CN115397979A

CN115397979A - 具有增加的头孢唑啉生产率的青霉素g酰化酶突变体及其用途

Info

Publication number: CN115397979A
Application number: CN202080093452.2A
Authority: CN
Inventors: 慎镛哲; 朴哲; 王垠善; 尹荣晟; 金娜俐; 姜美淑; 李红仙; 林秀禛; 尹智勋
Original assignee: Amicogen Inc
Current assignee: Amicogen Inc
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2022-11-25
Also published as: KR20210059533A; KR102363768B1; WO2021096298A1

Abstract

本发明涉及具有增加的头孢唑啉生产率的青霉素G酰化酶突变体及其用途，其中与其野生型酶及其它已知的突变体形式相比，具有本发明中公开的独特突变形式的无色杆菌属菌种CCM 4824衍生的青霉素G酰化酶突变体具有特异性地对于头孢唑啉非常高的合成活性，并且与用于合成头孢唑啉的底物的降解活性相比，具有惊人的高合成比(S/H比)，并且因此头孢唑啉的生产率惊人地增加到工业应用中的显著水平。

Description

具有增加的头孢唑啉生产率的青霉素G酰化酶突变体及其用途

技术领域

本申请要求于2019年11月15日提交的韩国专利申请号10-2019-0147086的优先权，并且其完整说明书整体引入本文作为参考。

本发明涉及具有增加的头孢唑林生产率的青霉素G酰化酶突变体及其用途，更具体而言，涉及在野生型青霉素G酰化酶蛋白(衍生自无色杆菌属(Achromobacter)物种CCM4824)序列中，包含选自A116αT、I156αN、N169αT、M3βV、S54βG、T64βA、H173βN、T251βA、T388βA、R478βH、E486βA、D541βE和Y555βC的至少一种突变的突变型青霉素G酰化酶，以及使用其用于合成(制备)头孢唑啉的方法，所述野生型青霉素G酰化酶蛋白包含由SEQ ID NO:1限定的α亚基；以及由SEQ ID NO:2限定的β亚基。

背景技术

在合成半合成的β-内酰胺化合物的方法中，将具有β-内酰胺核结构的化合物以及与其结合以变成侧链的化合物(酰基供体)用作底物。当将青霉素G酰化酶加入底物混合物中时，在活化侧链和β-内酰胺核之间发生酶促偶联反应，并且青霉素G酰化酶催化酰基从活化的侧链(即酰基供体)到β-内酰胺核的转移(酰化)。另一方面，该酶还具有用作酰基供体的活化侧链和水解合成的β-内酰胺化合物的活性，其对半合成的β-内酰胺化合物的生产率造成问题。特别地，考虑到在工业和经济方面以1:1的比率进行与底物的合成反应在生产过程和生产效率方面是有利的，重要挑战是降低底物降解反应，使得更多底物可以用于合成反应。

特别地，在头孢唑啉的常规酶促合成中，已使用了其中基团例如甲基、乙基、丙基与TzAA键合的酯化合物作为反应材料。在根据常规方法和手段，由TzAA和MMTD-7-ACA的酯化合物合成头孢唑啉的情况下，合成通过青霉素G酰胺酶(青霉素G酰化酶)的酶促活性进行，并且同时酯化合物的TzAA是天然水解的，即用作生物催化剂的青霉素G酰胺酶(青霉素G酰化酶)一方面经历水解，以竞争性地发生四唑-1-乙酸和相应醇的分解反应。该反应的具体实例显示于图2中。如图2中所示，可以使用例如四唑基乙酸甲酯(在本说明书中缩写为“TzAAMe”)和7-氨基-3-(2-甲基-1,3,4-噻二唑-5-基)-硫甲基-3-头孢烯-4-羧酸(在本说明书中缩写为“TDA”)作为通过酶促反应用于合成(S)头孢唑啉的底物。底物TzAAMe有时通过酶进行水解，以转换为四唑基乙酸(在本文中缩写为“TzAA”)(H1)，并且合成的头孢唑啉也通过酶进行水解(H2)，以制备TzAA。因此，为了增加头孢唑啉的生产率，重要的是增加合成反应(S)并降低分解反应(H1、H2)。

因此，通过尽可能减少水解速率来减少TzAA酯化合物的量是可能的。为了如上所述减少水解速率，已知期望在尽可能低的pH下进行酶促反应，但这种方法受到用于头孢唑啉合成反应的最佳条件和MMTD-7-ACA的溶解度问题的限制。因此，直到现在，当合成头孢唑啉时，采用了将TzAAMe以与MMTD-7-ACA等价的比率添加两次以上的方法进行反应。

另外，即使使用相同的酶，取决于抗生素的具体类型，在合成产率方面也可能出现显著差异。具有苄基环结构的抗生素如头孢氨苄、头孢克洛和头孢拉定，以及具有酚环结构的抗生素如阿莫西林、头孢羟氨苄和头孢丙烯，是结构上相似的，但在头孢唑啉的情况下，它具有四唑环并且在结构上不同于上文提到的抗生素。因此，即使使用相同的酶，也会出现其中头孢唑啉的产率效率相对较低的情形。例如，在KR101985911(专利文献1)的文献中公开的酶的情况下，它已知通过对于头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、头孢拉定、头孢羟氨苄和阿莫西林的半合成β-内酰胺类抗生素具有高效的多重合成能力而具有极佳的生产率，但对于头孢唑啉，它不能显著增加生产效率至它在工业水平上具有实用性的程度。具有对于工业水平应用足够高的高头孢唑啉生产率的酶仍是未知的。

[现有领域文献]

[专利文献]

(专利参考文献1)KR101985911B

发明内容

技术问题

相应地，当本发明人在研究增加头孢唑啉生产率的方法时，本发明通过确认以下来完成：与野生型(衍生自无色杆菌属物种CCM 4824菌株)相比，具有本发明中公开的独特突变的青霉素G酰化酶突变体不仅显著增加了特异性地合成头孢唑啉的能力，而且将S/H比改善到显著更高的水平，因此它具有关于头孢唑啉的高效生产率。

相应地，本发明的一个目的是提供突变型青霉素G酰化酶，其在包含由SEQ ID NO:1限定的α亚基以及由SEQ ID NO:2限定的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白序列中，包含选自A116αT、I156αN、N169αT、M3βV、S54βG、T64βA、H173βN、T251βA、T388βA、R478βH、E486βA、D541βE和Y555βC的至少一种突变。

本发明的另一个目的是提供编码突变型青霉素G酰化酶的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供包含该多核苷酸的重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供用该表达载体转化的宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供用于制备头孢唑啉的组合物，其包含本发明的突变型青霉素G酰化酶。

另外，提供了用于制备头孢唑啉的组合物，其由本发明的突变型青霉素G酰化酶组成。

另外，提供了用于制备头孢唑啉的组合物，其基本上由本发明的突变型青霉素G酰化酶组成。

本发明的另一个目的是用于由乙酸四唑酯和3-[5-甲基-1,3,4-硫二唑-2-基]-7-氨基头孢烷酸酶促合成头孢唑啉的方法，该方法包括使用本发明的突变型青霉素G酰化酶。

本发明的另一个目的是提供本发明的突变型青霉素G酰化酶用于制备头孢唑啉的用途。

技术解决方案

为了实现上述目的，本发明提供了突变型青霉素G酰化酶，其在包含由SEQ ID NO:1限定的α亚基以及由SEQ ID NO:2限定的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白序列中，包含选自A116αT、I156αN、N169αT、M3βV、S54βG、T64βA、H173βN、T251βA、T388βA、R478βH、E486βA、D541βE和Y555βC的至少一种突变。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了编码突变型青霉素G酰化酶的多核苷酸。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了包含该多核苷酸的重组表达载体。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了用该表达载体转化的宿主细胞。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了用于制备头孢唑啉的组合物，其包含本发明的突变型青霉素G酰化酶。

另外，本发明提供了用于制备头孢唑啉的组合物，其由本发明的突变型青霉素G酰化酶组成。

另外，本发明提供了用于制备头孢唑啉的组合物，其基本上由本发明的突变型青霉素G酰化酶组成。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了用于由乙酸四唑酯和3-[5-甲基-1,3,4-硫二唑-2-基]-7-氨基头孢烷酸酶促合成(制备)头孢唑啉的方法，该方法包括使用本发明的突变型青霉素G酰化酶。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了本发明的突变型青霉素G酰化酶用于制备头孢唑啉的用途。

在下文中，本发明将得到详细描述。

如本文使用的，术语“蛋白质”可与“多肽”或“肽”互换使用，例如，指如在以其天然状态的蛋白质中通常发现的氨基酸残基的聚合物。

如本文使用的，“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。除非另有限制，否则还包括以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。

如本文使用的，术语“表达”指在细胞中产生蛋白质或核酸。

如本文使用的，根据生物化学领域的标准缩写规则，氨基酸的一个字母(三个字母)指下述氨基酸：A(Ala)：丙氨酸；C(Cys)：半胱氨酸；D(Asp)：天冬氨酸；E(Glu)：谷氨酸；F(Phe)：苯丙氨酸；G(Gly)：甘氨酸；H(His)：组氨酸；I(IIe)：异亮氨酸；K(Lys)：赖氨酸；L(Leu)：亮氨酸；M(Met)：甲硫氨酸；N(Asn)：天冬酰胺；P(Pro)：脯氨酸；Q(Gln)：谷氨酰胺；R(Arg)：精氨酸；S(Ser)：丝氨酸；T(Thr)：苏氨酸；V(Val)：缬氨酸；W(Trp)：色氨酸；Y(Tyr)：酪氨酸。

