CN115397856A - 靶向密蛋白-18.2的rna组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了用于靶向密蛋白‑18.2多肽的RNA技术。在一些实施方案中，这样的RNA技术可用于治疗与密蛋白‑18.2的阳性表达相关的疾病。例如，在一些实施方案中，这样的RNA技术可用于治疗密蛋白‑18.2阳性癌症，其包括例如但不限于胆管癌、卵巢癌、胃癌、胃食管癌、胰腺癌。在一些实施方案中，这样的RNA技术可用于组合治疗(例如，与化学治疗剂组合)。

Description

靶向密蛋白-18.2的RNA组合物
背景技术
癌症是全球第二主要死亡原因，并且预期2018年将导致估计960万人死亡(Brayet al.2018)。通常，除了少数例外(例如生殖细胞和一些类癌瘤)，一旦实体瘤转移，5年存活率很少超过25％。
常规治疗例如化学治疗、放射治疗、手术和靶向治疗以及免疫治疗的最新进展在患有晚期实体瘤的患者中改善了结果。在过去的数年里，食品和药物管理局(Food andDrug Administration，FDA)和欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMA)已经批准了八种检查点抑制剂(一种靶向CTLA-4途径的单克隆抗体伊匹单抗(ipilimumab)以及七种靶向程序性死亡受体/配体[PD/PD-L1]的抗体，其包括阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)和德瓦鲁单抗(durvalumab)、纳武单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)和派姆单抗(pembrolizumab))用于治疗患有多种癌症类型(主要是实体瘤)的患者。这些批准极大地改变了癌症治疗的状况。然而，某些癌症，例如胰腺腺癌或转移性胆道癌，仍未从包括免疫治疗的现有治疗中受益。
发明内容
某些癌症例如胰腺癌和胆管癌类型的不良预后突出了对另外的治疗方法的需求。本公开内容尤其提供了这样的见解：密蛋白-18.2(CLDN-18.2)代表了特别有用的肿瘤相关抗原，治疗可以靶向该抗原。不希望受任何特定理论的束缚，本公开内容指出了CLDN-18.2的组织表达模式(包括其在非癌组织中的特别有限的表达)可有助于其作为如本文中所述的靶标的有用性。迄今为止，尚无靶向CLDN-18.2的治疗被批准用于任何癌症适应证。
本公开内容还提供了这样的见解：在一些实施方案中，如本文所述，靶向CLDN-18.2的治疗可有用地涉及施用靶向CLDN-18.2的抗体剂。此外，本公开内容提供了这样的特别的见解：用于递送这样的抗体剂的特别有益的策略可以是通过施用编码该抗体剂的核酸。更进一步，本公开内容提供了这样的特别的见解：通过靶向肝细胞的脂质纳米粒递送RNA(例如，ssRNA，例如编码抗体剂的mRNA)可以是用于递送这样的抗体剂的特别有益的策略。
本领域技术人员将意识到核酸治疗剂以及此外RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)治疗剂(参见，例如，mRNA编码蛋白质和/或细胞因子)的新兴领域。本文提供的技术的多个实施方案可以利用开发的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)治疗技术和/或递送***的特定特征。例如，在一些实施方案中，施用的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)可包含一个或更多个经修饰的核苷酸(例如，但不限于假尿苷)、核苷和/或键联。作为替代或补充，在一些实施方案中，施用的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)可包含增强稳定性和/或翻译效率的经修饰的polyA序列(例如，破坏的polyA序列)。作为替代或补充，在一些实施方案中，施用的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)可包含至少两个3′UTR序列的特定组合(例如，***RNA的氨基端增强子的序列元件与来源于线粒体编码的12S RNA的序列的组合)。作为替代或补充，在一些实施方案中，施用的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)可包含来源于人α-珠蛋白mRNA的‘5UTR序列。