CN115437131A - 对生物样品进行三维成像的方法及光片显微镜*** - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种利用光片显微镜对生物样品进行三维成像的方法及光片显微镜***，所述方法包括：在生物样品中使用光控荧光蛋白分子作为荧光探针，依序以如下步骤对各组子区域进行成像：使用控制激光照射该组子区域，以使得该组子区域中的光控荧光蛋白分子能够在激发光的照射下发射荧光；使用由光片显微镜基于激发激光形成的激发光片来激发该组子区域中的光控荧光蛋白分子以发射荧光；利用所发射的荧光对该组子区域进行成像；以及拼接各组子区域的成像结果，以得到生物样品的三维成像结果。本发明利用光控荧光蛋白的光控变换特性来解决光片显微镜对大体积透明化生物样品进行高分辨率三维成像时遇到的光漂白问题。

Description

对生物样品进行三维成像的方法及光片显微镜***

技术领域

本公开涉及一种精密光学仪器及其使用方法，更具体地，涉及一种利用光片显微镜对生物样品进行三维成像的方法及光片显微镜***。

背景技术

对生物组织的高分辨率三维荧光成像是获取生物组织三维结构，在亚细胞、细胞、和组织尺度上研究基因表达、细胞形态、和细胞分布等生物问题的有效手段。然而，由于生物组织的不透明性，对生物组织进行切片、二维成像、并三维重构的传统办法曾经是获取生物组织高分辨率三维结构的唯一手段。但是，生物组织的切片成像重构技术成像效率低、样品预处理难度大，数据重构复杂，使得这项技术很难被广泛应用。

生物组织透明化技术突破了阻碍荧光显微镜成像技术应用于生物组织高分辨率三维成像的主要障碍，使得前沿的三维荧光显微镜成像技术可以被用于高效的获取各种生物组织细胞级和亚细胞级的三维结构信息，从而帮助科研人员更好的了解生物组织、器官的结构和功能。在各种三维荧光显微镜成像技术中，光片显微镜技术具有高速、高分辨率、和高信噪比的特点，非常适合被用于对透明生物组织的三维成像。通过与生物组织透明化技术结合，光片显微镜使用光学切片方法替代了传统组织成像技术中的物理切片方法，极大的提高了生物组织高分辨率三维荧光成像的速度和分辨率。

光片显微镜对大体积透明化生物样品的成像是通过对样品的一系列子区域依次进行三维成像，再将各个子区域的三维成像结果拼接来实现的。光片显微镜对整个样品成像的分辨率等同于光片显微镜对每个子区域三维成像的分辨率。光片显微镜对大体积透明化生物样品的三维成像通过对一系列子区域的三维成像来完成。如图1(A)所示，每一个子区域的空间范围大，子区域数量少，成像分辨率低。如图1(B)所示，每一个子区域的空间范围小，子区域数量多，成像分辨率高。光片显微镜以这种方式对样品进行三维成像时，尽管只有处于激发光片中心的子区域被成像，处于激发光传播路径上的其他子区域也同时被激发光片所照射。因此，后成像的子区域在光片显微镜对先成像的子区域进行三维成像时也同时被激发光片反复照射，导致后成像的子区域中的荧光标记探针在光片显微镜对该子区域进行三维成像前已经淬灭，造成了样品的光漂白，使光片显微镜无法在后成像的子区域获得具有足够信噪比的三维图像。如图2(A)所示，对ROI1-ROI4子区域成像时，激发光会同时照射未成像子区域ROI5-ROI16。如图2(B)所示，对ROI5-ROI8成像时，激发光会同时照射未成像子区域ROI9-ROI12。如图2(C)所示，对子区域ROI9-ROI12成像时，激发光会同时照射未成像子区域ROI13-ROI16。如图2(D)所示，未成像子区域ROI13-ROI16在成像前已经被激发光多次照射，引起该区域的荧光探针的提前淬灭，从而导致更加严重的光漂白问题，使得光片显微镜无法以期望的分辨率完成对所有子区域，也即整个样品的三维成像。

此外，当光片显微镜对样品成像的分辨率增加时，每一个子区域的体积范围都会减小。因此，对同一个样品进行更高分辨率的三维成像需要通过对数量更多的体积范围更小的子区域的三维成像来完成,也因此会遇到更严重的光漂白问题。所以，光片显微镜对大体积透明化生物样品进行高分辨率三维成像时所遇到的光漂白问题限制了使用光片显微镜对大体积透明化生物样品进行三维成像所可以获得的最高分辨率。

发明内容

旨在提供一种利用光片显微镜对生物样品进行三维成像的方法及光片显微镜***，利用光控荧光蛋白的光控变换特性来解决光片显微镜对大体积透明化生物样品进行高分辨率三维成像时遇到的光漂白问题。

在第一方面，本公开的实施例提供了一种利用光片显微镜对生物样品进行三维成像的方法，所述方法包括：在所述生物样品中使用光控荧光蛋白分子作为荧光探针，其中，所述光控荧光蛋白分子在控制激光的照射后能够在激发光的照射下发射荧光；将所述生物样品划分为多组子区域，使得各组子区域分布于对应的路径上；依序以如下步骤对各组子区域进行成像：使用所述控制激光照射该组子区域，以使得该组子区域中的所述光控荧光蛋白分子能够在激发光的照射下发射荧光；使用由所述光片显微镜基于激发激光形成的激发光片来激发该组子区域中的所述光控荧光蛋白分子以发射荧光；利用所发射的荧光对该组子区域进行成像；以及拼接各组子区域的成像结果，以得到所述生物样品的三维成像结果。