如本文使用的，“(氨基酸单字母)(氨基酸位置)(氨基酸单字母)”意指在天然(野生型)多肽的相应氨基酸位置处前标注的氨基酸由后标注的氨基酸取代。例如，I156αN指示对应于天然多肽α亚基(在本发明中，SEQ ID NO:1的野生型APAα亚基)的位置156的异亮氨酸由天冬酰胺取代，M3βV意指天然多肽β亚基(在本发明中，SEQ ID NO:2的野生型APAβ亚基)的第三个甲硫氨酸由缬氨酸取代。

如本文使用的，术语MMTD-7-ACA指MMTD(巯基-5-甲基-1,3,4-噻二唑)和7-ACA(7-氨基头孢烷酸)的反应产物，并且它也表示为“3-[5-甲基-1,3,4-硫二唑-2-基]-7-氨基头孢烷酸”等等。它用作头孢唑啉抗生素合成反应中的底物，并且是具有β-内酰胺核结构的化合物。MMTD和7-ACA的反应产物在本领域中以各种表述已知，但在本发明中，它意欲包括本领域中被视为基本上等价的所有物质。尽管不限于此，但TDA(7-氨基-3-(2-甲基-1,3,4-噻二唑-5-基)-硫代甲基-3-头孢烯-4-羧酸)可以优选用作本发明中的实例。

如本文使用的，术语“TzAA酯”化合物指“乙酸四唑酯”，并且指其中基团例如甲基、乙基或丙基与TzAA键合的酯化合物，它在本说明书中也可以被称为“四唑-1-乙酸酯”等等。它在头孢唑啉合成反应中用作底物并且充当酰基供体。“TzAA酯”化合物并不限于此，但TzAAMe(四唑-1-乙酸甲酯)可以优选用作本发明中的实例。

本发明提供了对于头孢唑林具有增加的生产率的无色杆菌属物种CCM 4824衍生的青霉素G酰化酶突变体。

如本文使用的，衍生自CCM 4824青霉素G酰化酶蛋白的无色杆菌属物种称为“APA”，并且编码其的多核苷酸或基因序列表示为“apa”。

无色杆菌属物种CCM 4824衍生的青霉素G酰化酶(APA)野生型包括由SEQ ID NO:1限定的α亚基以及由SEQ ID NO:2限定的β亚基。具体而言，野生型APA表达为作为前体类型的单链多肽(例如SEQ ID NO:4)，所述单链多肽由通过间隔肽(例如SEQ ID NO:3)连接的、由SEQ ID NO:1限定的α亚基以及由SEQ ID NO:2限定的β亚基组成，其后，所述间隔肽通过细胞中的自催化加工去除，形成由α亚基和β亚基组成的成熟的活性二聚体。例如，由SEQ IDNO:4定义的前体野生型APA可以由例如称为NCBI genbank AY919310.1的核苷酸序列的多核苷酸编码，但并不限于此。

无色杆菌属物种CCM 4824菌株衍生的青霉素G酰化酶(APA野生型)已报道具有超过衍生自其它已知生物的同工酶的优良优点。例如，报道了与衍生自木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)的酶相比，热稳定性是优良的，并且在低底物浓度下，对于β-内酰胺抗生素合成的催化活性优于衍生自大肠杆菌(E.coli)的酶(Stanislav Becka等人，Penicillin G acylase from Achromobacter sp.CCM 4824，Appl MicrobiolBiotechnol DOI 10.1007/s00253-013-4945-3)。然而，无色杆菌属物种CCM 4824菌株衍生的青霉素G酰化酶(APA)野生型蛋白质也具有问题，即如本说明书的实施例中所述，与合成活性相比，出现显著水平的底物和产物分解活性。另一方面，已尝试制备衍生自各种微生物的青霉素G酰化酶的突变体并在工业上使用其，但这些都具有局限性，即仅报道了转换率而不考虑分解反应和S/H，或者开发仅集中于每个具体反应，例如仅集中于合成反应。在实践中，它们在应用于工业水平方面仍具有不足的效应，例如，尽管CN105483105A专利中公开的一些氨基酸突变体公开了阿莫西林等少量抗生素的底物转换率在90至120分钟后基本上为99％，但突变体的合成能力与野生型相比仅提高了约两倍左右，并且这种合成能力的S/H值仅为约3.9倍(基于阿莫西林)。当应用于实际工业单元时，这种改善程度具有在方法效率方面的限制。即，在改善酶时，为了确定其比较优点，有必要不仅评估合成活性的增加，而且评估分解活性的降低和S/H值的增加。

相比之下，作为本发明的突变体的代表性实例，ZSH1-13突变体不仅使头孢唑啉合成活性与野生型相比显著增加了12.5倍，而且除这种合成活性之外，还显示了与野生型相比6.1倍的S/H比。另外，作为另一个实例，在ZSH2-5突变体(基于ZSH1-13突变体开发的)中，使头孢唑啉的合成活性与野生型相比显著增加了43倍，并且除这种合成活性之外，还显示了与野生型相比19.8倍的S/H比。特别地，在通过无数步骤生成的各种突变体中，在最终选择的ZSH3-1突变体(基于ZSH2-5变体开发的)的情况下，头孢唑啉的合成活性与野生型相比显著增加了65倍，并且除这种合成活性之外，还显示了与野生型相比36.7倍的S/H比。相应地，根据本发明中提供的突变的APA，可以以高效率生产头孢唑啉。这是可以在生产方法中使用的优良改善，并且它意味着与现有技术相比重大的技术进步。

因此，具有本发明中公开的独特突变体(尤其是取代)形式的无色杆菌属物种CCM4824衍生的青霉素G酰化酶突变体的特征在于具有关于头孢唑啉的高效合成能力。在本发明中，术语“高效”意指增加合成产物的生产和速度以及S/H比很高。

相应地，本发明首次公开的APA突变体形式如下。本发明的突变型青霉素G酰化酶(以下在本说明书中称为突变型APA)的特征在于，它在包含由SEQ ID NO:1限定的α亚基以及由SEQ ID NO:2限定的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白序列中，包含选自A116αT、I156αN、N169αT、M3βV、S54βG、T64βA、H173βN、T251βA、T388βA、R478βH、E486βA、D541βE和Y555βC的一个或多个氨基酸残基由其它氨基酸取代的突变。

具体而言，突变型青霉素G酰化酶在包含由SEQ ID NO:1限定的α亚基以及由SEQID NO:2限定的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白序列中，包含选自A116αT、I156αN、N169αT、M3βV、S54βG、T64βA、H173βN、T251βA、T388βA、R478βH、E486βA、D541βE和Y555βC的至少一种突变。

例如，它可以是在包含由SEQ ID NO:1限定的α亚基以及由SEQ ID NO:2限定的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白序列中，具有一个突变位点的多肽，例如包含A116αT取代的多肽、包含I156αN取代的多肽、包含N169αT取代的多肽、包含H173βN取代的多肽、包含T251βA取代的多肽、包含E486βA取代的多肽或包含Y555βC取代的多肽，或

例如，它可以是在包含由SEQ ID NO:1限定的α亚基以及由SEQ ID NO:2限定的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白序列中，具有多重突变位点的多肽，例如包括任意地选自A116αT、I156αN、N169αT、M3βV、S54βG、T64βA、H173βN、T251βA、T388βA、R478βH、E486βA、D541βE和Y555βC的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个突变位点的多肽，但并不限于此。

优选地，本发明的突变型青霉素G酰化酶(突变型APA)可以包括在野生型青霉素G酰化酶蛋白序列中的I156αN、N169αT、H173βN、T251βA、E486βA和Y555βC的6个突变位点(参见ZSH1-13)。更优选地，本发明的突变型青霉素G酰化酶可以包括由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:6限定的β亚基。作为其优选的提供形式，i)它可以作为以单链多肽(例如SEQ ID NO:7)形式的前体蛋白质提供，所述单链多肽由通过间隔肽(例如SEQ ID NO:3)连接的、由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:6限定的β亚基组成，或ii)它可以作为成熟蛋白质提供，所述成熟蛋白质由通过SEQ ID NO:5限定的α亚基以及通过SEQ ID NO:6限定的β亚基组成，但并不限于此。

另外，本发明可以包括在突变的APA中的另外氨基酸残基的修饰。术语“修饰”指氨基酸残基的缺失、取代或添加。进行另外氨基酸残基的修饰，用于增加本发明的突变型APA的头孢唑啉合成活性，并且降低用于合成的底物的降解活性的目的，并且氨基酸残基的修饰形式(类型)和位置并无特别限制，只要可以实现上述目的。

优选地，在与野生型相比包含I156αN、N169αT、H173βN、T251βA、E486βA和Y555βC的6个突变位点的突变型APA序列中，可以进一步包括选自G49αF、T201αS、M3βV、T64βA、T225βN和T388βA的一种或多种突变。更优选地，在包含由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ IDNO:6限定的β亚基的突变型APA序列中，可以进一步包括选自G49αF、T201αS、M3βV、T64βA、T225βN和T388βA的一种或多种突变。

例如，在包含由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:6限定的β亚基的突变型APA序列中，可以另外包括一个突变位点，例如包括以下的多肽：包含G49αF取代的多肽、包含T201αS取代的多肽、包含M3βV取代的多肽、包含T64βA取代的多肽、包含T225βN取代或T388βA取代的多肽，或

例如，它可以是在包含由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:6限定的β亚基的突变型APA序列中，另外包括多重突变位点的多肽，例如包含任意地选自G49αF、T201αS、M3βV、T64βA、T225βN和T388βA的2个突变、3个突变、4个突变、5个突变或6个突变的多肽，但并不限于此。

