JP6890549B2

JP6890549B2 - 間葉系幹細胞の製造方法

Info

Publication number: JP6890549B2
Application number: JP2017554198A
Authority: JP
Inventors: 謙一田原; 育衛糠谷; 美津子出野; 沙織山口; 峰野　純一; 純一峰野
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2015-12-03
Filing date: 2016-12-02
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2036-12-02
Also published as: JPWO2017094879A1; KR20180083934A; WO2017094879A1; EP3385368A1; US20180362933A1; EP3385368A4; CN108495924A; EP3385368B1

Description

本発明は、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ：ＭＳＣ）の製造方法に関し、その中でも特に脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ：ＡＳＣ又はＡＤＳＣ）の製造方法に関する。本発明はまた、前記方法により得られる間葉系幹細胞、当該細胞を有効成分として含有する再生医療用の組成物に関する。

間葉系幹細胞とは、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞であり、間葉系に属する細胞への分化能をもつため、骨や血管、心筋の再構築などの再生医療への応用が期待されている。更に、発生学、分子生物学、薬学分野における研究ツールとしても利用可能性を有している。ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、血液、胎盤、臍帯、歯髄等、種々の組織から取得できることが知られているが、採取する組織により特性が異なるため、採取する組織ごとに骨髄由来幹細胞や脂肪由来幹細胞などとも呼ばれる。

従来、間葉系幹細胞は骨髄から採取されていたが、骨髄中には間葉系幹細胞は少量しか存在せず、また高齢になるにつれて間葉系幹細胞の数が減少するため、臨床応用を視野に入れると、十分な細胞数を得るために全身麻酔下で数百ｍＬもの骨髄を採取しなければならない場合が想定され、患者への負担が大きい。一方、皮下脂肪には間葉系幹細胞が豊富に存在し、局部麻酔の脂肪吸引により簡便に取得できるため、患者への負担は小さく、近年では脂肪由来幹細胞を用いた臨床研究が多くなっている。

一般的に行われている脂肪由来幹細胞の取得方法では、ヒトから採取した少量の脂肪片を酵素処理して得られる細胞集団から、遠心分離によって沈降性の間質血管画分（ｓｔｒｏｍａｌｖａｓｃｕｌａｒｆｒａｃｔｉｏｎ：ＳＶＦ）を分離し、ウシ血清を含む培地中で継代培養することによって増殖させる（非特許文献１）。しかし、動物由来成分であるウシ血清の使用は、臨床応用を視野に入れたときに大きな問題となる。

ティシューエンジニアリング（ＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、２００１年、第７巻、第２号、２１１−２１８頁

本発明は、このような従来の間葉系幹細胞の製造方法が有していた問題を解決しようとするものであり、異種由来成分を含まない培地で、短期間に大量の間葉系幹細胞を製造する方法を提供することを目的とするものである。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、間葉系幹細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養する工程を包含することで、異種由来成分不含培地で短期間に大量の間葉系幹細胞が製造されることを見出し、本発明を完成させた。

本発明を概説すれば、本発明は
［１］間葉系幹細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養する工程を包含する、間葉系幹細胞の製造方法、
［２］フィブロネクチンフラグメントが、細胞接着ドメイン及びヘパリン結合ドメインからなる群より選択される少なくとも一つのドメインを有するフラグメントであることを特徴とする、［１］に記載の製造方法、
［３］フィブロネクチンフラグメントの存在下で培養する工程が、フィブロネクチンフラグメントがコートされた固相と接触した状態で培養する工程であることを特徴とする、［１］に記載の製造方法、
［４］培養する工程が、異種由来成分不含培地で培養する工程であることを特徴とする、［１］に記載の製造方法、
［５］異種由来成分不含培地が、無血清培地又は同種血清を含有する培地であることを特徴とする、［４］に記載の製造方法、
［６］細胞集団が、ヒト由来の細胞集団であることを特徴とする、［１］に記載の製造方法、
［７］細胞集団が、生体組織より直接分離した細胞集団であることを特徴とする、［６］に記載の製造方法、
［８］生体組織が、脂肪組織、骨髄、血液、胎盤、臍帯、歯髄から選択されることを特徴とする、［７］に記載の製造方法、
［９］細胞集団が、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞から分化・誘導された間葉系幹細胞であることを特徴とする、［６］に記載の製造方法、
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の方法で得られる間葉系幹細胞、
［１１］［１０］に記載の細胞を有効成分として含有する治療用組成物、
［１２］［１］〜［９］のいずれかに記載の方法で得られる間葉系幹細胞を分化させる工程を包含する、間葉系に属する細胞の製造方法、
［１３］分化させる工程が、間葉系幹細胞から他の細胞への分化を誘導する分化誘導剤を含有する培地で培養する工程であることを特徴とする、［１２］に記載の製造方法、
に関する。

本発明により、異種由来成分不含培地で短期間に大量の間葉系幹細胞を製造することが可能となる。

実施例１における、培養８日目の顕微鏡像を示す。（左）条件Ａ、（中央）条件Ｂ、（右）条件Ｃ実施例２における、培養日数と回収時の細胞数を示す。実施例４における、間葉系幹細胞から各種細胞への分化を示す。