作为替代或补充，在一些实施方案中，施用的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)可包含5′帽类似物，例如，用于共转录加帽。作为替代或补充，在一些实施方案中，施用的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)可包含具有降低的免疫原性的分泌信号编码区(例如，人分泌信号编码序列)，使得编码的抗体剂被表达并且分泌。在一些实施方案中，施用的RNA可被配制在一种或更多种递送载剂(例如，纳米粒例如脂质纳米粒等)中或与其一起配制。作为替代或补充，在一些实施方案中，施用的RNA可以配制在肝靶向脂质纳米粒(例如，阳离子脂质纳米粒)中或与其一起配制。
本公开内容还提供了这样的见解：RiboMab形式(例如在图13中所示)对于递送如本文中所述的CLDN-18.2靶向剂(例如，CLDN-18.2靶向抗体剂)的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)可以是特别有用的。
本公开内容尤其提供了用于治疗癌症，特别是与密蛋白-18.2(CLDN-18.2)表达相关的癌症的见解和技术。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗选自胰腺癌、胃癌或胃食管癌、胆管癌、卵巢癌等癌症的技术。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于对局部晚期肿瘤施用治疗的技术。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗不可切除肿瘤的技术。在一些实施方案中，所提供的技术提供了用于治疗转移性肿瘤的技术。因此，例如，在一些实施方案中，可以将所提供的治疗施用于患有或易患癌症(例如，选自胰腺癌、胃癌或胃食管癌、胆道癌、卵巢癌和/或另外涉及一种或更多种胰腺、胃、胃食管、胆道和/或卵巢肿瘤的癌症)的对象或对象群体，所述癌症可以是或者包含一种或更多种局部晚期肿瘤、一种或更多种不可切除的肿瘤和/或一种或更多种转移瘤。
佐贝妥昔单抗(Zolbetuximab)(开发代码IMAB362)是靶向密蛋白-18同种型2的单克隆抗体，正在研究用于治疗胃肠道腺癌和胰腺肿瘤。在IMAB362的2a期MONO试验(NCT01197885)中，在82％(n＝44/54)的患者中发生IMAB362治疗紧急不良事件(“treatment emergent adverse event，TEAE”)；恶心(61％)、呕吐(50％)和疲劳(22％)是最常见的TEAE。在12名患者(22％)中报告了3级呕吐，并且在8名患者(15％)中报告了3级恶心。这些患者接受了600mg/m2剂量。在这样的IMAB362研究中所观察到的恶心和呕吐通过暂停或减慢IMAB362的输注得到控制，表明AE与Cmax相关(Türeci et al.2019)。
本公开内容尤其提供了这样的见解：施用编码CLDN-18.2靶向剂并且特别是CLDN-18.2靶向抗体剂并且特别是IMAB362的核酸，例如RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)可以代表靶向CLDN-18.2的治疗的特别理想的策略。不希望受任何特定理论的束缚，本公开内容提出了这样的递送模式可以实现一种或更多种改进，例如以降低的TEAE发生率(例如，频率和/或严重程度)和/或效力水平与TEAE水平之间改善的关系(例如，改善的治疗窗)的有效施用，这相对于在施用相应的(例如，编码的)蛋白质(例如，抗体)剂本身时观察到的那些。特别地，本公开内容教导了这样的改进尤其可以通过经由施用核酸并且特别是编码其的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)递送IMAB362来实现。
在一些实施方案中，本公开内容尤其提供了这样的见解：编码抗体剂(例如，IMAB362)或其功能部分的mRNA(其是脂质纳米粒(lipid nanoparticle，LNP)/或与脂质纳米粒一起配制用于静脉内(intravenous，IV)施用)可以被靶细胞(例如肝细胞)吸收，以有效地产生治疗相关血浆浓度的编码的抗体剂(例如，IMAB362)，例如，如图14中针对所述的靶向CLDN-18.2的RiboMab所示。