最优选地，本发明的突变型APA可以进一步包括在突变型APA中的M3βV、T64βA和T388βA的三个突变(取代)位点(包括与野生型相比的总共9个取代位点，参见ZSH2-5)，所述突变型APA包含由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:6限定的β亚基。更优选地，本发明的突变型APA可以包括由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:8限定的β亚基。作为其优选的提供形式，i)它可以作为以单链多肽(例如SEQ ID NO:9)形式的前体蛋白质提供，所述单链多肽由通过间隔肽(例如SEQ ID NO:3)连接的、由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:8限定的β亚基组成，或ii)它可以作为成熟蛋白质提供，所述成熟蛋白质由通过SEQ ID NO:5限定的α亚基以及通过SEQ ID NO:8限定的β亚基组成，但并不限于此。

本发明还提供了包含进一步加入突变型APA中的突变的多肽。优选地，在与野生型相比包含I156αN、N169αT、M3βV、T64βA、H173βN、T251βA、T388βA、E486βA和Y555βC的9个突变位点的突变型APA序列中，可以进一步包括选自S54βG、S150βT、N226βT、A310βD、R478βH和D541βE的一种或多种突变。更优选地，在包含由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ IDNO:8限定的β亚基的突变型APA序列中，可以进一步包括选自S54βG、S150βT、N226βT、A310βD、R478βH和D541βE的一种或多种突变。

例如，在包含由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:8限定的β亚基的突变型APA序列中，可以另外包括一个突变位点，例如包括以下的多肽：包含S54βG取代的多肽、包含S150βT取代的多肽、包含N226βT取代的多肽、包含A310βD取代的多肽、包含R478βH取代或T388βA取代的多肽、包含R478βH取代的多肽、或包含R478βH取代的多肽，或

例如，它可以是在包含由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:8限定的β亚基的突变型APA序列中，另外包括多重突变位点的多肽，例如包含任意地选自S54βG、S150βT、N226βT、A310βD、R478βH和D541βE的2个突变、3个突变、4个突变、5个突变或6个突变的多肽，但并不限于此。

最优选地，本发明的突变型APA可以进一步包括在突变型APA中的S54βG、R478βH和D541βE的三个突变(取代)位点(包括与野生型相比的总共12个取代位点，参见ZSH3-1)，所述突变型APA包含由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:8限定的β亚基。更优选地，本发明的突变型APA可以包括由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:10限定的β亚基。作为其优选的提供形式，i)它可以作为以单链多肽(例如SEQ ID NO:11)形式的前体蛋白质提供，所述单链多肽由通过间隔肽(例如SEQ ID NO:3)连接的、由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:10限定的β亚基组成，或ii)它可以作为成熟蛋白质提供，所述成熟蛋白质由通过SEQ ID NO:5限定的α亚基以及通过SEQ ID NO:10限定的β亚基组成，但并不限于此。

同时，本发明提供了编码突变型青霉素G酰化酶(突变型APA)的多核苷酸。

只要多核苷酸可以编码本发明的突变型APA多肽，构成多核苷酸的碱基的组合并无特别限制。当氨基酸序列已知时，基于本领域已知的密码子信息制备编码氨基酸序列的多核苷酸的技术是本领域众所周知的。多核苷酸可以作为单链或双链核酸分子提供，包括所有DNA、cDNA和RNA序列。

本发明提供了包含该多核苷酸的重组表达载体。

如本文使用的，术语“重组表达载体”指能够在适当的宿主细胞中表达靶蛋白或靶核酸(RNA)的载体，并且指遗传构建体，其包含可操作地连接的必需调控元件，使得多核苷酸(基因)***物得到表达。

如本文使用的，术语“可操作地连接的”指核酸表达控制序列与编码所需蛋白质或RNA以执行一般功能的核酸序列之间的功能性连接。即，这意味着编码蛋白质或RNA的核酸序列(例如，编码本发明的突变型APA的多核苷酸序列)以这样的方式连接，使得基因表达可以通过表达控制序列进行，例如，启动子和编码蛋白质或RNA的核酸序列必须是可操作地连接的，以实现编码核酸序列的表达。与重组载体的可操作连接可以使用本领域众所周知的遗传重组技术，使用本领域一般已知的酶的位点特异性DNA切割和连接等等来制备。

本发明的重组表达载体的特征在于它包含编码突变型APA的多核苷酸。克隆到根据本发明的载体内的多核苷酸序列可以与适当的表达控制序列可操作地连接，并且可操作地连接的多核苷酸(基因)序列和表达控制序列可以包括在一种表达载体中，所述表达载体包括用于选择含有该载体的宿主细胞的选择标记物和/或复制起点。另外，表达载体包括表达控制序列，以及必要时，用于膜靶向或分泌的信号序列或前导序列，并且可以根据目的以各种方式进行制备。表达控制序列指控制可操作连接的多核苷酸序列在特定宿主细胞中的表达的DNA序列。此类调控序列包括用于实现转录的启动子、用于调控转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、控制转录和翻译终止的序列、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号和增强子等等。载体的启动子可以是组成型或诱导型的。

作为信号序列，当宿主是埃希氏菌属(Escherichia)时，可以使用PhoA信号序列、OmpA信号序列等，当宿主是芽孢杆菌属(Bacillus)时，可以使用α-淀粉酶信号序列、枯草杆菌蛋白酶信号序列等，当宿主是酵母时，可以使用MFα信号序列、SUC2信号序列等，宿主是动物细胞时，可以使用胰岛素信号序列、α-干扰素信号序列、抗体分子信号序列等，但并不限于此。

本发明的表达载体并无特别限制，只要它是克隆领域中常用的载体，实例包括但不限于质粒载体、粘粒载体、细菌噬菌体载体和病毒载体。具体而言，质粒包括大肠杆菌衍生的质粒(pBR322、pBR325、pUC118和pUC119、pET-22b(+))、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)衍生的质粒(pUB110和pTP5)和酵母衍生的质粒(YEp13、YEp24和YCp50)等等，并且病毒可以是动物病毒例如逆转录病毒、腺病毒或牛痘病毒，可以是昆虫病毒例如杆状病毒等等，但并不限于此。在本发明的一个实施方案中，使用pBC-KS(+)。

本发明提供了用该表达载体转化的宿主细胞和微生物。

转化包括将核酸(编码本发明的突变型APA的多核苷酸)引入生物、细胞、组织或器官内的任何方法，它可以如本领域已知的，通过根据宿主细胞选择适当的已知技术来进行。此类方法包括但不限于电穿孔、原生质体融合、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、碳化硅晶须、超声处理、农杆菌介导的转化、通过聚乙二醇(PEG)的沉淀、硫酸葡聚糖、lipofectamine、热休克法、粒子枪轰击等等。

宿主细胞指含有通过任何手段(实例：电击法、磷酸钙沉淀法、显微注射法、转化法、病毒感染等)引入细胞内的异源DNA的原核或真核细胞。

在本发明中，作为宿主细胞，克隆领域中常用的任何类型的单细胞生物，例如原核微生物如各种细菌(例如梭菌属(Clostridia)、大肠杆菌等)，低等真核微生物如酵母，以及衍生自高等真核生物的细胞包括昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物等可以用作宿主细胞，但并不限于此。由于蛋白质的表达水平和修饰取决于宿主细胞而不同地显示，因此本领域技术人员可以选择且使用对于预期目的最合适的宿主细胞。

在本发明中，宿主细胞可以是选自以下的任何一个属的微生物：梭菌属物种(例如丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)、糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)或糖丁酸梭菌(Clostridium saccharobutylicum)等)、埃希氏菌属物种、醋杆菌属(Acetobacter)物种(例如混浊醋杆菌(Acetobacter turbidans)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)等)、气单胞菌属(Aeromonas)物种、产碱菌属(Alcaligenes)物种、隐毛幼枝菌属(Aphanocladium)物种、芽孢杆菌属物种、头孢菌属(Cephalosporium)物种、黄杆菌属(Flavobacterium)物种、克吕沃尔氏菌属(Kluyvera)物种、枝动菌属(Mycoplana)物种、精朊杆菌属(Protaminobacter)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、无色杆菌属物种和黄单胞菌属(Xanthomonas)物种(例如柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri)等)，但并不限于此。

埃希氏菌属的微生物可以优选为大肠杆菌(Escherichia coli)，在本发明的一个实施方案中，提供了大肠杆菌菌株MC1061/pBC-ZSH3-1(大肠杆菌MC1061/pBC-ZSH3-1，登录号KCTC 13991BP)作为进行转化以表达突变型APA的微生物。大肠杆菌MC1061/pBC-ZSH3-1表达包含由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:10限定的β亚基的多肽，或由该单元组成的多肽。即，大肠杆菌MC1061/pBC-ZSH3-1通过重组表达载体进行转化，所述重组表达载体包含编码SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多核苷酸。