定義等：
本明細書において「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ：ＭＳＣ）」とは、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞である。
間葉系幹細胞は、例えばＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５のような特異的な細胞表面マーカーを発現することが知られている。これらのマーカーの発現を免疫学的方法（抗体による検出）等で調べることにより、出発材料とする試料、あるいは最終的に得られた細胞集団中の間葉系幹細胞を検出・定量することができる。

本明細書において「脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ：ＡＤＳＣ又はＡＳＣ）」とは、脂肪組織に含まれる幹細胞である。脂肪由来幹細胞は間葉系幹細胞のひとつであり、間葉系幹細胞と同様の分化能を保持する。

本明細書において「同種」とは、生物又はそれが有する遺伝子等について、基準となる種と同じ種に由来することをいう。同種には、同系及び自己が包含される。

本明細書において「異種」とは、生物又はそれが有する遺伝子等について、基準となる種と異なる種に由来することをいう。

本明細書において「異種由来成分不含（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）」とは、基準となる種と異なる種由来の成分が入っていないことをいう。

以下に本発明について詳細に説明する。
（１）本発明の間葉系幹細胞の製造方法
＜間葉系幹細胞を含有する細胞集団＞
本発明の間葉系幹細胞の製造方法は、間葉系幹細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養する工程を包含する。以下では、「間葉系幹細胞を含有する細胞集団」について詳述する。

「間葉系幹細胞を含有する細胞集団」とは、間葉系幹細胞を有する細胞集団であれば特に限定はない。

使用される細胞の生物由来は特に限定されず、任意の生物、好ましくは哺乳動物に由来し得る。生物の年齢、性別は特に限定されない。１つの実施形態において、霊長目（例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が使用される。最も好ましくは、ヒト由来の細胞が使用されるが、本発明はそれに限定されない。ヒトへの投与を目的として本発明の方法により間葉系幹細胞を製造する場合、好ましくはレシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された細胞集団が材料とされる。より好ましくはレシピエント自身より採取された細胞集団が間葉系幹細胞の製造に供される。

「間葉系幹細胞を含有する細胞集団」は間葉系幹細胞を含有する生体組織から直接分離した初代細胞であってもよいし、また、樹立された間葉系幹細胞株、胚性幹細胞や人工多能性幹細胞から分化・誘導された間葉系幹細胞であってもよく、これらを凍結保存したものでもよい。ここで、「直接」とは、生体外での培養／増殖を行う工程を介さないことをいう。

上記間葉系幹細胞を含有する生体組織としては、骨髄、脂肪組織、血液、胎盤、臍帯、歯髄等が例示される。脂肪組織は脂肪吸引または脂肪組織切除で採取でき、個体に与える機能障害のおそれが小さいことから、上記細胞集団の採取源として好適である。

脂肪組織とは、脂肪細胞により構成される生体組織の一種である。本発明で使用される脂肪組織の部位は特に限定されないが、皮下脂肪、内臓脂肪、筋肉内脂肪、筋肉間脂肪が例示される。この中でも皮下脂肪は局所麻酔下で簡単に採取できるため、採取の際のドナーへの負担が少なく、好ましい細胞源といえる。

脂肪組織の調製方法は特に限定されず、美容整形の際の脂肪吸引手術により吸引される組織片や、外科手術などの際に生体から切除される組織に含まれる切除脂肪組織から調製することができる。脂肪由来幹細胞は太い血管の周囲に存在するため脂肪吸引液よりも切除脂肪組織から多く得ることができる。一方、脂肪吸引液から幹細胞を調製したほうが、手術跡が小さく済みドナーの負担が小さい。

なお、通常は一種類の脂肪組織を用いるが、二種類以上の脂肪組織を併用することも可能である。また、複数回に分けて採取した脂肪組織を混合し、使用してもよい。

脂肪組織の採取量は、ドナーの種類や組織の種類、或いは必要とされる間葉系幹細胞の量を考慮して定めることができる。特に本発明を限定するものではないが、０．３〜２０ｇの脂肪組織から間葉系幹細胞を得ることができる。スケールアップや複数回に分けて操作を行うことにより、さらに多量の脂肪組織を出発材料とすることもできる。

採取した脂肪組織は、必要に応じてそれに付着した血液成分の除去及び細片化を経た後、以下の酵素処理（プロテアーゼ処理）に供される。なお、脂肪組織を適当な緩衝液や培養液中で洗浄することによって血液成分を除去することができる。

酵素処理は、脂肪組織をコラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ等のプロテアーゼによって消化することにより行う。このような酵素処理は当業者に既知の手法及び条件により実施すればよい（例えば、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，４ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＡＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｅｓＩｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ参照）。好ましくは、後述の実施例に記載の手法及び条件によって酵素処理を行う。

酵素処理された脂肪組織は、２つの主要な細胞集団、間質血管画分と成熟脂肪細胞とを含む。間質血管画分は、前脂肪細胞、成熟内皮細胞、内皮前駆細胞、血管平滑筋細胞、周皮細胞、壁細胞、マクロファージ、線維芽細胞、および脂肪由来幹細胞からなる細胞混合物である。脂肪由来幹細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞などに容易に分化できる間葉系幹細胞である。細胞集団を構成する細胞の種類や比率などは、使用した脂肪組織の由来や種類に依存する。