在一些实施方案中，本公开内容利用RiboMab作为CLDN-18.2靶向剂。在一些实施方案中，这样的RiboMab是由例如改造成用于最小免疫原性和/或配制在脂质纳米粒(LNP)中的mRNA编码的抗体剂。
此外，本公开内容尤其提供了这样的见解：如本文中所述的靶向CLDN-18.2的抗体剂在利用接受对象的免疫***的同时来诱导针对靶细胞(例如肿瘤细胞)的抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)的能力可以增强化学治疗和/或其他抗癌治疗的细胞毒性作用。在一些实施方案中，这样的组合治疗可延长无进展和/或总存活，例如，相对于单独施用的个体治疗和/或相对于另一个合适的参考。
不希望受特定理论的束缚，本公开内容观察到某些化学治疗剂，例如如吉西他滨、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶显示出在胰腺癌细胞系中上调现有的CLDN-18.2表达水平；此外，未观察到这些药剂在CLDN-18.2阴性细胞系中提高从头表达。参见例如Türeci et al.(2019)“Characterization of zolbetuximab in pancreatic cancer models”InOncoimmunology 8(1),pp.e1523096。
本公开内容尤其提供了这样的见解：如本文中所述的靶向CLDN-18.2的治疗在施用于特征在于(例如，已确定显示和/或预期或预测显示)肿瘤细胞中CLDN-18.2表达的表达和/或活性升高(例如，可能或已经由于暴露于一种或更多种化学治疗剂所导致)的肿瘤(例如，肿瘤细胞、怀疑和/或已检测到这样的肿瘤和/或肿瘤细胞的对象等)时，可以是特别有用和/或有效的。实际上，本公开内容尤其教导了所提供的如本文中所述的靶向CLDN-18.2的治疗(例如，施用核酸例如RNA，并且更特别地，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的mRNA)当与一种或更多种CDLN18.2增强剂(例如，一种或更多种特定化学治疗剂)组合施用(例如，施用于已接受和/或正在接受或在其他情况下暴露于所述一种或更多种CDLN18.2增强剂(例如，一种或更多种特定化学治疗剂)的对象)时可以提供协同治疗。因此，在一些实施方案中，如本文中所述的靶向CLDN-18.2的治疗与预期和/或已证明在肿瘤细胞中上调CLDN-18.2表达的其他抗癌剂组合可以是有用的。
在一些方面中，本文提供了靶向CLDN-18.2的药物组合物。在一些实施方案中，这样的药物组合物包含：(a)至少一种单链RNA(ssRNA)，其包含一个或更多个编码相对于密蛋白-18.1(CLDN18.1)多肽优先与密蛋白-18.2(CLDN-18.2)多肽结合的抗体剂(“CLDN-18.2靶向抗体剂”)的编码区；和(b)脂质纳米粒；其中所述至少一种单链RNA被包封在至少一个脂质纳米粒内。在一些实施方案中，这样的药物组合物可包含和/或递送一种或更多种ssRNA，其编码相对于CLND18.1多肽优先与CLDN-18.2多肽结合的抗体。在一些实施方案中，这样的药物组合物可包含和/或递送一种或更多种ssRNA，其编码相对于CLND18.1多肽优先与CLDN-18.2多肽结合的抗原结合片段。
在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2(并且可以由RNA例如ssRNA，例如本文中所述的mRNA编码)的抗体剂与CLDN-18.2多肽的第一胞外结构域(ECD1)特异性地结合。例如，在一些实施方案中，这样的抗体剂与癌细胞中暴露的ECD1的表位特异性地结合。
在一些实施方案中，至少一种ssRNA(例如，mRNA)编码CLDN-18.2靶向抗体剂的可变重链(VH)结构域和该抗体剂的可变轻链(VL)结构域。在一些实施方案中，CLDN-18.2靶向抗体剂的这样的VH结构域和VL结构域可以由单一ssRNA构建体编码；或者，在一些实施方案中，其可以由至少两种单独的ssRNA构建体分别编码。例如，在一些实施方案中，如本文所用的ssRNA包含两个或更多个编码区，其包含编码至少抗体剂的VH结构域的重链编码区；和编码至少抗体剂的VL结构域的轻链编码区。在一些替代实施方案中，药物组合物可以包含：(i)第一ssRNA，其包含编码至少抗体剂的VH结构域的重链编码区；和(ii)第二ssRNA，其包含编码至少抗体剂的VL结构域的轻链编码区。