本发明还提供了用于制备头孢唑林(用于合成)的组合物，其包含本发明的上述突变型青霉素G酰化酶。

如上所述，本发明的突变型APA提供了在合成头孢唑啉方面的显著优点。相应地，本发明提供了本发明的突变型APA用于头孢唑啉合成的用途。

本发明的突变型APA可以参考上述序列信息通过本领域众所周知的蛋白质生产方法进行制备，但并不限于此，而是可以通过例如遗传改造方法进行构建。例如，根据常规方法构建编码突变型APA多肽的核酸。可以通过使用适当引物的PCR扩增来构建核酸。可替代地，DNA序列可以通过本领域已知的标准方法进行合成，例如使用自动DNA合成仪(由Biosearch或Applied Biosystems销售)。将构建的核酸***载体内，所述载体包含与其可操作连接的一种或多种表达控制序列(表达控制序列，例如启动子、增强子等)，以控制核酸的表达，并且用由其形成的重组表达载体转化宿主细胞。所得到的转化体在适合于核酸表达的培养基和条件下进行培养，以从培养物中回收由核酸表达的基本上纯的多肽。可以使用本领域已知的方法(例如色谱法)进行回收。另外，使用如上所述制备的本发明的突变型APA是可能的，或者直接使用或者纯化用于靶产物的制备中。突变型APA酶的分离和纯化可以通过使用蛋白质分离方法，通过使用先前揭示的APA特性的各种色谱方法照原样使用，或者为了实验的目的对其进行略微修改而使用。另外，通过使用特定的结合特性的亲和色谱法纯化突变的APA也是可能的，所述结合特性例如组氨酸肽与镍柱组分或纤维素结合结构域(CBD)之间的结合力、与纤维素的结合力等。

如本文使用的，术语“基本上纯的多肽”意指根据本发明的多肽基本上不含任何其它衍生自宿主细胞的蛋白质。用于合成本发明的多肽的遗传改造方法是本领域已知的。

另外，本发明的突变型APA可以通过本领域已知的化学合成容易地进行制备。代表性方法包括但不限于液相或固相合成、片段缩合、F-MOC或T-BOC化学。

本发明的突变型APA可以以固定状态以及游离状态使用。可以通过本领域已知的常规蛋白质固定方法来固定突变型APA，作为载体，可以使用天然聚合物例如纤维素、淀粉、葡聚糖和琼脂糖；合成聚合物例如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯和EupergitC；或者矿物质例如二氧化硅、膨润土或金属。另外，通过共价键合、离子键合、疏水键合、物理吸附、微囊化等等，将突变型APA与这些载体结合是可能的。另外，通过戊二醛、溴化氰等等的作用，通过在这些载体-酶缀合物之间形成共价键来固定突变型APA是可能的。另外，作为更优选的方法，将含有突变型APA的微生物细胞照原样固定且使用是可能的，而无需分开地纯化突变型APA。在这种全细胞固定中，为了增加微生物中包含的突变型APA的反应性，对细胞进行穿刺或应用技术如表面表达也是可能的。

在本发明的用于制备头孢唑啉的组合物中，术语“包含突变型APA”意指该组合物包含选自编码(encoding)(编码(coding))突变型APA的多核苷酸、含有该多核苷酸的表达载体以及用该表达载体转化的宿主细胞(微生物)中的至少一种，以及从开始就在组合物中包括突变型APA多肽本身的直接方式。因此，它最终意欲包括诱导突变型APA的生成的所有间接方式。

具体而言，本发明提供了用于由乙酸四唑酯和3-[5-甲基-1,3,4-硫二唑-2-基]-7-氨基头孢烷酸酶促合成(制备)头孢唑啉的方法，该方法包括使用本发明的突变型青霉素G酰化酶。

在头孢唑啉合成(制备)过程中提供的本发明的突变型APA酶可以以包含突变型APA多肽的组合物或突变型APA产生菌株的培养物的形式提供，并且突变型APA可以以游离或固定状态提供，但本发明不限于此并且将参考前文进行理解。

如果本发明的突变型APA酶的活性并未丧失，则每种底物的反应条件并无特别限制，而是可以优选在上文提到的合成方法中，在水溶液(水或缓冲液)中进行制备，可以选择优选的反应混合物的pH在pH5至pH9的范围内，优选的反应时间在0.1至24小时的范围内，优选的反应温度在3至30℃的范围内。根据在一种反应中使用的反应底物和酶的量、以及所需的方法速度和效率，上述条件可以由本领域技术人员适当地选择且加以控制。

在头孢唑啉合成(制备)过程中，作为底物提供的MMTD-7-ACA(3-[5-甲基-1,3,4-硫二唑-2-基]-7-氨基头孢烷酸)和TzAA酯(四唑乙酸酯)加入反应混合物中的浓度和比率并无特别限制，但MMTD-7-ACA:TzAA酯的比率可以为例如1:1至1:1.5，优选地，考虑到本发明在工业和经济方面的优点，它可以以1:1的比率使用。

本发明的突变型APA在反应混合物中的添加量并无特别限制，而是可以例如在0.1至100U/ml的范围内，优选地，相对于反应混合物中包括的底物化合物的总量，它可以以2至10％(w/w)的比率包括。

可以通过本领域已知的常规化合物纯化方法(例如色谱法等)，从反应溶液中分离且纯化在反应的过程中最终产生的头孢唑啉。

本发明还提供了本发明的上述突变型青霉素G酰化酶用于制备头孢唑啉的用途。

在本发明中，术语‘包含’与‘包括’或‘特征在于’同义使用，并且在组合物或方法中，并不排除未提到的另外的组分要素或方法步骤。术语‘由……组成’意欲排除未另外指定的另外的要素、步骤或成分。在组合物或方法的范围内，术语‘基本上由……组成’意欲包括所述的组分要素或步骤、以及基本上不影响其基本特性的组分要素或步骤。

有利效应

具有本发明中公开的独特突变体形式、无色杆菌属物种CCM 4824衍生的青霉素G酰化酶突变体的特征在于，显著提高了专门用于头孢唑啉的生产率。具体而言，与其野生型酶及其它已知的突变体形式相比，具体而言，本发明的突变型APA具有对于头孢唑啉非常高的合成活性，同时合成比(S/H比)与用于头孢唑啉合成的底物的降解活性显著很高，因此它的特征在于头孢唑啉生产率显著增加到工业应用中的显著水平。

附图说明

图1显示了本发明的突变体中的代表性ZSH1-13突变体、ZSH2-5突变体和ZSH3-1突变体的氨基酸取代位点。

图2显示了通过酶促反应，从作为前体(底物)的TzAAMe和TDA合成头孢唑啉的反应(S)、前体中的TzAAMe至TzAA的水解反应(H1)、以及作为分解反应的头孢唑啉至TzAAMe和TDA的水解反应(H2)。

图3是显示了在通过ZSH3-1突变体的头孢唑啉合成反应中，随着时间的头孢唑啉转换率、TzAAMe的残留量和TzAA的生产量的数据。

具体实施方式

在下文中，本发明将得到详细描述。

然而，下述实施例仅是本发明的说明，并且本发明的内容并不限于下述实施例。

实施例1：无色杆菌属物种CCM 4824衍生的青霉素G酰化酶(APA)野生型的制备

1-1.表达无色杆菌属物种CCM 4824衍生的青霉素G酰化酶(APA)野生型的基因的合成

野生型APA(无色杆菌属物种CCM 4824衍生的青霉素G酰化酶)是前体类型，并且作为单链多肽(SEQ ID NO:4)表达，在所述单链多肽中，由SEQ ID NO:1限定的α亚基以及由SEQ ID NO:2限定的β亚基通过由SEQ ID NO:3定义的间隔肽进行连接，其后通过细胞中的自催化加工，它具有由α亚基和β亚基组成的成熟的活性二聚体形式。表达SEQ ID NO:4的野生型APA前体的基因(缩写为“apa基因”)通过请求Bioneer(Daejeon，韩国)公司进行合成。

1-2.表达野生型APA的重组载体(pBC-APA)的制备

将实施例1-1中获得的apa基因***pBC-KS(+)载体(Stratagene，USA)的XbaI和NotI限制性酶识别位点内，以制备用于表达野生型APA的pBC-APA质粒。具体制备方法如下。

apa基因DNA产物(大小约2.6kb)用限制性酶XbaI和NotI进行消化，然后用纯化试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit；QIAGEN，德国)进行纯化并用作***DNA。另外，用限制性酶XbaI和NotI消化的pBC KS(+)载体(Stratagene，USA)DNA以及用CIP去磷酸化的DNA片段用作载体DNA。在***DNA和载体DNA使用T4 DNA连接酶(New England Biolabs，瑞典)在16℃下连接12至16小时后，通过使用缀合物溶液的电穿孔，对大肠杆菌MC1061菌株进行转化。通过将菌株涂抹在含有浓度为20μg/mL的氯霉素抗生素的LB琼脂培养基上，并且在30℃下培养过夜来选择转化体。通过从转化体中分离质粒并确定所***DNA的碱基序列，最终得到含有apa基因的pBC-APA质粒。pBC-APA质粒表达野生型APA蛋白。

进行了众多程序例如下文的实施例2和3，以制备显示出关于头孢唑啉的高水平的合成能力，并且同时具有显著减少的使反应底物水解的活性的突变体，下文实施例2和3代表了众多程序的实例。下文制备的突变体以关于α亚基和β亚基各自的氨基酸位置的特定突变的形式指示。

实施例2：具有高头孢唑啉合成活性的变体的制备和选择

2-1.通过易错聚合酶链反应(易错PCR)制备初级突变体文库

为了制备具有增加的头孢唑啉合成活性的突变型APA，在实施例1中合成的apa基因的核苷酸序列中人为诱导了随机突变，为此通过进行易错聚合酶链反应(易错PCR)制备了突变体文库。特异性突变体文库的制备方法如下所述。

具体而言，使用Diversity PCR Random Mutagenesis试剂盒(Clontech，USA)进行错误诱导聚合酶链反应，以引起1-2个突变/1,000bp。PCR反应溶液的组成使用1ng/μL的pBC-APA质粒作为模板DNA，各10pmol的T3引物(SEQ ID NO:12)和T7引物(SEQ ID NO:13)，2mM dGTP，50X Diversity dNTP混合物，10X TITANIUM Taq缓冲液和TITANIUM Taq聚合酶，以50μL的最终体积使用。PCR反应条件为在96℃下使反应混合物预变性2分钟，将96℃下30秒的变性、在52℃下30秒的退火、以及在68℃下3分钟的聚合的反应重复18次，随后为在68℃下5分钟的后聚合。通过在上述条件下进行错误诱导聚合酶链反应，扩增了大小约2.7kb的突变型DNA片段。