酵素処理された脂肪組織は続いて遠心処理に供され、２つの細胞集団は相互に分離される。遠心処理による沈殿物を沈降細胞集団（前記の間質血管画分を含む）として回収する。遠心処理の条件は、細胞の種類や量によって異なるが、例えば１〜１５分間、３００〜２０００×ｇである。なお、遠心処理に先立ち、酵素処理後の細胞集団を濾過等に供し、その中に含まれる酵素未消化組織等を除去しておくことができる。濾過には例えば孔径５０〜２０００μｍ、好ましくは孔径１００μｍのフィルターを使用すればよい。本発明においては、間質血管画分を「間葉系幹細胞を含有する細胞集団」として使用することができる。

＜フィブロネクチンフラグメント＞
フィブロネクチンは動物の血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量約２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。そのドメイン構造は７つに分けられており、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列はＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型と呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型はアミノ酸残基７１〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７〜４０％である。フィブロネクチン中には１４個のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０と称する）は細胞接着ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。ＩＩＩ−１０にはインテグリンα_５β_１（ＶＬＡ−５ともいう）に対して結合活性を有する領域が含まれており、このコア配列はＲＧＤである。また、フィブロネクチンのＣ末端側寄りの部位にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ここはＣＳ−１と呼ばれる２５アミノ酸からなる配列が含まれており、当該配列はインテグリンα_４β_１（ＶＬＡ−４ともいう）に対して結合活性を示す。

ＩＩＩ−８〜ＩＩＩ−１４及びＣＳ−１のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１〜７及び８として、本明細書の一部である配列表に示す。本発明には、間葉系幹細胞の培養に適した性質を有する限りにおいて、任意のフィブロネクチンフラグメント、例えば前記のアミノ酸配列から選択される１又は複数のアミノ酸配列を含有するフィブロネクチンフラグメントを使用することができる。

フィブロネクチンフラグメントとして、分子内に細胞接着ドメインやヘパリン結合ドメインを有するフラグメントが多数知られている［例えば、ジャーナルオブバイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、２８４−２９１頁（１９９１）］。

本発明で使用されるフィブロネクチンフラグメントは、特に限定はされないが、例えば、細胞接着ドメイン（ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、及びＩＩＩ−１０）及びヘパリン結合ドメイン（ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、及びＩＩＩ−１４）からなる群より選択される少なくとも一つのドメインを有するものが挙げられる。

本明細書において、フィブロネクチンフラグメントは、上記のフィブロネクチンの機能的なドメイン、すなわち、細胞接着ドメインまたはヘパリン結合ドメイン、を包含するものであればよく、フィブロネクチンの連続したアミノ酸配列の一部からなるものでなくてもよい。フィブロネクチンフラグメントは、天然から得られたフィブロネクチンの酵素消化による断片化、又は組換えＤＮＡ技術により製造することができる。不純物の除去に関する労力の点、および酵素認識部位などに左右されず目的とするフラグメントを設計・取得できる点で、組換えフィブロネクチンフラグメントは本発明に好適である。組み換え体の製造、あるいは、取扱いの点で、本発明で使用されるフィブロネクチンフラグメントの分子量は１００ｋＤａ以下が望ましい。

細胞接着ドメインとヘパリン結合ドメインの両方を有するフィブロネクチンフラグメントの一例として、レトロネクチン（登録商標）（タカラバイオ株式会社製）が挙げられる。レトロネクチンは前出のジャーナルオブバイオケミストリーにＣＨ−２９６として記載されている。レトロネクチンは、細胞接着ドメイン（ＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、およびＩＩＩ−１０）、ヘパリン結合ドメイン（ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、およびＩＩＩ−１４）およびＣＳ−１を含む、分子量約６３０００（５７４アミノ酸残基）の組換えタンパク質である。レトロネクチンのアミノ酸配列を、配列番号９として、本明細書の一部である配列表に示す。

なお、本明細書におけるフィブロネクチンフラグメントにはアセチル化などのタンパクの化学修飾体なども包含される。また、本発明における間葉系幹細胞の製造では、フィブロネクチンフラグメントの単一の分子種の他、複数の分子種を混合して使用してもよい。

またこれらのフィブロネクチンフラグメントと機能的に同等な物質、例えば、細胞接着ドメイン及び／又はヘパリン結合ドメインを有する物質も使用することができる。また、フィブロネクチンフラグメントの誘導体等も使用することができる。

本発明におけるフィブロネクチンフラグメントの存在下での培養は、間葉系幹細胞を含有する細胞集団とフィブロネクチンフラグメントとが接触するいずれの方法で実施してもよい。例えば、フィブロネクチンフラグメントを培地中に溶解させて培養に供してもよく、またはフィブロネクチンフラグメントを固相に固定化して、該固相を培養に用いてもよい。本発明の好適な態様では、間葉系幹細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンフラグメントがコートされた固相と接触した状態で培養する工程を包含する。以下では、「フィブロネクチンフラグメントがコートされた固相」について詳述する。

