治疗剂很重要。在本公开中，本文所描述的抗DDR1抗体或其抗原结合片段可以用于减少癌细胞计数，因此可以潜在地用于治疗多种类型的癌症系。在一些方面，本公开的抗体或其抗原结合片段可以用于治疗癌症，包含实体瘤，特别是分泌DDR1蛋白或其部分(如DDR1细胞外结构域)和/或在癌细胞或癌症干细胞的表面上存在DDR1的癌症。在一些实施例中，选择过表达DDR1蛋白的一种癌细胞或多种癌细胞以用本公开的抗体进行治疗。
在一些实施例中，可以根据本公开治疗的癌症和癌细胞类型包含但不限于膀胱、血液、骨、骨髓、脑、***、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头部、肾、肝、肺、鼻咽、颈部、卵巢、***、皮肤、胃、胰腺、睾丸、舌、子宫颈或子宫的癌症或癌细胞。另外，癌症可能具体属于以下组织学类型，但不限于这些：恶性肿瘤；癌；未分化癌；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；***状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；***状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管肺泡癌；***状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；***状和滤泡状腺癌；无包膜形成的硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附件癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；***状囊腺癌；***状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特氏病(Paget′s disease)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；恶性男性细胞瘤；塞尔托利氏细胞癌(sertoli cell carcinoma)；恶性莱迪希细胞瘤(Leydig cell tumor)；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维性组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒氏混合瘤(Mullerian mixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间质瘤；恶性布伦纳瘤(Brenner tumor)；恶性叶状瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；***肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏肉瘤(Ewing′s sarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆型星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；节细胞神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘膜瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病(Hodgkin′sdisease)；类肉芽肿；恶性小淋巴细胞淋巴瘤；恶性弥漫大细胞淋巴瘤；恶性滤泡性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其它特定的非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma)；恶性组织细胞增多病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。在某些方面，肿瘤可以包括骨肉瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤文氏肉瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤或白血病。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段用于治疗胰腺癌；肺癌，包含小细胞肺癌和非小细胞肺癌；结肠癌和结直肠癌；头颈癌、胃(stomach/gastric)癌；卵巢癌；乳腺癌；肾癌；肝癌；***癌、***、脑癌；皮肤癌，包含黑色素瘤；或骨癌。在一些实施例中，选择用于治疗的癌症是乳腺癌，包含各种乳腺癌亚型，如下文进一步讨论的。
在一些实施例中，选择用于用抗体或其抗原结合片段治疗的受试者患有分泌DDR1蛋白或其部分和/或在癌细胞的表面上存在DDR1的癌症。在一些实施例中，用于治疗癌症的方法包含确定用于治疗的癌症是否分泌DDR1蛋白和/或在癌细胞的表面上具有表达的DDR1蛋白的步骤。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段用于治疗血液学癌症或血液癌症，包含但不限于恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；类肉芽肿；恶性小淋巴细胞淋巴瘤；恶性弥漫大细胞淋巴瘤；恶性滤泡性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其它特定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
在一些实施例中，选择用于用抗体或其抗原结合片段治疗的受试者患有分泌DDR1蛋白或其部分和/或在癌细胞的表面上存在DDR1的癌症。在一些实施例中，用于治疗癌症的方法包含确定用于治疗的癌症是否分泌DDR1蛋白和/或在癌细胞的表面上具有表达的DDR1蛋白的步骤。因此，在一些实施例中，用于治疗受试者的癌症的方法包括确定受试者体内癌细胞的表面上存在分泌的DDR1蛋白或存在DDR1蛋白，以及如果确定癌细胞已分泌DDR1蛋白或在癌细胞的表面上存在DDR1，通过施用治疗有效量的本文所公开的抗体或抗原结合片段来治疗受试者的癌症。
2.乳腺癌的治疗
在一些实施例中，用于治疗的癌症是乳腺癌，其通常起源于***，通常位于乳导管或小叶的内衬。有不同类型的乳腺癌，具有不同的阶段(传播)、侵袭性和基因组成。通过最佳治疗，10年无病存活率从98％到10％不等。治疗选自外科手术、药物(化学疗法)和放射。在美国，2004年有216,000例侵入性乳腺癌病例和40,000人死亡。在全世界，乳腺癌是仅次于肺癌的第二大常见癌症类型(占所有癌症发病率的10.4％，两性都计算在内)，并且是癌症死亡的第五大常见原因。2004年，乳腺癌在全世界造成519,000人死亡(占癌症死亡人数的7％；几乎占所有死亡人数的1％)。女性患乳腺癌的几率约是男性的100倍，但两性的存活率相当。
乳腺癌的第一个症状或主观迹象通常是感觉与周围***组织不同的肿块。根据《默克手册(Merck Manual)》，超过80％的乳腺癌病例是在女性感觉到肿块时发现的。根据美国癌症协会(American Cancer Society)，医师检测到的乳腺癌的第一个医学征象或客观适应症是通过***X线照片发现的。在位于腋窝的***中发现的肿块也可能表明患有乳腺癌。除肿块外，乳腺癌的适应症可能包含***大小或形状的变化、皮肤凹陷、***内陷或自发性单***溢液。疼痛(“乳腺痛”)是确定存在或不存在乳腺癌的不可靠工具，但可能表明其它***健康问题。
当乳腺癌细胞侵入真皮***——***皮肤中的小***时，其表现可能类似于皮肤炎症，因此被称为炎性乳腺癌(IBC)。炎性乳腺癌的症状包含整个***的疼痛、肿胀、发热和发红，以及被称为“橙皮样”的橙皮质地。另一种报告的乳腺癌症候群是乳腺佩吉特氏病。此综合征表现为湿疹样皮肤变化，如***皮肤发红和轻度剥落。随着佩吉特氏病的发展，症状可能包含刺痛、瘙痒、敏感性增加、灼热和疼痛。***也可能有溢液。大约一半被诊断患有佩吉特氏病的女性也有***肿块。
有时，乳腺癌表现为转移性疾病，即，已经扩散到原始器官之外的癌症。转移性乳腺癌将引起取决于转移位置的症状。常见的转移位点包含骨、肝、肺和脑。不明原因的体重减轻有时可能预示着隐匿性乳腺癌，发烧或发冷的症状也是如此。骨或关节疼痛有时可能是转移性乳腺癌的表现，黄疸或神经***症状也是如此。这些症状是“非特异性的”，这意味着它们也可能是许多其它疾病的表现。
已鉴定的主要风险因素是性别、年龄、生育、激素、高脂肪饮食、饮酒、肥胖和环境因素，如烟草使用、辐射和轮班工作。95％的乳腺癌病例的病因不明，而大约5％的新发乳腺癌可归因于遗传综合征。特别是，乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的载体患乳腺癌和卵巢癌的风险增加30％到40％，这取决于突变发生在蛋白质的哪个部分。专家认为，95％的遗传性乳腺癌可以追溯到这两个基因之一。遗传性乳腺癌可以表现为位点特异性遗传性乳腺癌的形式——仅影响***的癌症——或乳腺-卵巢和其它癌症综合征。乳腺癌可以从女性和男性亲属那里遗传。
乳腺癌亚型通常基于免疫组织化学进行分类。亚型定义一般如下：
●正常(ER+、PR+、HER2+、细胞角蛋白5/6+和HER1+)
●管腔A(ER+和/或PR+、HER2-)
●管腔B(ER+和/或PR+、HER2+)
●三阴性(ER-、PR-、HER2-)
●HER2+/ER-(ER-、PR-和HER2+)
●未分类(ER-、PR-、HER2-、细胞角蛋白5/6-和HER1-)
在三阴性乳腺癌细胞的情况下，癌症的生长不是由***或***或来自HER2蛋白的生长信号驱动的。出于同样的原因，此类癌细胞对如三苯氧胺或芳香酶抑制剂等激素疗法或如
Figure BPA0000324724060000721
等靶向HER2受体的疗法没有应答。约10％到20％的乳腺癌被发现是三阴性的。鉴定这些类型的癌症很重要，这样就可以避免难以成功的疗法的昂贵和毒性作用，并专注于可以用于治疗三阴性乳腺癌的治疗。与其它形式的乳腺癌一样，三阴性乳腺癌可以通过外科手术、放射疗法和/或化学疗法进行治疗。一种特别有前途的方法是“新辅助”疗法，其中在外科手术前提供化学和/或放射疗法。另一种药物疗法是使用聚(ADP-核糖)聚合酶或PARP抑制剂。
虽然上文讨论的筛查技术可用于确定癌症的可能性，但需要进一步测试以确认筛查中检测到的肿块是否为癌症，而不是如简单的囊肿等良性替代物。在临床环境中，通常使用临床***检查(由训练有素的医师进行***检查)、***X线照相术和细针抽吸细胞学检查的“三重测试”来诊断乳腺癌。***X线照相术和临床***检查(也用于筛查)都可以表明肿块是癌症的大致可能性，并且还可以鉴定任何其它病变。使用局部麻醉剂作为门诊流程进行的细针抽吸和细胞学检查(FNAC)涉及尝试从肿块中提取一小部分流体。透明流体使肿块极不可能是癌性的，但血性流体可能会被送去在显微镜下检查癌细胞。这三个工具可以一起用来诊断乳腺癌，准确度很高。活检的其它选择包含芯活检(其中切除一部分***肿块)和切除活检(其中切除整个肿块)。
乳腺癌筛查是试图在其它健康个体中发现癌症。女性最常见的筛查方法是x射线***X线照相术和临床***检查相结合。对于风险高于正常风险的女性，如有很强的癌症家族史的女性，另外的工具可能包含基因检测或***磁共振成像。
***自我检查是过去大力提倡的一种筛查形式，但由于几项大型研究表明***自我检查对女性没有生存益处并且经常引起相当大的焦虑，因此已经不受欢迎。这被认为是因为可以检测到的癌症往往已经处于相对晚期的阶段，而其它方法则推动在治愈性治疗通常更有可能的早期阶段鉴定癌症。
x射线***X线照相术使用x射线检查***是否有任何异常团块或肿块。若干国家推荐一定年龄以上的女性定期进行***X线照片检查作为筛查工具。
乳腺癌的基因检测通常涉及检测BRCA基因的突变。除了那些患乳腺癌风险较高的人外，这通常不是推荐的技术。
乳腺癌治疗的主要方法是在肿瘤被定位时进行外科手术，使用可能的辅助激素疗法(使用三苯氧胺或芳香化酶抑制剂)、化学疗法和/或放射疗法。目前，外科手术后的治疗建议(辅助疗法)遵循一个模式。根据临床标准(年龄、癌症类型、大小、转移)，患者大致分为高风险和低风险病例，每个风险类别遵循不同的疗法规则。治疗可能性包含放射疗法、化学疗法、激素疗法和免疫疗法。
靶向癌症疗法是靶向癌细胞特定特性的治疗，如使癌细胞以快速或异常方式生长的蛋白质。与化学疗法相比，靶向疗法通常不太可能伤害正常、健康的细胞。一些靶向疗法是抗体，其作用类似于人体免疫***自然产生的抗体。这些类型的靶向疗法有时被称为免疫靶向疗法。
目前医生使用3种靶向疗法治疗乳腺癌。
Figure BPA0000324724060000731
(曲妥珠单抗(trastuzumab))通过阻断癌细胞接收告诉细胞生长的化学信号的能力来对抗HER2阳性乳腺癌。
Figure BPA0000324724060000741
(拉帕替尼(lapatinib))通过阻断某些可能导致不受控制的细胞生长的蛋白质来对抗HER2阳性乳腺癌。
Figure BPA0000324724060000742
(贝伐单抗(bevacizumab))通过阻断癌细胞赖以生长和发挥作用的新血管的生长起作用。
激素(抗***)疗法以两种方式对抗激素受体阳性乳腺癌：首先，通过降低体内***的量，其次，通过阻断体内***的作用。女性体内的大部分***是由卵巢产生的。***使激素受体阳性乳腺癌生长。因此，减少***的量或阻断***的作用可以帮助缩小激素受体阳性乳腺癌并降低激素受体阳性乳腺癌再次发生(复发)的风险。激素疗法药物对激素受体阴性乳腺癌无效。
有若干种类型的激素疗法药物，包含芳香酶抑制剂、选择性***受体调节剂和***受体下调调节剂。在一些情况下，可能会通过外科手术切除卵巢和输卵管以治疗激素受体阳性乳腺癌或作为乳腺癌高风险女性的预防措施。卵巢也可以使用药物暂时关闭。
在计划治疗时，医生还可以使用Oncotype DX等PCR测试或基于基因表达预测乳腺癌复发风险的微阵列测试。2007年2月，第一个乳腺癌预测因子测试获得了食品和药物管理局(Food and Drug Administration)的正式批准。这是一项新的基因测试，可帮助预测患有早期乳腺癌的女性是否会在5年或10年内复发，这可能有助于影响初始肿瘤的治疗力度。
放射疗法也用于帮助破坏外科手术后可能残留的癌细胞。当以正确的剂量递送时，放射可以将复发的风险降低50％到66％。
因此，在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段用于治疗乳腺癌，包含上文描述的乳腺癌亚型中的每种亚型。在一些实施例中，本公开的抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂组合使用，其中第二治疗剂包含本文所描述的一种或多种药剂(例如，放射、化学治疗剂、激素和免疫治疗剂)。在一些实施例中，用抗体或抗原结合片段治疗确定在细胞表面上具有DDR蛋白或分泌DDR1蛋白的乳腺癌或其亚型。
3.纤维化病症的治疗
除了在癌症中表达外，DDR1蛋白还在肾脏、肺、胃肠道、皮肤和脑等器官中表达，并且与皮肤、肺和肝的纤维化有关(Moll等人，2019，通过引用并入本文)。因此，在一些实施例中，本公开的抗DDR1抗体或其抗原结合片段可以单独或与其它疗法组合使用，以治疗纤维化病症。在一些实施例中，纤维化病症是器官纤维化。在一些实施例中，纤维化病症是皮肤、肾、肝、肺或心脏的纤维化。在一些实施例中，所治疗的纤维化病症是但不限于皮肤肥厚性疤痕、特发性肺纤维化、肝硬化和肾纤维化。
在一些实施例中，用于治疗的纤维化病症是肺纤维化。在一些实施例中，所治疗的受试者患有间质性肺病。在一些实施例中，所治疗的受试者患有特发性肺纤维化(IPF)或肺疤痕。
B.调配物和施用
另一方面，本公开提供了包括抗DDR1抗体和用于生成所述抗体的抗原的药物组合物。此类组合物包括预防或治疗有效量的抗体或其片段以及药学上可接受的载体。在具体实施例中，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其它普遍认可的药典中列出的可用于动物、并且更具体地用于人的。术语“载体”是指治疗剂与之一起施用的稀释剂、赋形剂或媒剂。此类药物载体可以是无茵液体，如水和油，包含石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是特定载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。其它合适的药物赋形剂包含淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。
如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释调配物等形式。口服调配物可以包含标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。《雷明顿氏药物科学》中描述了合适的药剂的实例。此类组合物将含有预防或治疗有效量的抗体或其片段(优选地呈纯化形式)连同合适的量的载体，以便提供适当施用于患者的形式。调配物应适合施用方式，施用方式可以是口服、静脉内、动脉内、颊内、鼻内、雾化、支气管吸入或通过机械通气递送。
如本文所描述的，本公开的抗体可以调配用于肠胃外施用，例如，调配用于通过皮内、静脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内或甚至腹膜内途径注射。可替代地，抗体可以通过局部途径直接施用于粘膜，例如通过滴鼻剂、吸入或通过雾化器。药学上可接受的盐包含酸式盐，并且所述药学上可接受的盐与如盐酸或磷酸等无机酸或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸等形成。由游离羧基形成的盐也可以源自无机碱(如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(如异丙胺、三甲胺、2-乙胺乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等)。