在用限制性酶XbaI和NotI消化通过PCR得到的突变型基因，即2.7kb的PCR产物，使用纯化试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit；QIAGEN，德国)进行纯化，并且用作***DNA后，用限制性酶XbaI和NotI消化pBC-KS(+)载体DNA，并且用CIP去磷酸化的DNA片段用作载体DNA。

在使用T4 DNA连接酶(New England Biolabs，瑞典)在16℃下使上述***DNA和载体DNA缀合16小时后，使用缀合物溶液进行通过电穿孔的大肠杆菌MC1061菌株转化。通过将菌株涂抹在含有浓度为20μg/mL的氯霉素抗生素的LB琼脂培养基上，并且在30℃下培养过夜，来制备随机突变体文库。

从突变体文库中，按照下述步骤搜索对头孢唑啉合成具有增加的反应性的突变型APA。用于合成头孢唑啉的反应底物和具体的化学反应过程显示于图2中。在将包含突变的apa基因的大肠杆菌MC1061转化体接种到96孔板内之后，然后在23℃、165rpm条件下伴随振荡温育60-70小时，在所述96孔板中，分配了160μl含有氯霉素抗生素的LB肉汤。这之后，从96孔板中取出20μl培养液并转移到新的96孔板中，并且向其中加入105μL细胞裂解液(1.25mg/mL溶菌酶、1.25mM EDTA、0.375％Triton X-100)，在25℃下放置2小时，并且在10℃下放置1小时。这之后，将通过溶解10mM TDA和10mM TzAAMe(其为1:1底物比)制备的125μL底物溶液加入100mM磷酸铵(pH 7.5)缓冲溶液中，然后合成反应在10℃下进行16-18小时。在进行合成反应后，将反应溶液中的40μL上清液转移到新的96孔板中。在通过添加100μL的0.2N HCl作为反应终止剂终止酶促反应后，使用HPLC搜索具有增加的头孢唑啉合成活性的突变体。关于HPLC分析条件，0.01M磷酸钾(pH 6.8)和甲醇(7:3)用作溶剂，所使用的柱是YMC-Triart C18，250*4.6mm，并且注入10μL，以0.8mL/分钟流动，并且在270nm下分析12分钟。

确认了7种突变体中的头孢唑啉合成活性以与上述相同的方式增加。通过对基因进行测序，确认了与野生型相比，7种突变体分别突变为A116αT(ZEP1-9)、I156αN(ZEP1-10)、H173βN(ZEP1-12)、Y555βC(ZEP1-13)、E486βA(ZEP1-18)、N169αT(ZEP1-26)或T251βA(ZEP1-33)。

2-2.通过定点诱变(DNA改组)制备的二级突变体文库_ZSH1-13改善了菌株选择

另外，为了改善具有增加的头孢唑啉合成活性的突变型青霉素G酰化酶，根据易错聚合酶链反应获得的改良菌株的活性，制备了7个氨基酸残基(A116αT、I156αN、N169αT、H173βN、T251βA、E486βA、Y555βC)的定点突变文库。

具体而言，为了制备A116α氨基酸发生突变的文库，使用野生型APA作为模板，并且使用M13R引物(SEQ ID NO:15)和SH116a-R引物(SEQ ID NO:17)进行PCR，以回收大小约510bp的PCR产物，为了制备其中A116α、I156α和N169α氨基酸发生突变的文库，使用野生型APA和ZEP1-10作为模板，并且使用SH116a-F引物(SEQ ID NO:16)和SH169a-R引物(SEQ IDNO:19)进行PCR，以回收大小约160bp的PCR产物，为了制备其中N169α、H173β和T251β氨基酸发生突变的文库，使用野生型APA和ZEP1-12作为模板，使用SH169a-F引物(SEQ ID NO:18)和SH251b-R引物(SEQ ID NO:21)进行PCR，以回收大小约1,100bp的PCR产物。另外，使用野生型APA和ZEP1-18作为模板，以使T251β、E486β和Y555β氨基酸突变，使用SH251b-F引物(SEQ ID NO:20)和SH555b-R引物(SEQ ID NO:23)进行PCR，以回收大小约910bp的PCR产物，使用野生型APA作为模板，以使Y555β氨基酸突变，使用SH555b-F引物(SEQ ID NO:22)和M13F引物(SEQ ID NO:14)进行PCR，以回收大小约100bp的PCR产物。

通过用每种模板DNA、引物、pfu-x缓冲液、dNTP混合物和pfu-x聚合酶，将最终体积调整到100μL来进行PCR反应溶液的组成。PCR反应条件为在96℃下使反应混合物预变性3分钟，将96℃下30秒的变性、在52℃下30秒的退火、以及在68℃下2分钟的聚合的反应重复18次，随后为在68℃下5分钟的后聚合。

将在上述条件下获得的约510bp的PCR产物、160bp的PCR产物、1,100bp的PCR产物、910bp的PCR产物和约100bp的PCR产物进行混合，在此处使用T3引物(SEQ ID NO:12)和T7引物(SEQ ID NO:13)进行PCR，以扩增大小约2.7kb的多重突变型DNA片段。因此获得的约2.7kb的PCR产物以与实施例2-1相同的方式***pBC KS(+)载体DNA内，并且进行大肠杆菌MC1061菌株的转化，以制备定点突变体文库。

作为以与实施例2-1相同的方式，从定点突变体文库中搜索对头孢唑啉合成活性具有增加的反应性的突变体的结果，选择与野生型APA相比具有增加的头孢唑啉合成活性的6重突变体(I156αN、N169αT、H173βN、T251βA、E486βA和Y555βC)，并命名为ZSH1-13。ZSH1-13表达SEQ ID NO:5的α亚基和SEQ ID NO:6的β亚基。

2-3.通过易错聚合酶链反应(易错PCR)制备三级突变体文库

为了进一步增加实施例2-2中制备的ZSH1-13突变体的头孢唑啉合成活性，以与实施例2-1相同的方式，使用ZSH1-13的DNA作为模板DNA来制备引起错误的突变体文库。

这之后，在关于头孢唑啉的合成能力的搜索中，在添加通过将20mM TDA和20mMTzAAMe以1:1的底物比率溶解于100mM磷酸铵(pH 7.5)缓冲溶液中制备的125μL底物溶液后，通过在6℃下降低反应温度17至18小时来进行合成反应。除了底物浓度和比率以及底物反应温度之外，全部以与实施例2-1相同的方式进行。

作为搜索所制备的引起错误的突变体文库的结果，确认了在六种突变体中，与ZSH1-13相比，头孢唑啉合成活性是增加的。通过对ZSH1-13的氨基酸测序，确认了6种突变体各自突变为T64βA(ZEP2-7)、G49αF(ZEP2-9)、T388βA(ZEP2-13)、T201αS(ZEP2-17)、M3βV(ZEP2-21)或T225βN(ZEP2-54)。

2-4.通过定点突变制备的四级突变体文库_ZSH2-5改善了菌株选择

为了在实施例2-3中获得的改良菌株的活性基础上获得头孢唑啉合成活性提高的突变体，使用ZSH1-13质粒DNA作为模板DNA来制备6个氨基酸残基(G49αF、T201αS、M3βV、T64βA、T225βN、T388βA)的定点突变文库。在该实施例中，PCR反应条件以与上文实施例2-2中所述相同的方式进行。

具体而言，为了制备其中G49α和T201α氨基酸发生突变的文库，使用ZSH1-13和ZEP2-9作为模板，并且使用M13R引物(SEQ ID NO:15)和SH201a-R引物(SEQ ID NO:25)进行PCR，以回收大小约770bp的PCR产物，为了制备其中T201α、M3β和T64β氨基酸发生突变的文库，使用ZSH1-13和ZEP2-21作为模板，并且使用SH201a-F引物(SEQ ID NO:24)和SH64b-R引物(SEQ ID NO:27)进行PCR，以回收大小约440bp的PCR产物，为了制备其中T64β、T225β和T388β氨基酸发生突变的文库，使用ZSH1-13和ZEP2-54作为模板，并且使用SH64b-F引物(SEQ ID NO:26)和SH388b-R引物(SEQ ID NO:29)进行PCR，以回收大小约970bp的PCR产物，使用ZSH1-13作为模板以使T388β氨基酸突变，使用SH388b-F引物(SEQ ID NO:28)和M13F引物(SEQ ID NO:14)进行PCR，以回收大小约600bp的PCR产物。

将在上述条件下获得的约770bp的PCR产物和大小为440bp的PCR产物、大小为970bp的PCR产物和大小为600bp的PCR产物进行混合，在此处使用T3引物(SEQ ID NO:12)和T7引物(SEQ ID NO:13)进行PCR，以扩增大小约2.7kb的多重突变型DNA片段。因此获得的约2.7kb的PCR产物以与实施例2-1相同的方式***pBC KS(+)载体DNA内，并且进行大肠杆菌MC1061菌株的转化，以制备定点突变体文库。

这之后，作为以与实施例2-3相同的方式搜索文库的结果，作为与ZSH1-13相比具有显著增加的头孢唑啉合成活性的突变体，选择了其中M3βV、T64βA和T388βA另外对于ZSH1-13进行突变的菌株，并命名为ZSH2-5。ZSH2-5表达由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:8限定的β亚基。