本発明の好適な態様において、前記のフィブロネクチンフラグメントは適切な固相、例えば細胞培養に使用される容器又は担体（マイクロビーズ等）にコートされた状態で使用される。培養容器は、細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる素材、形状のものを用いることが出来る。培養容器の素材としては、例えばガラス、不織布を含む合成樹脂や天然樹脂又は金属等がある。また、培養容器の形状としては、三角柱、立方体、直方体などの多角柱や円柱、三角錐、四角錐などの多角錘や円錐、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円形、楕円形、半円形等がある。市販の培養フラスコ、培養皿（培養ディッシュ）、培養バッグ、中空糸型の培養装置などを用いる事も出来る。

なお、培養バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができるが、得られた間葉系幹細胞のヒトへの投与等を目的とする場合には、閉鎖系で培養を実施することが好ましい。

固相表面へのフィブロネクチンフラグメントのコーティングは、公知の手法によって実施すればよく、例えば、フィブロネクチンフラグメントを滅菌蒸留水、緩衝液あるいは生理食塩水等に溶解した状態でコーティングに使用することができる。好適には、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）にフィブロネクチンフラグメントを溶解させる。

本発明において使用されるフィブロネクチンフラグメントの量は、特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。例えば、フィブロネクチンフラグメントとしてレトロネクチンを使用する場合、例えば終濃度２０μｇ／ｍＬのレトロネクチンを含むＰＢＳを培養容器に添加し、室温で１時間インキュベートすることにより、コーティングを実施することができる。

フィブロネクチンフラグメントがコートされた容器は、使用時まで低温、例えば４℃で保存することができる。使用直前にはこれらの培養器材からフィブロネクチンフラグメント含有溶液を吸引除去し、ＰＢＳで１回、次いで各細胞培養用培地で１回洗浄してから細胞培養に供する。

＜培養＞
本発明の間葉系幹細胞の製造方法において「間葉系幹細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養する工程」は、間葉系幹細胞の単離培養工程、または間葉系幹細胞の拡大培養工程、または間葉系幹細胞の単離培養および間葉系幹細胞の拡大培養の両方を含む工程である。したがって、本発明の間葉系幹細胞の製造方法は、「間葉系幹細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養する工程」を包含する間葉系幹細胞の単離培養方法、または「間葉系幹細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養する工程」を包含する間葉系幹細胞の拡大培養方法であってもよい。本発明の好適な態様では、間葉系幹細胞の単離培養、並びに単離培養した間葉系幹細胞の拡大培養、の２段階の工程により、間葉系幹細胞を取得する方法が例示される。以下では、これらの工程について詳述する。

（ｉ）間葉系幹細胞の単離培養
本工程は、間葉系幹細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養することにより、目的の間葉系幹細胞を選択的に増殖させる。

本工程における培地は、通常の動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。好適には、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ又はｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）やヒツジ血清などの異種由来成分を含まない培地が挙げられる。このような異種由来成分不含（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）培地は適宜調製することができるが、公知の培地や市販の培地をそのまま、あるいは改変して使用してもよい。市販の異種由来成分不含培地としては、例えばＤＥＦ−ＣＳ５００ＸＦ（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社製）、ＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を使用することができる。

生体への投与を目的として自己の組織から間葉系幹細胞を製造する場合、培地は、同種血清を含有するものであってもよいし、あるいは無血清培地でもよい。好適な例としては、異種由来成分を含まない同種血清含有または無血清培地が挙げられる。同種血清は、自己血清が好ましい。ここで自己血清、並びに後述の自己血漿とは、培養される細胞集団と同一のドナーより採取された血液から得られた血清および血漿をそれぞれ意味する。

血漿は血清の成分を含有していることから、自己血漿を含有する培地を使用してもよい。好ましくは非働化した自己血漿が培地に添加される。例えば、１０％（Ｖ／Ｖ）以下、好ましくは５％（Ｖ／Ｖ）以下、さらに好ましくは２％（Ｖ／Ｖ）以下の非働化した自己血漿を含む培養液中で細胞を培養する。自己血漿を使用することによって、製造工程中から異種由来成分を排斥し、安全性が高い細胞の製造方法が提供される。

細胞の培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養条件を採用できる。前記培養条件として、温度３７℃、湿度９５％、ＣＯ_２濃度５％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。例えば、温度３０〜４０℃、湿度９０〜９８％、ＣＯ２濃度３〜７％、での培養が例示されるが、所望の細胞の増殖が達成できる温度であれば前記の範囲以外の温度、湿度、ＣＯ_２濃度で実施してもよい。培養中は適切な間隔で有効成分を含有する培地の交換を実施することが好ましい。

本発明の好適な態様において、間質血管画分はフィブロネクチンフラグメントがコートされた容器中で５％自己血漿が添加された異種由来成分不含培地を使用し、３〜４日毎に培地交換を行いながら、例えば４〜１４日間、好ましくは７〜１０日間培養される。この培養により、間葉系幹細胞を選択的に増殖させることができる。すなわち、この培養で得られた細胞集団の８０％以上、好ましくは９０％以上が間葉系幹細胞である。