在第二方面，本公开的实施例提供了一种光片显微镜***，所述光片显微镜***用于在生物样本中使用光控荧光蛋白分子作为荧光探针的情况下对所述生物样本进行三维成像，且所述光片显微镜***包括：第一激光器，其配置为：发射控制激光以照射生物样品，使得光控荧光蛋白分子在控制激光的照射后能够在激发光的照射下发射荧光；第二激光器，其配置为：发射激发激光；光片显微镜主体，其配置为：基于所述激发激光形成激发光片以照射生物样品，以使得所述生物样品中的光控荧光蛋白分子能够在激发光的照射下发射荧光；成像构件，其配置为：接收来自生物样品的荧光，并利用所接收的荧光对所述生物样品成像；以及处理器，其配置为：将所述生物样品划分为多组子区域，使得各组子区域分布于对应的路径上；控制所述第一激光器、所述第二激光器、所述光片显微镜主体和所述成像构件，依序以如下步骤对各组子区域进行成像：控制所述第一激光器发射所述控制激光以照射该组子区域；控制所述光片显微镜主体使用基于所述激发激光形成的激发光片照射所述生物样品的该组子区域；控制所述成像构件利用来自所述生物样品的该组子区域的荧光对该组子区域进行成像；以及拼接各组子区域的成像结果，以得到所述生物样品的三维成像结果。

利用根据本公开的各个实施例的利用光片显微镜对生物样品进行三维成像的方法及光片显微镜***，其能够利用光控荧光蛋白的光控变换特性来解决光片显微镜对大体积透明化生物样品进行高分辨率三维成像时遇到的光漂白问题，从而实现对生物样品的三维成像。

附图说明

在不一定按比例绘制的附图中，相同的附图标记可以在不同的视图中描述相似的部件。具有字母后缀或不同字母后缀的相同附图标记可以表示相似部件的不同实例。附图大体上通过举例而不是限制的方式示出各种实施例，并且与说明书以及权利要求书一起用于对所公开的实施例进行说明。这样的实施例是例证性的，而并非旨在作为本装置或方法的穷尽或排他实施例。

图1(A)-图1(B)示出根据本公开实施例的利用光片显微镜对生物样品成像的示意图。

图2(A)-图2(D)示出利用光片显微镜对生物样品成像时发生光漂白情况的示意图。

图3示出根据本公开实施例的利用光片显微镜对生物样品的三维成像方法的流程图。

图4示出光激活荧光蛋白分子的工作原理图。

图5(A)-图5(I)示出根据本公开实施例的利用光片显微镜使用光激活荧光蛋白分子对生物样品子区域成像的示意图。

图6示出光转换荧光蛋白分子的工作原理图。

图7(A)-图7(I)示出根据本公开实施例的利用光片显微镜使用光转换荧光蛋白分子对生物样品子区域成像的示意图。

图8示出光开关荧光蛋白分子的工作原理图。

图9(A)-图9(I)示出根据本公开实施例的利用光片显微镜使用光开关荧光蛋白分子对生物样品子区域成像的示意图。

图10示出根据本公开实施例的光片显微镜***的示意性框图。

图11示出根据本公开实施例的光片显微镜***的示例的结构示意图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本公开的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本公开作详细说明。下面结合附图和具体实施例对本公开的实施例作进一步详细描述，但不作为对本公开的限定。

本公开中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指在该词前的要素涵盖在该词后列举的要素，并不排除也涵盖其他要素的可能。

本公开的实施例提供一种利用光片显微镜对生物样品进行三维成像的方法，如图3所示，该三维成像方法始于步骤301，在所述生物样品中使用光控荧光蛋白分子作为荧光探针标记生物样品，其中，所述光控荧光蛋白分子在控制激光的照射后能够在激发光的照射下发射荧光。可以在步骤302，将所述生物样品划分为多组子区域，使得各组子区域分布于对应的路径上。接着，对各组子区域，可以依序通过如下步骤303a-303c进行成像。在步骤303a，使用所述控制激光照射该组子区域，以使得该组子区域中的所述光控荧光蛋白分子能够在激发光的照射下发射荧光。在步骤303b，使用由所述光片显微镜基于激发激光形成的激发光片来激发该组子区域中的所述光控荧光蛋白分子以发射荧光。在步骤303c，利用所发射的荧光对该组子区域进行成像。接着，在对各组子区域完成成像之后，可以在步骤304，拼接各组子区域的成像结果，以得到所述生物样品的三维成像结果。

通过这样的三维成像方法，需要对子区域成像时，才通过控制激光的照射使得作为荧光探针的光控荧光蛋白分子能够响应于激发光的照射而发射荧光，从而克服传统的三维成像方法中，后成像的子区域在被成像前，会受到激发光片的多次照射，导致荧光探针提前淬灭造成后成像子区域的光漂白问题。通过实施例提供三维成像方法，可以使得在利用光片显微镜成像过程中，尤其是在对后成像的子区域成像时，取得满意的信噪比，从而本实施例的三维成像方法能够应用于对大体积透明化生物样品进行高分辨率三维成像。

在一些实施例中，生物样品为天然光学透明，或者经过生物组织透明化技术或者膨胀技术处理，从而具有一定光学透明性质的生物样品。将所述生物样品划分为多组子区域可以按照行列将所述生物样品划分为多组子区域，使得各组子区域位于各列上，使得各组子区域分布于对应的路径上，由此获得的各条路径不重叠且是直线形的。如此，可以按照规划好的路径来遍历各个组子区域，以实现对各组子区域的高效成像，路径的不重叠设计可以进一步减少在子区域进行成像前，荧光探针的提前淬灭。

在一些实施例中，所述光控荧光蛋白分子为光激活荧光蛋白分子，其在被控制激光照射前不发射荧光，且在被控制激光照射后激活为能够在激的照射下发射荧光的状态，如图4所示。在一些实施例中，光激活荧光蛋白分子可以是PA-GFP。在具体操作过程中，可以使用波长范围在350nm-450nm的紫色激光作为控制激光，所述光片显微镜用于形成激发光片的激发激光为蓝色激光，且所述光激活荧光蛋白分子在激活后在所述激发光片的照射下发射绿色荧光。