一般地，将本公开的组合物的成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在气密封容器中的干燥冻干粉或无水浓缩剂，所述气密封容器如指示活性剂的量的安瓿或小药囊。在通过输注施用组合物时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶分配。当组合物通过注射施用时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，使得成分可以在施用之前混合。
在一些实施例中，本公开的组合物可以被调配成中性或盐形式。药学上可接受的盐包含与阴离子(如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些阴离子)形成的那些盐以及与阳离子(如源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些阳离子)形成的那些盐。
在一些实施例中，以有效量施用抗体或其抗原结合片段以治疗疾病或病症，特别是如乳腺癌等癌症。施用的抗DDR1抗体的量将取决于多种因素，包含但不限于治疗的癌症的特定类型、治疗的癌症的阶段、施用方式、施用频率、期望的治疗益处以及其它参数，如患者的年龄、体重和其它特性等。
最初可以从体内动物模型或临床试验中估计有效提供治疗益处的剂量。用于各种疾病的合适的动物模型在本领域中是已知的，并且确定有效地为特定施用方式和施用频率提供治疗益处的剂量在本领域技术人员的能力范围内。
在一些实施例中，可以施用的抗DDR1抗体或其抗原结合片段可以在0.0001mg/kg到100mg/kg体重的范围内。鉴于可用的抗体组合物的多样性和各种施用途径的不同效率，预期施用的剂量会有很大差异。这些剂量水平的变化可以使用本领域所熟知的用于优化的标准经验方式进行调整。在一些实施例中，对于本文所描述的适应症的治疗，本公开的抗体的有效剂量可以在以下范围内：约0.001mg/kg到约75mg/kg体重；0.005mg/kg到约50mg/kg体重；约0.01mg/kg到约30mg/kg体重；或约0.01mg/kg到5mg/kg体重。
C.细胞疗法
另一方面，本公开提供了表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞。在一些实施例中，CAR包括本文提供的抗原结合片段。在一些实施例中，CAR蛋白从N末端到C末端包含：前导肽、抗DDR1重链可变结构域、接头结构域、抗DDR1轻链可变结构域、人IgG1-CH2-CH3结构域、间隔区、CD28跨膜结构域、抗DDR1细胞内共刺激信号传导和CD3ζ细胞内T细胞信号传导结构域。
还提供了用于免疫疗法的方法，所述方法包括施用有效量的本公开的免疫细胞。在一个实施例中，通过转移引起免疫应答的免疫细胞群体来治疗医学疾病或病症。在本公开的某些实施例中，通过转移引起免疫应答的免疫细胞群体来治疗癌症或感染。本文提供了用于治疗个体的癌症或延缓其进展的方法，所述方法包括向个体施用有效量的抗原特异性细胞疗法。
免疫细胞可以是T细胞(例如，调控T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)、NK细胞、恒定型NK细胞、NKT细胞或巨噬细胞。本文还提供了产生免疫细胞和对其进行工程化的方法以及使用和施用细胞用于过继性细胞疗法的方法，在这种情况下，细胞可以是自体的或同种异体的。因此，免疫细胞可以用作免疫疗法，如靶向癌细胞。
免疫细胞可以从受试者，特别是人受试者中分离。免疫细胞可以从健康人受试者、健康志愿者或健康供体获得。免疫细胞可以从所关注的受试者获得，如怀疑患有特定疾病或病状的受试者、怀疑对特定疾病或病状的具有易感性的受试者或正在接受针对特定疾病或病状的疗法的受试者。免疫细胞可以从它们存在于受试者中的任何位置收集，所述位置包含但不限于血液、脐带血、脾脏、胸腺、***和骨髓。分离的免疫细胞可以直接使用，或者其可以如通过冷冻而储存一定时间段。
免疫细胞可以从它们所在的任何组织中富集/纯化，所述组织包含但不限于血液(包含由血库或脐带血库收集的血液)、脾脏、骨髓、外科手术程序期间取出和/或暴露的组织，以及通过活检程序获得的组织。免疫细胞从中富集、分离和/或纯化的组织/器官可以从活体和非活体受试者中分离，其中非活体受试者是器官供体。在特定实施例中，免疫细胞从如外周血或脐带血等血液中分离。在一些方面，从脐带血中分离的免疫细胞具有增强的免疫调节能力，如通过CD4-或CD8-阳性T细胞抑制测量的。在特定方面，免疫细胞从汇集的血液，特别是汇集的脐带血中分离，以增强免疫调节能力。汇集的血液可以来自2个或更多个来源，如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个来源(例如，供体受试者)。
免疫细胞群体可以从需要疗法或患有与免疫细胞活性降低相关的疾病的受试者获得。因此，细胞对于需要疗法的受试者来说将是自体的。可替代地，免疫细胞群体可以从供体，优选地组织相容性匹配的供体获得。免疫细胞群体可以从外周血、脐带血、骨髓、脾脏或免疫细胞存在于在所述受试者或供体中的任何其它器官/组织中采集。免疫细胞可以从一组受试者和/或供体，如从汇集的脐带血中分离。
当免疫细胞群体是从与受试者不同的供体获得时，所述供体优选地是同种异体的，前提是获得的细胞与受试者相容，因为可以将所述细胞引入受试者中。同种异体供体细胞可能与人类白细胞抗原(HLA)相容或可能不相容。为了使与受试者相容，可以处理同种异体细胞以降低免疫原性。
免疫细胞可以被基因工程化成表达如工程化TCR和/或嵌合抗原受体(CAR)等抗原受体。例如，宿主细胞(例如，自体或同种异体T细胞)被修饰成表达对癌症抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。在特定实施例中，NK细胞被工程化成表达TCR。NK细胞可以被进一步工程化成表达CAR。多个CAR和/或TCR，如针对不同的抗原，可以添加到单个细胞类型，如T细胞或NK细胞。
合适的修饰方法是本领域已知的。例如参见Sambrook等人，同上；和Ausubel等人，《当代分子生物学实验指南》，纽约格林出版协会和约翰威利父子公司(Greene PublishingAssociates and John Wiley&Sons，NY)，1994。例如，可以使用以下描述的转导技术转导细胞以表达对癌症抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)：Heemskerk等人(2008)和Johnson等人(2009)。
在一些实施例中，细胞包括一种或多种通过基因工程引入的编码一种或多种抗原受体的核酸，以及此类核酸的基因工程化产物。在一些实施例中，核酸是异源的，即，通常不存在于细胞或从所述细胞获得的样品中，如从另一生物体或细胞获得的样品，例如，其通常不会见于被工程化的细胞和/或此类细胞来源的生物体中。在一些实施例中，核酸不是天然存在的，如自然界中未发现的核酸(例如，嵌合的)。
D.组合疗法
还可能期望提供使用本公开的抗体与另外的抗癌疗法相结合的组合疗法。这些疗法将以有效降低一种或多种疾病参数的组合量提供。此过程可以涉及同时使细胞/受试者与两种药剂/疗法接触，例如，使用包含两种药剂的单一组合物或药理调配物、或通过同时使细胞/受试者与两种不同的组合物或调配物接触，其中一种组合物包含抗体，并且另一种组合物包含另一种药剂。
可替代地，抗体可以在其它治疗之前或之后间隔数分钟到数周。通常会确保在每次递送时间之间不会超过显著的时间段，这样疗法仍将能够对细胞/受试者发挥有利的组合作用。在此类情况下，经考虑在彼此相隔约12小时到24小时内、在彼此相隔约6小时到12小时内、或仅约12小时的延迟时间内以两种方式接触细胞。在一些情况下，可能需要显著延长治疗时间段；然而，其中在相应的施用之间经过了若干10天(2天、3天、4天、5天、6天或7天)到若干周(1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周)。
还可以设想的是，将期望多于一次施用抗DDR1抗体或其它疗法。可以采用各种组合，其中抗体是“A”，而另一种疗法是“B”，如下所例示：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B
考虑了其它组合。为了杀死细胞、抑制细胞生长、抑制转移、抑制血管生成或以其它方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型，使用本发明的方法和组合物，可以将靶细胞或位点与抗体和至少一种其它疗法接触。这些疗法将以有效杀死癌细胞或抑制癌细胞增殖的组合量提供。此过程可能涉及同时将细胞/位点/受试者与药剂/疗法接触。
考虑用于与本公开的抗体的组合疗法的特定药剂包含化学疗法和造血干细胞移植。化学疗法可能包含阿糖胞苷(ara-C)和蒽环霉素(最常见的是柔红霉素)、单独的高剂量阿糖孢苷、全反式视黄酸(ATRA)以及巩固疗法完成后的诱导化学疗法，通常是蒽环霉素、组胺二盐酸盐(Ceplene)和白介素2(Proleukin)、不适合高剂量化学疗法的60岁以上复发性AML患者的吉妥单抗(Mylotarg)、氯法拉滨以及靶向疗法，如激酶抑制剂、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨和MDR1(多药耐药蛋白)抑制剂或三氧化二砷或复发性急性早幼粒细胞白血病(APL)。
在某些实施例中，用于组合疗法的药剂是一种或多种药物，所述一种或多种药物选自由以下组成的组：拓扑异构酶抑制剂、蒽环类拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素、柔红霉素、核苷代谢抑制剂、阿糖胞苷、低甲基化剂、低剂量阿糖胞苷(LDAC)、柔红霉素和阿糖胞苷的组合、用于注射的柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、
Figure BPA0000324724060000791
氮杂胞苷、
Figure BPA0000324724060000792
地西他滨、全反式视黄酸(ATRA)、砷、三氧化二砷、组胺二盐酸盐、
Figure BPA0000324724060000793
白介素-2、阿地白介素、
Figure BPA0000324724060000794
吉妥单抗、
Figure BPA0000324724060000795
FLT-3抑制剂、米哚妥林、
Figure BPA0000324724060000796
氯法拉滨、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨、IDH1抑制剂、艾伏尼布、
Figure BPA0000324724060000797
IDH2抑制剂、依那昔布、
Figure BPA0000324724060000798
平滑(SMO)抑制剂、格拉吉布、精氨酸酶抑制剂、IDO抑制剂、艾卡哚司他、BCL-2抑制剂、维奈托克、
Figure BPA0000324724060000799
铂复合物衍生物、奥沙利铂、激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、BTK抑制剂、依鲁替尼、
Figure BPA00003247240600007910
阿卡替尼、
Figure BPA00003247240600007911
赞布替尼、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG3抗体、ICOS抗体、TIGIT抗体、TIM3抗体、CD40抗体、4-1BB抗体、CD47抗体、SIRP1α抗体或融合蛋白、E-选择蛋白的拮抗剂、与肿瘤抗原结合的抗体、与T细胞表面标志物结合的抗体、与髓样细胞或NK细胞表面标志物结合的抗体、烷化剂、亚硝基脲剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、来源于植物的生物碱、激素疗法药物、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。在一些实施例中，组合疗法中使用的药剂是先前已被用作针对如特定类型的癌症等特定适应症的疗法的药剂。在一些实施例中，特定适应症是乳腺癌，并且与抗体或其抗原结合剂组合使用的药剂是接受的针对乳腺癌治疗的药剂。
VI.抗体缀合物
本公开的抗体可以与至少一种药剂连接以形成抗体缀合物。为了提高抗体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，通常连接或共价结合或复合至少一种期望的分子或部分。此类分子或部分可以是但不限于至少一种效应子或报告分子。效应子分子包括具有期望的活性，例如细胞毒活性的分子。已与抗体的效应子分子连接的非限制性实例包含毒素、抗肿瘤剂、治疗酶、放射性核素、抗病毒剂、螯合剂、细胞因子、生长因子和寡核苷酸或多核苷酸。相比之下，报告分子被定义为可以使用测定检测到的任何部分。已与抗体缀合的报道分子的非限制性实例包含酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、发色团、光亲和分子、有色颗粒或配体，如生物素。
抗体-药物缀合物已成为开发癌症治疗的突破性方法。抗体-药物缀合物(ADC)包括与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。此方法将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效的细胞毒性药物相结合，从而产生将有效负载(药物)递送到具有富集抗原水平的肿瘤细胞的“武装的”MAb。药物的靶向递送还可以最小化其在正常组织中的暴露，从而降低毒性并提高治疗指数。FDA对两种ADC药物：2011年的
Figure BPA0000324724060000801
(本妥昔单抗(brentuximabvedotin))和2013年的
Figure BPA0000324724060000802
(曲妥珠单抗美坦新(trastuzumab emtansine)或T-DM1)的批准验证了所述方法。目前有30多种ADC候选药物处于癌症治疗临床试验的各个阶段(Leal等人，2014)。随着抗体工程化和接头-有效负载优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合此方法的新靶标的鉴定和验证以及靶向MAb的生成。ADC靶标的两个标准是肿瘤细胞中上调/高水平的表达和稳健的内化。
抗体缀合物也优选用作诊断剂。抗体诊断通常分为两类，一类用于体外诊断，如各种免疫测定，并且另一类用于体内诊断方案，通常称为“抗体-定向成像”。许多合适的成像剂在本领域中是已知的，以及其与抗体连接的方法也是已知的(参见例如，美国专利5,021,236、4,938,948和4,472,509)。所使用的成像部分可以是顺磁离子、放射性同位素、荧光染料、NMR可检测物质和X射线成像剂。
在一些实施例中，与抗体或其抗原结合片段连接的部分是顺磁性离子，所述顺磁性离子可以选自铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)，镍(II)，铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)钬(III)和/或铒(III)等，其中钆是特别优选的。适用于其它上下文的离子，如X射线成像，包含但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)，并且尤其是铋(III)。
在用于治疗和/或诊断应用的放射性同位素的情况下，同位素可以选自砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m和/或钇90。125I通常优选用于某些实施例中，而锝99m和/或铟111由于其能量低且适于长距离检测也通常是优选的。本公开的放射性标记的单克隆抗体可以根据本领域熟知的方法产生。例如，单克隆抗体可以通过与碘化钠和/或碘化钾以及如次氯酸钠的化学氧化剂或如乳过氧化物酶的酶氧化剂接触而碘化。可以通过配体交换过程用锝99m标记根据本公开的单克隆抗体，例如通过用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到葡聚糖凝胶柱(Sephadex column)上，并且将抗体应用于此柱。可替代地，可以使用直接标记技术，例如通过温育高锝酸盐、如SNCl2的还原剂、如邻苯二甲酸钠钾溶液的缓冲溶液和抗体。通常用于将作为金属离子存在的放射性同位素与抗体结合的中间官能团是二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
考虑用作缀合物的荧光标记包含Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、级联蓝色、Cy3、Cy5、6-FAM、荧光素异硫氰酸盐、HEX、6-JOE、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂(Renographin)、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或得克萨斯州红。
本公开中考虑的另一种类型的抗体缀合物是旨在主要用于体外的抗体缀合物，其中抗体与次级结合配体和/或酶(酶标签)连接，所述酶在与显色底物接触时将产生有色产物。合适的酶的实例包含尿素酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的次级结合配体是生物素和亲和素以及链霉亲和素化合物。此类标记的使用对于本领域技术人员是熟知的并且描述于例如，美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中。
分子与抗体的位点特异性连接的又另一种已知方法包括抗体与基于半抗原的亲和标记的反应。本质上，基于半抗原的亲和标记与抗原结合位点中的氨基酸进行反应，从而破坏此位点并阻断特异性抗原反应。然而，这可能不是有利的，因为其导致抗体缀合物失去抗原结合。
含有叠氮基的分子也可以用于通过低强度紫外线生成的反应性氮烯中间体与蛋白质形成共价键(Potter和Haley，1983)。特别地，嘌呤核苷酸的2-和8-叠氮基类似物已被用作定点光探针来鉴定粗细胞提取物中的核苷酸结合蛋白(Owens和Haley，1987；Atherton等人，1985)。2-和8-叠氮基核苷酸也已用于映射纯化的蛋白质的核苷酸结合结构域(Khatoon等人，1989；King等人，1989；Dholakia等人，1989)并可以用作抗体结合剂。