単離培養における培養開始時の細胞濃度としては、特に限定はないが、例えば０．１〜１０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には０．３〜５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には０．５〜２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。

（ｉｉ）間葉系幹細胞の拡大培養
本工程は、間葉系幹細胞を、フィブロネクチンフラグメントの存在下で拡大培養することにより、間葉系幹細胞を大量に増殖させる。本工程の培養に供される間葉系幹細胞としては、いずれかの方法によって単離された間葉系幹細胞または間葉系幹細胞を含む細胞集団、例えば、前記工程（ｉ）で単離培養された間葉系幹細胞、または樹立された間葉系幹細胞株、胚性幹細胞や人工多能性幹細胞から分化・誘導された間葉系幹細胞が挙げられる。

前記工程（ｉ）で単離培養された間葉系幹細胞を培養容器から分離する方法としては、当該分野で通常行われる方法を用いればよく、例えば、物理的方法、キレート剤を用いる方法、プロテアーゼ活性及び／又はコラゲナーゼ活性を有する分離液（例えばＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）及びＡｃｃｕｍａｘ（登録商標）等）を用いる酵素的方法やそれらの組合せが挙げられる。好ましくは、酵素的方法で間葉系幹細胞のシートを解離した後、物理的に細かく細胞を分散させる方法である。ここで、用いる細胞は、使用した培養容器に対して７０〜９５％コンフルエントになるまで培養された細胞であることが好ましく、さらに好ましくは８０〜９０％コンフルエントになるまで培養された細胞である。

分離した細胞集団は、そのままもしくは凍結保存したもののいずれも使用することができる。さらに、前記の細胞集団より特定の細胞表面マーカーに基づいて分離された細胞のサブセット、例えば単離された間葉系幹細胞を本工程に使用することもできる。

本工程における培地および培養条件は、前記工程（ｉ）について記載されたのと同様である。本工程は、前記工程（ｉ）と同じ培地・容器・培養条件で実施してもよく、または前記工程（ｉ）とは異なる培地・容器・培養条件で実施してもよい。前記工程（ｉ）に記載された培養と同様に、好適には異種由来成分を含まない培地が使用され、任意の異種成分不含培地、例えば公知の培地や市販の培地をそのまま、あるいは改変して使用してもよい。

本発明の好適な態様において、単離培養された間葉系幹細胞はフィブロネクチンフラグメントがコートされた容器中で、血清が添加されていない異種由来成分不含培地を使用し、３〜４日毎に培地交換を行いながら、適宜継代し、例えば４〜１４日間、好ましくは６〜１２日間拡大培養される。この培養により、間葉系幹細胞を大量に増殖させることができる。すなわち、この培養による増殖倍率は１００倍以上、好ましくは３００倍以上である。

拡大培養における培養開始時の細胞濃度としては、特に限定はないが、例えば０．１〜１０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には０．３〜５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には０．５〜２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。

（２）本発明の方法で得られる間葉系幹細胞
上記の、本発明の間葉系幹細胞の製造方法により、間葉系幹細胞又は間葉系幹細胞を含有する細胞集団を得ることができる。

本発明の方法で得られる間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞に特徴的な分子、例えば酵素、レセプター、低分子化合物等を検出して確認することができる。間葉系幹細胞に特徴的な分子としては、細胞表面マーカー（ポジティブマーカー）であるＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、間葉系幹細胞には発現していないネガティブマーカーとしてＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４等が知られており、間葉系幹細胞であることの確認に利用することができる。前記の分子の検出には免疫学的方法を利用できるが、各分子のｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。

本発明の方法で得られる間葉系幹細胞を含有する細胞集団は、例えば、該細胞集団の８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上が上記ポジティブマーカーを発現している。また、本発明の方法で得られる間葉系幹細胞を含有する細胞集団におけるネガティブマーカーの発現率は、例えば５％以下、好ましくは１％以下、さらに好ましくは検出限界以下である。

間葉系幹細胞に特徴的な分子を認識する抗体は、本発明により得られた間葉系幹細胞を単離、精製するうえでも有用である。本発明は、間葉系幹細胞に特徴的な分子に基づき間葉系幹細胞を単離、分離、精製した細胞集団を包含する。

本発明で得られる間葉系幹細胞は、例えば間葉系幹細胞の分化に関する研究や種々の疾患に関する医薬スクリーニング、医薬候補化合物の効能・安全性評価等に使用することもできる。本発明によれば、一度の操作で多くの間葉系幹細胞を取得することができることから、これまでのように細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能となる。

（３）本発明の治療用組成物
上記の、本発明の方法で得られる間葉系幹細胞を有効成分として含有する治療用組成物を調製することができる。

本発明の方法により得られる間葉系幹細胞ならびに当該細胞を含有する組成物は、骨疾患、軟骨疾患、心疾患、脊髄損傷、移植片対宿主病等の疾患の治療に有用である。本発明により得られた間葉系幹細胞を使用して、種々の疾患の治療のための医薬用組成物を製造することができる。