在一些实施方案中，重链编码区还可以编码恒定重链(CH)结构域；和/或轻链编码区还可编码恒定轻链(CL)结构域。例如，在一些实施方案中，重链编码区可以编码免疫球蛋白G(IgG)形式的抗体剂的VH结构域、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域；和/或轻链编码区可编码IgG形式的抗体剂的VL结构域和CL结构域。在一些实施方案中，IgG形式的抗体剂是IgG1。
在一些实施方案中，ssRNA的重链编码区由编码佐贝妥昔单抗或克劳西单抗(Claudiximab)的全长重链的核苷酸序列组成或者包含编码佐贝妥昔单抗或克劳西单抗的全长重链的核苷酸序列。在一些实施方案中，ssRNA的轻链编码区由编码佐贝妥昔单抗或克劳西单抗的全长轻链的核苷酸序列组成或者包含编码佐贝妥昔单抗或克劳西单抗的全长轻链的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA可包含分泌信号编码区。在一些实施方案中，这样的分泌信号编码区允许由一个或更多个RNA编码的CLDN-18.2靶向抗体剂在被(例如存在于待治疗对象中的)细胞翻译之后被分泌，因此产生具有生物活性的CLDN-18.2靶向抗体剂的血浆浓度。
在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA可包含至少一个非编码序列元件(例如，以增强RNA稳定性和/或翻译效率)。非编码序列元件的实例包括但不限于3′非翻译区(untranslated region，UTR)、5′UTR、用于mRNA的共转录加帽的帽结构、聚腺嘌呤(poly A)尾及其任意组合。例如，在一些实施方案中，ssRNA(例如，第一ssRNA和/或第二ssRNA)各自独立地在5′至3′方向上包含：(a)5′UTR编码区；(b)分泌信号编码区；(c)重链编码区；(d)3′UTR编码区；和(e)polyA尾编码区。在一些实施方案中，ssRNA中包含的polyA尾编码区是经修饰的polyA序列或包含经修饰的polyA序列。
在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA可包含5′帽。
在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA可包含至少一个经修饰的核糖核苷酸。例如，在一些实施方案中，ssRNA的A、U、C和G核糖核苷酸中的至少一个可以被经修饰的核糖核苷酸替代。在一些实施方案中，这样的经修饰的核糖核苷酸可以是假尿苷或包含假尿苷。
在其中药物组合物包含编码CLDN-18.2靶向抗体剂的可变重链(VH)结构域的第一ssRNA和编码该抗体剂的可变轻链(VL)结构域的第二ssRNA的一些实施方案中，这样的第一ssRNA和第二ssRNA可以以约1.5:1至约1:1.5的摩尔比存在。在一些实施方案中，这样的第一ssRNA和第二ssRNA可以以3:1至1:1的重量比存在。在一些实施方案中，这样的第一ssRNA和第二ssRNA可以以约2:1的重量比存在。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物的RNA内容物(例如，一种或更多种编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA)以0.5mg/mL至1.5mg/mL的浓度存在。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物中提供的脂质纳米粒是肝靶向脂质纳米粒。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物中提供的脂质纳米粒是阳离子脂质纳米粒。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物中提供的脂质粒的平均尺寸可以为约50至150nm。
在一些实施方案中，形成脂质纳米粒的脂质包含：聚合物缀合的脂质、阳离子脂质和中性脂质。在一些这样的实施方案中，聚合物缀合的脂质以总脂质的约1至2.5mol％存在；阳离子脂质以总脂质的35至65mol％存在；并且中性脂质以总脂质的35至65mol％存在。