本领域已知若干种用于将抗体与其缀合物部分连接或缀合的方法。一些连接方法涉及使用金属螯合复合物，例如，有机螯合剂，如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；乙烯三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或与抗体连接的四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(美国专利4,472,509和4,938,948)。单克隆抗体也可在如戊二醛或高碘酸盐的偶联剂存在下与酶反应。在这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯反应，制备与荧光素标志物的缀合物。在美国专利4,938,948中，乳腺肿瘤的成像是使用单克隆抗体实现的，并且可检测的成像部分使用如对羟基苯甲酸甲酯或N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯等接头与抗体结合。
在其它实施例中，考虑了通过使用不改变抗体结合位点的反应条件在免疫球蛋白的Fc区中选择性地引入巯基来衍生免疫球蛋白。公开了根据此方法产生的抗体缀合物以展现改进的寿命、特异性和敏感性(美国专利5,196,066，通过引用并入本文)。效应子或报告分子的位点特异性连接也已在文献中公开(O′Shannessy等人，1987)，其中报告或效应子与Fc区中的碳水化合物残基缀合。据报道，此方法会产生目前处于临床评估的有诊断前景和治疗前景的抗体。
VII.免疫检测方法
在仍另外的实施例中，本公开涉及用于结合、纯化、去除、定量和以其它方式一般地检测DDR1相关癌症的免疫检测方法。虽然此类方法可以在传统意义上应用，但另一种用途将是疫苗和其它病毒原液的质量控制和监测，其中根据本公开的抗体可以用于评估病毒中H1抗原的量或完整性(即，长期稳定性)。可替代地，所述方法可以用于筛选各种抗体以获得合适的/期望的反应谱。
一些免疫检测方法包含酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定和蛋白质印迹，仅举几例。特别地，还提供了用于检测DDR1和对其进行定量的竞争性测定。各种有用的免疫检测方法的步骤已在科学文献中进行了描述，例如Doolittle和Ben-Zeev(1999)；Gulbis和Galand(1993)；DeJager等人(1993)和Nakamura等人(1987)。通常，免疫结合方法包含获得怀疑含有DDR1相关癌症的样品，以及在有效允许形成免疫复合物的条件下使样品与根据本公开的第一抗体接触，可以视情况而定。
这些方法包含用于从样品中检测或纯化DDR1或DDR1相关癌细胞的方法。抗体将优选地与固体支持物连接，如以柱基质的形式，并且将怀疑含有DDR1相关癌细胞的样品应用于固定化抗体。不期望的组分将从柱中洗掉，使表达DDR1的细胞与固定化抗体免疫复合，然后通过从柱中去除有机体或抗原来收集所述固定化抗体。
免疫结合方法还包含用于检测样品中DDR1相关癌细胞或相关组分的量和对其进行定量以及检测结合过程期间形成的任何免疫复合物和对其进行定量的方法。在此，将获得怀疑含有DDR1相关癌细胞的样品，并且将样品与结合DDR1或其组分的抗体接触，随后检测在特定条件下形成的免疫复合物的量和对其进行定量。在抗原检测方面，所分析的生物样品可以是任何怀疑含有DDR1相关癌症的样品，如组织切片或样本、均质化的组织提取物、生物流体(包含血液和血清)或如粪便或尿液等分泌物。
在有效条件下将所选生物样品与抗体接触并且持续足以允许形成免疫复合物(初级免疫复合物)的时间段通常只需将抗体组合物添加到样品中并将混合物温育足够长的时间段使抗体与DDR1形成免疫复合物，即，与DDR1结合。在此时间后，通常将洗涤如组织切片、ELISA板、斑点印迹或蛋白质印迹等样品-抗体组合物，以去除任何非特异性结合的抗体物种，从而仅检测特异性结合在初级免疫复合物内的那些抗体。
通常，对免疫复合物形成的检测在本领域熟知的，并且可以通过应用许多方法来实现。这些方法通常基于对如那些放射性、荧光、生物和酶标签中的任何一种等标记或标志物的检测。有关使用此类标记的专利包含美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。当然，如本领域已知的，可以通过使用如第二抗体和/或生物素/亲和素配体结合布置等次级结合配体发现另外的优势。
检测中使用的抗体本身可以与可检测标记连接，其中然后可以简单地检测此标记，从而可以确定组合物中初级免疫复合物的量。可替代地，可以通过对抗体具有结合亲和力的第二结合配体来检测结合在初级免疫复合物内的第一抗体。在这些情况下，第二结合配体可以与可检测标记连接。第二结合配体本身通常是抗体，因此其可以称为“次级”抗体。初级免疫复合物与标记的次级结合配体或抗体在有效条件下接触并且持续足以允许形成次级免疫复合物的时间段。然后通常洗涤次级免疫复合物以去除任何非特异性结合的标记的次级抗体或配体，并且然后检测次级免疫复合物中剩余的标记。
另外的方法包含通过两步法检测初级免疫复合物。如上文所描述的，第二结合配体，如对抗体具有结合亲和力的抗体，用于形成次级免疫复合物。洗涤后，将次级免疫复合物与对第二抗体具有结合亲和力的第三结合配体或抗体再次在有效条件下接触足以允许形成免疫复合物(三级免疫复合物)的时间段。第三配体或抗体与可检测标记连接，从而允许检测由此形成的三级免疫复合物。如果期望，此***可以提供信号放大。
一种免疫检测方法使用两种不同的抗体。第一种生物素化抗体用于检测靶抗原，然后第二种抗体用于检测与复合的生物素连接的生物素。在所述方法中，要检测的样品首先在含有第一步抗体的溶液中温育。如果存在靶抗原，抗体中的某个抗体与抗原结合以形成生物素化抗体/抗原复合物。然后通过在链霉亲和素(或亲和素)、生物素化DNA和/或互补生物素化DNA的连续溶液中温育来扩增抗体/抗原复合物，每个步骤将另外的生物素位点添加到抗体/抗原复合物。重复扩增步骤直到达到合适的扩增水平，此时将样品在含有第二步抗生物素抗体的溶液中温育。此第二步抗体被标记，例如用可以用于通过使用生色底物的组织酶学检测抗体/抗原复合物的存在的酶。通过合适的扩增，可以产生肉眼可见的缀合物。
另一种已知的免疫检测方法利用免疫-PCR(聚合酶链式反应)方法。PCR方法与Cantor方法类似，直到与生物素化DNA一起温育，然而，代替使用多轮链霉亲和素和生物素化DNA温育，用释放抗体的低pH或高盐缓冲液洗掉DNA/生物素/链霉亲和素/抗体复合物。然后使用所得洗涤溶液与合适的引物和合适的对照进行PCR反应。至少在理论上，PCR的巨大扩增能力和特异性可以用于检测单个抗原分子。
A.ELISA
在免疫测定的最简单且直接的意义上，免疫测定是结合测定。某些优选的免疫测定是本领域已知的各种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。使用组织切片的免疫组织化学检测也特别有用。然而，很容易理解，检测不限于此类技术，并且也可以使用蛋白质印迹、斑点印迹、FACS分析等。
在一个示例性ELISA中，将本公开的抗体固定到展现出蛋白质亲和力的所选表面上，如聚苯乙烯微量滴定板中的孔。然后，将怀疑含有DDR1相关癌细胞的测试组合物添加到孔中。在结合和洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物后，可以检测到结合的抗原。可以通过添加另一种与可检测标记连接的抗-DDR1抗体来实现检测。这种类型的ELISA是简单的“夹心ELISA”。也可以通过添加第二抗-DDR1抗体，随后添加对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来实现检测，其中第三抗体与可检测标记连接。
在另一个示例性ELISA中，将怀疑含有DDR1相关癌细胞的样品固定到孔表面上，然后与本公开的抗DDR1抗体接触。在结合和洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物后，检测结合的抗DDR1抗体。在最初的抗DDR1抗体与可检测标记连接的情况下，可以直接检测免疫复合物。同样，可以使用对第一抗-DDR1抗体具有结合亲和力的第二抗体检测免疫复合物，其中第二抗体与可检测标记连接。
无论采用何种形式，ELISA都具有某些共同特征，如涂覆、温育和结合、洗涤以去除非特异性结合的物种，以及检测结合的免疫复合物。这些在下文进行了描述。
在用抗原或抗体涂覆板时，通常将板的孔与抗原或抗体的溶液一起温育过夜或持续指定的数小时时间段。然后将洗涤板的孔以去除不完全吸附的材料。然后用对测试抗血清呈抗原中性的非特异性蛋白质“涂覆”孔的任何剩余可用表面。这些非特异性蛋白包含牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。所述涂覆允许封闭固定表面上的非特异性吸附位点，并且因此减少由抗血清非特异性结合到表面上引起的背景。
在ELISA中，可能更习惯于使用次级或三级检测手段，而不是直接程序。因此，在蛋白质或抗体与孔结合，用非反应性材料涂覆以降低背景，并洗涤以去除未结合的材料之后，使固定表面与要测试的生物样品在有效地允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下接触。然后免疫复合物的检测需要标记的次级结合配体或抗体，以及与标记的三级抗体或第三结合配体的结合的次级结合配体或抗体。
“在有效地允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下”意指所述条件优选地包含用如BSA、牛丙种球蛋白(BGG)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)/吐温等溶液稀释抗原和/或抗体。这些添加的药剂也有助于减少非特异性背景。
“合适的”条件还意味着温育的温度或时间段足以使其有效结合。温育步骤通常为约1小时到2小时到4小时左右，温度优选地为约25℃到27℃，或者可以在约4℃左右过夜。
在ELISA中的所有温育步骤之后，将接触的表面洗涤以去除非复合材料。优选的洗涤程序包含用如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液等溶液洗涤。在测试样品与最初结合的材料之间形成特异性免疫复合物并随后洗涤后，可以确定甚至微量免疫复合物的出现。
为了提供检测手段，第二或第三抗体将具有允许检测的相关标记。优选地，这将是酶，所述酶将在与适当的显色底物一起温育时产生颜色显影。因此，例如，期望将第一和第二免疫复合物与脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶缀合的抗体接触或孵育，所述接触和温育的时间段和条件有利于进一步的免疫复合物形成的发展(例如，在室温下在如PBS-吐温等含有PBS的溶液中温育2小时)。
在与标记的抗体温育后，并且在洗涤以去除未结合的材料后，例如通过在过氧化物酶作为酶标记的情况下与如脲或溴甲酚紫或2，2′-叠氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)或H2O2等显色底物温育来对标记的量进行定量。然后通过例如使用可见光谱分光光度计测量颜色生成的程度来实现定量。
B.蛋白质印迹
蛋白质印迹(可替代地，蛋白质免疫印迹)是用于检测给定组织匀浆或提取物的样品中的特定蛋白质的分析技术。蛋白质印迹使用凝胶电泳根据多肽的长度(变性条件)或蛋白质的3-D结构(天然/非变性条件)分离天然或变性蛋白质。然后将蛋白质转移到膜(通常是硝酸纤维素或PVDF)上，在膜上使用对靶蛋白质具有特异性的抗体对所述蛋白质进行探测(检测)。
样品可以取自整个组织或细胞培养物。在大多数情况下，首先使用搅拌器(用于较大的样品体积)、使用均质器(较小的体积)或通过超声对固体组织进行机械分解。细胞也可以通过上述机械方法之一被打破。然而，应注意细菌、病毒或环境样品可能是蛋白质的来源，因此蛋白质印迹不仅限于细胞研究。可以使用各种去污剂、盐和缓冲液来促进细胞裂解和溶解蛋白质。通常添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂以防止样品被其自身的酶消化。组织制备通常在低温下进行以避免蛋白质变性。
使用凝胶电泳分离样品的蛋白质。可以通过等电点(pI)、分子量、电荷或这些因素的组合来分离蛋白质。分离的性质取决于样品的处理和凝胶的性质。这是确定蛋白质的一种非常有用的方法。也可以使用二维(2-D)凝胶，所述凝胶将单个样品中的蛋白质在两个维度上展开。在第一维度上根据等电点(其具有中性净电荷的pH)，并且在第二维度上根据其分子量来分离蛋白质。
为了使蛋白质能够被抗体检测，将蛋白质从凝胶内移动到由硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的膜上。将膜放置于凝胶的顶部，并且在所述凝胶的顶部放置一叠滤纸。整个堆叠被放置在缓冲溶液中，所述缓冲溶液通过毛细作用在纸上移动，从而使蛋白质随缓冲溶液一起移动。另一种用于转移蛋白质的方法称为电印迹，并且使用电流将蛋白质从凝胶拉入PVDF或硝酸纤维素膜中。蛋白质从凝胶内移动到膜上，同时保持蛋白质在凝胶内的组织。由于此印迹过程，蛋白质暴露在薄表面层上进行检测(参见下文)。选择这两种膜是因为其非特异性蛋白质结合特性(即，对所有蛋白质的结合都一样好)。蛋白质结合基于疏水相互作用，以及膜与蛋白质之间的带电相互作用。硝酸纤维素膜比PVDF便宜，但更脆弱，并且不能很好地经受反复探测。可以通过用考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)或丽春红S(Ponceau S)染料染色膜来检查蛋白质从凝胶转移到膜的均匀性和整体有效性。一旦转移，使用标记的初级抗体或未标记的初级抗体检测蛋白质，随后使用与初级抗体的Fc区结合的标记蛋白A或次级标记的抗体进行间接检测。
C.免疫组织化学
在一些实施例中，本公开的抗体也可以与新鲜冷冻的和/或***固定的、石蜡包埋的组织块结合使用，所述组织块为免疫组织化学(IHC)研究而制备。由这些颗粒样本制备组织块的方法已成功用于各种预后因素的先前IHC研究，并且为本领域技术人员所熟知(Brown等人，1990；Abbondanzo等人，1990；Allred等人，1990)。
简而言之，冷冻切片可以通过以下来制备：将50ng冷冻的“粉碎”组织在室温下在小塑料胶囊中的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中再水合；通过离心使颗粒粒化；将颗粒重新悬浮于粘性包埋介质(OCT)中；翻转胶囊和/或通过离心再次粒化；在-70℃异戊烷中速冻；切割塑料胶囊和/或取出组织的冷冻圆筒；将组织圆筒固定在恒冷箱切片机卡盘上；和/或从胶囊上切下25个到50个连续切片。可替代地，整个冷冻组织样品可以用于连续切片切割。
永久性切片可以通过类似的方法制备，所述类似的方法涉及将50mg样品在塑料微量离心管中再水合；粒化；重新悬浮于10％***以进行4小时固定；洗涤/粒化；重新悬浮于温热的2.5％琼脂中；粒化；在冰水中冷却以硬化琼脂；从管中取出组织/琼脂块；将块渗入和/或包埋在石蜡中；和/或切割至多50个连续的永久性切片。同样，可以替换整个组织样品。
D.免疫检测试剂盒
在仍另外的实施例中，本公开涉及与上文描述的免疫检测方法一起使用的免疫检测试剂盒。由于抗体可以用于检测DDR1相关的癌细胞，因此所述抗体可以包含在试剂盒中。因此，免疫检测试剂盒将在合适的容器装置中包括与DDR1结合的第一抗体，以及任选地免疫检测试剂。
在某些实施例中，抗体可以与固体支持物预结合，如柱基质和/或微量滴定板的孔。试剂盒的免疫检测试剂可以采用多种形式中的任何一种，包含与给定抗体缔合或连接的那些可检测标记。还考虑了与次级结合配体缔合或连接的可检测标记。示例性次级配体是对第一抗体具有结合亲和力的那些次级抗体。
用于在本试剂盒中的其它合适的免疫检测试剂包含双组分试剂，所述双组分试剂包括对第一抗体具有结合亲和力的次级抗体，以及对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体，所述第三抗体与可检测标记连接。如上所述，许多示例性标记在本领域中是已知的，并且所有此类标记都可以与本公开结合使用。
试剂盒可以进一步包括适当等分的DDR1组合物，无论是标记的还是未标记的，都可以用于制备检测测定的标准曲线。试剂盒可以含有完全缀合形式、中间体形式或作为由试剂盒用户缀合的单独部分的抗体-标记缀合物。试剂盒的组分可以以水性介质或冻干形式包装。
试剂盒的容器装置通常包含抗体可以放置于其中，或优选地适当地等分的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置。本公开的试剂盒通常还将包含一种用于以紧密封闭的方式容纳抗体、抗原和任何其它试剂容器以供商业销售的装置。此类容器可以包含将期望的小瓶保留在其中的注射或吹气模制的塑料容器。
E.流式细胞术和FACS
本公开的抗体也可以用于流式细胞术或FACS。流式细胞术是一种基于激光或阻抗的技术，用于许多检测测定，包含细胞计数、细胞分选、生物标志物检测和蛋白质工程化。所述技术将细胞悬浮于流体流中，并将细胞穿过电子检测设备，从而允许同时对每秒至多数千个颗粒的物理和化学特性进行多参数分析。流式细胞术通常用于诊断病症，尤其是血癌，但在基础研究、临床实践和临床试验中还有许多其它应用。
荧光激活的细胞分选(FACS)是一种特殊类型的细胞术。荧光激活的细胞分选提供了一种用于基于每个细胞的特定光散射和荧光特性按一次一个细胞将生物细胞的非均质混合物分选到两个或多个容器中的方法。通常，所述技术涉及一种细胞悬浮液，所述细胞悬浮液夹在狭窄、快速流动的液体流的中心。液流被布置成使得细胞之间相对于其直径有很大的分离。振动机制使细胞流***成单独的液滴。就在流***成液滴之前，液流穿过荧光测量站，在所述荧光测量站中测量每个细胞的荧光。在流***成液滴的点处放置充电环。在即将测量荧光强度之前，将电荷放置于环上，并且当液滴从流中***时，相反的电荷被捕获在液滴上。带电的液滴然后下落通过静电偏转***，所述***会基于其电荷将液滴转移到容器中。
在某些实施例中，为了用于流式细胞术或FACS，本公开的抗体用荧光团标记，然后允许与所关注的细胞结合，将所述细胞在流式细胞仪中分析或通过FACS机器分选。
VIII.实例
包含了以下实例以说明本发明的优选实施例。本领域的技术人员应当理解，以下实施例中所公开的技术表示由本发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用并且因此可以被认为构成本发明的优选实践模式的技术。然而，根据本公开内容，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施例进行许多改变并且仍然获得相同或类似的结果。