本発明の間葉系幹細胞を医薬用の組成物とする場合には、常法により、当該細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。

（４）本発明の間葉系に属する細胞の製造方法
本発明の方法で得られる間葉系幹細胞を、他の細胞への分化を誘導する分化誘導剤を含有する培地で培養することにより、間葉系幹細胞から分化して生じることが知られている各種の細胞、すなわち間葉系に属する細胞を得ることができる。

本発明の方法で得られる、間葉系に属する細胞には特に限定はなく、脂肪細胞（褐色脂肪細胞、白色脂肪細胞）、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、筋細胞等が例示される。間葉系に属する種々の細胞について、間葉系幹細胞から分化誘導する方法が知られている。例えば、脂肪細胞についてはデキサメサゾン、インシュリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン等が、骨細胞についてはデキサメサゾン、アスコルビン酸又はアスコルビン酸−２−リン酸、β−グリセロリン酸等が、骨芽細胞についてはハイドロコルチゾン、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸等が、軟骨細胞についてはインスリン、アスコルビン酸−２−リン酸、ハイドロコルチゾン等が、それぞれ分化誘導剤として知られている。間葉系幹細胞にこれらの分化誘導剤を接触させることにより、所望の細胞を得ることができる。

上記のような分化誘導培地は適宜調製することができるが、公知の培地や市販の培地をそのまま、あるいは改変して使用してもよい。市販の分化誘導培地として、例えば、脂肪細胞への分化はｈＭＳＣｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔＫｉｔｓ−ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ培地（ロンザ社製）、骨芽細胞への分化はｈＭＳＣｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔＫｉｔｓ−ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ培地（ロンザ社製）、軟骨細胞への分化はｈＭＳＣｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔＫｉｔｓ−ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ培地（ロンザ社製）を使用することができる。

また、上記の方法により得られた間葉系に属する細胞も、医薬用の組成物とすることができる。この場合も、目的や投与の方法に応じて適切な組成、形態が選択される。さらにこれらの間葉系に属する細胞を、医薬候補化合物のスクリーニングや化合物の安全性評価に使用することもできる。

以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されない。

実施例１脂肪由来幹細胞の単離培養
（１）自己血漿の分離
インフォームド・コンセントの得られたヒト健常人ドナーより採血用注射筒にて採取した血液を５００×ｇで２０分間遠心し、血漿を回収した。回収した血漿は５６℃で３０分間の非働化後、４℃で３０分間冷却し、８００×ｇで３０分間遠心分離し、その上清を非働化自己血漿として使用した（以下自己血漿と略す）。

（２）間質血管画分（ｓｔｒｏｍａｌｖａｓｃｕｌａｒｆｒａｃｔｉｏｎ：ＳＶＦ）の分離
実施例１−（１）の健常人ドナーより採取した脂肪組織を生理食塩水中で保管した。安全キャビネット内で脂肪組織を１０ｃｍ培養ディッシュに取出し、滅菌ハサミによって一辺１〜２ｍｍの立方体になるように組織を細断した。新しい１０ｃｍ培養ディッシュを秤量計に載せて、細断した脂肪組織を１５ｇ測り取った。この組織１ｇに対して３ｍＬの２ｍｇ／ｍＬＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＴｙｐｅＩ／ＨＢＳＳ溶液を加え、組織を懸濁した。この懸濁液を恒温槽内で１００ｒｐｍ／分の条件で振盪させながら３７℃で１時間保温した。遠心チューブを安全キャビネットに搬入し、１００μｍメッシュを通じて濾過した懸濁液を遠心チューブに回収した。懸濁液を２５℃、１２００×ｇ、１０分間の条件で遠心分離を行い、電動ピペッターを用いて慎重に上清を取り除いた。沈殿物に１０〜２０ｍＬのＡＣＫｌｙｓｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（ＬＯＮＺＡ社製）を加えて懸濁し、室温で５分間静置した後、２５℃、４００×ｇ、５分間の条件で遠心分離を行った。電動ピペッターを用いて遠心後の試料から慎重に上清を取り除き、得られた沈殿に適量のＰＢＳを加えて懸濁し、間質血管画分を得た。

（３）レトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ：ＲＮ）によるコーティング
以下の実験で使用する培養器材にＲＮをコートした。すなわちＴ−２５培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）にレトロネクチン（登録商標）（タカラバイオ社製）（終濃度２０μｇ／ｍＬ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を５ｍＬ添加した。対照として、レトロネクチン（以下、ＲＮと略す）を含まないＰＢＳを添加した群も設定した。
これらの培養器材を室温で１時間インキュベートした後、使用時まで４℃で保存した。使用直前にはこれらの培養器材からＰＢＳを吸引除去後、ＰＢＳで１回、次いで各細胞培養用培地で１回洗浄し培養に供した。ＲＮがコートされた培養フラスコは、以下、ＲＮフラスコと記載する。