下面，以光激活荧光蛋白分子作为光控荧光蛋白分子的示例，对本示例的利用光片显微镜对生物样品进行三维成像的方法进行举例说明。

使用光激活荧光蛋白进行标记的生物样品，在经过透明化处理以后，光片显微镜通过对每一列子区域分别进行荧光激活和成像的次序来完成对所有子区域的三维成像，也就是整个样品的三维成像。由于每一个子区域的光激活荧光蛋白分子只在该子区域被三维成像前才被激活进入激活状态，可以发射绿色荧光，因此可以有效的避免光漂白问题。以图5(A)-图5(I)所示的对使用光激活荧光蛋白标记的生物样品的成像为例，光片显微镜按以下步骤完成对整个样品，即ROI1到ROI16子区域的三维成像。

如图5(A)所示，在成像前所有子区域的光激活蛋白分子均未激活，因此均不发射荧光。

如图5(B)所示，可以使用波长为405nm的控制激光照射样品第一列子区域(ROI1-ROI4)，以激活这些子区域中的光激活荧光蛋白分子。经过405nm的控制激光的照射，第一列子区域中的光激活荧光蛋白分子由不发荧光的状态激活为可以发射绿色荧光的激活状态。

然后，如图5(C)所示，可以使用基于波长为488nm的激发光所形成的激发光片，激发处于激活状态的可以发射绿色荧光的光激活荧光蛋白分子，对第一列子区域(ROI1-ROI4)依次进行三维成像。

接着，可以重复前述步骤，逐列完成对剩余子区域的光激活荧光蛋白分子的激活，并利用处于激活状态的光激活荧光蛋白分子进行三维成像。

例如，如图5(D)-图5(E)所示，可以使用波长为405nm的控制激光照射生物样品第二列子区域(ROI5-ROI8)，激活第二列子区域内的光激活荧光蛋白。使用基于波长为488nm的激发光所形成的激发光片，激发处于激活状态的可以发射绿色荧光的光激活荧光蛋白分子，从而可以对第二列子区域(ROI5-ROI8)依次进行三维成像。

接着，如图5(F)-图5(G)所示，使用波长为405nm的控制激光照射生物样品第三列子区域(ROI9-ROI12)，激活第三列子区域内的光激活荧光蛋白。使用基于波长为488nm的激发光所形成的激发光片，激发处于激活状态的可以发射绿色荧光的光激活荧光蛋白分子，从而可以对第三列子区域(ROI9-ROI12)依次进行三维成像。

接着，如图5(H)-图5(I)所示，使用波长为405nm的控制激光照射生物样品第四列子区域(ROI13-ROI16)，激活第四列子区域内的光激活荧光蛋白。使用基于波长为488nm的激发光所形成的激发光片，激发处于激活状态的可以发射绿色荧光的光激活荧光蛋白分子，可以对第四列子区域(ROI13-ROI16)依次进行三维成像。

最后，可以将获得的ROI1到ROI16子区域的三维成像结果进行拼接，获得整个生物样品的三维成像结果。

通过本发明以光激活荧光蛋白分子作为光控荧光蛋白分子，利用光片显微镜对生物样品进行三维成像的方法，有效解决了光片显微镜对大体积透明化生物样品进行高分辨率三维成像时遇到的光漂白问题，实现了对大体积透明化生物样品的高分辨率成像。

在一些实施例中，所述光控荧光蛋白分子也可以采用光转换荧光蛋白分子，其在控制激光的照射前在第一激发光的照射下发射第一波长范围的第一荧光，而在所述控制激光的照射后转换为在第二激发光的照射下发射第二波长范围的第二荧光。在一些实施方式中，所述第一激发光和所述第二激发光的波长范围可以不同，且所述第一波长范围和所述第二波长范围可以不同。如图6所示，光转换荧光蛋白分子在光转换前在被激发时可以发射荧光，通过紫色光照射，可以将光转换荧光蛋白吸收激发光的波长范围和发射荧光的波长转换到另外的波长范围，从而发射不同颜色荧光的荧光蛋白。光转换荧光蛋白分子可以是mEOS，在具体操作过程中可以使用波长范围可以在350nm-450nm的紫色激光。在一些实施方式中，所述控制激光可以是紫色激光，所述第一荧光可以是绿色荧光而所述第二荧光可以是红色荧光，所述光片显微镜用于形成第二激发光的激发激光可以是黄绿色激光。

在一些实施例中，在所述光转换荧光蛋白分子转换之前：还可以对所述生物样品照射第一激发光使之发射第一波长范围的第一荧光；利用所发射的第一荧光对所述生物样品进行成像。光转换荧光蛋白在被转换前可以受激发发射荧光，光转换以后受激通常发射波长比转换前更长的荧光。因此光转换蛋白转换前也可以受激发射荧光，使用光转换荧光蛋白可以在进行三维成像前，方便地对样品的结构进行观察和成像。

下面，以光转换荧光蛋白分子作为光控荧光蛋白分子的示例，对利用光片显微镜对生物样品进行三维成像的方法进行举例说明。

使用光转换荧光蛋白进行标记的生物样品，在经过透明化处理以后，光片显微镜通过对每一列子区域分别进行荧光转换和成像的次序来完成对所有子区域的三维成像，也就是整个样品的三维成像。由于每一个子区域的光转换荧光蛋白分子只在该子区域被三维成像前才转换到成像的所使用的荧光颜色通道。因此，使用转换后的荧光颜色通道可以有效的解决光漂白问题。以图7(A)-图7(I)所示的对使用光激活荧光蛋白标记的生物样品的成像为例，光片显微镜按以下步骤完成对整个样品，即ROI1到ROI16子区域的三维成像。