实例1-材料和方法
CRISPR KO：DDR1在M-WNT、AT-3和E0771中通过使用DDR1 sgRNA CRISPR/Cas9一体式慢病毒载体设置(ABM公司(ABM)；目录号：#K4331005)按照制造商的说明进行敲除。简而言之，通过Lipofectamine 2000(生命技术公司(Life Technologies)，目录号：#11668027)将HEK293T细胞与DDR1 KO载体和两个辅助载体(psPAX2和pMD2.G)共转染进行慢病毒包装。两天后，采集含有慢病毒的上清液并用于感染靶肿瘤细胞。在抗生素选择后挑选和扩增单个克隆。提取所有选择的KO克隆的基因组DNA并对其进行测序以验证期望的突变。sgRNA序列如下：sgRNA1，AAGCAGTGATGGAGATG(SEQ ID NO：303)；sgRNA2，TGTGTTCCCCAAAGAAG(SEQID NO：304)；sgRNA3，GACCATGCAGTTATCTG(SEQ ID NO：305)。乱序sgRNA序列用作对照。
蛋白质印迹：对于细胞裂解物的制备，用勒姆利(Laemmli)缓冲液裂解细胞。通过BCA蛋白质测定试剂盒(皮尔斯公司(Pierce)，23225)评估蛋白质浓度。然后通过SDS-PAGE运行蛋白质并按照既定方案转移到膜上。初级抗体是：抗DDR1(稀释度：1∶1000；CST公司(CST)，5583S)和抗GAPDH(稀释度：1∶5000；CST公司，2118S)。
为了在条件培养基中采集蛋白质，采集培养基并在6,000rpm下离心，随后穿过孔径为0.45um的过滤器以去除任何细胞碎片。培养基在SDS-PAGE上运行，随后用抗DDR1 ECD抗体进行免疫印迹(稀释度：1∶1000；R&D公司(R&D)，AF2396)。
qRT-PCR：RNA提取和RT-qPCR如先前所描述的进行(Sun等人，2018)。简而言之，ImProm-II逆转录***(普洛麦格公司(Promega)，A3800)用于逆转录RNA，并且LuminarisColor HiGreen qPCR主混合物(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，K0364)用于建立实时PCR。相关引物通过Primer Premier软件制作。引物序列如下：
Col1a2-F GGTGAGCCTGGTCAAACGG(SEQ ID NO：306)
Col1a2-R ACTGTGTCCTTTCACGCCTTT(SEQ ID NO：307)
Col12a1-F AGGCAGAAGTTGACCCACCT(SEQ ID NO：308)
Col12a1-R CAGTGGTACTAGCTGCAAGGG(SEQ ID NO：309)
mActin-F CAACGAGCGGTTCCGATG(SEQ ID NO：310)
mActin-R GCCACAGGATTCCATACCCA(SEQ ID NO：311)
MTT：将肿瘤细胞接种在96孔板中并在分析前培养指定的时间段。在采集当天，将MTT溶液(3mg/ml)添加到各个孔中，并将板温育1小时。随后除去培养基并用100μl DMSO溶解紫色沉淀。测量各个孔在570nm处的吸光度。
肿瘤细胞迁移和侵袭：对于细胞迁移，将肿瘤细胞悬浮在不含血清的培养基中，然后在跨孔室的顶部上接种。将含有10％FBS的培养基放置于室的底部处。在分析前将细胞培养12小时。
对于细胞侵袭，按照制造商的说明将基质胶基质(康宁公司(Corning)，354483)上样到***物上，并在37℃下温育30分钟。将肿瘤细胞接种在***物的顶部室上，底部室中有含有10％FBS的培养基。然后将细胞在37℃下温育20小时。将顶部室上侧的细胞轻轻去除并将顶部室底侧的细胞用结晶紫染色，并在标准显微镜下计数六个随机场。
小鼠处理和肿瘤研究：所有动物实验均经乔治华盛顿大学的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee at the George WashingtonUniversity)批准。将8周大的WT C57BL/6(杰克森实验室(Jackson Lab)，000664)、Rag1-/-(杰克森实验室，002216)或裸鼠(杰克森实验室，002019)用于肿瘤研究。将E0771、AT-3和M-Wnt细胞以每次接种5×105个、2×105个和2×105个细胞的剂量分别注射到小鼠乳腺脂肪垫中，体积为100μl。在指定天数用卡尺测量肿瘤体积(0.5×长×宽2)。采集肿瘤后，对肿瘤进行称重并将样品用于免疫表型和IHC。
对于肿瘤移植测定，首先将肿瘤细胞接种在Rag1-/-小鼠中。当肿瘤体积达到大约200mm3到300mm3时(通常在接种后20天)，将60mg肿瘤类器官移植到WT C57BL/6小鼠。在第12天收集肿瘤样品进行免疫染色。
对于肿瘤重新激发实验，首先在WT C57BL/6小鼠腹股沟乳腺脂肪垫的一侧单独接种50万个DDR1 KO E0771或PBS。30天后，在同样的小鼠的乳腺脂肪垫的两侧接种50万个DDR1 WT E0771肿瘤细胞。如上所述测量肿瘤体积。
对于DDR1抗体体内处理，在大小大于100mm3后，每隔一天将自制对照IgG和抗huDDR1 ECD抗体以10mg/kg局部注射到肿瘤中，直到实验结束。
脱细胞化：E0771细胞接种在5μm孔径(Costar，康宁公司，3422)的***物中，每个***物2,000个细胞，并在DMEM+10％FBS+1％PS培养基中培养2天。将从DDR1 WT或KO细胞中得到的ECM用PBS洗涤，并通过在37℃下在含有0.5％Triton X-100和20mM NH4OH的PBS中温育5分钟来脱细胞。将脱细胞ECM用PBS洗涤3次，随后用蒸馏水冲洗3次，并立即用于T细胞迁移实验。
体外CD8+T细胞分离和迁移测定：通过EasySepTM小鼠CD8+阴性分离试剂盒(干细胞技术公司(Stemcell)，19853)从C57BL/6原初小鼠的脾细胞中分离出CD8+T细胞，然后按照制造商的手册进行。使用6.5mm聚碳酸酯膜和5μm孔径的***物(Costar，康宁公司，3422)进行CD8+T细胞迁移测定。将50万个纯化的CD8+T细胞添加到上部室，并允许所述细胞在存在重组CCL21(100ng/ml，R&D***公司(R&D systems)，4576C025CF)和底部室中的肿瘤条件培养基的情况下在37℃下迁移2小时。通过流式细胞术对迁移到底部室的CD8+T细胞进行定量。对于huDDR1抗体中和，首先将抗体与条件培养基在37℃下共温育1小时，然后按照如上文所描述的程序进行。
二次谐波生成和免疫荧光：将小鼠乳腺肿瘤组织包埋并保存在-80℃的最佳切割温度(OCT)化合物中。切割前，将样品置于-20℃下持续至少2小时并使用恒冷箱切片机切割20μm厚的切片。将载玻片解冻并在37℃下温育30分钟，然后转移到沸腾的抗原修复溶液(载体实验室(Vector labs)，H-3300)中持续10分钟。将样品与CD3e(BD公司(BD)，553057)初级抗体和Alexa-488(生命技术公司)次级抗体一起温育。每个肿瘤切片都用fluoromount-G培养基(VWR)固定在显微镜盖玻片上(1.5号)。
使用Leiea TCS SP8多光子共聚焦显微镜对所有样品进行成像，并在整个实验过程中使用20x、HC PL Apo、NA 0.7油浸物镜。
将激发波长微调到840mm(Erikson等人，2007)，并使用420±5nm窄带发射滤光片检测胶原蛋白的SHG信号。当入射光的两个光子与胶原蛋白纤维的非中心对称结构相互作用时，会生成SHG信号，这导致产生的光子是入射光子波长的一半。使用LAS X软件获取1024×1024像素的图像。使用CT Fire软件(可在loci.wise.edu/software/ctfire免费获得)进行胶原蛋白测量。对于来自肿瘤边缘分析的胶原蛋白，取肿瘤边界60μm的区域。
免疫组织化学染色(IHC)：将小鼠乳腺肿瘤组织在4℃下用10％缓冲***(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，23-427098)固定过夜。固定的肿瘤样品被石蜡包埋并切成4μm切片进行染色。将样品在PBS中脱蜡和再水合。将切片用抗原修复溶液(载体实验室，H-3300)煮沸20分钟，然后在室温下用含10％的正常山羊血清的PBS封闭1小时。将CD8(博欧特公司(Biorbyt)，orb10325)和CD4(义翘神州公司(Sino Biological Inc.)，50134-R001)初级抗体在4℃下温育过夜。对于初级抗体的检测，根据制造商的说明，使用ABC过氧化物酶检测***(载体实验室，PK-6105)和DAB(载体实验室，SK-4105)作为底物。
CD8+T细胞耗竭和过继性转移：对于CD8+T细胞耗竭，C57BL/6小鼠在肿瘤接种前两天腹膜内施用200μg/小鼠抗小鼠CD8(克隆2.43，BioxCell公司(BioxCell)，BE0061)或IgG2b同种型对照(克隆LTF-2，BioxCell公司，BE0090)，然后每周两次。
对于CD8+T细胞过继性转移，将纯化的CD8+T细胞(＞90％)在肿瘤接种17天后以5×106个细胞/小鼠的浓度转移到携带E0771乳腺肿瘤的Rag1-/-小鼠。
天狼猩红(Picrosirius Red)染色：如先前所描述的制备固定的乳腺肿瘤样品并对其进行切片(Sun等人，2018)。简而言之，将石蜡包埋的肿瘤组织切成4μm载玻片并用天狼猩红染色试剂盒(艾博抗公司(Abeam)，目录号：#ab150681)染色。将切片脱蜡并在蒸馏水中水合，将天狼猩红溶液施加于载玻片持续1小时。然后将载玻片在乙酸溶液中冲洗并在无水酒精中脱水。然后在标准显微镜下检查安装的载玻片，并通过Image J软件对阳性胶原蛋白纤维信号进行定量。
ELISA：将I型胶原蛋白在PBS中稀释到50μg/ml的浓度并添加到96孔微量滴定板(50μl/孔)中。将板密封并在室温下温育过夜，并且用洗涤缓冲液(R&D公司，WA126)洗涤三次，然后用200μl试剂稀释剂(R&D公司，DY995)封闭1小时。洗涤三次后，在室温下将100ul条件培养基或重组ECD(用作标准品，义翘神州公司，10730-H08H)添加到板中持续2小时。洗涤三次后，添加100μl稀释的抗DDR1 N末端抗体(1∶500，R&D公司，AF2396)并温育2小时。与生物素缀合的抗体反应1小时后，将稀释度为1∶2000的链霉亲和素-HRP(R&D公司，893975)添加到每个孔中并在黑暗中温育20分钟。添加100μl底物溶液(R&D公司，DY999)并且温育另外20分钟。添加50μl终止溶液(R&D公司，DY994)后，在450nm下在ELISA读数器中分析板。
流式细胞术：使用PBS中1∶1000稀释度的Ghost DyeTM Violet 450(Tonbo生物科学公司(Tonbo Biosciences)，13-0863-T100)在以在4℃下在黑暗中对细胞进行活力染色持续20分钟，随后用PBS洗涤。将样品用1∶100稀释度的抗CD16/32封闭(克隆2.4G2，Tonbo生物科学公司，70-0161-U100)。将抗体在黑暗中在4℃下温育30分钟。使用了以下商业抗体：CD45-BV 645(英杰公司，64-0451-82)、CD3-eflour 660(e生物科学公司(eBiosciences)，50-0032-82)、CD4-FITC(e生物科学公司，35-0042-U500)、CD8-APC-CyTM7(BD公司，557654)、CD44-BV 786(百进生物公司(Biolegend)，103059)、CD62L-太平洋蓝(百进生物公司，104424)。在BD FACSCelesta流式细胞仪上获取数据，并通过FACSDiva或FlowJo软件(BD公司)进行分析。
扫描电子显微镜：将E0771细胞(WT和DDR1 KO)以0.1×106的密度铺板并在DMEM(10％FBS)中培养两天以均匀粘附在玻璃盖玻片的表面上。然后将细胞用2.5％戊二醛和1％多聚甲醛溶液固定，随后用OsO4和水冲洗。然后将样品依次用酒精梯度脱水并在临界点处干燥。安装在SEM柱上后，将盖玻片用铱涂覆，并在带有ETD检测器的扫描电子显微镜(型号FEI)下观察，停留时间为10毫秒，放大倍数为12,000。
筛选和生成抗DDR1单克隆抗体(mAb)：人DDR1细胞外结构域(ECD)蛋白(义翘神州公司，10730-H08H)用于使兔免疫并使用先前描述的方法生成抗huDDR1单克隆抗体(Gui等人，2019b)。简而言之，新西兰白兔通过腹膜内(ip)注射0.5mg重组人DDR1ECD蛋白施用以进行致敏，并在3周间隔内致敏免疫后进行一系列3次到4次加强免疫。从PBMC中分离出记忆B细胞，并将单个B细胞在96孔细胞培养板中培养10天到14天以产生抗体。使用ELISA分析细胞培养上清液的DDR1结合，并选择阳性命中用于抗体基因克隆和序列分析。
裂解阳性B细胞培养孔中的细胞，分离总RNA，并根据制造商的建议使用上标逆转录酶II(英杰公司)合成cDNA。使用一组设计的引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增来自重链和轻链的抗体可变区的DNA序列，并克隆到载体中，用于对每种抗体的可变区进行测序。将克隆的重链和轻链的抗体可变序列构造到哺乳动物表达载体中，分别与IgG1重链和κ轻链的恒定区融合，用于人胚胎肾(HEK)293(HEK293F)细胞(生命科学技术公司(Lifescience Technologies))中的全长重组抗体表达。使用如先前所描述的方法(O′Donnell等人，2019)使用蛋白质A亲和树脂从HEK293细胞培养基中纯化单克隆抗体直到纯度＞95％(。筛选纯化的抗体在细胞培养测定中的中和功能和在小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性。
统计：斯图登t检验(Student t test)用于比较两组之间的平均差异。单向ANOVA和事后多重比较用于比较多组之间的平均差异。通过对数秩(Mantel-Cox)分析来分析存活曲线。皮尔逊相关性分析(Pearson correlation analysis)和所有其它统计均在GraphpadPrism中完成。P＜0.05被认为是显著的。数据呈现为平均值±SEM。
实例2-结果
发明人在具有基底样/TNBC特性的多个小鼠乳腺肿瘤细胞中特异性地缺失了Ddr1(E0771、AT-3和M-Wnt；图1a、图5b-d)。敲除(KO)肿瘤细胞在体外细胞增殖、迁移或侵袭方面没有展现出任何明显的缺陷(图1b-d、图5e-f)。另外，免疫缺陷宿主中的Ddr1-KO肿瘤以与野生型(WT)对照小鼠相同的速率生长(图1e和图5g)。与之形成鲜明对比的是，在所有三个测试的乳腺肿瘤模型中，免疫活性宿主(C57BL/6)中的Ddr1-KO肿瘤在接种后2周完全消退(图1f-h)。通过移植数量越来越多的KO肿瘤细胞(每个接种物0.5-20×106个细胞，图5h)，免疫活性宿主中KO肿瘤的这种生长缺陷基本上没有得到缓解，也没有通过免疫缺陷宿主(Rag1-/-)中的初始生长和随后再移植到原初免疫活性小鼠中来挽救生长不全(图1i-j)。此外，使用相同数量的亲本WT和KO肿瘤细胞的混合物进行的共移植在免疫活性宿主中产生了稳健的肿瘤生长(图5i-k)，表明肿瘤DDR1的主导作用。当WT肿瘤细胞被注射到先前用KO肿瘤细胞激发的免疫活性小鼠中时，无论是在相同的还是对侧的乳腺中，都没有观察到重新激发的亲本肿瘤有明显的生长(图1k-m)。这表明KO肿瘤细胞可以为宿主接种针对WT肿瘤的疫苗。总之，这些数据强烈表明肿瘤DDR1在免疫活性宿主的肿瘤生长中起着独特的作用。
免疫组织化学(IHC)显示CD4+和CD8+T细胞在从免疫缺陷宿主重新移植到免疫活性宿主后仅限于亲本肿瘤的***区域(图2a)。相比之下，这些淋巴细胞大量存在于Ddr1-KO肿瘤的边缘和核心处(图2a)。作为支持，流式细胞术显示与亲本对照相比，KO肿瘤组中肿瘤浸润CD8+和CD4+T细胞的总数(以肿瘤重量归一化)显著升高(图2b-c)。与WT对应物相比，KO肿瘤中产生干扰素(IFN)γ的CD8+和CD4+细胞也更丰富(图2d-e)。此外，与其亲本对照相比，KO肿瘤中的效应子和辅助T细胞被更有效地激活(CD44hiCD62Llo)(图2f-g)。然而，当以对应的总T细胞数量归一化时，KO和亲本对照在对Ki67(图6a-b)、IFNγ或Gzmb(图2c-d)呈阳性的CD4+或CD8+T细胞的百分比方面没有展现出差异。这表明肿瘤DDR1可能赋予T细胞肿瘤排斥，而不会减弱其增殖或抗肿瘤活性本身。
为了确定肿瘤DDR1拮抗抗肿瘤免疫的作用，发明人通过抗体中和耗竭了免疫活性小鼠的CD8+T细胞。Ddr1-KO肿瘤在CD8+细胞耗竭的宿主中与其同基因WT对照一样稳健地生长(图2h-j、图2e-f)，类似于发明人在免疫缺陷宿主中的发现(图1e)。在互惠实验中，发明人将纯化的CD8+T细胞过继性转移到免疫缺陷小鼠中，并比较了亲本和KO肿瘤的生长。与假手术处理的免疫缺陷宿主不同，具有转移的CD8+T细胞的小鼠产生的KO肿瘤比亲本肿瘤显著更小(图2k-m、图6g)。总的来说，这些结果证实了这样一种观点，即肿瘤DDR1虽然对于乳腺肿瘤的内在生长是可有可无的，但其在阻止T细胞浸润方面发挥着重要作用。
T细胞的瘤内转运是一个高度动态的多步骤过程，所述过程包含通过血管外渗、肿瘤诱导的趋化性和穿过基于ECM的物理屏障(Slaney等人，2014；Sackstein等人，2017；Ager等人，2016)。基于CD31的组织学分析未显示WT与KO肿瘤之间的任何显著免疫血管变化(数据未示出)，RNA-seq也未显示T细胞归巢基因或趋化因子编码基因的mRNA水平存在任何差异，所述差异可以解释Ddr1-KO组增强的免疫浸润(图6h-i)。鉴于DDR1对胶原蛋白的亲和力，发明人试图测试一种替代模型，由此肿瘤DDR1-胶原蛋白相互作用使肿瘤不易被免疫细胞穿透。为此，发明人首先通过将以下构建体引入Ddr1-KO肿瘤细胞来确定DDR1的免疫调节功能是否取决于其激酶活性(图3a)：(1)空载体(EV)；(2)全长小鼠DDR1(FL)；(3)AKD，一种缺乏细胞内激酶结构域KD但保留其跨膜(TM)结构域的截短DDR1；以及(4)仅ECD。免疫活性宿主中KO肿瘤的生长缺陷通过异位表达的FL DDR1和两个截短突变体AKD和ECD得到类似程度的挽救(图3a)。进一步的缺失分析表明，负责胶原蛋白结合的N末端盘状蛋白同源结构域(DS，图3b)完全挽救了DDR1 KO细胞的肿瘤生长(图7a-b)。总之，这些数据清楚地表明肿瘤DDR1以不依赖激酶的方式抑制抗肿瘤免疫。