（４）間質血管画分の培養
実施例１−（２）で得られた間質血管画分から一部検体を採取し、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ社製）により全有核細胞濃度を計測した。この後、１×１０^５全有核細胞／ｍＬとなるように培養用培地（表１の基礎培地及び添加物）を添加し、細胞懸濁液を調製した。この後、実施例１−（３）で準備したＲＮフラスコ又は対照フラスコに１０ｍＬの細胞懸濁液を添加し、３７℃、ＣＯ_２濃度５％で培養を開始した（培養０日目）。培養開始後１日目に培地を新鮮培地に交換し、以降、細胞が８０〜９０％コンフルエントに達するまで３〜４日／回の頻度で培地交換を行った。

培養に用いた基礎培地、添加物、ＲＮコーティングの有無、及び８０〜９０％コンフルエントに達するまでに費やした培養日数と回収時の細胞数を表１に示す。また、培養８日目の顕微鏡像を図１に示す。

表１及び図１で示されるように、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ（条件Ａ、従来法）を５％自己血漿が添加されたＤＥＦ−ＣＳ５００ＸＦ（条件Ｂ）に変更した場合、細胞がコンフルエントな状態に達することはなかった。一方、５％自己血漿が添加されたＤＥＦ−ＣＳ５００ＸＦを用いてＲＮフラスコで培養した場合（条件Ｃ）には、細胞の増殖率は従来法（条件Ａ）を大きく上回り、短期間の培養でより多くの細胞を得ることが出来た。
なお、培養開始時の細胞数（１×１０^６）は間質血管画分中の全ての細胞が含有され、大部分は培養開始後１日目の培地交換で排除されるため、回収時の細胞数は１×１０^６よりも少なくなる。また、８０〜９０％コンフルエントに達した時の条件Ａと条件Ｃの細胞数が大きく異なるのは、細胞の大きさや形状が異なるからである。

実施例２脂肪由来幹細胞の拡大培養
（１）間質血管画分の培養
実施例１−（４）に記載の方法と同様に、実施例１−（２）で得られた間質血管画分を１×１０^５全有核細胞／ｍＬとなるように培養用培地に懸濁し、実施例１−（３）で準備したＲＮフラスコ又は対照フラスコ中、１０ｍＬの細胞懸濁液を添加し、３７℃、ＣＯ_２濃度５％で培養を開始した（培養０日目）。培養開始後１日目に培地を新鮮培地に交換し、以降、細胞が８０〜９０％コンフルエントに達するまで３〜４日／回の頻度で培地交換を行った。本培養に用いた基礎培地、添加物、ＲＮコーティングの有無を表２に示す。

（２）拡大培養
細胞が８０〜９０％コンフルエントに達した時点で細胞を回収し、１×１０^５細胞／ｍＬとなるように培養用培地（表２の基礎培地及び添加物）を添加し、細胞懸濁液を調製した。１０ｍＬの細胞懸濁液を、実施例１−（３）で準備したＲＮフラスコ又は対照フラスコに添加し、３７℃、ＣＯ_２濃度５％で拡大培養を開始した（Ｐ０）。

拡大培養開始後１日目に培地を新鮮培地に交換し、以降、細胞が７０〜９５％コンフルエントに達するまで３〜４日／回の頻度で培地交換を行った。細胞が７０〜９５％コンフルエントに達した時点（Ｐ１）で細胞を回収し、トリパンブルー染色により全有核細胞濃度を計測した後、再度、１×１０^５細胞／ｍＬとなるように培養用培地（表２の基礎培地及び添加物）を添加し、調製した細胞懸濁液を、新しいＲＮフラスコ又は対照フラスコに添加し、３７℃、ＣＯ_２濃度５％で拡大培養を続けた。細胞が８０〜９０％コンフルエントに達した時点（Ｐ２）で細胞を回収し、トリパンブルー染色により全有核細胞濃度を計測した。培養日数と回収時の細胞数を表３に示す。また、これらの結果をグラフ化したものを、図２に示す。

表３及び図２で示されるように、１０％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ（条件Ｄ、従来法）での培養に比べて、ＤＸＦを用いてＲＮフラスコで培養した場合（条件Ｅ及び条件Ｆ）には、短期間の培養でより多くの細胞を得ることが出来た。また、自己血漿を含まない場合（条件Ｅ）でも、細胞の増殖率は従来法（条件Ｄ）を大きく上回った。

実施例３細胞表面マーカーの解析
実施例２−（２）で得られたＰ２の細胞集団を、それぞれの培養条件で細胞が８０〜９０％コンフルエントに達した時点で継代し、拡大培養を続けた。拡大培養を開始してからおよそ２０日目で細胞を回収し、０．１％牛血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ、シグマ社製）を含むＰＢＳ（以下、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳと記載）で洗浄した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに細胞集団を懸濁し、抗体反応液として、ＰＥ−Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＣＤ７３抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ９０抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ１０５抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ３４抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ４５抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＰＥ−Ｃｙ７標識マウス抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）、及びＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ１４抗体（ベクトン・ディッキンソン社製）を含む抗体液をそれぞれ添加し、室温で１０分間静置した。その後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで細胞集団を２回洗浄し、再度０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁した。この細胞集団をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ、ベクトン・ディッキンソン社製）に供し、細胞集団の各種細胞表面マーカーの含有率を算出した。ここで、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５は間葉系幹細胞の細胞表面マーカー（ポジティブマーカー）であり、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４は間葉系幹細胞に発現していないネガティブマーカーである。結果を表４に示す。