实施例3：与高合成能力同时具有减少的基质分解活性的高效头孢唑啉合成突变体的制备和选择

3-1.通过易错聚合酶链反应(易错PCR)制备第5代突变体文库

为了增加实施例2-4中制备的ZSH2-5突变体的头孢唑啉合成活性，并且降低反应底物(通常为TzAAMe)分解活性，以与实施例2-1相同的方式，使用ZSH2-5作为模板DNA来制备引起错误的突变文库。这之后，以与实施例2-3相同的方式，进行关于头孢唑啉合成能力的搜索。另外，在关于底物TzAAMe的反应性搜索中，在将30μL酶溶液转移到96孔板后，将在此基础上以1:1.5比率溶解5mM TDA和7.5mM TzAAMe制备的125μL底物溶液加入100mM磷酸铵(pH7.5)缓冲液中，将反应温度升高至10℃，并且合成反应进行18至20小时。除了底物浓度和底物反应温度之外，全部以与实施例2-3相同的方式进行。

作为探索因此制备的引起错误的突变体文库的头孢唑啉合成活性和底物降解活性的结果，确认了在六种突变体中，与ZSH2-5相比，头孢唑啉合成活性的增加和TzAAMe分解活性的降低。通过对ZSH2-5的氨基酸序列分析，确认了6种突变体各自突变为S54βG(ZEP3-2)、S150βT(ZEP3-11)、R478βH(ZEP3-14)、N226βT(ZEP3-26)、A310βD(ZEP3-33)、或D541βE(ZEP3-48)。

3-2.通过定点突变制备的第6代突变体文库_ZSH3-1改善了菌株选择

基于实施例3-1中获得的改良菌株的活性，使用ZSH2-5的DNA作为模板DNA，来制备6个氨基酸残基(S54βG、S150βT、N226βT、A310βD、R478βH、D541βE)的定点突变文库。在该实施例中，以与上文实施例2-2中所述相同的方式，进行PCR反应条件。

具体而言，为了制备其中S54β氨基酸发生突变的文库，使用M13R引物(SEQ ID NO:15)和SH54b-R引物(SEQ ID NO:31)以及ZSH2-5作为模板来进行PCR，以回收大小约1,180bp的PCR产物，为了制备其中S54β、S150β和N226β氨基酸发生突变的文库，使用SH54b-F引物(SEQ ID NO:30)和SH226b-R引物(SEQ ID NO:33)以及ZSH2-5和ZEP3-11作为模板进行PCR，以回收大小约520bp的PCR产物。为了制备其中N226β、A310β和R478β氨基酸发生突变的文库，使用SH226b-F引物(SEQ ID NO:32)和SH478b-R引物(SEQ ID NO:35)以及ZSH2-5和ZEP3-33作为模板来进行PCR，以回收大小约760bp的PCR产物，为了制备其中R478β和D541β氨基酸发生突变的文库，使用SH478b-F引物(SEQ ID NO:34)和M13F引物(SEQ ID NO:14)以及ZSH2-5和ZEP3-48作为模板来进行PCR，以回收大小约340bp的PCR产物。将1,180bp大小的PCR产物和520bp大小的PCR产物、760bp大小的PCR产物和340bp大小的PCR产物混合，并且使用T3引物(SEQ ID NO:12)和T7引物(SEQ ID NO:13)来进行PCR，以扩增大小约2.7kb的多重突变型DNA片段。因此获得的约2.7kb的PCR产物以与实施例2-1相同的方式***pBC KS(+)载体DNA内，并且进行大肠杆菌MC1061菌株的转化，以制备定点突变体文库。

这之后，作为以与实施例3-1相同的方式搜索文库活性的结果，作为其中与ZSH2-5相比头孢唑啉合成活性显著增加且底物(TzAAMe)分解活性显著减少的突变体，选择其中S54βG、R478βH和D541βE进一步突变的菌株，并命名为ZSH3-1。ZSH3-1表达由SEQ ID NO:5限定的α亚基以及由SEQ ID NO:10限定的β亚基。

3-3.菌株保藏

在所制备的突变型酶中，截止2019年10月11日，用pBC-ZSH3-1质粒(其含有编码显示最佳活性的ZSH3-1突变型酶的基因)转化的大肠杆菌MC1061菌株命名为“大肠杆菌MC1061/pBC-ZSH3-1”，并且保藏于韩国生命工学研究院基因库(Gene Bank of the KoreaResearch Institute of Bioscience and Biotechnology)(登录号：KCTC 13991BP)中。

实施例2至3中描述的代表性突变体各自的头孢唑啉合成效率的比较评价结果在下文实施例中进行描述。

实施例4：APA突变体的头孢唑啉活性效率的比较

4-1.酶溶液的制备

为了比较所制备的APA突变体的活性程度，如下制备每种酶溶液。在以与实施例1-2中所述相同的方式，将编码实施例2至3中制备的每种APA突变体的基因***pBC-KS(+)载体内之后，将每种表达载体转化到大肠杆菌MC1061的菌株内。在将每种大肠杆菌转化体接种到含有20μg/mL氯霉素的3mL LB培养基(1％Bacto-蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)内之后，振荡培养在28℃和200rpm条件下进行16小时。这之后，将350μL培养基接种到含有20μg/mL氯霉素的35mL新鲜LB培养基内，振荡培养在23℃和190rpm下进行48小时。将培养基离心(4℃，8000rpm，10分钟)以回收细胞，然后用0.05M磷酸铵(pH 7.5)缓冲液洗涤一次。在将细胞悬浮于35mL相同的缓冲液中，在4℃下用超声波破碎仪(Vibra Cell VC750，Sonics&Materials Inc，USA)破碎5分钟后，通过在4°℃和13,500rpm下离心20分钟以获取上清液，来制备每种APA突变型酶溶液。

4-2.头孢唑啉合成活性的测量

为了测量头孢唑啉合成活性，通过将浓度各为10mM的TDA和TzAAMe溶解于0.05M磷酸铵(pH 7.5)缓冲液中，来制备底物溶液。在将500μL实施例4-1的每种APA突变型酶溶液加入500μL底物溶液中之后，酶反应在25℃下进行10分钟，然后获取500μL反应溶液，并且向其中加入500μL的0.2N HCl溶液以停止反应。其后，它在与实施例2-1相同的条件下进行过滤并通过HPLC进行分析，并且通过与标准材料的定量曲线的比较进行定量。此时，在本说明书中，1单位(单位，U)定义为每分钟能够产生1μmole头孢唑啉的酶量。另一方面，在根据Bradford方法测量酶溶液中的蛋白质量后，对底物的非活性表示为对应于1mg蛋白质的活性单位。

【表1】

*，头孢唑啉合成活性/TzAAMe水解活性

表1比较地显示了在本发明的突变体中的ZSH1-13突变体、ZSH2-5突变体和ZSH3-1突变体与野生型APA之间的头孢唑啉合成活性。如表1中所示，与野生型APA相比，本发明的突变体通过连续改善而增加了头孢唑啉的合成产率。与野生型相比，ZSH1-13将合成产率增加了约12.5倍，与野生型APA相比，ZSH2-5增加了约43.0倍，与野生型APA相比，最终突变体ZSH3-1增加了约65.5倍，指示了显著更高的头孢唑啉生产率。

4-3.反应底物TzAAMe分解活性和S/H比的测量

类似地，为了测量TzAAMe针对APA突变体的降解活性程度，通过将15mM TzAAMe溶解于0.1M磷酸铵(pH 7.5)缓冲液中，来制备底物溶液。将100μl上述突变体各自加入100μl这种底物溶液中，并且酶反应在25℃下进行10分钟，然后通过将100μl的0.2N HCl溶液加入100μl反应溶液中，来终止反应。其后，通过以与实施例4-2相同的方式的过滤和HPLC分析，通过与标准材料的定量曲线的比较，来计算并定量TzAAMe的水解量(即TzAA)。在这种情况下，1单位(U)定义为每分钟能够生成1μmole TzAA的酶量。用通过上述方法衍生的TzAAMe分解活性和实施例4-2中获得的头孢唑啉合成活性的值来测量S/H比。

如上表1中所示，与野生型APA相比，确认了本发明的突变体降低了相对的TzAAMe分解活性，并且TzAAMe分解活性与头孢唑啉合成活性的比(S/H比)是显著增加的。特别地，S/H比按ZSH1-13、ZSH2-5和ZSH3-1的次序增加，并且与野生型APA相比，最终突变体ZSH3-1将S/H比增加了大约36.7倍。

4-4.来自TDA和TzAAMe的头孢唑啉的转换率的确定

为了测量头孢唑啉在一段时间内的转换率，可以通过测量前体TDA的转换率来推断头孢唑啉的合成产率。使用最终变体ZSH3-1测量TDA转换。具体而言，除了含有氯霉素的LB培养基的量为1L之外，以与实施例4-1相同的方式培养菌株。培养的细胞悬浮液在4℃下以8,000rpm离心10分钟，并且去除上清液以获得细胞团块。在悬浮于90ml的0.1M磷酸铵缓冲液中之后，使用超声波仪将细胞破碎20分钟。为了分离且纯化酶溶液，允许破碎的细胞在10℃下静置2小时，然后离心(4℃，10,000rpm，30分钟)，以获得上清液。该溶液用于TDA转换反应实验。

使用以这种方式制备的3U/ml分离且纯化的溶液(上清液)，并且分别将200mM TDA和240mM TzAAMe加入0.1M磷酸铵(pH 7.5)缓冲液中，并且与总共50mL以1:1.2的底物比制备的底物溶液反应。在10℃下2小时的头孢唑啉合成反应过程中，以与实施例4-2相同的方式，通过HPLC分析TDA转换率、TzAAMe的残留量和TzAA的生产量。