基于胶原蛋白-DS结构域晶体结构(Leitinger，2014；Carafoli等人，2012；Carafoli和Hohenester，2013)，发明人对许多关键的胶原蛋白结合氨基酸残基(小鼠DDR1中的W54、T58、D71、K113、E114和S176，分别对应于人DDR1中的W53、T57、D70、K112、E113和S175；图3b)进行了突变。发明人还对R33，即远离胶原蛋白结合袋并负责DDR1跨膜信号传导的残基进行了突变。通过ELISA和co-IP在体外验证WT和突变体ECD的胶原蛋白结合亲和力(图3c、图7c)，并在体内评估其挽救KO肿瘤生长的能力(图3d-k)。如预期的，位于ECD的胶原蛋白结合区之外的R33A保留了其与胶原蛋白结合和支持肿瘤生长的能力(WT ECD为10/10肿瘤，R33A为6/6，图3c-e)。相比之下，W54A在体外完全失去了胶原蛋白结合和支持肿瘤生长的能力(0/6位点，图3f)。突变体D71A、K113A、E114A和S176A保留了WT ECD的适度胶原蛋白结合活性(图3c)并在一部分宿主中引起肿瘤生长(分别为2/6、1/6、3/6和1/6肿瘤，图3h-k)。另一方面，T58A保留了大约50％的WT胶原蛋白结合亲和力(图3c)和100％的肿瘤发生率(6/6)，但展现出比WT慢的肿瘤生长速率(图3g)。鉴于ECD突变体的胶原蛋白结合亲和力和肿瘤挽救能力的强相关性，发明人得出结论，ECD需要胶原蛋白结合以阻碍抗肿瘤免疫。
仅异位DDR1ECD就足以支持免疫活性宿主中的肿瘤生长，这一事实让人想起早期关于ECD从全长DDR1脱落的报道(Vogel，2020；Flynn等人，2010；Shitomi等人，2015)，但是脱落的ECD的生物学意义尚不清楚。作为支持，发明人在用亲本鼠乳腺肿瘤细胞和人乳腺癌细胞系的子集调节的培养基中检测到ECD(图7d)。已公开的体外生化研究表明，重组DDR1ECD可以重塑胶原蛋白纤维结构(Flynn等人，2010；Agarwal等人，2007)。作为支持，扫描电子显微镜(SEM)显示体外培养的DDR1-WT肿瘤细胞与其KO对应物相比，与更显著的ECM网络缔合(图3l)。为了确定肿瘤细胞缔合的ECM的功能，发明人将亲本和KO肿瘤细胞脱细胞(Chen等人，2007)(Chen等人，2007)，并在Transwell测定中通过脱细胞ECM评估纯化的CD8+T细胞的外显率(图3m)。源自亲本肿瘤的ECM显著降低了T细胞迁移，这在从Ddr1-KO肿瘤脱细胞的ECM中得到缓解(图3m)。在源自ECD表达性KO肿瘤的ECM中，T细胞阻碍作用恢复到亲本水平(图3m)。为了证实体外发现，发明人使用二次谐波生成(SHG)显微镜直接使从免疫缺陷宿主移植到免疫活性宿主的亲本和Ddr1-KO肿瘤中的胶原蛋白纤维可视化。亲本肿瘤边缘处的胶原蛋白纤维倾向于平行于肿瘤边缘(由图3n中的顶部图的实心箭头表示)定向，让人想起抵抗入侵肿瘤细胞的防线。如预期的，来自同一亲本肿瘤的CD3+T细胞被限制在肿瘤边缘(图3n)。与之形成鲜明对比的是，KO肿瘤中的胶原蛋白纤维相对较短且无序(图3n)。一致地，与WT肿瘤相比，免疫细胞更深入地渗透到KO肿瘤中(图3n)。作为纤维排列的测量，KO肿瘤的胶原蛋白纤维角度变化系数明显大于亲本肿瘤的胶原蛋白纤维角度变化系数(图3o)。另外，KO肿瘤中的平均胶原蛋白纤维长度显著短于其亲本对应物的平均胶原蛋白纤维长度(图3p)。为了支持DDR1依赖性胶原蛋白纤维重塑，对来自原发性Ddr1-WT和KO肿瘤的RNA-seq数据的途径分析表明，参与细胞外基质和胶原蛋白纤维组织的基因受影响最大(p＜1×10-12，图7e)。总之，这些数据强烈表明DDR1 ECD有助于强化基于胶原蛋白的物理屏障，以阻碍抗肿瘤免疫细胞渗透到肿瘤微环境中。
目前所有检测过的DDR1小分子抑制剂的治疗潜力都靶向细胞内激酶结构域(Kothiwale等人，2015；Li等人，2015)。为了有效中和阻断免疫细胞浸润中不依赖激酶的ECD活性，发明人通过用重组人DDR1(huDDR1)ECD使兔免疫并随后进行抗体记忆B细胞分离生成了一系列单克隆抗体克隆，如先前所描述的(Meng等人，2015；Gui等人，2019a)。为了筛选huDDR1特异性中和抗体，发明人在鼠Ddr1-KO乳腺肿瘤细胞中异位表达huDDR1(图4a)。huDDR1完全挽救了免疫活性宿主中KO鼠肿瘤的生长缺陷(图4b、c)。使用评估肿瘤细胞对T细胞迁移的影响的体外共培养测定(图8a)，发明人筛选了可以有效中和T细胞迁移的huDDR1依赖性干扰的抗huDDR1抗体(图8b)。进一步检查了若干个靠前中和抗体的体内肿瘤抑制潜力。与IgG同种型对照相比，在对宿主体重没有任何明显影响的情况下，施用抗huDDR1抗体导致表达huDDR1的肿瘤生长显著更慢，肿瘤发病率更低和宿主存活期更长(图4d-f、图8c-d)。值得注意的是，在免疫缺陷宿主中施用相同的抗体并未导致任何明显的肿瘤抑制(图8e)，表明所述治疗主要中和了DDR1的免疫排斥功能。SHG显微镜显示，免疫活性宿主中抗huDDR1抗体治疗的肿瘤与排列较少，胶原蛋白纤维较短和显著增强的抗肿瘤免疫浸润相关(图4g-i、图8f)。总之，发明人的发现为抗hDDR1抗体方法作为潜在的抗肿瘤疗法提供了原理证明。
使用TCGARNA-seq数据集和TIMER(Li等人，2018)，即用于估计肿瘤-免疫相关性的临床影响的公共生物信息学资源，发明人发现乳腺癌在DDR1 mRNA水平与包含CD8、IFNG、GZMB和PRF1的各种抗肿瘤免疫特征基因之间展现出负相关(图4j；图8g-i)。值得注意的是，对DDR1观察到的负相关程度与其它最近鉴定的具有免疫调节功能的肿瘤相关基因相当(Pan等人，2018)。在来自未经治疗的TNBC患者的单独的队列的样品中观察到相同的相关性(n＝37；图4k-m)，所述样品用于基于免疫排斥的表型对TNBC进行分层(Grusso等人，2019)。总之，这些临床相关性强烈表明高DDR1表达与低肿瘤浸润和CD8+T细胞的低细胞毒活性相关。通过阐明先前未探索的、不依赖激酶的DDR1在建立免疫排斥防线中的作用(图4n)，此研究为开发新的独立疗法提供了信息，所述疗法靶向ECM重塑和阻断抗肿瘤免疫中的DDR1活性。发明人还设想其工作可以帮助改善目前针对乳腺癌和如胰腺癌等其它纤维化癌症类型的免疫疗法的临床结果和功效。
靶向人DDR1的单克隆抗体的生成和克隆.针对DDR1的单克隆抗体(mAb)是通过使兔免疫和从单个B细胞中分离抗体生成的。人DDR1蛋白用于抗体生成并在HEK293细胞中表达。所述蛋白质具有6XHIS标签，并使用Ni-NTA树脂(义翘神州公司)纯化到＞95％的纯度。使用标准免疫程序用重组产生的DDR1使兔(NZW，查尔斯河实验室公司(Charles River))免疫，在初次致敏免疫后进行3次加强注射。抗DDR1血清的滴度通过ELISA中血清的系列稀释来确定，以结合96孔板(max-sorb板，能肯公司(Nunc))上包被的DDR1蛋白。当血清滴度达到＞106时，从免疫的兔收集外周血样品，使用荧光辅助细胞分选(FACS)仪器(BD FACSAriaTMIII，BD生物科学公司(BD Biosciences))从新鲜制备的外周血单核细胞(PBMC)中分离B细胞。将分选的单个B细胞收集在96孔细胞培养板(飞世尔科技公司)中，并在具有5％CO2和95％湿度的细胞培养箱中，在含有10％FBS和添加细胞因子的RPMI培养基中培养7天到10天。测定培养上清液中的抗体的DDR1结合。裂解阳性孔中的细胞，分离总RNA，并根据制造商的建议使用上标逆转录酶II(英杰公司)合成cDNA。使用一组设计的引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增来自重链和轻链的抗体可变区的DNA序列，并克隆到载体中，用于对每种抗体的可变区进行测序。抗体可变区的氨基酸和DNA序列分别列于表3和4以及表8和9中。抗DDR1单克隆抗体的轻链和重链CDR的氨基酸序列分别列于表1和2中。
使用哺乳动物表达载体***在人胚胎肾(HEK293)细胞(英杰公司)中将选择的DDR1结合命中表达为全长人IgG或兔/人嵌合IgG。通过快速蛋白液相色谱(FPLC)使用蛋白质A亲和树脂纯化抗体。纯化的DDR1结合抗体对其生物学特性进行了表征。
使用基于生物层干涉(BLI)传感器的Octet仪器确定的抗DDR1单克隆抗体的结合亲和力。对于抗体亲和力测量，将抗体(30μg/mL)上样到蛋白A生物传感器上持续4分钟。在动力学缓冲液中的短基线后，将上样的生物传感器暴露于0.1nM到200nM的一系列重组DDR1蛋白，并使用背景减除来校正传感器漂移。所有实验均在1,000rpm的振荡下进行。背景波长偏移是从仅上样抗体的参考生物传感器测量的。每种抗体的动力学传感图在图10A-B中示出。使用ForteBio的数据分析软件将数据拟合到1∶1结合模型以提取关联速率和解离速率。使用koff/kon的比率和表13中DDR1 mAb的KD估计值来计算KD。
DDR1 mAb的表位分箱。使用Octet仪器和蛋白A生物传感器，使用抗DDR1 mAb之间的成对结合竞争来确定每个mAb的结合表位。表位箱总结在表14中。
抗hECD抗体抑制自发性肿瘤生长：为了证明抗DDR1抗体治疗对不同阶段乳腺肿瘤发生的影响，当平均肿瘤大小达到100mm3时(“肿瘤后”)，将MMTV-PyMT小鼠(C57BL/6菌株背景)用对照IgG或抗DDR1抗体治疗两周。DDR1#9人源化抗体因其对小鼠和人ECD的高亲和力而被选择用于此研究(数据未示出)。抗体治疗不影响宿主体重。然而，抗体治疗显著减少了肿瘤体积(图12a)和肿瘤发生率(图12b)。一致地，抗体治疗显著破坏胶原蛋白排列并促进大量免疫细胞浸润(图12c)。在不同背景菌株(FVB)的MMTV-PyMT小鼠的不同阶段，使用抗DDR1抗体治疗和乳腺肿瘤发生也获得了类似的结果。
抗hECID抗体和DDR1激酶抑制剂的比较：在抗hECD抗体显示出显著肿瘤抑制活性的同一乳腺肿瘤模型中，先前公开的小分子DDR1激酶抑制剂7rh抑制了肿瘤中DDR1的酪氨酸激酶活性，但并未减少肿瘤生长。这与DDR1依赖性抗肿瘤免疫排斥与其激酶活性无关的断言是一致的(图13a-e)。
DDR1在一些肿瘤类型生长中是必需的：利用基于CRISPR的肿瘤Ddr1的基因消融显著提高了携带ID8agg卵巢肿瘤的免疫活性宿主的存活率。然而，B16黑色素瘤或MC38结直肠肿瘤中的Ddr1 KO不影响同基因免疫活性宿主中的肿瘤生长(参见图14b-c)。结合在乳腺肿瘤中获得的发现，此研究表明靶向DDR1可以导致多种类型的癌症中的肿瘤抑制。
DDR1与抗肿瘤免疫标志物的相关性：TCGA转录组数据集的挖掘表明，与对应的正常组织相比，DDR1在多种人癌症中的表达异常地高(数据未示出)。此外，多种癌症中的DDR1mRNA水平与如颗粒酶B(GZMB，参见图15a)等细胞毒性免疫标志物负相关，这表明DDR1可能在多种癌症类型中发挥拮抗抗肿瘤免疫的作用。此外，对TCGA蛋白质组数据集的分析导致DDR1蛋白与CD8之间的负相关(图15b)，以及DDR1与参与抗肿瘤免疫的细胞溶解效应子通路的蛋白质之间的负相关(图15c)。因此，在mRNA和蛋白质水平，DDR1的高表达与低水平的抗肿瘤免疫标志物表达相关。DDR1似乎起到抗肿瘤免疫的拮抗剂的作用，因此抑制此拮抗剂，例如使用DDR1抗体，可以增加多种癌症类型的抗肿瘤免疫。
高肿瘤DDR1蛋白与免疫排斥相关：如图16所示，在多重IHC图像中使用未经治疗的三阴性乳腺癌(TNBC)队列，DDR1高肿瘤显示肿瘤内存在的CD8+T细胞百分比降低，而肿瘤边缘处存在的CD8+T细胞百分比增加，与DDR1低肿瘤相反，其中更大百分比的CD8+T细胞存在于肿瘤内和肿瘤边缘处。此类临床相关性强烈表明，肿瘤DDR1与CD8+T细胞的细胞毒性活性水平降低和此类细胞的低肿瘤浸润相关。
抗体结合结构域确定：为了确定DDR1-9(图18B)和DDR1-14(图18C)以及人源化DDR1-9hu-Ab1与ECD和DS或DSL结构域的结合，使用了ELISA方法(图18A)。将重组DDR1细胞外(ECD)蛋白和结构域缺失蛋白以2ug/ml的浓度包被到高结合96孔板上。DDR1抗体滴定用于确定图18中所示的结合曲线和EC50，ECD和结构域蛋白在HEK293细胞中表达并使用NTA树脂纯化到＞85％的纯度。将重组表达的结构域蛋白以2ug/ml的浓度包被在高结合96孔板(飞世尔科技公司)上。使用一系列抗体滴定来确定结合EC50。DDR1 ECD的DSL结构域的缺失损害了DDR1-9和DDR1-14抗体的结合。缺失DS结构域的片段显示出与ECD蛋白类似或更好的结合。缺失DSL的片段完全消除了DDR1-9、DDR1-14和DDR1-9Hu结合。
DDR1 ECD的DS结构域的缺失不影响DDR1-9和DDR1-14抗体的结合，但会导致人源化DDR1-9hu抗体的结合减少。单独缺失DS结构域减少了结合，其中EC50从168ng/ml变为83ng/ml，而单独缺失DSL结构域完全消除了所有三种DDR1抗体的结合。
表11.使用基于BLI的Octet方法确定的结合亲和力
Figure BPA0000324724060000991
表12.抗DDR1单克隆抗体的EC50
Mab名称 EC50(μg/ml)
DDR1-3 0.0598
DDR1-9 0.1827
DDR1-14 0.0713
DDR1-33 0.1482
表13.使用Octet(96-红)仪器确定的与人DDR1的结合亲和力
抗体 KD kon(1/毫秒) kdis(1/秒) 完整X^2 完整R^2
DDR1-3 1.100±0.038nM 1.73E+06 1.91E-03 6.840 0.934
DDR1-9 0.236±0.003nM 3.11E+05 7.35E-05 0.368 1.000
DDR1-14 0.113±0.005nM 2.02E+05 2.27E-05 0.162 1.000
DDR1-33 0.797±0.005nM 6.19E+05 4.93E-04 2.602 0.998
表14.DDR1 mAb的表位组
Figure BPA0000324724060000992
为了确定一组抗人DDR1单克隆抗体对人DDR2 ECD的交叉反应性，使用了ELISA方法。将DDR1 ECD或DDR2 ECD蛋白包被在高结合板上，并以1ug/ml浓度施加单克隆抗体中的每种单克隆抗体，并使用HRP缀合的抗兔抗体(宾夕法尼亚州的杰克逊免疫研究实验室有限公司)检测结合。图19中示出了结果。单克隆抗体DDR1-3；DDR1-9；DDR1-10；DDR1-14和DDR1-33对DDR1表位具有特异性，而克隆DDR1-13；DDR1-15；DDR1-21；DDR1-22和DDR1-34似乎识别DDR1和DDR2 ECD上存在的表位。
*************
根据本公开，无需过度实验即可制备和执行本文所公开和要求保护的所有方法。虽然已经根据优选实施例描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域的技术人员来说将显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以改变所述方法以及本文所描述的方法的步骤或步骤序列。更具体地，将显而易见的是，化学和生理学相关的某些药剂可以取代本文所描述的药剂，同时将实现相同或类似的结果。对于本领域的技术人员来说显而易见的所有此类类似的替代和修改都被认为处于由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献就其为本文所阐述的彼等提供示例性程序性或其它细节补充的程度而言，通过引用明确地并入本文。
Joyce和Fearon，T细胞排斥、免疫特权和肿瘤微环境(T cell exclusion，immuneprivilege，and the tumor microenvironment.)《科学(Science)》348，74-80，doi：10.1126/science.aaa6204(2015)。
Binnewies等人，了解肿瘤免疫微环境(TIME)以进行有效疗法(Understandingthe tumor immune microenvironment(TIME)for effective therapy.)《自然医学(NatMed)》24，541-550，doi：10.1038/s41591-018-0014-x(2018)。
O′Donnell等人，癌症免疫编辑和对基于T细胞的免疫疗法的抗性(Cancerimmunoediting and resistance to T cell-based immunotherapy.)《临床肿瘤学自然评论(Nat Rev Clin Oncol)》16，151-167，doi：10.1038/s41571-018-0142-8(2019)。
Gruosso等人，空间上不同的肿瘤免疫微环境将三阴性乳腺癌分层(Spatiallydistinct tumor immune microenvironments stratify triple-negative breastcancers.)《临床研究杂志(J Clin Invest)》129，1785-1800，doi：10.1172/JCI96313(2019)。
Fu等人，盘状蛋白结构域受体：胶原蛋白介导的信号传导中的独特受体酪氨酸激酶(Discoidin domain receptors：unique receptor tyrosine kinases in collagen-mediated signaling.)《生物化学杂志》288，7430-7437，doi：10.1074/jbc.R112.444158(2013)。
Leitinger，B.盘状蛋白结构域受体在生理和病理条件下发挥作用(Discoidindomain receptor functions in physiological and pathological conditions.)《细胞与分子生物学国际综述(Int Rev Cell Mol Biol)》310，39-87，doi：10.1016/B978-0-12-800180-6.00002-5(2014)。
Valiathan等人，盘状蛋白结构域受体酪氨酸激酶：癌症进展中的新参与者(Discoidin domain receptor tyrosine kinases：new players in cancerprogression.)《癌症和转移综述(Cancer Metastasis Rev)》31，295-321，doi：10.1007/s10555-012-9346-z(2012)。