表中、Ｐ３は、Ｐ２の細胞集団を継代培養して８０〜９０％コンフルエントに達した時点の細胞集団を示す。Ｐ５は、Ｐ３の細胞集団を２回継代培養して８０〜９０％コンフルエントに達した時点の細胞集団を示す。

表４で示されるように、すべての条件で間葉系幹細胞のポジティブマーカーの発現は９５％以上だった。一方、間葉系幹細胞のネガティブマーカーは、従来の方法（条件Ｄ）では少し発現していたのに対して、ＤＸＦを用いてＲＮフラスコで培養した場合（条件Ｅ及び条件Ｆ）ではすべて検出限界以下だった。すなわち、ＤＸＦを用いてＲＮフラスコで培養した場合、従来の方法よりも効率的に、間葉系幹細胞を高含有する細胞集団を取得できることが明らかとなった。

実施例４間葉系に属する細胞への分化
実施例３で得られた間葉系幹細胞（条件ＥＰ５）を、各種細胞へ分化させた。

脂肪細胞への分化では、間葉系幹細胞（条件ＥＰ５）をｈＭＳＣｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔＫｉｔｓ−ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ培地（ロンザ社製）を用いて、説明書の記載に従い、培養した。培地を除去後、４％パラフォルムアルデヒド（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、室温で１０分間静置することで細胞を固定した。６０％イソプロパノール（ＳＩＧＭＡ社製）で細胞を洗浄した後、Ｏｉｌ−ＲｅｄＯを添加し室温で１５分間インキュベートし、脂質の液滴を可視化した。

骨芽細胞への分化では、間葉系幹細胞（条件ＥＰ５）をｈＭＳＣｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔＫｉｔｓ−ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ培地（ロンザ社製）を用いて、説明書の記載に従い、培養した。培地を除去後、４％パラフォルムアルデヒド（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、室温で１０分間静置することで細胞を固定した。蒸留水で細胞を洗浄した後、ＡｌｉｚａｒｉｎＲｅｄ染色液を添加し室温で４５分間インキュベートし、カルシウム沈着を可視化した。

軟骨細胞への分化では、間葉系幹細胞（条件ＥＰ５）をｈＭＳＣｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔＫｉｔｓ−ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ培地（ロンザ社製）を用いて、説明書の記載に従い、培養した。培地を除去後、４％パラフォルムアルデヒド（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、室温で６０分間静置することで細胞を固定した。蒸留水で細胞を洗浄した後、ＡｌｃｉａｎＢｌｕｅ染色液を添加し室温で一晩インキュベートし、軟骨を作る細胞外マトリックスの主要成分であるプロテオグリカンを可視化した。

上記の結果を図３に示す。図３で示されるように、それぞれの分化誘導培地で培養した場合にのみ、細胞は染色された。これらの結果より、本発明の方法で得られた間葉系幹細胞が、分化誘導剤を含有する培地で培養することにより、間葉系幹細胞から分化して生じることが知られている各種の細胞、すなわち間葉系に属する細胞へと分化し得ることが明らかとなった。

本発明により、短期間で大量の間葉系幹細胞を製造する方法が提供される。本発明の間葉系幹細胞の製造方法は、特に再生医療への応用に有用である。

SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-8
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-9
SEQ ID NO:3 ; Partial region of fibronectin named III-10
SEQ ID NO:4 ; Partial region of fibronectin named III-11
SEQ ID NO:5 ; Partial region of fibronectin named III-12
SEQ ID NO:6 ; Partial region of fibronectin named III-13
SEQ ID NO:7 ; Partial region of fibronectin named III-14
SEQ ID NO:8 ; Partial region of fibronectin named CS-1
SEQ ID NO:9 ; Fibronectin fragment named Retronectin (CH-296)

Claims

間葉系幹細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養する工程を包含し、それにより間葉系幹細胞を選択的に増殖させる、間葉系幹細胞の製造方法であって、前記細胞集団が、脂肪組織から単離された細胞集団である、方法。
フィブロネクチンフラグメントが、細胞接着ドメイン及びヘパリン結合ドメインからなる群より選択される少なくとも一つのドメインを有するフラグメントであることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
フィブロネクチンフラグメントの存在下で培養する工程が、フィブロネクチンフラグメントがコートされた固相と接触した状態で培養する工程であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
培養する工程が、異種由来成分不含培地で培養する工程であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
異種由来成分不含培地が、無血清培地又は同種血清を含有する培地であることを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
細胞集団が、ヒト由来の細胞集団であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
間葉系幹細胞を含有する細胞集団をフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養し、それにより間葉系幹細胞を選択的に増殖させる工程、ここに前記細胞集団が脂肪組織から単離された細胞集団である、および前記工程により得られる間葉系幹細胞を分化させる工程を包含する、間葉系に属する細胞の製造方法。
分化させる工程が、間葉系幹細胞から他の細胞への分化を誘導する分化誘導剤を含有する培地で培養する工程であることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。