如图7(A)所示，所有子区域的光转换蛋白分子均未转换，转换前的光转换荧光蛋白分子受激发射绿色荧光。

如图7(B)所示，可以使用波长为405nm的控制激光照射样品第一列子区域(ROI1-ROI4)，转换这些子区域中的光转换荧光蛋白分子。经过405nm的控制激光的照射，第一列子区域中的光转换荧光蛋白分子由被激发后发射绿色荧光转换为被激发后发射红色荧光。

然后，如图7(B)所示，可以使用基于波长为561nm的激发光所形成的激发光片，激发完成荧光转换的可以发射红色荧光的光转换荧光蛋白分子，对第一列子区域(ROI1-ROI4)依次进行三维成像。

接着，可以重复前述步骤，逐列完成对剩余子区域的光转换荧光蛋白分子的转换，并利用完成转换的光转换荧光蛋白分子进行三维成像。

例如，如图7(D)-图7(E)所示，可以使用波长为405nm的控制激光照射生物样品的第二列子区域(ROI5-ROI8)，从而可以对这些子区域内的光转换荧光蛋白进行荧光转换。

使用基于波长为561nm的激发光所形成的激发光片，激发完成荧光转换的可以发射红色荧光的光转换荧光蛋白分子，对第二列子区域(ROI5-ROI8)依次进行三维成像。

接着，如图7(F)-图7(G)所示，使用波长为405nm的控制激光照射生物样品第三列子区域(ROI9-ROI12)，对第三列子区域内的光转换荧光蛋白进行荧光转换。

使用基于波长为561nm的激发光所形成的激发光片，激发完成荧光转换的可以发射红色荧光的光转换荧光蛋白分子，可以对第三列子区域(ROI9-ROI12)依次进行三维成像。

接着，如图7(H)-图7(I)所示，使用波长为405nm的控制激光照射样品的第四列子区域(ROI13-ROI16)，对第四列子区域内的光转换荧光蛋白进行荧光转换。

使用基于波长为561nm的激发光所形成的激发光片，激发完成荧光转换的可以发射红色荧光的光转换荧光蛋白分子，可以对第四列子区域(ROI13-ROI16)依次进行三维成像。

最后可以将获得的ROI1到ROI16子区域的三维成像结果进行拼接，获得整个生物样品的三维成像结果。

通过本发明以光转换荧光蛋白分子作为光控荧光蛋白分子，利用光片显微镜对生物样品进行三维成像的方法，有效解决了光片显微镜对大体积透明化生物样品进行高分辨率三维成像时遇到的光漂白问题，实现了对大体积透明化生物样品的高分辨率成像。

在一些实施例中，所述光控荧光蛋白分子为光开关荧光蛋白分子，其在控制激光的照射前处于不发射荧光的关闭状态，在控制激光的照射后进入能够在激发光的照射下发射荧光的打开状态，且在发射荧光后又返回不发射荧光的关闭状态。如图8所示，光开关荧光蛋白分子是一种在光打开前不发射荧光，通过紫外光打开进入打开状态的光开关荧光蛋白可以发射荧光，然而在受到激发光激发后，处于打开状态的光开关荧光蛋白在发射荧光后又进入关闭状态。光开关荧光蛋白分子允许重复进行光打开、激发和光关闭的操作，在打开状态和关闭状态间多次切换。因此使用光开关荧光蛋白标记的样品可以在成像过程中反复对光开关荧光蛋白进行打开和关闭的操作，从而允许更灵活的成像方式。在一实施方式中，光开关荧光蛋白分子可以是Dronpa。在具体操作过程中可以使用波长范围可以在350nm-450nm的紫色激光。

下面以光开关荧光蛋白分子作为光控荧光蛋白分子对本示例的利用光片显微镜对生物样品进行三维成像的方法进行举例说明。

使用光开关荧光蛋白进行标记的生物样品，在经过透明化处理以后，光片显微镜通过对每一列子区域分别进行荧光打开和成像的次序来完成对所有子区域，也就是整个生物样品的三维成像。每一个子区域的光开关荧光蛋白分子只在该子区域被三维成像前和成像时才处于打开状态，可以发射荧光。因此，使用光开关荧光蛋白分子可以有效的解决光漂白问题。以对图9(A)-图9(I)所示样品的ROI1到ROI16子区域的三维成像为例，光片显微镜按以下步骤完成对整个样品，即ROI1到ROI16子区域的三维成像。

如图9(A)所示，光开关荧光蛋白分子打开前，所有子区域的光开关蛋白分子均处于关闭状态，打开前的光开关荧光蛋白分子即使受到激发也不发射荧光。

如图9(B)所示，可以使用波长为405nm的控制激光照射样品的第一列子区域(ROI1-ROI4)，打开第一列子区域中的光开关荧光蛋白分子。经过405nm的控制激光的照射，第一列子区域中的光开关荧光蛋白分子由不发射荧光打开为激发后可以发射绿色荧光的荧光蛋白分子。由于光开关蛋白在发射荧光后又进入不可以发射荧光的关闭状态，因此可以在成像过程中使用405nm的控制激光对第一列子区域进行重复照射，使得被成像子区域的光开关蛋白始终处在打开状态，用于该子区域的三维成像。

然后，如图9(C)所示，可以使用基于波长为488nm的激发光所形成的激发光片，激发已经处于打开状态的光开关荧光蛋白分子，对第一列子区域(ROI1-ROI4)依次进行三维成像。

接着，可以重复前述步骤，逐列打开剩余子区域的光开关荧光蛋白分子，并利用处于打开状态的光开关荧光蛋白分子进行相应子区域的三维成像。

例如，如图9(D)-图9(E)所示，可以使用波长为405nm的控制激光对样品第二列子区域(ROI5-ROI8)进行重复照射，打开ROI5-ROI8子区域内的光开关荧光蛋白。