结果，如图3中所示，本发明的ZSH3-1突变型酶显示了在一段时间内的高TDA转换率，确认了TzAA难以生成至与头孢唑啉合成反应的初始阶段几乎相似的程度。结果，本发明的ZSH3-1突变型酶不仅以高效率合成头孢唑啉，而且显著降低了TzAAMe至TzAA的降解率和头孢唑啉的降解率，确认了头孢唑啉具有极佳的生产率。

工业适用性

如上所述，本发明涉及具有增加的头孢唑林生产率的青霉素G酰化酶突变体及其用途，更具体而言，涉及在野生型青霉素G酰化酶蛋白(来自无色杆菌属物种CCM 4824)序列中，包含选自A116αT、I156αN、N169αT、M3βV、S54βG、T64βA、H173βN、T251βA、T388βA、R478βH、E486βA、D541βE和Y555βC的至少一种突变的突变型青霉素G酰化酶，以及使用其用于合成(制备)头孢唑啉的方法，所述野生型青霉素G酰化酶蛋白包含由SEQ ID NO:1限定的α亚基；以及由SEQ ID NO:2限定的β亚基。

与其野生型酶及其它已知的突变体相比，具有本发明中公开的独特突变体形式的无色杆菌属物种CCM 4824衍生的青霉素G酰化酶突变体，特异性地具有对于头孢唑啉非常高的合成活性，并且合成比(S/H比)惊人地高，并且头孢唑啉生产率惊人地增加到工业应用中的显著水平，因此工业应用性很高。

[保藏号]

保藏机构名称：韩国生命工学研究院

保藏号：KCTC13991BP

保藏日期：20191011

保藏地址：(56212)韩国生命工学研究院(KRIBB)，181，Ipsin-gil，Jeongeup-si，Jeollabuk-do，Republic of Korea

原始保藏的收据

致：Amicogen.Inc.

Amicogen.Inc.

14-10，Worasan-ro 950beon-gil，Munsan-euo，Jinju-si，Gyeongsangnam-do

韩国

序列表

<110> 艾美科健株式会社

<120> 具有增加的头孢唑啉生产率的青霉素G酰化酶突变体及其用途

<130> OP21-0155/PCT/CN

<150> KR 10-2019-0147086

<151> 2019-11-15

<150> PCT/KR 2020/016010

<151> 2020-11-13

<160> 35

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自Achromobacter sp. CCM 4824的野生型青霉素G酰化酶(APA)蛋白的α亚基(氨基酸序列)

<400> 1

Ala Gln Pro Val Ala Pro Ala Ala Gly Gln Thr Ser Glu Ala Val Ala

1 5 10 15

Ala Arg Pro Gln Thr Ala Asp Gly Lys Val Thr Ile Arg Arg Asp Ala

20 25 30

Tyr Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asp Thr Val Tyr Gly Ile Phe Tyr

35 40 45

Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Met

50 55 60

Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala Glu Val Leu Gly Ala Ser

65 70 75 80

Met Val Gly Phe Asp Lys Ser Ile Arg Ala Asn Phe Ser Pro Glu Arg

85 90 95

Ile Gln Arg Gln Leu Ala Ala Leu Pro Ala Ala Asp Arg Gln Val Leu

100 105 110

Asp Gly Tyr Ala Ala Gly Met Asn Ala Trp Leu Ala Arg Val Arg Ala

115 120 125

Gln Pro Gly Gln Leu Met Pro Lys Glu Phe Asn Asp Leu Gly Phe Ala

130 135 140

Pro Ala Asp Trp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Met Ile Phe Val Gly Thr

145 150 155 160

Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ala Asn Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala

165 170 175

Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Arg His Gly Ala Ala Asp Ala Met Arg

180 185 190

Ile Phe Asn Gln Leu Arg Trp Leu Thr Asp Ser Arg Ala Pro Thr Thr

195 200 205

Val Pro Ala Glu Ala Gly Ser Tyr Gln Pro Pro Val Phe Gln Pro Asp

210 215 220

Gly Ala Asp Pro Leu Ala Tyr Ala Leu Pro Arg Tyr Asp Gly Thr Pro

225 230 235 240

Pro Met Leu Glu Arg Val Val

245

<210> 2

<211> 557

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自Achromobacter sp. CCM 4824的野生型青霉素G酰化酶(APA)蛋白的β亚基(氨基酸序列)

<400> 2

Ser Asn Met Trp Ile Val Gly Arg Asp His Ala Lys Asp Ala Arg Ser

1 5 10 15

Ile Leu Leu Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Trp Asn Pro Ala Tyr Thr

20 25 30

Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Phe Asp Val Val Gly Asn Thr

35 40 45

Pro Phe Ala Tyr Pro Ser Ile Leu Phe Gly His Asn Ala His Val Thr

50 55 60

Trp Gly Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asp Val Asp Ile Phe Ala Glu

65 70 75 80

Lys Leu Asp Pro Ala Asp Arg Thr Arg Tyr Phe His Asp Gly Gln Trp

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Lys Thr Leu Glu Lys Arg Thr Asp Leu Ile Leu Val Lys Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Val Thr Leu Asp Val Tyr Arg Ser Val His Gly Leu Ile Val Lys

115 120 125

Phe Asp Asp Ala Gln His Val Ala Tyr Ala Lys Ala Arg Ala Trp Glu

130 135 140

Gly Tyr Glu Leu Gln Ser Leu Met Ala Trp Thr Arg Lys Thr Gln Ser

145 150 155 160

Ala Asn Trp Glu Gln Trp Lys Ala Gln Ala Ala Arg His Ala Leu Thr

165 170 175

Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Asp Arg Gly Asn Ile Gly Tyr Ala His

180 185 190

Thr Gly Phe Tyr Pro Arg Arg Arg Pro Gly His Asp Pro Arg Leu Pro

195 200 205

Val Pro Gly Thr Gly Glu Met Asp Trp Leu Gly Leu Leu Pro Phe Ser

210 215 220

Thr Asn Pro Gln Val Tyr Asn Pro Arg Gln Gly Phe Ile Ala Asn Trp

225 230 235 240

Asn Asn Gln Pro Met Arg Gly Tyr Pro Ser Thr Asp Leu Phe Ala Ile

245 250 255

Val Trp Gly Gln Ala Asp Arg Tyr Ala Glu Ile Glu Thr Arg Leu Lys

260 265 270

Ala Met Thr Ala Asn Gly Gly Lys Val Ser Ala Gln Gln Met Trp Asp

275 280 285

Leu Ile Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Val Asn Arg Arg His Phe Leu

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Pro Phe Leu Gln Arg Ala Val Gln Gly Leu Pro Ala Asp Asp Pro Arg

305 310 315 320

Val Arg Leu Val Ala Gly Leu Ala Ala Trp Asp Gly Met Met Thr Ser

325 330 335

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340 345 350

Ala Trp Leu Arg Ala Met Leu Arg Arg Thr Leu Ala Asp Glu Met Pro

355 360 365

Ala Asp Phe Phe Lys Trp Tyr Ser Ala Thr Gly Tyr Pro Thr Pro Gln

370 375 380

Ala Pro Ala Thr Gly Ser Leu Asn Leu Thr Thr Gly Val Lys Val Leu

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Phe Asn Ala Leu Ala Gly Pro Glu Ala Gly Val Pro Gln Arg Tyr Asp

405 410 415

Phe Phe Asn Gly Ala Arg Ala Asp Asp Val Ile Leu Ala Ala Leu Asp

420 425 430

Asp Ala Leu Ala Ala Leu Arg Gln Ala Tyr Gly Gln Asp Pro Ala Ala

435 440 445

Trp Lys Ile Pro Ala Pro Pro Met Val Phe Ala Pro Lys Asn Phe Leu

450 455 460

Gly Val Pro Gln Ala Asp Ala Lys Ala Val Leu Cys Tyr Arg Ala Thr

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Gln Asn Arg Gly Thr Glu Asn Asn Met Thr Val Phe Asp Gly Lys Ser

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Pro Asp Gly Thr Pro Ser Pro His Thr Arg Asp Gln Phe Asp Leu Tyr

515 520 525

Asn Thr Phe Gly Ser Lys Arg Val Trp Phe Thr Ala Asp Glu Val Arg

530 535 540

Arg Asn Ala Thr Ser Glu Glu Thr Leu Arg Tyr Pro Arg

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<210> 3

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 间隔肽

<400> 3

Arg Asp Pro Ala Thr Arg Gly Val Val Asp Gly Ala Pro Ala Thr Leu

1 5 10 15

Arg Ala Gln Leu Ala Ala Gln Tyr Ala Gln Ser Gly Gln Pro Gly Ile

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Ala Gly Phe Pro Thr Thr

35

<210> 4

<211> 843

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 来自Achromobacter sp. CCM 4824的野生型青霉素G酰化酶(APA)蛋白(氨基酸序列，前体，全)

<400> 4

Met Ala Gln Pro Val Ala Pro Ala Ala Gly Gln Thr Ser Glu Ala Val

1 5 10 15

Ala Ala Arg Pro Gln Thr Ala Asp Gly Lys Val Thr Ile Arg Arg Asp

20 25 30

Ala Tyr Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asp Thr Val Tyr Gly Ile Phe

35 40 45

Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu

50 55 60

Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala Glu Val Leu Gly Ala

65 70 75 80

Ser Met Val Gly Phe Asp Lys Ser Ile Arg Ala Asn Phe Ser Pro Glu

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Arg Ile Gln Arg Gln Leu Ala Ala Leu Pro Ala Ala Asp Arg Gln Val