多种脂质(其包括，例如，聚合物缀合的脂质、阳离子脂质和中性脂质)是本领域已知的并且在本文中可用于形成脂质纳米粒，例如靶向特定细胞类型(例如，肝细胞)的脂质纳米粒。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物中包含的聚合物缀合的脂质可以是PEG缀合的脂质(例如，2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺或其衍生物)。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物中包含的阳离子脂质可以是((3-羟丙基)氮杂二基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)或其衍生物。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物中包含的中性脂质可以是磷脂或其衍生物(例如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPSC))和/或胆固醇，或者包含磷脂或其衍生物(例如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPSC))和/或胆固醇。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物还可包含一种或更多种添加剂，例如，在一些实施方案中，其可增强这样的组合物在某些条件下的稳定性。例如，在一些实施方案中，药物组合物还可包含冷冻保护剂(例如，蔗糖)和/或水性缓冲溶液，其在一些实施方案中可包含一种或更多种盐(例如，钠盐)。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物还可包含一种或更多种除编码CLDN-18.2靶向剂(例如抗体剂)的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)之外的活性剂。例如，在一些实施方案中，这样的另一些活性剂可以是化学治疗剂或包含化学治疗剂。示例性化学治疗剂可以是适用于治疗胰腺癌的化学治疗剂或包含适用于治疗胰腺癌的化学治疗剂。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可以被靶细胞吸收以用于产生治疗相关血浆浓度的编码的CLDN-18.2靶向抗体剂。在一些实施方案中，本文中所述的这样的药物组合物可诱导针对靶细胞(例如，肿瘤细胞)的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
因此，本公开内容的另一方面涉及使用本文中所述的药物组合物的方法。例如，本文提供的一个方面涉及包括向患有CLDN-18.2阳性实体瘤的对象施用所提供的药物组合物的方法。CLDN-18.2-阳性实体瘤的实例为但不限于胆道肿瘤、胃肿瘤、胃食管肿瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤以及表达或表现出一定水平的CLDN-18.2多肽的肿瘤。在一些实施方案中，CLDN-18.2阳性肿瘤的特征可以在于≥50％的肿瘤细胞显示出≥2+CLDN-18.2蛋白染色强度，如在经***固定石蜡包埋的来自待施用对象的肿瘤组织中通过免疫组织化学测定所评估的。在一些实施方案中，患有CLDN-18.2阳性实体瘤的对象可患有局部晚期的、不可切除的或转移性的肿瘤。在一些实施方案中，患有CLDN-18.2阳性实体瘤的对象可能已经接受了足以提高CLDN-18.2水平以使得他/她的实体瘤被表征为CLDN-18.2阳性实体瘤的预治疗。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可以作为单一治疗施用。在一些实施方案中，药物组合物可以作为包含这样的药物组合物和化学治疗剂的组合治疗的一部分来施用。因此，在一些实施方案中，正在接受所提供的药物组合物的对象已经接受了化学治疗剂。在一些实施方案中，向正在接受所提供的药物组合物的对象施用化学治疗剂以使得这样的对象接受二者作为组合治疗。在一些实施方案中，所提供的药物组合物和化学治疗剂可以同时或依次施用。例如，在一些实施方案中，化学治疗剂可以在施用所提供的药物组合物之后(例如，之后至少四小时)施用。