Rammal等人，盘状蛋白结构域受体：癌症中的潜在参与者和靶标(Discoidindomain receptors：Potential Actors and Targets in Cancer.)《前端药理学(FrontPharmacol)》7，55，doi：10.3389/fphar.2016.00055(2016)。
Gao等人，由非经典盘状蛋白结构域受体1信号传导介导的多器官部位转移再激活(Multi-organ Site Metastatic Reactivation Mediated by Non-canonical DiscoidinDomain Receptor 1 Signaling.)《细胞(Cell)》166，47-62，doi：10.1016/j.cell.2016.06.009(2016)。
Bayer等人，DDR2通过调节CAF中整合素介导的机械转导来控制乳腺肿瘤的硬度和转移(DDR2 controls breast tumor stiffness and metastasis by regulatingintegrin mediated mechanotransduction in CAFs.)《E生命(Elife)》8，doi：10.7554/eLife.45508(2019)。
Hidalgo-Carcedo等人，集体细胞迁移需要抑制由DDR1和细胞极性调节剂Par3和Par6介导的细胞接触处的肌动球蛋白(Collective cell migration requiressuppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cellpolarity regulators Par3 and Par6.)《自然细胞生物学(Nature Cell Biol)》13，49-58，doi：10.1038/ncb2133(2011)。
Marcotte等人，乳腺癌、胰腺癌细胞和卵巢癌细胞中的基本基因谱(Essentialgene profiles in breast，pancreatic，and ovarian cancer cells.)《癌症发现(CancerDiscov)》2，172-189，doi：10.1158/2159-8290.CD-11-0224(2012)。
Moll等人，DDR1在纤维化中的作用和其药理学靶向(DDR1 role in fibrosis andits pharmacological targeting.)《BBA-分子细胞研究(BBA-Molecular CellResearch)》1866，118474，doi：10.1016/j.bbamcr.2019.04.004(2019)。
Takai等人，盘状蛋白结构域受体1(DDR1)消融促进组织纤维化和缺氧诱导侵袭性基底样乳腺癌(Discoidin domain receptor 1(DDR1)ablation promotes tissuefibrosis and hypoxia to induce aggressive basal-like breast cancers.)《基因与发育(Genes Dev)》32，244-257，doi：10.1101/gad.301366.117(2018)。
Slaney等人，将T细胞转运到肿瘤中(Trafficking of T cells into tumors.)《癌症研究(Cancer Research)》74，7168-7174(2014)。
Sackstein等人，T淋巴细胞归巢：癌症免疫治疗成功的一个被低估但至关重要的障碍(T-lymphocyte homing：an underappreciated yet critical hurdle forsuccessful cancer immunotherapy.)《实验室调查(Laboratory Investigation)》，97，669(2017)。
Ager等人，实体癌归巢：使用CAR T细胞的过继性细胞疗法中的血管检查点(Homing to solid cancers：a vascular checkpoint in adoptive cell therapy usingCAR T-cells.)《生化学会汇刊(Biochemical Society Transactions)》44，377(2016)。
Carafoli等人，与抑制性Fab片段结合的盘状蛋白结构域受体1细胞外区域的结构揭示了对信号传导很重要的特征(Structure of the discoidin domain receptor 1extracellular region bound to an inhibitory Fab fragment reveals featuresimportant for signaling.)《结构(Structure)》20，688-697，doi：10.1016/j.str.2012.02.011(2012)。
Carafoli和Hohenester，通过盘状蛋白结构域受体的胶原蛋白识别和跨膜信号传导(Collagen recognition and transmembrane signalling by discoidin domainreceptors.)《生物化学与生物物理学报(Biochim Biophys Acta)》1834，2187-2194，doi：10.1016/j.bbapap.2012.10.014(2013)。
Vogel，W.F.配体诱导的盘状蛋白结构域受体1的脱落(Ligand-induced sheddingof discoidin domain receptor 1.)《欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS Lett)》514，175-180(2002)。
Flynn等人，表达DDR1和DDR2的可溶性细胞外结构域的细胞抑制胶原蛋白纤维生成(Inhibition of collagen fibrillogenesis by cells expressing solubleextracellular domains of DDR1 and DDR2.)《分子生物学杂志》395，533-543，doi：10.1016/j.jmb.2009.10.073(2010)。
Fu等人，膜型基质金属蛋白酶对盘状蛋白结构域受体1的脱落作用(Shedding ofdiscoidin domain receptor 1 by membrane-type matrix metalloproteinases.)《生物化学杂志》288，12114-12129，doi：10.1074/jbe.M112.409599(2013)。
Shitomi等人，ADAM10通过脱落盘状蛋白结构域受体1(DDR1)的胞外域来控制胶原蛋白信号传导和细胞迁移(ADAM10 controls collagen signaling and cell migrationon collagen by shedding the ectodomain of discoidin domain receptor 1(DDR1).)《分子细胞生物学(Mol Biol Cell)》26，659-673，doi：10.1091/mbc.E14-10-1463(2015)。
Agarwal等人，盘状蛋白结构域受体1与1型胶原蛋白的相互作用(Interaction ofdiscoidin domain receptor 1 with collagen type 1.)《分子生物学杂志》367，443-455，doi：10.1016/j.jmb.2006.12.073(2007)。
Chen等人，由骨髓细胞制成的细胞外基质促进骨髓间充质祖细胞的扩增，并防止其分化为成骨细胞(Extracellular matrix made by bone marrow cells facilitatesexpansion of marrow-derived mesenchymal progenitor cells and prevents theirdifferentiation into osteoblasts.)《骨矿物质研究杂志(J Bone Miner Res)》22，1943-1956，doi：10.1359/Jbmr.070725(2007)。
Kothiwale等人，盘状蛋白结构域受体1(DDR1)激酶作为基于结构的药物发现的靶标(Discoidin domain receptor 1(DDR1)kinase as target for structure-based drugdiscovery.)《今日药物开发(Drug Discov Today)》20，255-261，doi：10.1016/j.drudis.2014.09.025(2015)。
Li等人，小分子盘状蛋白结构域受体激酶抑制剂和潜在的医学应用(Smallmolecule discoidin domain receptor kinase inhibitors and potential medicalapplications.)《药物化学杂志》58，3287-3301，doi：10.1021/jm5012319(2015)。
Meng等人，从单个恒河猴抗体分泌细胞高效生成单克隆抗体(Efficientgeneration of monoclonal antibodies from single rhesus macaque antibodysecreting cells.)《单克隆抗体(MAbs)》7，707-718，doi：10.1080/19420862.2015.1051440(2015)。
Gui等人，通过有效的人源化抗体破坏LILRB4/APOE相互作用可逆转T细胞抑制并阻断AML发展(Disrupting LILRB4/APOE Interaction by an Efficacious HumanizedAntibody Reverses T-cell Suppression and Blocks AML Development.)《癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res)》7，1244-1257，doi：10.1158/2326-6066.CIR-19-0036(2019a)。
Li等人，肿瘤免疫综合分析：对癌症免疫疗法的影响(Comprehensive analysesof tumor immunity：implications for cancer immunotherapy.)《基因组生物学(GenomeBiol)》17，174，doi：10.1186/s13059-016-1028-7(2016)。
Pan等人，一种主要的染色质调节剂决定肿瘤细胞对T细胞介导的杀伤的抵抗力(Amajor chromatin regulator determines resistance of tumor cells to T cell-mediated killing.)《科学》359，770-775，doi：10.1126/science.aao1710(2018)。
Sun等人，肿瘤外源性盘状蛋白结构域受体1通过调节小鼠脂肪基质白介素6的产生来促进乳腺肿瘤的生长(Tumor-extrinsic discoidin domain receptor 1 promotesmammary tumor growth by regulating adipose stromal interleukin 6 productionin mice.)《生物化学杂志》293，2841-2849(2018)。
Erikson等人，使用激光扫描显微镜对胶原蛋白I的二阶非线性敏感性进行定量(Quantification of the second-order nonlinear susceptibility of collagen Iusing a laser scanning microscope.)《生物医学光学杂志(Journal of biomedicaloptics)》12，044002(2007)。
Gui等人，通过有效的人源化抗体破坏LILRB4/APOE相互作用可逆转T细胞抑制并阻断AML发展(Disrupting LILRB4/APOE interaction by an efficacious humanizedantibody reverses T-cell suppression and blocks AML development.)《癌症免疫学研究》7，1244-1257(2019b)。
Figure IPA0000324724010000011
Figure IPA0000324724010000021
Figure IPA0000324724010000031
Figure IPA0000324724010000041
Figure IPA0000324724010000051
Figure IPA0000324724010000061
Figure IPA0000324724010000071
Figure IPA0000324724010000081
Figure IPA0000324724010000091
Figure IPA0000324724010000101
Figure IPA0000324724010000111
Figure IPA0000324724010000121
Figure IPA0000324724010000131
Figure IPA0000324724010000141
Figure IPA0000324724010000151
Figure IPA0000324724010000161
Figure IPA0000324724010000171
Figure IPA0000324724010000181
Figure IPA0000324724010000191
Figure IPA0000324724010000201
Figure IPA0000324724010000211
Figure IPA0000324724010000221
Figure IPA0000324724010000231
Figure IPA0000324724010000241
Figure IPA0000324724010000251
Figure IPA0000324724010000261
Figure IPA0000324724010000271
Figure IPA0000324724010000281
Figure IPA0000324724010000291
Figure IPA0000324724010000301
Figure IPA0000324724010000311
Figure IPA0000324724010000321
Figure IPA0000324724010000331
Figure IPA0000324724010000341
Figure IPA0000324724010000351
Figure IPA0000324724010000361
Figure IPA0000324724010000371
Figure IPA0000324724010000381
Figure IPA0000324724010000391
Figure IPA0000324724010000401
Figure IPA0000324724010000411
Figure IPA0000324724010000421
Figure IPA0000324724010000431
Figure IPA0000324724010000441
Figure IPA0000324724010000451
Figure IPA0000324724010000461
Figure IPA0000324724010000471
Figure IPA0000324724010000481
Figure IPA0000324724010000491
Figure IPA0000324724010000501
Figure IPA0000324724010000511
Figure IPA0000324724010000521
Figure IPA0000324724010000531
Figure IPA0000324724010000541
Figure IPA0000324724010000551
Figure IPA0000324724010000561
Figure IPA0000324724010000571
Figure IPA0000324724010000581
Figure IPA0000324724010000591
Figure IPA0000324724010000601
Figure IPA0000324724010000611
Figure IPA0000324724010000621
Figure IPA0000324724010000631
Figure IPA0000324724010000641
Figure IPA0000324724010000651
Figure IPA0000324724010000661
Figure IPA0000324724010000671
Figure IPA0000324724010000681
Figure IPA0000324724010000691
Figure IPA0000324724010000701
Figure IPA0000324724010000711
Figure IPA0000324724010000721
Figure IPA0000324724010000731
Figure IPA0000324724010000741
Figure IPA0000324724010000751
Figure IPA0000324724010000761
Figure IPA0000324724010000771
Figure IPA0000324724010000781
Figure IPA0000324724010000791
Figure IPA0000324724010000801
Figure IPA0000324724010000811
Figure IPA0000324724010000821
Figure IPA0000324724010000831
Figure IPA0000324724010000841
Figure IPA0000324724010000851
Figure IPA0000324724010000861
Figure IPA0000324724010000871