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Leu Asp Gly Tyr Ala Ala Gly Met Asn Ala Trp Leu Ala Arg Val Arg

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130 135 140

Ala Pro Ala Asp Trp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Met Ile Phe Val Gly

145 150 155 160

Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ala Asn Ser Glu Ile Asp Asn Leu

165 170 175

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Arg Ile Phe Asn Gln Leu Arg Trp Leu Thr Asp Ser Arg Ala Pro Thr

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Thr Val Pro Ala Glu Ala Gly Ser Tyr Gln Pro Pro Val Phe Gln Pro

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340 345 350

Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asp Val Asp Ile Phe Ala Glu Lys Leu

355 360 365

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<210> 5

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变体ZSH1-13、ZSH2-5 和ZSH3-1的α亚基

<400> 5

Ala Gln Pro Val Ala Pro Ala Ala Gly Gln Thr Ser Glu Ala Val Ala

1 5 10 15

Ala Arg Pro Gln Thr Ala Asp Gly Lys Val Thr Ile Arg Arg Asp Ala

20 25 30

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35 40 45

Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe Gln Met Glu Met

50 55 60

Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala Glu Val Leu Gly Ala Ser

65 70 75 80

Met Val Gly Phe Asp Lys Ser Ile Arg Ala Asn Phe Ser Pro Glu Arg

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Gln Pro Gly Gln Leu Met Pro Lys Glu Phe Asn Asp Leu Gly Phe Ala

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225 230 235 240

Pro Met Leu Glu Arg Val Val

245

<210> 6

<211> 557

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ZSH1-13 突变体的β亚基

<400> 6

Ser Asn Met Trp Ile Val Gly Arg Asp His Ala Lys Asp Ala Arg Ser

1 5 10 15

Ile Leu Leu Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Trp Asn Pro Ala Tyr Thr

20 25 30

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35 40 45

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130 135 140

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145 150 155 160

Ala Asn Trp Glu Gln Trp Lys Ala Gln Ala Ala Arg Asn Ala Leu Thr

165 170 175

Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Asp Arg Gly Asn Ile Gly Tyr Ala His

180 185 190

Thr Gly Phe Tyr Pro Arg Arg Arg Pro Gly His Asp Pro Arg Leu Pro

195 200 205

Val Pro Gly Thr Gly Glu Met Asp Trp Leu Gly Leu Leu Pro Phe Ser

210 215 220

Thr Asn Pro Gln Val Tyr Asn Pro Arg Gln Gly Phe Ile Ala Asn Trp

225 230 235 240

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245 250 255

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705 710 715 720

Leu Ala Ala Leu Arg Gln Ala Tyr Gly Gln Asp Pro Ala Ala Trp Lys

725 730 735

Ile Pro Ala Pro Pro Met Val Phe Ala Pro Lys Asn Phe Leu Gly Val

740 745 750

Pro Gln Ala Asp Ala Lys Ala Val Leu Cys Tyr His Ala Thr Gln Asn

755 760 765

Arg Gly Thr Ala Asn Asn Met Thr Val Phe Asp Gly Lys Ser Val Arg

770 775 780

Ala Val Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Val Ala Pro Asp

785 790 795 800

Gly Thr Pro Ser Pro His Thr Arg Asp Gln Phe Asp Leu Tyr Asn Thr

805 810 815

Phe Gly Ser Lys Arg Val Trp Phe Thr Ala Glu Glu Val Arg Arg Asn

820 825 830

Ala Thr Ser Glu Glu Thr Leu Arg Cys Pro Arg

835 840

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T3 引物

<400> 12

aattaaccct cactaaaggg a 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T7 引物

<400> 13

taatacgact cactataggg 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> M13F 引物

<400> 14

cgccagggtt ttcccagtca cga 23

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> M13R 引物

<400> 15

agcggataac aatttcacac agga 24

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH116a-F

<400> 16

gttctggacg gttacrctgc tggcatgaac g 31

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH116a-R

<400> 17

cgttcatgcc agcagygtaa ccgtccagaa c 31

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH169a-F

<400> 18

cgtttcagcg atgcaamctc cgagatcgac aac 33

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH169a-R

<400> 19

gttgtcgatc tcggagkttg catcgctgaa acg 33

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH251b-F

<400> 20

gcgcggttac ccaagcrctg atctgttcgc gatc 34

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH251b-R

<400> 21

gatcgcgaac agatcagygc ttgggtaacc gcgc 34

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH555b-F

<400> 22

gaggagacgc tgcgttrccc gcgttaataa aagc 34

<210> 23

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH555b-R

<400> 23

gcttttatta acgcgggyaa cgcagcgtct cctc 34

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH201a-F

<400> 24

gctgcgctgg ctgascgatt ctcgtgctc 29

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH201a-R

<400> 25

gagcacgaga atcgstcagc cagcgcagc 29

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH64b-F

<400> 26

cataacgctc acgtarcctg gggctctact g 31

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH64b-R

<400> 27

cagtagagcc ccaggytacg tgagcgttat g 31

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH388b-F

<400> 28

cgcaggcacc ggcgrctggt tccctgaacc 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH388b-R

<400> 29

ggttcaggga accagycgcc ggtgcctgcg 30

<210> 30

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH54b-F

<400> 30

cgttcgctta tccgrgyatt ctgtttggcc 30

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH54b-R

<400> 31

ggccaaacag aatrcycgga taagcgaacg 30

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH226b-F

<400> 32

ctgccgttca gcaccamccc acaggtgtac aac 33

<210> 33

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH226b-R

<400> 33

gttgtacacc tgtgggktgg tgctgaacgg cag 33

<210> 34

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH478b-F

<400> 34

cggttctgtg ttaccrtgcc acccagaatc g 31

<210> 35

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SH478b-R

<400> 35

cgattctggg tggcayggta acacagaacc g 31

Claims

1.一种突变型青霉素G酰化酶，其在包含由SEQ ID NO:1限定的α亚基以及由SEQ IDNO:2限定的β亚基的野生型青霉素G酰化酶蛋白序列中，包含选自A116αT、I156αN、N169αT、M3βV、S54βG、T64βA、H173βN、T251βA、T388βA、R478βH、E486βA、D541βE和Y555βC的至少一种突变。

2.根据权利要求1的突变型青霉素G酰化酶，其中所述野生型青霉素G酰化酶蛋白序列包含I156αN、N169αT、H173βN、T251βA、E486βA和Y555βC的突变。

3.根据权利要求2的突变型青霉素G酰化酶，其中所述突变型青霉素G酰化酶包含由SEQID NO:5限定的α亚基；以及由SEQ ID NO:6限定的β亚基。

4.根据权利要求2的突变型青霉素G酰化酶，其中所述突变型青霉素G酰化酶进一步包含选自G49αF、T201αS、M3βV、T64βA、T225βN和T388βA的至少一种突变。

5.根据权利要求4的突变型青霉素G酰化酶，其中所述突变型青霉素G酰化酶包含M3βV、T64βA和T388βA的突变。

6.根据权利要求5的突变型青霉素G酰化酶，其中所述突变型青霉素G酰化酶包含由SEQID NO:5限定的α亚基；以及由SEQ ID NO:8限定的β亚基。

7.根据权利要求4的突变型青霉素G酰化酶，其中所述突变型青霉素G酰化酶进一步包含选自S54βG、S150βT、N226βT、A310βD、R478βH和D541βE的至少一种突变。

8.根据权利要求7的突变型青霉素G酰化酶，其中所述突变型青霉素G酰化酶包含S54βG、R478βH和D541βE的突变。

9.根据权利要求8的突变型青霉素G酰化酶，其中所述突变型青霉素G酰化酶包含由SEQID NO:5限定的α亚基；以及由SEQ ID NO:10限定的β亚基。

10.一种多核苷酸，其编码权利要求1至9中任一项的突变型青霉素G酰化酶。

11.一种重组表达载体，其包含权利要求10的多核苷酸。

12.一种宿主细胞，其用权利要求11的表达载体进行转化。

13.根据权利要求12的转化宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自以下的任何一个属的微生物：梭菌属物种(Clostridia spp.)、埃希氏菌属物种(Escherichia spp.)、醋杆菌属物种(Acetobacter spp.)、气单胞菌属物种(Aeromonas spp.)、产碱菌属物种(Alcaligenes spp.)、隐毛幼枝菌属物种(Aphanocladium spp.)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)、头孢菌属物种(Cephalosporium spp.)、黄杆菌属物种(Flavobacteriumspp.)、克吕沃尔氏菌属物种(Kluyvera spp.)、枝动菌属物种(Mycoplana spp.)、精朊杆菌属物种(Protaminobacter spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、无色杆菌属物种(Achromobacter spp.)和黄单胞菌属物种(Xanthomonas spp.)。

14.根据权利要求13的转化宿主细胞，其中所述埃希氏菌属的微生物是用重组表达载体转化的大肠杆菌MC1061/pBC-ZSH3-1(大肠杆菌MC1061/pBC-ZSH3-1，保藏号KCTC13991BP)，所述重组表达载体包含编码SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多核苷酸。

15.一种用于制备头孢唑啉的组合物，其包含权利要求1至9中任一项的突变型青霉素G酰化酶。

16.一种用于由乙酸四唑酯和3-[5-甲基-1,3,4-硫二唑-2-基]-7-氨基头孢烷酸酶促合成头孢唑啉的方法，所述方法包括使用根据权利要求1至9中任一项的突变型青霉素G酰化酶。

17.权利要求1至9中任一项的突变型青霉素G酰化酶用于制备头孢唑啉的用途。