在一些实施方案中，本文提供的技术可用于治疗CLDN-18.2阳性胰腺肿瘤。在涉及向患有CLDN-18.2阳性胰腺肿瘤的对象施用所提供的药物组合物的一些实施方案中，这样的对象可以接受这样的所提供的组合物作为单一治疗或者作为包含这样的所提供的药物组合物和适用于治疗胰腺肿瘤的化学治疗剂的组合治疗的一部分。在一些实施方案中，这样的化学治疗剂可以是吉西他滨和/或紫杉醇(例如，nab-紫杉醇(nab-paclitaxel))或者包含吉西他滨和/或紫杉醇(例如，nab-紫杉醇)。在一些实施方案中，这样的化学治疗剂可以是FOLFIRINOX或包含FOLFIRINOX，其是癌症药物(其包括：亚叶酸(folinic acid，FOL)、氟尿嘧啶(fluorouracil，F)、伊立替康(irinotecan，IRIN)和奥沙利铂(oxalipatin，OX))的组合。
在一些实施方案中，本文所提供的技术可用于治疗CLDN-18.2阳性胆道肿瘤。在涉及向患有CLDN-18.2阳性胆道肿瘤的对象施用所提供的药物组合物的一些实施方案中，这样的对象可以接受这样的所提供的组合物作为单一治疗或者作为包含这样的所提供的药物组合物和适用于治疗胆道肿瘤的化学治疗剂的组合治疗的一部分。在一些实施方案中，这样的化学治疗剂可以是吉西他滨和/或顺铂或者包含吉西他滨和/或顺铂。
本文中所述的药物组合物和方法可适用于患有CLDN-18.2阳性实体瘤的任何年龄的对象。在一些实施方案中，患有CLDN-18.2阳性实体瘤的对象是成年对象。
本文中所述的药物组合物可通过本领域已知的适当方法施用于有此需要的对象。例如，在一些实施方案中，所提供的药物组合物可以通过静脉内注射施用于患有CLDN-18.2阳性实体瘤的对象。
本文中所述的药物组合物的剂量可以随许多因素而变化，该因素包括例如但不限于待治疗对象的体重、癌症类型和/或癌症阶段，和/或单一治疗或组合治疗。在一些实施方案中，将本文中所述的药物组合物以至少一个或更多个(其包括，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或更多个)给药周期施用于患有CLDN-18.2阳性实体瘤的对象。在一些实施方案中，每个给药周期可以是三周给药周期。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物以每个给药周期至少一剂施用。在一些实施方案中，给药周期涉及施用设定数量和/或模式的剂量；在一些实施方案中，给药周期涉及施用设定的累积剂量，例如，在特定时间段内，并且任选地通过多个剂量，其可以例如以设定的间隔和/或根据设定的模式施用。在一些实施方案中，本文所述药物组合物的每个剂量或累积剂量可包含一种或更多种编码CLDN-18.2靶向抗体剂(无论其是由单一ssRNA编码还是两种或更多种ssRNA编码)的ssRNA，其量在0.1mg/kg至5mg/kg待施用对象体重的范围内。
本公开内容的另一个方面涉及在对象中递送CLDN-18.2靶向抗体剂以用于癌症治疗的方法的某些改进，该方法包括向癌症对象施用所提供的药物组合物。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可以实现一种或更多种改进，例如以降低的TEAE(例如，频率和/或严重程度)和/或效力水平与TEAE水平之间改善的关系(例如，改善的治疗窗)的有效施用，这相对于在施用相应的(例如，编码的)蛋白质(例如，抗原)剂本身时观察到的那些。特别地，本公开内容教导了这样的改进尤其可以通过经由施用核酸并且特别是编码其的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)递送IMAB362来实现。
产生CLDN-18.2靶向抗体剂的方法也在本公开内容的范围内。在一些实施方案中，产生CLDN-18.2靶向抗体剂的方法包括向细胞施用组合物，所述组合物包含至少一种ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)，其包含一个或更多个编码CLDN-18.2靶向抗体剂的编码区以使得这样的细胞表达并分泌由这样的ssRNA编码的CLDN-18.2靶向抗体剂。在一些实施方案中，待施用或靶向的细胞是肝细胞或包含肝细胞。
在一些实施方案中，细胞存在于细胞培养物中。
在一些实施方案中，细胞存在于对象中。在一些这样的实施方案中，本文中所述的药物组合物可以施用于有此需要的对象。在一些实施方案中，可以将这样的药物组合物施用于对象以使得CLDN-18.2靶向抗体剂以治疗相关血浆浓度产生。在一些实施方案中，治疗相关血浆浓度足以通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导癌细胞死亡。例如，在一些实施方案中，治疗相关血浆浓度为0.3至28μg/mL。