Figure IPA0000324724010000881
Figure IPA0000324724010000891
Figure IPA0000324724010000901
Figure IPA0000324724010000911
Figure IPA0000324724010000921
Figure IPA0000324724010000931
Figure IPA0000324724010000941
Figure IPA0000324724010000951
Figure IPA0000324724010000961
Figure IPA0000324724010000971
Figure IPA0000324724010000981
Figure IPA0000324724010000991
Figure IPA0000324724010001001
Figure IPA0000324724010001011
Figure IPA0000324724010001021
Figure IPA0000324724010001031
Figure IPA0000324724010001041
Figure IPA0000324724010001051
Figure IPA0000324724010001061
Figure IPA0000324724010001071
Figure IPA0000324724010001081
Figure IPA0000324724010001091
Figure IPA0000324724010001101
Figure IPA0000324724010001111
Figure IPA0000324724010001121
Figure IPA0000324724010001131
Figure IPA0000324724010001141
Figure IPA0000324724010001151
Figure IPA0000324724010001161
Figure IPA0000324724010001171
Figure IPA0000324724010001181
Figure IPA0000324724010001191
Figure IPA0000324724010001201
Figure IPA0000324724010001211
Figure IPA0000324724010001221
Figure IPA0000324724010001231
Figure IPA0000324724010001241
Figure IPA0000324724010001251
Figure IPA0000324724010001261
Figure IPA0000324724010001271
Figure IPA0000324724010001281
Figure IPA0000324724010001291
Figure IPA0000324724010001301
Figure IPA0000324724010001311
Figure IPA0000324724010001321
Figure IPA0000324724010001331
Figure IPA0000324724010001341
Figure IPA0000324724010001351
Figure IPA0000324724010001361
Figure IPA0000324724010001371

Claims (60)

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与盘状蛋白结构域受体1(DDR1)蛋白特异性结合，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重可变区或其变体，所述轻链可变区具有在选自SEQ ID NO：108-128的轻链可变区内的LC-LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，所述重可变区具有在选自SEQ IDNO：129-149的重链可变区内的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括选自表1的克隆配对的LC-LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3和选自表2的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3或其变体，其中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
3.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列QSIGSV(SEQ ID NO：11)的LC-CDR1、包括氨基酸序列GVF的LC-CDR2和包括氨基酸序列QYIPYGSSP(SEQ ID NO：12)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSLNRYY(SEQ ID NO：57)的HC-CDR1、包括氨基酸序列ISYGDTT(SEQ ID NO：58)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARADTGDNGYLGLQL(SEQ ID NO：59)(DDR1-9)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
4.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区或其变体，所述轻链可变区具有包括氨基酸序列ESINSW(SEQ ID NO：41)的LC-CDR1、包括氨基酸序列DAS的LC-CDR2和包括氨基酸序列QSYYIINRSNYGNS(SEQ ID NO：42)的LC-CDR3，所述重链可变区具有包括氨基酸序列GFSLSSYY(SEQ ID NO：102)的HC-CDR1、包括氨基酸序列ITTAGPL(SEQ ID NO：103)的HC-CDR2和包括氨基酸序列ARGHAGSIYYSYFDL(SEQ ID NO：104)(DDR1-32)的HC-CDR3，在所述变体中所述LC-CDR和/或所述HC-CDR中的一者或多者具有一个、两个或三个氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
5.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有选自SEQ ID No：108-128的氨基酸序列，所述重链可变区具有选自SEQ ID NO：129-149的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括：
(a)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：108(DDR1-1K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：129(DDR1-1H)的氨基酸序列；
(b)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：109(DDR1-3K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：130(DDR1-3H)的氨基酸序列；
(c)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：110(DDR1-5K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：131(DDR1-5H)的氨基酸序列；
(d)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：111(DDR1-6K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：132(DDR1-6H)的氨基酸序列；
(e)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：112(DDR1-9K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：133(DDR1-9H)的氨基酸序列；
(f)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：113(DDR1-11K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：134(DDR1-11H)的氨基酸序列；
(g)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：114(DDR1-12K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：135(DDR1-12H)的氨基酸序列；
(h)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：115(DDR1-13K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：136(DDR1-13H)的氨基酸序列；
(i)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：116(DDR1-14K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：137(DDR1-14H)的氨基酸序列；
(j)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：117(DDR1-15K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：138(DDR1-15H)的氨基酸序列；
(k)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：118(DDR1-17K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：139(DDR1-17H)的氨基酸序列；
(l)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：119(DDR1-20K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：140(DDR1-20H)的氨基酸序列；
(m)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：120(DDR1-21K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：141(DDR1-21H)的氨基酸序列；
(n)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：121(DDR1-22K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：142(DDR1-22H)的氨基酸序列；
(o)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：122(DDR1-23K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：143(DDR1-23H)的氨基酸序列；
(p)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：123(DDR1-26K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：144(DDR1-26H)的氨基酸序列；
(q)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：124(DDR1-28K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：145(DDR1-28H)的氨基酸序列；
(r)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：125(DDR1-29K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：146(DDR1-29H)的氨基酸序列；
(s)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：126(DDR1-32K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：147(DDR1-32H)的氨基酸序列；
(t)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：127(DDR1-33K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：148(DDR1-33H)的氨基酸序列；或
(u)轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：128(DDR1-34K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：149(DDR1-34H)的氨基酸序列；或
其变体，其中所述轻链可变区与亲本轻链可变区氨基酸序列具有80％或更多的氨基酸序列同一性，并且所述重链可变区与亲本重链可变区氨基酸序列具有80％或更多的序列同一性，其中所述变体与DDR1蛋白特异性结合。
7.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：112(DDR1-9K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：133(DDR1-9H)的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：126(DDR1-32K)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：147(DDR1-32H)的氨基酸序列。
9.根据权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体是鼠类抗体、啮齿动物抗体、兔抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
10.根据权利要求9所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体是兔抗体或嵌合抗体。
11.根据权利要求9所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体是兔抗体或嵌合抗体。
12.根据权利要求1到4中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的单克隆抗体是人源化抗体。
13.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：150或151(DDR1-9hu_Lv1或DDR1-9hu_Lc2)的氨基酸序列，所述重链可变区具有SEQ ID NO：152(DDR1-9hu_Hv)的氨基酸序列；或其变体，其中所述轻链可变区与亲本轻链可变区氨基酸序列具有80％或更多的氨基酸序列同一性，并且所述重链可变区与亲本重链可变区氨基酸序列具有80％或更多的序列同一性，其中所述变体与DDR1蛋白特异性结合。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是ScFv(单链片段可变)抗体、Fab片段、F(ab′)2片段或Fv片段。
15.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与根据权利要求1到14中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合的表位的全部或一部分或同一表位特异性结合。
16.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与根据权利要求1到14中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争同一表位。
17.一种抗体-药物缀合物，其包括根据权利要求1到16中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段以及抗肿瘤药物，其中所述抗肿瘤药物与所述抗体或其抗原结合片段连接。
18.根据权利要求17所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗肿瘤药物通过光不稳定接头或酶促可切割接头与所述抗体连接。
19.根据权利要求17或18所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗肿瘤药物是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
20.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到14中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
21.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1到14中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段。
22.一种载体，其包括根据权利要求21所述的分离的核酸。
23.根据权利要求22所述的载体，其包括能够表达经编码的抗体或其抗原结合片段的表达载体。
24.一种宿主细胞，其包括根据权利要求21所述的多核苷酸或根据权利要求22或23所述的载体。