使用基于波长为488nm的激发光所形成的激发光片，激发已经打开的可以发射绿色荧光的光开关荧光蛋白分子，可以对第二列子区域(ROI5-ROI8)依次进行三维成像。

接着，如图9(F)-图9(G)所示，可以使用波长为405nm的控制激光对样品第三列子区域(ROI9-ROI12)进行重复照射，打开ROI9-ROI12子区域内的光开关荧光蛋白。

使用基于波长为488nm的激发光所形成的激发光片，激发已经打开的可以发射绿色荧光的光开关荧光蛋白分子，可以对第三列子区域(ROI9-ROI12)依次进行三维成像。

接着，如图9(H)-图9(I)所示，使用波长为405nm的控制激光对样品第四列子区域(ROI13-ROI6)进行重复照射，打开ROI13-ROI16子区域内的光开关荧光蛋白。

使用基于波长为488nm的激发光所形成的激发光片，激发已经打开的可以发射绿色荧光的光开关荧光蛋白分子，可以对第四列子区域(ROI13-ROI16)依次进行三维成像。

最后可以将获得的ROI1到ROI16子区域的三维成像结果进行拼接，获得整个生物样品的三维成像结果。

通过本发明以光开关荧光蛋白分子作为光控荧光蛋白分子，利用光片显微镜对生物样品进行三维成像的方法，有效解决了光片显微镜对大体积透明化生物样品进行高分辨率三维成像时遇到的光漂白问题，实现了对大体积透明化生物样品的高分辨率成像。本示例中的光开关荧光蛋白在被打开前不发射荧光，在被打开以后可以发射绿色或其他颜色的荧光，在被激发并发射荧光以后，光开关荧光蛋白会回到关闭的状态。关闭的光开关蛋白可以再次被打开和关闭，并且循环操作可以进行多次，一直到光开关荧光蛋白淬灭。因此在具体操作过程中可以反复对光开关荧光蛋白进行打开和关闭的操作，从而有效提高成像质量。

图10示出根据本公开实施例的光片显微镜***的示意性框图，所述光片显微镜***用于在生物样本中使用光控荧光蛋白分子作为荧光探针的情况下对所述生物样本进行三维成像。如图10所示，所述光片显微镜***可以包括第一激光器1011、第二激光器1008、光片显微镜主体1000、成像构件1010和处理器1012。第一激光器1011可以配置为发射控制激光以照射生物样品，使得光控荧光蛋白分子在控制激光的照射后能够在激发光的照射下发射荧光。第二激光器1008可以配置为发射激发激光。光片显微镜主体1000可以配置为基于所述激发激光形成激发光片以照射生物样品，以使得所述生物样品中的光控荧光蛋白分子能够在激发光的照射下发射荧光。成像构件1010可以配置为：接收来自生物样品的荧光，并利用所接收的荧光对所述生物样品成像。处理器1012可以配置为：将所述生物样品划分为多组子区域，使得各组子区域分布于对应的路径上；控制所述第一激光器1011、所述第二激光器1008、所述光片显微镜主体和所述成像构件1010，依序以如下步骤对各组子区域进行成像。例如，处理器1012可以配置为控制所述第一激光器1011发射所述控制激光以照射该组子区域。处理器1012可以配置为控制所述光片显微镜主体使用基于所述激发激光形成的激发光片照射所述生物样品的该组子区域。处理器1012可以配置为控制所述成像构件1010利用来自所述生物样品的该组子区域的荧光对该组子区域进行成像。以及，处理器1012可以配置为拼接各组子区域的成像结果，以得到所述生物样品的三维成像结果。

在根据本公开的实施例中，所述处理器1012可以是包括一个以上通用处理设备的处理设备，诸如微处理器、中央处理单元(CPU)、图形处理单元(GPU)等。更具体地，该处理器可以是复杂指令集计算(CISC)微处理器、精简指令集计算(RISC)微处理器、超长指令字(VLIW)微处理器、运行其他指令集的处理器或运行指令集的组合的处理器。该处理器还可以是一个以上专用处理设备，诸如专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)、数字信号处理器(DSP)、片上***(SoC)等。处理器1012可以通信地耦合到存储器并且被配置为执行存储在其上的计算机可执行指令，以执行诸如根据本公开各实施例的对生物样品进行三维成像的方法。

在一些实施例中，存储器/储存器可以是非暂时性计算机可读的介质，诸如只读存储器(ROM)、随机存取存储器(RAM)、相变随机存取存储器(PRAM)、静态随机存取存储器(SRAM)、动态随机存取存储器(DRAM)、电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)、其他类型的随机存取存储器(RAM)、闪存盘或其他形式的闪存、缓存、寄存器、静态存储器、光盘只读存储器(CD-ROM)、数字通用光盘(DVD)或其他光学存储器、盒式磁带或其他磁存储设备，或被用于储存能够被计算机设备访问的信息或指令的任何其他可能的非暂时性的介质等。

本示例中的生物样品为天然光学透明，或者经过生物组织透明化技术或者膨胀技术处理，从而具有一定光学透明性质的生物样品。将所述生物样品划分为多组子区域可以按照行列将所述生物样品划分为多组子区域，使得各组子区域位于各列上，使得各组子区域分布于对应的路径上，由此获得的各条路径不重叠且是直线形的。

在一些实施例中，所述光控荧光蛋白分子可以是光激活荧光蛋白分子，其在控制激光的照射前不发射荧光，且在控制激光的照射后激活为能够在激发光的照射下发射荧光的状态。在一些实施例中，所述控制激光可以是紫色激光，所述激发激光可以是蓝色激光，且所述光激活荧光蛋白分子可以在激活后在所述激发光片的照射下发射绿色荧光。

在一些实施例中，所述光控荧光蛋白分子可以是光转换荧光蛋白分子，其在控制激光的照射前在第一激发光的照射下发射第一波长范围的第一荧光，而在所述控制激光的照射后转换为在第二激发光的照射下发射第二波长范围的第二荧光。其中，所述第一激发光和所述第二激发光的波长范围可以不同，且所述第一波长范围和所述第二波长范围可以不同。在一些实施例中，所述控制激光为紫色激光，所述第一荧光为绿色荧光而所述第二荧光为红色荧光，所述光片显微镜用于形成第二激发光的激发激光为黄绿色激光。在一些实施例中，所述处理器还可以被配置为，在所述光转换荧光蛋白分子转换之前：控制所述光片显微镜主体对所述生物样品照射第一激发光使之发射第一波长范围的第一荧光；且控制所述成像构件利用所发射的第一荧光对所述生物样品进行成像。

在一些实施例中，所述光控荧光蛋白分子可以是光开关荧光蛋白分子，其在控制激光的照射前处于不发射荧光的关闭状态，在控制激光的照射后进入能够在激发光的照射下发射荧光的打开状态，且在发射荧光后又返回不发射荧光的关闭状态。在一些实施例中，所述处理器还可以被配置为，控制所述第一激光器使用所述控制激光重复照射该组子区域，直到完成该组子区域的成像为止。在一些实施例中，所述控制激光可以是紫色激光，所述激发激光可以是蓝色激光，且所述光开关荧光蛋白分子在打开状态下在所述激发光片的照射下发射绿色荧光。

在一些实施例中，处理器1012可以配置为执行采用光激活荧光蛋白分子、光转换荧光蛋白分子、光开关荧光蛋白分子任何一种作为荧光探针时，对各个子区域的依序处理过程，包括但不限于根据本公开各个实施例的各个子区域的依序成像过程。

根据本公开的实施例的光片显微镜***可以采用各种构造，如图11所示。但须知根据本公开的实施例的光片显微镜***并不限于此，只要能够经由处理器1012控制相应的显微镜构件执行对各组子区域的成像过程即可。

例如，如图11所示，光片显微镜主体可以包括扩束准直透镜L1和L2、二元SLM组件1001、光学狭缝1009、至少第一对中继透镜L3和L4、第一振镜1002、至少第二对中继透镜L5和L6或者L7和L8、激发物镜1004和1007。

第二激光器1008被配置为生成激光束，例如具有488nm和561nm的激发波长的合束后的激光束。扩束准直透镜L1和L2可以配置为对来自激光生成组件1008的激光束进行扩展和准直，例如将合束后的激光束扩束到大约7mm的1/e²射束直径，扩束准直透镜L1的焦距例如但不限于30mm而扩束准直透镜L2的焦距例如但不限于250mm，并将扩展后的激光束发送到二元SLM组件1001。

二元SLM组件1001可以包括二元SLM 10011且配置为对扩展后的激光束进行相位调制。相应地，向二元SLM 10011加载的相位图为二元相位图，可通过将相应连续相位图二值化来得到。除了二元SLM 10011(例如尺寸为1280×1024的二元SLM 10011)以外，二元SLM组件1001还可以包括偏振分光棱镜10013、半波片10012，用于对扩展后的激光束进行分光、滤杂和相位调制。经调制的激光束可以被聚焦到光学狭缝1009上，以阻挡由所述二元SLM组件1001生成的不需要的激光衍射级，从而提升成像效果。所述二元SLM组件1001可以经由所述至少第一对中继透镜L3和L4共轭到所述第一振镜1002，透镜L3的焦距例如但不限于300mm而透镜L4的焦距例如但不限于175mm。第一振镜1002通过偏转振镜角度可以将照明光引导到两个对称的照明路径1003和1006中的一个上。在晶格光片显微镜中，第一振镜1002还可以通过扫描激光束来创建虚拟激发光片以实现生物样品照明。

第一振镜1002可以经由所述至少第二对中继透镜L5和L6或者L7和L8共轭到相应激发物镜1004或1007的入瞳，其中，透镜L5和L7的焦距例如但不限于150mm，而透镜L6和L8的焦距例如但不限于250mm，如此能够从两个相反的方向照明样品，从而尽量减小激发光在样品中的传输距离，相应地减少激发光的衰减，实现更好的成像效果。在一些实施例中，第二激发物镜1007和第一激发物镜1004可以具有不同的数值孔径(NA)，例如，Mitutoyo公司的MY5X-802和MY5X-803两者均可以用作第一激发物镜1004和第二激发物镜1007。

下面使用光激活荧光蛋白分子作为荧光探针、利用图11中所示的光片显微镜***并按照图5(A)-图5(I)的流程为例进行说明。但须知，该流程可以依据作为荧光探针的光控荧光蛋白分子的类型的不同进行调整，例如以光转换荧光蛋白分子作为光控荧光蛋白分子、光开关荧光蛋白分子作为光控荧光蛋白分子。还可以依据光片显微镜***的具体结构进行调整以适用于实际情况，在此不赘述。进一步地，成像流程虽然以行-列构型的子区域组作为示例说明，但也可以采用其他的子区域组的构型，可以基于成像流程的变型对控制进行调整，在此不赘述。

在一些实施例中，所述光控荧光蛋白分子为光激活荧光蛋白分子，其在控制激光的照射前不发射荧光，且在控制激光的照射后激活为能够在激发光的照射下发射荧光的状态。

在一些实施例中，可以使用波长范围在350nm-450nm的紫色激光作为控制激光。光激活荧光蛋白分子在光激活前不发射荧光，通过紫色光照射可以从不发射荧光的状态激活为可以发射荧光状态，并且光激活荧光蛋白分子在被激活以后，在激发光的照射下可以发射荧光。在一些实施方式中，光激活荧光蛋白分子可以是PA-GFP。

具体的操作流程可以包括：将处理好的生物样品放置在成像室1005中，处理器1012控制所述第一激光器1011、所述第二激光器1008、所述光片显微镜主体和所述成像构件1010，依序以如下步骤对生物样品各组子区域进行成像：

如图5(A)所示，所有子区域的光激活蛋白分子均未激活，因此均不发射荧光。

如图5(B)所示，处理器1012可以控制第一激光器1011发射波长为405nm的控制激光照射样品第一子区域(ROI1-ROI4)，从而可以激活这些子区域中的光激活荧光蛋白分子。经过405nm的控制激光的照射，第一子区域中的光激活荧光蛋白分子由不发荧光的状态激活为可以发射绿色荧光的激活状态。

然后，如图5(C)所示，处理器1012可以控制第二激光器1008发射波长为488nm的激发光形成激发光片。

处理器1012可以控制光片显微镜主体利用激发光片激发处于激活状态的可以发射绿色荧光的光激活荧光蛋白分子。

成像构件1010对第一子区域(ROI1-ROI4)依次进行三维成像。

接着，可以重复前述步骤，逐列完成对剩余子区域的光激活荧光蛋白分子的激活，并利用处于激活状态的光激活荧光蛋白分子进行三维成像。

例如，如图5(D)-图5(E)所示，处理器1012可以控制第一激光器1011发射波长为405nm的控制激光照射生物样品第二列子区域(ROI5-ROI8)，激活第二列子区域内的光激活荧光蛋白。处理器1012可以控制光片显微镜主体利用基于波长为488nm的激发光所形成的激发光片，激发处于激活状态的可以发射绿色荧光的光激活荧光蛋白分子，从而可以对第二列子区域(ROI5-ROI8)依次进行三维成像。

接着，如图5(F)-图5(G)所示，处理器1012可以控制第一激光器1011发射波长为405nm的控制激光照射生物样品第三列子区域(ROI9-ROI12)，激活第三列子区域内的光激活荧光蛋白。处理器1012可以控制光片显微镜主体利用基于波长为488nm的激发光所形成的激发光片，激发处于激活状态的可以发射绿色荧光的光激活荧光蛋白分子，从而可以对第三列子区域(ROI9-ROI12)依次进行三维成像。

接着，如图5(H)-图5(I)所示，处理器1012可以控制第一激光器1011发射波长为405nm的控制激光照射生物样品第四列子区域(ROI13-ROI16)，激活第四列子区域内的光激活荧光蛋白。处理器1012可以控制光片显微镜主体利用基于波长为488nm的激发光所形成的激发光片，激发处于激活状态的可以发射绿色荧光的光激活荧光蛋白分子，可以对第四列子区域(ROI13-ROI16)依次进行三维成像。

处理器1012将获得的各个子区域的三维成像结果进行拼接，获得整个生物样品的三维成像结果。

利用本示例性的光片显微镜***在成像过程中，尤其是在对后成像的子区域成像时，取得满意的信噪比，从而本实施例的三维成像***能够应用于对大体积透明化生物样品进行高分辨率三维成像。

此外，尽管已经在本文中描述了示例性实施例，其范围包括任何和所有基于本公开的具有等同元件、修改、省略、组合(例如，各种实施例交叉的方案)、改编或改变的实施例。权利要求书中的元件将被基于权利要求中采用的语言宽泛地解释，并不限于在本说明书中或本申请的实施期间所描述的示例，其示例将被解释为非排他性的。因此，本说明书和示例旨在仅被认为是示例，真正的范围和精神由以下权利要求以及其等同物的全部范围所指示。

以上描述旨在是说明性的而不是限制性的。例如，上述示例(或其一个或更多方案)可以彼此组合使用。例如本领域普通技术人员在阅读上述描述时可以使用其它实施例。另外，在上述具体实施方式中，各种特征可以被分组在一起以简单化本公开。这不应解释为一种不要求保护的公开的特征对于任一权利要求是必要的意图。相反，本公开的主题可以少于特定的公开的实施例的全部特征。从而，以下权利要求书作为示例或实施例在此并入具体实施方式中，其中每个权利要求独立地作为单独的实施例，并且考虑这些实施例可以以各种组合或排列彼此组合。本发明的范围应参照所附权利要求以及这些权利要求赋权的等同形式的全部范围来确定。

以上实施例仅为本公开的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本公开的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (24)

1.一种利用光片显微镜对生物样品进行三维成像的方法，其特征在于，所述方法包括：

在所述生物样品中使用光控荧光蛋白分子作为荧光探针，其中，所述光控荧光蛋白分子在控制激光的照射后能够在激发光的照射下发射荧光；

将所述生物样品划分为多组子区域，使得各组子区域分布于对应的路径上；依序以如下步骤对各组子区域进行成像：使用所述控制激光照射该组子区域，以使得该组子区域中的所述光控荧光蛋白分子能够在激发光的照射下发射荧光；使用由所述光片显微镜基于激发激光形成的激发光片来激发该组子区域中的所述光控荧光蛋白分子以发射荧光；利用所发射的荧光对该组子区域进行成像；以及

拼接各组子区域的成像结果，以得到所述生物样品的三维成像结果。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光控荧光蛋白分子为光激活荧光蛋白分子，其在控制激光的照射前不发射荧光，且在控制激光的照射后激活为能够在激发光的照射下发射荧光的状态。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述控制激光为紫色激光，所述光片显微镜用于形成激发光片的激发激光为蓝色激光，且所述光激活荧光蛋白分子在激活后在所述激发光片的照射下发射绿色荧光。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光控荧光蛋白分子为光转换荧光蛋白分子，其在控制激光的照射前在第一激发光的照射下发射第一波长范围的第一荧光，而在所述控制激光的照射后转换为在第二激发光的照射下发射第二波长范围的第二荧光，其中，所述第一激发光和所述第二激发光的波长范围不同，且所述第一波长范围和所述第二波长范围不同。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述控制激光为紫色激光，所述第一荧光为绿色荧光而所述第二荧光为红色荧光，所述光片显微镜用于形成第二激发光的激发激光为黄绿色激光。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括，在所述光转换荧光蛋白分子转换之前：对所述生物样品照射第一激发光使之发射第一波长范围的第一荧光；利用所发射的第一荧光对所述生物样品进行成像。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光控荧光蛋白分子为光开关荧光蛋白分子，其在控制激光的照射前处于不发射荧光的关闭状态，在控制激光的照射后进入能够在激发光的照射下发射荧光的打开状态，且在发射荧光后又返回不发射荧光的关闭状态。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使用所述控制激光照射该组子区域进一步包括使用所述控制激光重复照射该组子区域，直到完成该组子区域的成像为止。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述控制激光为紫色激光，所述光片显微镜用于形成激发光片的激发激光为蓝色激光，且所述光开关荧光蛋白分子在打开状态下在所述激发光片的照射下发射绿色荧光。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，各条路径不重叠且是直线形的。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述生物样品划分为多组子区域进一步包括按照行列将所述生物样品划分为多组子区域，使得各组子区域位于各列上。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品为天然光学透明，或者经过生物组织透明化技术或者膨胀技术处理，从而具有一定光学透明性质的生物样品。

13.一种光片显微镜***，其特征在于，所述光片显微镜***用于在生物样本中使用光控荧光蛋白分子作为荧光探针的情况下对所述生物样本进行三维成像，且所述光片显微镜***包括：

第一激光器，其配置为：发射控制激光以照射生物样品，使得光控荧光蛋白分子在控制激光的照射后能够在激发光的照射下发射荧光；

第二激光器，其配置为：发射激发激光；

光片显微镜主体，其配置为：基于所述激发激光形成激发光片以照射生物样品，以使得所述生物样品中的光控荧光蛋白分子能够在激发光的照射下发射荧光；

成像构件，其配置为：接收来自生物样品的荧光，并利用所接收的荧光对所述生物样品成像；以及

处理器，其配置为：

将所述生物样品划分为多组子区域，使得各组子区域分布于对应的路径上；

控制所述第一激光器、所述第二激光器、所述光片显微镜主体和所述成像构件，依序以如下步骤对各组子区域进行成像：控制所述第一激光器发射所述控制激光以照射该组子区域；控制所述光片显微镜主体使用基于所述激发激光形成的激发光片照射所述生物样品的该组子区域；控制所述成像构件利用来自所述生物样品的该组子区域的荧光对该组子区域进行成像；以及

拼接各组子区域的成像结果，以得到所述生物样品的三维成像结果。

14.根据权利要求13所述的光片显微镜***，其特征在于，所述光控荧光蛋白分子为光激活荧光蛋白分子，其在控制激光的照射前不发射荧光，且在控制激光的照射后激活为能够在激发光的照射下发射荧光的状态。

15.根据权利要求13所述的光片显微镜***，其特征在于，所述控制激光为紫色激光，所述激发激光为蓝色激光，且所述光激活荧光蛋白分子在激活后在所述激发光片的照射下发射绿色荧光。

16.根据权利要求13所述的光片显微镜***，其特征在于，所述光控荧光蛋白分子为光转换荧光蛋白分子，其在控制激光的照射前在第一激发光的照射下发射第一波长范围的第一荧光，而在所述控制激光的照射后转换为在第二激发光的照射下发射第二波长范围的第二荧光，其中，所述第一激发光和所述第二激发光的波长范围不同，且所述第一波长范围和所述第二波长范围不同。

17.根据权利要求16所述的光片显微镜***，其特征在于，所述控制激光为紫色激光，所述第一荧光为绿色荧光而所述第二荧光为红色荧光，所述光片显微镜用于形成第二激发光的激发激光为黄绿色激光。

18.根据权利要求16所述的光片显微镜***，其特征在于，还包括，所述处理器进一步配置为，在所述光转换荧光蛋白分子转换之前：控制所述光片显微镜主体对所述生物样品照射第一激发光使之发射第一波长范围的第一荧光；且控制所述成像构件利用所发射的第一荧光对所述生物样品进行成像。

19.根据权利要求13所述的光片显微镜***，其特征在于，所述光控荧光蛋白分子为光开关荧光蛋白分子，其在控制激光的照射前处于不发射荧光的关闭状态，在控制激光的照射后进入能够在激发光的照射下发射荧光的打开状态，且在发射荧光后又返回不发射荧光的关闭状态。

20.根据权利要求19所述的光片显微镜***，其特征在于，所述处理器进一步配置为：控制所述第一激光器使用所述控制激光重复照射该组子区域，直到完成该组子区域的成像为止。

21.根据权利要求19或20所述的光片显微镜***，其特征在于，所述控制激光为紫色激光，所述激发激光为蓝色激光，且所述光开关荧光蛋白分子在打开状态下在所述激发光片的照射下发射绿色荧光。

22.根据权利要求13所述的光片显微镜***，其特征在于，各条路径不重叠且是直线形的。

23.根据权利要求13所述的光片显微镜***，其特征在于，将所述生物样品划分为多组子区域进一步包括按照行列将所述生物样品划分为多组子区域，使得各组子区域位于各列上。

24.根据权利要求13所述的光片显微镜***，其特征在于，所述生物样品为天然光学透明，或者经过生物组织透明化技术或者膨胀技术处理，从而具有一定光学透明性质的生物样品。

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