本公开内容还尤其提供了表征ssRNA或其组合物的一个或更多个特征的方法，其中ssRNA编码抗体剂的一部分或全部。在一些实施方案中，方法包括以下步骤：确定由引入到细胞中的至少一种mRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征，其中这样的至少一种mRNA包含至少一种或更多种ssRNA的一个或更多个特征，所述ssRNA包含编码相对于密蛋白-18.1多肽优先与密蛋白-18.2(CLDN-18.2)多肽结合的抗体剂的编码区，其中这样的一个或更多个特征包含：(i)抗体剂的蛋白质表达水平；(ii)抗体剂与CLDN-18.2的结合特异性；(iii)抗体剂通过ADCC介导靶细胞死亡的效力；以及(iv)抗体剂通过补体依赖性细胞毒性(CDC)介导靶细胞死亡的效力。
在一些实施方案中，本文所提供的是表征靶向CLDN-18.2的药物组合物的方法。这样的方法包括以下步骤：(a)使细胞与至少一种本文中所述的组合物或药物组合物(其编码CLDN-18.2靶向抗体剂的一部分或全部)接触；以及检测由细胞产生的抗体剂。在一些实施方案中，细胞可以是肝细胞或包含肝细胞。
在一些实施方案中，这样的方法还可包括确定由本文中所述的一种或更多种ssRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征，其中这样的一个或更多个特征包含：(i)抗体剂的蛋白质表达水平；(ii)抗体剂与CLDN-18.2多肽的结合特异性；(iii)抗体剂通过ADCC介导靶细胞死亡的效力；以及(iv)抗体剂通过补体依赖性细胞毒性(CDC)介导靶细胞死亡的效力。在一些实施方案中，确定由本文中所述的一种或更多种ssRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征的步骤可以包括将CLDN-18.2靶向抗体剂的这样的特征与参考CLDN-18.2靶向抗体的特征进行比较。
在一些实施方案中，确定由本文中所述的一种或更多种ssRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征的步骤可以包括评估抗体剂的蛋白质表达水平高于阈值水平。例如，在一些实施方案中，阈值水平对应于治疗相关血浆浓度。
在一些实施方案中，确定由本文中所述的一种或更多种ssRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征的步骤可以包括评估抗体剂与CLDN-18.2多肽的结合。在一些实施方案中，这样的结合评估可包括确定相对于抗体剂与CLDN18.1多肽的结合，所述抗体剂与CLDN-18.2多肽的结合。在一些实施方案中，这样的结合评估可以包括确定抗体剂的结合优先谱至少与参考CLDN-18.2靶向抗体的结合优先谱相当。例如，在一些实施方案中，参考CLDN-18.2靶向抗体是佐贝妥昔单抗或克劳西单抗。
在一些实施方案中，如果由本文中所述的一种或更多种ssRNA表达的抗体剂包含以下特征，则所提供的表征靶向CLDN-18.2的药物组合物或其组分的方法还可包括将该抗体剂表征为CLDN-18.2靶向抗体剂：(a)细胞所表达的抗体剂的蛋白质水平高于阈值水平；(b)抗体剂相对于CLDN18.1优先与CLDN-18.2结合；以及(c)通过ADCC和/或CDC介导对至少50％靶细胞(例如癌细胞)的杀伤。
在一些实施方案中，如果受试抗体特征与佐贝妥昔单抗或克劳西单抗的特征至少相当，则所提供的表征靶向CLDN-18.2的药物组合物或其组分的方法还可包括将由本文中所述的一种或更多种ssRNA表达的抗体剂表征为佐贝妥昔单抗或克劳西单抗等同抗体。
在涉及确定由本文中所述的一种或更多种ssRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征的步骤的一些实施方案中，这样的步骤可以包括确定以下特征中的一个或更多个：
·在接触或施用48小时之后评估时，细胞是否表达由至少一种ssRNA编码的CLDN-18.2靶向抗体剂；
·细胞所表达的抗体剂是否相对于CLDN18.1多肽优先与CLDN-18.2多肽结合；
·细胞所表达的抗体剂是否表现出与参考CLDN-18.2靶向单克隆抗体相当的针对CLDN-18.2的靶特异性，如在流式细胞术结合测定中所观察到的；
·在抗体剂存在下将免疫效应细胞(例如，PBMC细胞)与CLDN-18.2阳性细胞或CLDN-18.2阴性对照细胞孵育48小时之后进行评估时，是否是CLDN-18.2阳性细胞而不是对照细胞被裂解；