25.根据权利要求24所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
26.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
27.一种杂交瘤或工程化细胞，其编码和/或产生根据权利要求1到14中任一项所述的分离的单克隆抗体。
28.一种产生抗体的方法，所述方法包括培养根据权利要求24到26中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够表达所述单克隆抗体或其抗原片段，所述方法包括在适于表达所述抗体或其抗原结合片段的条件下培养所述宿主细胞；以及分离所述抗体或其抗原结合片段。
29.一种嵌合抗原受体(CAR)蛋白，其包括根据权利要求1到14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
30.一种分离的核酸，其编码根据权利要求29所述的CAR蛋白。
31.一种载体，其包括根据权利要求30所述的分离的核酸。
32.根据权利要求31所述的载体，其中所述载体能够表达所述CAR蛋白。
33.一种工程化细胞，其包括根据权利要求30所述的分离的核酸或根据权利要求32所述的载体。
34.根据权利要求33所述的工程化细胞，其中所述细胞是T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
35.一种治疗受试者的癌症或改善受试者的癌症的作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1到14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求33或34所述的工程化细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法减少或根除所述受试者的肿瘤负荷。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述方法减少肿瘤细胞的数量或减少肿瘤大小。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述癌症是实体癌或实体瘤。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌；肺癌，包含小细胞肺癌和非小细胞肺癌；结肠癌和结直肠癌；头颈癌；胃(stomach/gastric)癌；卵巢癌；乳腺癌；肾癌；肝癌；***癌、***、脑癌；皮肤癌，包含黑色素瘤；以及骨癌。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述乳腺癌是选自以下的乳腺癌亚型：(a)管腔A(ER+和/或PR+、HER2-)；(b)管腔B(ER+和/或PR+、HER2+)；(c)三阴性(ER-、PR-、HER2-)；(d)HER2+/ER-(ER-、PR-和HER2+)；以及(e)未分类(ER-、PR-、HER2-、细胞角蛋白5/6-和HER1-)。
42.根据权利要求35到41中任一项所述的方法，其中所述癌症的癌细胞被鉴定为在癌细胞表面表达或确定表达分泌的DDR1蛋白和/或DDR1蛋白。
43.根据权利要求35到42中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段静脉内、动脉内、肿瘤内或皮下施用。
44.根据权利要求35所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用一种或多种药物，所述一种或多种药物选自由以下组成的组：拓扑异构酶抑制剂、蒽环类拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素(anthracycline)、柔红霉素(daunorubicin)、核苷代谢抑制剂、阿糖胞苷(cytarabine)、低甲基化剂、低剂量阿糖胞苷(LDAC)、柔红霉素和阿糖胞苷的组合、用于注射的柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、
Figure FPA0000324724050000061
氮杂胞苷、
Figure FPA0000324724050000062
地西他滨(decitabine)、全反式视黄酸(ATRA)、砷、三氧化二砷、组胺二盐酸盐、
Figure FPA0000324724050000063
白介素-2(interleukin-2)、阿地白介素(aldesleukin)、
Figure FPA0000324724050000064
吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、
Figure FPA0000324724050000065
FLT-3抑制剂、米哚妥林(midostaurin)、
Figure FPA0000324724050000066
氯法拉滨(clofarabine)、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨、IDH1抑制剂、艾伏尼布(ivosidenib)、
Figure FPA0000324724050000067
IDH2抑制剂、依那昔布(enasidenib)、
Figure FPA0000324724050000068
平滑(SMO)抑制剂、格拉吉布(glasdegib)、精氨酸酶抑制剂、IDO抑制剂、艾卡哚司他(epacadostat)、BCL-2抑制剂、维奈托克(venetoclax)、
Figure FPA0000324724050000071
铂复合物衍生物、奥沙利铂(oxaliplatin)、激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、BTK抑制剂、依鲁替尼(ibrutinib)、
Figure FPA0000324724050000072
阿卡替尼(acalabrutinib)、
Figure FPA0000324724050000073
赞布替尼(zanubrutinib)、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG3抗体、ICOS抗体、TIGIT抗体、TIM3抗体、CD40抗体、4-1BB抗体、CD47抗体、SIRP1α抗体或融合蛋白、E-选择蛋白的拮抗剂、与肿瘤抗原结合的抗体、与T细胞表面标志物结合的抗体、与髓样细胞或NK细胞表面标志物结合的抗体、烷化剂、亚硝基脲剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、来源于植物的生物碱、激素疗法药物、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。
45.根据权利要求35到44中任一项所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段进一步包括与其连接的抗肿瘤药物。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述抗肿瘤药物是毒素、放射性同位素、细胞因子或酶。
47.一种治疗受试者的纤维化或改善受试者的纤维化的作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1到14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求33或34所述的工程化细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述受试者患有器官纤维化。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述受试者患有肾纤维化、肝纤维化、肺纤维化或心脏纤维化。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述受试者患有肺纤维化。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述受试者患有间质性肺病。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述受试者患有特发性肺纤维化(IPF)或肺疤痕。
53.一种检测样品或受试者中癌细胞或癌症干细胞的方法，所述方法包括：
(a)使受试者或来自所述受试者的样品与根据权利要求1到14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及
(b)检测所述抗体与所述受试者或样品中的癌细胞或癌症干细胞的结合。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述样品是体液或活检。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述样品是血液、骨髓、痰、眼泪、唾液、粘液、血清、尿液或粪便。
56.根据权利要求53到55中任一项所述的方法，其中检测包括免疫组织化学、流式细胞术、FACS、ELISA、RIA或蛋白质印迹。
57.根据权利要求53所述的方法，其进一步包括第二次执行步骤(a)和(b)以及确定相较于第一次的检测水平的变化。
58.根据权利要求53到57中任一项所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段进一步包括标记。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述标记是肽标签、酶、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。
60.根据权利要求35到59中任一项所述的方法，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与脂质体或纳米颗粒缀合。
CN202080094867.1A 2019-12-17 2020-12-17 新型ddr1抗体和其用途 Pending CN115443150A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962949300P 2019-12-17 2019-12-17
US62/949,300 2019-12-17
PCT/US2020/065618 WO2021127185A1 (en) 2019-12-17 2020-12-17 Novel ddr1 antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115443150A true CN115443150A (zh) 2022-12-06

Family

ID=76478553

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080094867.1A Pending CN115443150A (zh) 2019-12-17 2020-12-17 新型ddr1抗体和其用途

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20230130372A1 (zh)
EP (1) EP4076526A4 (zh)
JP (1) JP2023508277A (zh)
CN (1) CN115443150A (zh)
AU (1) AU2020407089B2 (zh)
BR (1) BR112022011037A2 (zh)
CA (1) CA3160181A1 (zh)
IL (1) IL294019A (zh)
MX (1) MX2022007353A (zh)
WO (1) WO2021127185A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3160181A1 (en) * 2019-12-17 2021-06-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Novel ddr1 antibodies and uses thereof
CN116023497B (zh) * 2022-11-09 2024-06-21 四川大学华西医院 抗ddr1抗体及其用途
WO2024107895A1 (en) * 2022-11-16 2024-05-23 Incendia Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer using anti-ddr1 antibodies and immune checkpoint inhibitors
WO2024107899A1 (en) * 2022-11-16 2024-05-23 Incendia Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer using anti-ddr1 antibodies

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8652843B2 (en) * 2008-08-12 2014-02-18 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. DDR1-binding agents and methods of use thereof
EP2749572A4 (en) * 2011-08-23 2015-04-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd NEW ANTI-DDR1 ANTIBODY WITH ANTITUMORACTIVITY
TW201427995A (zh) * 2012-09-24 2014-07-16 Gilead Sciences Inc 抗ｄｄｒ１抗體
MX2019006866A (es) * 2016-12-16 2019-08-22 Merck Patent Gmbh Metodos para el uso de proteina de enlace a galectina 3 detectada en la orina para supervisar la gravedad y el progreso de nefritis lupica.
WO2018162724A1 (en) * 2017-03-09 2018-09-13 Mab Discovery Gmbh Antibodies specifically binding to human il-1r7
US20210139589A1 (en) * 2017-06-22 2021-05-13 Apexigen, Inc Anti-vista antibodies and methods of use
CA3160181A1 (en) * 2019-12-17 2021-06-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Novel ddr1 antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020407089A1 (en) 2022-06-30
IL294019A (en) 2022-08-01
JP2023508277A (ja) 2023-03-02
CA3160181A1 (en) 2021-06-24
US20230235078A1 (en) 2023-07-27
MX2022007353A (es) 2022-09-19
EP4076526A1 (en) 2022-10-26
BR112022011037A2 (pt) 2022-09-13
EP4076526A4 (en) 2024-07-03
WO2021127185A1 (en) 2021-06-24
US20230130372A1 (en) 2023-04-27
AU2020407089B2 (en) 2023-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11498963B2 (en) Anti-LILRB antibodies and their use in detecting and treating cancer
JP5677744B2 (ja) ヒトＤｅｌｔａ様リガンド４に対するヒト抗体
AU2020407089B2 (en) Novel DDR1 antibodies and uses thereof
KR102617853B1 (ko) 항-lair1 항체 및 그의 용도
KR20210061341A (ko) 신규한 lilrb4 항체 및 이의 용도
JP2023513158A (ja) 新規のｌｉｌｒｂ２抗体およびその使用
CN113527489A (zh) 抗cd73的抗体及其用途
CN113194994A (zh) 使用抗trem2抗体的方法
US20230399384A1 (en) Antibodies to coronavirus spike protein and methods of use thereof
TW201900213A (zh) 免疫球蛋白ａ陽性細胞的調節
CN113747917A (zh) 针对MHC结合的人Dickkopf-1肽的单克隆抗体及其应用
CN115916347A (zh) 针对壳多糖酶3样1的抗体及其使用方法
TWI837517B (zh) 抗claudin 18.2和cd3的雙特異性抗體以及其用途
TW201840588A (zh) 抗ｇｐｒ２０抗體
WO2022166987A1 (zh) 结合lag-3的抗体及其用途
WO2021141492A1 (en) Epithelial cadherin-specific antibodies
CN116997354A (zh) 用于诊断和治疗用途的针对lilrb1的单克隆抗体
CN116848139A (zh) Bcma/taci抗原结合分子
JP2022523145A (ja) 抗ｔｒｅｍ１抗体及び関連方法
CA3201419A1 (en) Antibody variants against wnt receptor ryk

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination