CN115417867A - 取代萘甲酰胺类衍生物及其医药用途 - Google Patents

取代萘甲酰胺类衍生物及其医药用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及式I取代萘甲酰胺类衍生物或其可药用盐或水合物，包含上述化合物的药用组合物，用于调节蛋白激酶活性，并调节细胞内与细胞间的信号传导与响应。本发明还涉及包含本发明化合物或其可药用盐或水合物或上述化合物的药用组合物的制备方法及其在治疗与新生血管形成有关疾病的药物用途。

Description

取代萘甲酰胺类衍生物及其医药用途
技术领域
本发明涉及取代萘甲酰胺类衍生物及其可药用盐或水合物，含有它们的药用组合物的医药用途。特别的作为治疗和/或预防与酪氨酸激酶/酪氨酸激酶受体通路有关疾病的药物用途。
背景技术
蛋白酪氨酸激酶(Tyrosine Protein Kinase，TPK)是细胞信号传递过程中的重要因子，参与一系列细胞功能，与细胞生长、分化、增殖密切相关，它催化ATP的γ磷酸基转移到许多重要蛋白质的酪氨酸残基上，使酚羟基磷酸化，从而传递信号。TPK 属于蛋白激酶家族，按其结构可以分为两大类：受体酪氨酸蛋白激酶(Receptor PTKs， RTK)和非受体酪氨酸蛋白激酶(Non-receptor PTKs)，这两类酪氨酸蛋白激酶按结构同源性可进一步分为多个酶属。人体共有518种激酶基因，其中90种PTKs已被发现，包括受体型的酪氨酸激酶58种和非受体型的酪氨酸激酶32种。受体型的酪氨酸激酶包括血小板生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)、表皮生长因子受体(epidermal growthfactor receptor，EGFR)、成纤维细胞生长因子受体 (fibroblast growth factorreceptor，FGFR)等成员，它们通常具有一个细胞外结构域、一个跨膜区以及一个细胞内激酶域，RTK通过跨膜结构的酶蛋白受体连接细胞内外，与生长因子配体结合后激活信号传导。研究表明，这些受体及其配体与很多肿瘤都有重要联系，很多癌症出现了多种生长因子的过量表达，导致过量的酪氨酸磷酸化信号传入细胞。肿瘤细胞中受体激活后通过与下游分子结合并激活，使其具有酪氨酸激酶活性，促进细胞增殖，因此，抑制肿瘤细胞中RTK的活性，阻断受体-配体信号传导将有效抑制肿瘤发生发展。非受体型的酪氨酸激酶(nrPTKs)一般没有细胞外结构，它们通常与细胞膜耦联或存在于胞质中，包括Abl激酶、Src激酶、C-端Src激酶等成员。在肿瘤组织中nrPTKs常被激活，再激活下游的信号传导途径，促进细胞增殖、抵抗细胞凋亡，促使肿瘤发生和发展。
血管生成是由血管形成新萌芽的过程或从预先存在的血管***出来的过程。在正常生理条件下，血管生成是促血管生成因子和抑血管生成因子协调作用的复杂过程。当血管生成发生异常就会引起一系列的疾病，包括视网膜病、关节炎、子宫内膜异位症、动脉粥样硬化和癌症。Folkman在70年代初就已经证实原发性肿瘤的生长、转移必须依赖新血管的生成。事实上，肿瘤为了生长需要新的毛细血管来提供营养并带走代谢废物，新血管也为在后期的肿瘤细胞转移中提供帮助。
血管生成受到大量内源性促血管生成因子和抗血管生成因子的严格控制和调节。促血管生成因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成素(Tie)、肝配蛋白(Ephrin)、爱帕琳肽(apelin/APLN)、趋化因子等。这些因子通常同时表达，并在肿瘤血管生成的不同阶段有效合作。其中血管内皮生长因子及其受体(VEGF/VEGFR)是目前研究最多，作用特异性最强的促血管生成调控因子，能够诱导内皮细胞分化和血管生成。VEGF直接作用于内皮细胞，促使有丝***发生、新生血管生长，多数恶性肿瘤细胞有自分泌VEGF功能，转移的肿瘤细胞释放VEGF刺激了局部血管生成。作为VEGF的特异受体VEGFR在肿瘤新生血管中高表达。血管内皮细胞具有遗传稳定性，所以VEGFR抑制剂不易产生耐药性，易于到达靶点，在肿瘤组织内高浓度聚集。 VEGFR主要有3类：VEGFR-1(FLT-1)；VEGFR-2(KDR)和VEGFR-3(FLT-4)。VEGFR 是具有高度特异性的跨膜受体，蛋白结构由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成。胞外区是其与VEGF的结合位点，含有7个免疫球蛋白样的功能区；胞内区有1个***片段的酪氨酸蛋白激酶(PTK)；VEGFR的生物学功能是与其配体结合后通过级联式的磷酸化反应使信号逐级传导和放大，引起细胞相应的生物学效应，从而诱导血管内皮细胞的***、增殖和迁移，增强毛细血管通透性、使血浆外渗，促成周围血管大量形成。研究证明，VEGF/VEGFR信号通路与肿瘤血管生成和***形成密切相关。该信号通路为自身的生存发展创造了有利的微环境，它可促进其微血管的生成，获取丰富的营养供应，***的生成在肿瘤扩散过程中发挥着更重要的作用，因此阻断VEGF/VEGFR信号通路可以有效抑制肿瘤血管生成和***生成，抑制肿瘤的生长和转移。
发明内容
本发明的目的是寻找并发明一类新型作用于VEGFR的小分子化合物，其可阻断VEGF/VEGFR相关的信号通路，具有强效的血管形成抑制作用，从而具有抗肿瘤活性，并对伴有新生血管形成异常增值的其他各种疾病有改善、预防和治疗作用。
本发明人经过研究现已发现，具有下面通式I的化合物可作用于VEGF/VEGFR信号通路，显著抑制VEGF等蛋白激酶活性，具有抑制新血管的生成和抗肿瘤作用。
本发明第一方面涉及式I化合物或其可药用盐或水合物：
Figure BSA0000281702710000031
其中，R为无取代五元杂环，该五元杂环中包括1-4个选自O，S，N，Se的杂原子。
本发明的第二个方面涉及药物组合物，其包括至少一种式I化合物或其药用盐或其水合物载体或赋形剂。
本发明的第三个方面涉及式I化合物或其药用盐或水合物用于治疗和/或预防与酪氨酸激酶/酪氨酸激酶受体通路有关疾病的用途，所述的疾病包括但不限于：动脉粥样硬化或肺纤维化、视网膜病、子宫内膜异位症、关节炎和癌症等。
本发明的第四个方面涉及治疗和/或预防与VEGF/VEGFR通路有关的疾病的方法，其包括将预防和/或治疗有效量的至少一种式I化合物或其药用盐或其水合物给予需要治疗和 /或预防与VEGF/VEGFR通路有关的疾病的患者，所述的疾病包括但不限于：动脉粥样硬化或肺纤维化、视网膜病、子宫内膜异位症、关节炎和癌症等。
本发明的第五个方面涉治疗和/或预防VEGF/VEGFR通路有关的癌症疾病方法，其包括预防和/或治疗有效量的至少一种式I化合物或其药用盐或其水合物给予需要治疗和/或预防与VEGF/VEGFR通路有关的癌症疾病的患者。所述癌症疾病包括但不限于：胃癌、口腔癌、食道癌、甲状腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、大肠癌、肾癌、骨肉瘤、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤中的一种或几种。
根据本发明，本发明式(I)的化合物或其药用盐或水合物优选下面的化合物：
Figure BSA0000281702710000032
根据本发明，本发明化合物可通过下面的反应路线制备：
Figure BSA0000281702710000041
以2-甲氧基-4-氨基苯甲酸甲酯(1)为起始原料，原料1先与2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮(米氏酸)反应制得4-[(2，2-二甲基-4，6-二氧代-1，3-二噁烷-5-亚甲基) 氨基]-2-甲氧基苯甲酸甲酯(3)，2在二苯醚介导的高温条件下环合制得7-甲氧基-4-氧代-1，4-二氢喹啉-6-羧酸甲酯(4)，3经氯化亚砜氯代制得4-氯-7-甲氧基喹啉-6-羧酸甲酯(5)，4经氨解反应得关键中间体6。以1-萘甲酸(7)为原料经过甲磺酸化和碱融制备中间体10。在DMF介质中，以Hobt，EDCI为缩合剂，该中间体与各种胺反应，合成目标化合物12。
根据本发明，本发明化合物的术语“可药用盐”包括本发明化合物与制药学上可接受的无机或有机酸形成的酸盐或与制药学上可接受的碱形成的碱盐。其中酸盐包括但不限于：盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，硝酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，磷酸氢盐，乙酸盐，丙酸盐，丁酸盐，草酸盐，三甲基乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，乳酸盐，柠檬酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，富马酸盐，苦味酸盐，天冬氨酸盐，葡糖酸盐，苯甲酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐；碱盐包括但不限于：铵盐，碱金属盐如钠和钾盐，碱土金属盐如钙和镁盐，有机碱盐如二环己胺和N-甲基-D-葡糖胺盐，以及氨基酸盐如精氨酸和赖氨酸盐。
根据本发明，本发明化合物术语的碱，通常只要是有机合成上作为碱已知的物质，任何物质均可，没有特别的限定，例如碳酸钠，碳酸氢钠，碳酸钾，碳酸氢钾，氢化钠，氢化钾，叔丁醇钠，叔丁醇钾，碳酸铯，三乙胺，三甲胺，N-甲基吗啉，N，N- 二甲基苯胺，吡啶，异喹啉，氢氧化钾，氢氧化钠，甲醇钠，甲醇钾等。
十六烷酯蜡，十六碳烯芳醇，2-辛基十二烷醇，苄醇和水。
当下肠道局部施用时，本发明化合物可制成如上所述的直肠栓剂制剂或适宜的灌肠制剂形式，另外也可使用局部透皮贴剂。
本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液，或无菌注射溶液.其中，可使用的载体和溶剂包括水，林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯.
另外需要指出，本发明化合物针对不同患者的特定使用剂量和使用方法决定于诸多因素，包括患者的年龄，体重，性别，自然健康状况，营养状况，化合物的活性强度，服用时间，代谢速率，病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。
具体实施方式：
下面的实施例是本发明优选的说明性优选实施方案，对本发明不构成任何限制。
对于以下全部实施例，可以使用本领域技术人员已知的标准操作和纯化方法。除非另有说明，所有温度以℃(摄氏度)表示。化合物的结构是通过核磁共振(NMR) 或质谱(MS)来确证的。化合物熔点由RY-1型熔点仪测定，温度计未经校正，是以℃给出。1HNMR由日本电子JNM-ECA-400型核磁共振仪测定。质谱由API3000(ESI) 型质谱仪测定。所有反应用溶剂未注明都经标准化预处理。
下面实施例中如无特殊说明，％是指质量百分比。
实施例1：4-[5-[(噻唑基)氨基甲酰基)]萘-2-氧基]-7-甲氧基-6-喹啉甲酰胺的合成(LYD-2-45)
1.1 4-[(2，2-二甲基-4，6-二氧代-1，3-二噁烷-5-亚甲基)氨基]-2-甲氧基苯甲酸甲酯(3)
将50.0g(347.0mmol)丙二酸环(亚)异丙酯、100.0g(942.0mmol)原甲酸三甲酯、125mL 异丙醇加入到250mL三颈瓶中，加热回流搅拌40min。加入25g(138.0mmol)2-甲氧基-4-氨基苯甲酸甲酯继续回流搅拌10min。冷却至室温，过滤，滤饼用***(50mL×2)洗涤，真空干燥，得黄色结晶状固体42.75g，收率92.4％，mp.200～202℃。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δppm：11.22(s，1H)，8.67(s，1H)，7.69(d，J＝8.5Hz，1H)，7.40(d，J＝2.0Hz，1H)， 7.16(dd，J＝8.5，2.1Hz，1H)，3.84(s，3H)，3.76(d，J＝16.9Hz，3H)，1.67(d，J＝17.1Hz，6H)。 ESI-MSm/z：336.1[M+H]+。
1.2 7-甲氧基-4-氧代-1，4-二氢喹啉-6-羧酸甲酯(4)
将20.0g(59.6mmol)1.1的产物(3)、100mL二苯醚加入到250mL圆底烧瓶中，加热至200℃搅拌30min，反应结束后降温至40℃，加入***，搅拌30min。过滤，滤饼用***洗涤，真空干燥，得淡黄色固体(4)12.6g，收率90.5％，mp.243～246℃。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δppm：11.64(s，1H)，8.39(s，1H)，7.83(dd，J＝7.5，5.8Hz，1H)，6.98(s，1H)，5.95(dd，
根据本发明，本发明的药用组合物包括有效剂量的本发明式(I)化合物或其可药用盐或水合物和一种或多种适宜的可药用载体.这里可药用载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物和羊毛脂。
根据本发明，本发明化合物的药用组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，***用药，局部用药，非肠道用药如皮下，静脉，肌内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选口服，腹膜内或静脉内用药方式。另外，为使本发明化合物有效治疗中枢神经***紊乱病症，可优选心室内途径用药以克服化合物可能低的血脑屏障透过率。
当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂，胶囊，水溶液或水悬浮液。其中，片剂一般使用的载体包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂一般使用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。如果需要，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂，芳香剂或着色剂。
当直肠用药时，本发明化合物一般可制成栓剂的形式，其通过将药物与一种适宜的非刺激性赋形剂混合而制得。该赋形剂在室温下呈现固体状态，而在直肠温度下熔化释出药物.这类赋形剂包括可可脂，蜂蜡和聚乙二醇。
当局部用药时，特别是治疗局部外敷容易达到的患面或器官，如眼睛，皮肤或下肠道神经性疾病时，本发明化合物可根据不同的患面或器官制成不同的局部用药制剂形式，具体说明如下：
当眼部局部施用时，本发明化合物可配制成一种微粉化悬浮液或溶液的制剂形式，所使用载体为等渗的一定pH的无菌盐水，其中可加入也可不加防腐剂如氯化苄基烷醇盐.此外对于眼用，也可将化合物制成膏剂形式如凡士林膏.
当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏，洗剂或霜剂制剂形式，其中活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中.这里软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，吐温60，J＝7.5，1.1Hz，1H)，3.85(s，3H)，3.77(s，3H)。ESI-MSm/z：234.2[M+H]+。
1.3 4-氯-7-甲氧基喹啉-6-羧酸甲酯(5)
将5.0g(21mmol)1.2产物(4)、15mL氯化亚砜加入到100mL圆底烧瓶中，氮气保护下回流搅拌1h。减压蒸出氯化亚砜，将所得剩余淡黄色固体加入到200mL饱和碳酸氢钠溶液(含3mL乙酸乙酯)中，搅拌至无气泡冒出，过滤，滤饼用水洗涤，滤饼直接用于下一步反应。
1.4 4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺(6)
将1.3的滤饼(中间体5)、150mL体积分数28％氨水、5mL乙酸乙酯加入到圆底烧瓶中，室温搅拌6h。过滤，滤饼用水洗涤，真空干燥，得淡黄色固体(5)3.86g，收率76.1％，mp.214～ 218℃。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：8.78(d，J＝4.8Hz，1H)，8.46(s，1H)，7.80(s，1H)， 7.89(s，1H)，7.59(s，1H)，7.64(d，J＝4.8Hz，1H)，4.00(s，3H)。ESI-MSm/z：237.0[M+H]+。
1.5 6-磺酸钠-1-萘甲酸(9)
将5.0g(29.04mmol)1-萘甲酸(7)加入50ml的茄型瓶中，常温下将6.0ml浓硫酸加入至茄型瓶中。缓慢升温至115℃恒温3h。TLC监测，反应完全。将反应母液缓慢滴加到30ml水中，冷却至室温后，用饱和NaOH调pH至4左右(溶液颜色由酒红色变为乳白色并伴有大量固体析出)。抽滤，滤饼用少量蒸馏水洗涤，得淡黄色固体，真空干燥得产物5.01g，收率62.7％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：13.16(s，1H)，8.81(d，J＝9.0Hz，1H)，8.27～8.20(m， 2H)，8.15(dd，J＝7.2，1.2Hz，1H)，7.82(dd，J＝9.0，1.8Hz，1H)，7.64～7.53(m，1H)。ESI-MSm/z：257[M-H]-。
1.6 6-羟基-1-萘甲酸(10)
将5.0g(18.25mmol)6-磺酸钠-1-萘甲酸(8)用研钵研磨成细粉状，分成三批。将15.0g (165.0mmol)KOH加入至100ml坩埚中，用电热套加热至300℃左右(KOH熔融)，将研磨好的6-磺酸钠-1-萘甲酸分批加入至坩埚中(加热过程边加入边搅拌)。加入完毕后恒温搅拌10 分钟，停止加热。冷却50℃左右，缓慢加入25.0ml水，坩埚中的液体呈混浊状。然后将坩埚中的液体转移至烧杯中，用浓盐酸调pH至2左右(调节过程中溶液中有大量灰白色固体析出)。抽滤，滤饼用少量水清洗，真空干燥得1.55g灰白色固体，产率44.9％。1H-NMR(400MHz， DMSO-d6)δppm：13.03(s，1H)，9.93(s，1H)，8.72(d，J＝10.1Hz，1H)，8.02～7.76(m，2H)，7.45(dd， J＝8.1，7.3Hz，1H)，7.30-6.98(m，2H)。ESI-MSm/z：257[M-H]-。
1.7 6-(6-氨基甲酰基-7-甲氧基喹啉-4-基氧基)-1-萘甲酸(11)
将6-羟基-1-萘甲酸(10)(1.08g，5.74mmol)、碳酸铯(5.2g，16.02mmol)、DMF(11.0ml)依次加入至茄型瓶(氮气保护)中，常温搅拌10min。然后将4-氯-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺(5) (0.8g，3.39mmol)加入至茄型瓶中，常温搅拌10min后缓慢升温至75℃，恒温反应5h，TLC 监测反应完全后，将反应液冷却至室温，加入20.0ml蒸馏水，用饱和NaHCO3调节pH至4～5，有大量固体析出。抽滤，滤饼用少量水洗涤，真空干燥得到白色固体。得1.7g，产率：68.9％。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：9.05(d，J＝9.5Hz，1H)，8.73(s，1H)，8.69(d，J＝5.2Hz， 1H)，8.20(s，1H)，8.18(s，1H)，7.96(d，J＝2.5Hz，1H)，7.90(s，1H)，7.78(s，1H)，7.67(t， J＝5.3Hz，1H)，7.65～7.62(m，1H)，7.56(s，1H)，6.64(d，J＝5.2Hz，1H)，4.05(s，3H)。 ESI-MSm/z：387[M-H]-。
1.9 4-{5-[(4-氟苯基)氨基甲酰基)]萘-2-氧基}-7-甲氧基-6-喹啉甲酰胺的合成
将0.30g(0.77mmol)6-(6-氨基甲酰基-7-甲氧基喹啉-4-基氧基)-1-萘甲酸(11)、0.30gEDCI(1.54mmol)、0.21gHobt(1.54mmol)、DMF(5.0ml)置于茄型瓶中，氮气保护，冰浴条件下搅拌。1h后TLC监测反应完全。然后往茄型瓶中加入2-噻唑胺，加入后撤去冰浴，常温下反应5h，TLC监测反应完全。将50.0ml蒸馏水加入到反应液中搅拌30min，抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤(10.0ml×3)，真空干燥得灰黄色固体，经柱色谱分离(二氯甲烷-甲醇，体积比 20∶1)，得0.07g。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：12.89(s，1H)，8.73(s，1H)，8.70(d，J＝5.2Hz，1H)，8.41(d，J＝9.1Hz，1H)，8.16(d，J＝8.5Hz，1H)，7.98(d，J＝2.7Hz，1H)，7.95～7.88(m， 2H)，7.79(s，1H)，7.76～7.66(m，1H)，7.63(dd，J＝9.3，2.6Hz，1H)，7.59(d，J＝3.6Hz，1H)，7.56 (s，1H)，7.36(d，J＝3.6Hz，1H)，6.64(d，J＝5.2Hz，1H)，4.05(s，3H)。ESI-MS m/z：471.1[M+H]+， 493.1[M+Na]+。
实施例2：4-{5-[(异恶唑基)氨基甲酰基)]萘-2-氧基}-7-甲氧基-6-喹啉甲酰胺(LYD-2-49)
方法同实施例1，经柱色谱分离(二氯甲烷-甲醇，体积比20∶1)，得0.06g。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm：11.74(s，1H)，8.91(d，J＝1.3Hz，1H)，8.74(s，1H)，8.72(d，J＝5.2Hz，1H)， 8.39(d，J＝9.6Hz，1H)，8.14(d，J＝9.5Hz，1H)，7.98(d，J＝2.5Hz，1H)，7.90(s，1H)，7.86(dd，J ＝7.1，0.9Hz，1H)，7.78(s，1H)，7.72～7.65(m，1H)，7.61(dd，J＝8.6，2.1Hz，1H)，7.57(s，1H)， 7.15(s，1H)，6.66(d，J＝5.5Hz，1H)，4.06(s，3H)。ESI-MS m/z：455.1[M+H]+，477.1[M+Na]+。
实施例3：化合物对VEGFR-2激酶活性的抑制作用
1)化合物储液的制备
化合物LYD-2-45和LYD-2-49溶于DMSO，制备成适当浓度的储液。三个月内使用的化合物室温储存于干燥器内，其它的可以在-20℃长期储存。
2)工作液的制备
化合物用DMSO稀释，进行3倍梯度稀释，12个浓度点。起始浓度依据化合物的初筛活性确定，0.05mM，或1mM起等。
3)制备1x kinase buffer
1个体积的5X enzymatic buffer加4个体积的蒸馏水；5mM MgCl2；1mM DTT；1mMMnCl2；
4)激酶VEGFR-2的滴定(100μM ATP，1uMTK-substrate-biotin)
用1x kinase buffer制备5ng/uL的5XVEGFR-2。
用1x kinase buffer对5ng/uL的5XVEGFR-2进行2倍梯度稀释，8浓度点+0。
将步骤b梯度稀释的VEGFR-2加入384实验板中(784075，Greiner)，2ul/well。每孔再加4ul 1x kinase buffer，1000g离心30s。用1X kinase buffer制备5uM的5X TK-substrate-biotin和500μM的5X ATP。
384实验板每孔加2μL的TK-substrate-biotin和2ul的ATP。激酶VEGFR-2的最终起始浓度为1ng/uL；TK-substrate-biotin和ATP的浓度分别为1uM和100μM。1000g 离心30s。封板，室温放置40min。用HTRF detection buffer制备250nM的4X Sa-XL 665。
384实验班每孔加步骤i制备的5μL Sa-XL665和5ul TK-antibody-Cryptate。1000g 离心30s，室温放置60min。
Envision 2104 plate reader读取荧光值。激发光：320nm；发射光：620nm(Cryptate) 和665nm(XL665)。
5)ATP Km值的确定
用1x kinase buffer制备0.156ng/uL的5xVEGFR-2。384实验板中每孔加2μL的 5XVEGFR-2。
384实验板中每孔再加4ul 1x kinase buffer，1000g离心30s。用1X kinasebuffer 制备5uM的5X TK-substrate-biotin。用1x kinase buffer对ATP进行3倍梯度稀释，起始浓度300uM，12浓度点+0。
384实验板每孔加2μL的TK-substrate-biotin(见步骤d)和2ul的ATP(见步骤e)。1000g离心30s。封板，室温放置40min。用HTRF detection buffer制备250nM的4X Sa-XL665。
384实验板每孔加5μL的Sa-XL 665(见步骤i)和5ul的TK-antibody-Cryptate。1000g离心30s，室温放置60min。
Envision 2104 plate reader读取荧光值。激发光：320nm；发射光：620nm(Cryptate) 和665nm(XL665)。
6)化合物的筛选
用Echo550转移上面步骤中制备的10nl化合物稀释液到384实验板中(784075，Greiner)。1000g离心1min。封板。用1x kinase buffer制备0.156ng/uL的5x VEGFR-2。加步骤d稀释的VEGFR-2到上面步骤c的384孔实验板中，2ul/well。1000g离心30s，室温放置10min。用1X kinase buffer制备5uM的5x TK-substrate-biotin和6μM的 5x ATP。加TK-substrate-biotin和ATP到步骤f的384孔实验板中，每孔各2ul。1000g 离心30s。封板，室温放置40min。
用HTRF detection buffer制备250nM的4X Sa-XL 665.
384实验板每孔加5μL的Sa-XL665(见步骤k)和5ul的TK-antibody-Cryptate。1000g离心30s，室温放置60min.
Envision 2104 plate reader读取荧光值。激发光：320nm；发射光：620nm(Cryptate) 和665nm(XL665)。
7)数据分析
A.计算每孔665/620的比值
B.绘制曲线和计算化合物的IC50
用Graphpad 5.0通过nonlinear regression(dose response-variable slope)的方法，对％Inhibition和log of compound concentrations的关系进行拟合。
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*Hill Slope))
X：log of inhibitor concentration
Y：％Inhibition
8)试验结果
表1.受试化合物对VEGFR-2激酶抑制的IC50
Figure BSA0000281702710000101
注：化合物编号为实施例号。
实施例4：LYD-2-45、LYD-2-49对其他酪氨酸激酶的抑制作用
照实施例3方法，测定LYD-245和LYD-2-49(见实施例3)对其他酪氨酸激酶的抑制活性，包括Kit，FGFR1，FGFR2，FGFR3，Flt1，PDGFβ，Met，EGFR，Flt4，PDGFα，Ret。试验结果如表2所示。
实验结果表明，LYD-2-45和LYD-2-49对多种酪氨酸激酶均具有优良的抑制活性，在Kit， FGFR1，FGFR2，FGFR3，Flt1，PDGFβ，Flt4，PDGFα，Ret等酪氨酸激酶中，LYD-2-45和LYD-2-49的抑制活性均优于阳性药Lenvatinib。
表2.受试化合物对Kit，FGFR1等酪氨酸激酶抑制的IC50(μM)
Figure BSA0000281702710000111
实施例5：LYD-2-45、LYD-2-49对肺癌A549裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用
本实施例中的细胞模型选取A549肺癌细胞株，测定LYD-2-45和LYD-2-49对肿瘤细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用。评价方法和结果如下文所述。
1.实验材料和仪器
1.1用于生物活性评价的实验耗材
Figure BSA0000281702710000112
2.实验步骤
胰酶消化对数生长期细胞，细胞计数后重悬于PBS中，将5×106个A549细胞分别接种于4～6周龄大小的雌性BALB/c裸鼠的***垫处(一般选择腋下或腹股沟等血管丰富的部位)，每只裸鼠注射0.1mL细胞悬液，根据不同实验要求可设置每组7只。动物实验给药方案为：溶剂对照，lenvatinib(30mg/kg)LYD-2-45(30mg/kg)，LYD-2-49(30mg/kg)，口服给药，每天给药一次。
从接种时间开始，每隔2天观察和测量肿瘤生长的大小情况，测量肿瘤的最大直径(L) 和最小直径(D)，肿瘤体积大小的计算公式为V＝L×D2×1/2。每隔2天称量裸鼠体重，在最后一次给药24小时后，根据肿瘤体积大小计算抑瘤率TGI(％)＝(Vc-Vt)/(Vc-V0)*100。Vc， Vt和V0分别为初始给药肿瘤体积，给药组肿瘤体积和控制组肿瘤体积，处死小鼠，解剖对皮下移植的肿瘤进行称重。
3.试验结果
如附图1及表3所示，实验结果表明，LYD-2-45和LYD-2-49显著抑制A549移植瘤的生长，同等剂量下，效果优于阳性药Lenvatinib，实验过程中没有出现裸鼠体重降低及其他毒副反应，而Lenvatinib组出现了裸鼠体重下降，表明LYD-2-45和LYD-2-49具有良好的耐受性。
表3.LYD-2-45、LYD-2-49对A549裸鼠异种移植瘤蛋白的抑制作用
Figure BSA0000281702710000121
实施例6：LYD-2-45、LYD-2-49对甲状腺癌8305C裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用
本实施例中细胞模型选取甲状腺癌8305C细胞株，测定LYD-2-45和LYD-2-49对肿瘤细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用。评价方法和结果如下文所述。
1.实验材料和仪器
1.1用于生物活性评价的实验耗材
Figure BSA0000281702710000122
2.实验步骤
方法同实施例5。
3.试验结果
如附图2及表4所示，实验结果表明，LYD-2-45和LYD-2-49显著抑制8305C移植瘤的生长，同等剂量下，效果优于阳性药Lenvatinib。
表4.LYD-2-45、LYD-2-49对8305C裸鼠异种移植瘤的抑制作用
Figure BSA0000281702710000123
实施例7：LYD-2-45、LYD-2-49对肝癌HepG2裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用
本实施例中细胞模型选取肝癌HepG2细胞株，测定LYD-2-45和LYD-2-49对肿瘤细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用。评价方法和结果如下文所述。
1.实验材料和仪器
1.1用于生物活性评价的实验耗材
Figure BSA0000281702710000131
2.实验步骤
方法同实施例5。
3.试验结果
如附图3及表5所示，实验结果表明，LYD-2-45和LYD-2-49显著抑制肝癌HepG2移植瘤的生长，同等剂量下，效果优于阳性药Lenvatinib，实验过程中没有出现裸鼠体重降低及其他毒副反应，表明LYD-2-45和LYD-2-49具有良好的耐受性。
表5.LYD-2-45、LYD-2-49对肝癌HepG2裸鼠异种移植瘤蛋白的抑制作用
Figure BSA0000281702710000132
实施例8：LYD-2-45、LYD-2-49对肝癌SMMC-7721裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用
本实施例中的细胞模型选取肝癌SMMC-7721细胞株，测定LYD-2-45和LYD-2-49对肿瘤细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用。评价方法和结果如下文所述。
1.实验材料和仪器
1.1用于生物活性评价的实验耗材
Figure BSA0000281702710000141
2.实验步骤
方法同实施例5。
3.试验结果
如附图4及表5所示，实验结果表明，LYD-2-45和LYD-2-49显著抑制肝癌SMMC-7721移植瘤的生长，同等剂量下，效果优于阳性药Lenvatinib，实验过程中没有出现裸鼠体重降低及其他毒副反应，而Lenvatinib组出现了裸鼠体重下降，表明LYD-2-45和LYD-2-49具有良好的耐受性。
表5.LYD-2-45、LYD-2-49对肝癌SMMC-7721裸鼠异种移植瘤蛋白的抑制作用
Figure BSA0000281702710000142
实施例9：LYD-2-45、LYD-2-49对肾癌786-O裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用
本实施例中的细胞模型选取肾癌786-O细胞株，测定LYD-2-45和LYD-2-49对肿瘤细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用。评价方法和结果如下文所述。
1.实验材料和仪器
1.1用于生物活性评价的实验耗材
Figure BSA0000281702710000143
Figure BSA0000281702710000151
2.实验步骤
方法同实施例5。
3.试验结果
如附图5及表6所示，实验结果表明，LYD-2-45和LYD-2-49显著抑制肾癌786-O移植瘤的生长，同等剂量下，效果优于阳性药Lenvatinib。
表6.LYD-2-45、LYD-2-49对肾癌786-O裸鼠异种移植瘤蛋白的抑制作用
Figure BSA0000281702710000152
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
附图说明：
图1为LYD-2-45、LYD-2-49对肺癌A549裸鼠异种移植瘤的抑制作用效果图
图2为LYD-2-45、LYD-2-49对甲状腺癌8305C裸鼠异种移植瘤的抑制作用效果图
图3为LYD-2-45、LYD-2-49对肝癌HepG2裸鼠异种移植瘤的抑制作用效果图
图4为LYD-2-45、LYD-2-49对肝癌SMMC-7721裸鼠异种移植瘤的抑制作用效果图
图5为LYD-2-45、LYD-2-49对肾癌786-O裸鼠异种移植瘤的抑制作用效果图。

Claims (9)

1.式I所示的化合物，或其水合物，溶剂化物，可药用盐，或包含上述化合物的药用组合物。
Figure FSA0000281702700000011
其中，R为无取代五元杂环，该五元杂环中包括1-4个选自O，S，N，Se的杂原子。
2.根据权利要求1所述的化合物，式I中R优选如下结构：
Figure FSA0000281702700000012
3.权利要求1-2任一项的化合物、其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物，其化合物选自，但不局限如下化合物：
Figure FSA0000281702700000013
4.权利要求1-3任一项所述的化合物制备方法。
5.药物组合物，其中至少包括一种权利要求1任一项所述的化合物、其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。所述的药用载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。
6.权利要求1-3任一项所述的化合物、其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物或者权利要求3所述的药物组合物用于制备治疗和/或预防与酪氨酸激酶/酪氨酸激酶受体通路有关疾病的药物中的应用。所述的疾病包括：动脉粥样硬化或肺纤维化、视网膜病、子宫内膜异位症、关节炎和癌症等。
7.权利要求1-3任一项所述的化合物、其药学可接受的盐、溶剂合物、水合物或者权利要求3所述的药物组合物用于制备治疗和/或预防与VEGF/VEGFR通路有关疾病的药物中的应用。所述的疾病包括：动脉粥样硬化或肺纤维化、视网膜病、子宫内膜异位症、关节炎和癌症等。
8.权利要求7～8所述的在治疗癌症疾病中的应用，所述癌症疾病为胃癌、口腔癌、食道癌、甲状腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、大肠癌、肾癌、骨肉瘤、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤中的一种或几种。
9.根据权利要求5～8任一项所述的药物，及其可以适宜的途径进行给药。所述的适宜途径如口服、舌下、直肠、胃肠外、注射(皮内、皮下、肌肉、静脉、动脉注射)、肺、鼻、舌、颊、皮肤、粘膜、结膜、局部给药或以植入物的形式给药。
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