·细胞所表达的抗体剂是否表现出与如在相同浓度的参考CLDN-18.2靶向单克隆抗体的情况下观察到的至少相当的所靶向CLDN-18.2阳性细胞的ADCC谱；以及
·在抗体剂存在下将CLDN-18.2阳性细胞或CLDN-18.2阴性对照细胞与人血清一起孵育2小时之后进行评估时，是否是CLDN-18.2阳性细胞而不是对照细胞被裂解。
在一些实施方案中，在所提供的表征靶向CLDN-18.2的药物组合物或其组分的方法中使用的细胞存在于体内，例如存在于对象(例如哺乳动物对象，例如哺乳动物非人对象，例如小鼠或猴子对象)中。在一些这样的实施方案中，确定由本文中所述的一种或更多种ssRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征的步骤可包括确定在这样的对象的一个或更多个组织中的抗体水平。在一些实施方案中，如果本文中所述的组合物或药物组合物被表征为CLDN-18.2靶向抗体剂，则这样的表征方法还可以包括将这样的组合物或药物组合物施用于各自荷人CLDN-18.2阳性异种移植肿瘤的动物对象的组，以确定抗肿瘤活性。
在本公开内容的范围内还包括制造方法，其包括以下步骤：
(A)确定ssRNA或其组合物的一个或更多个特征，该ssRNA编码抗体剂的一部分或全部，该一个或更多个特征选自：
(i)ssRNA的长度和/或序列；
(ii)ssRNA的完整性；
(iii)ssRNA中一个或更多个化学部分的存在和/或位置；
(iv)当ssRNA被引入到细胞中时，抗体剂的表达程度；
(v)ssRNA或其组合物的稳定性；
(vi)来自已将ssRNA引入其中的生物体的生物样品中抗体剂的水平；
(vii)由ssRNA表达的抗体剂的结合特异性，任选地与CLDN-18.2且任选地相对于CLDN18.1的结合特异性；
(viii)抗体剂通过ADCC介导靶细胞死亡的效力；
(ix)抗体剂通过补体依赖性细胞毒性(CDC)介导靶细胞死亡的效力；
(x)组合物中脂质的身份和量/浓度；
(xi)组合物内脂质纳米粒的尺寸；
(xii)组合物内脂质纳米粒的多分散性；
(xiii)组合物内ssRNA的量/浓度；
(xiv)ssRNA在脂质纳米粒内的包封程度；和
(xv)其组合；
(B)将ssRNA或其组合物的这样的一个或更多个特征与适当参考标准的特征进行比较；以及
(C)(i)如果比较表明ssRNA或其组合物达到或超过参考标准，则将ssRNA或其组合物指定用于制造和/或分配的一个或更多个另外的步骤；或者
(ii)如果比较表明ssRNA或其组合物不符合或未超过参考标准，
则采取替代行动。
在制造方法的一些实施方案中，当评估ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)并且该ssRNA的一个或更多个特征达到或超过适当的参考标准时，将这样的ssRNA指定用于配制，其例如在一些实施方案中涉及用本文中所述的脂质颗粒进行配制。
在制造方法的一些实施方案中，当评估包含ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)的组合物并且该组合物的一个或更多个特征达到或超过适当的参考标准时，将这样的组合物指定用于组合物的释放和/或分配。
在制造方法的一些实施方案中，当ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)被指定用于配制，和/或包含ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)的组合物被指定用于组合物的释放和/或分配时，这样的方法还可以包括将制剂和/或组合物施用于各自荷人CLDN-18.2阳性异种移植肿瘤的动物对象的组，以确定抗肿瘤活性。
本文还提供了确定靶向CLDN-18.2的药物组合物的给药方案的方法。例如，在一些实施方案中，这样的方法包括以下步骤：(A)在预先确定的给药方案下将药物组合物(例如，本文中所述的药物组合物)施用于患有CLDN-18.2阳性实体瘤的对象；(B)在一段时间内定期监测或测量对象的肿瘤尺寸；(C)基于肿瘤尺寸测量评价给药方案。例如，如果在施用药物组合物(例如本文中所述的药物组合物)之后肿瘤尺寸的降低不是治疗相关的，则可以提高剂量和/或给药频率；或者如果在施用药物组合物(例如本文中所述的药物组合物)之后肿瘤尺寸的降低是治疗相关的，但在对象中显示出不良作用(例如毒性作用)，则可以降低剂量和/或给药频率。如果在施用药物组合物(例如本文中所述的药物组合物)之后肿瘤尺寸的降低是治疗相关的，并且在对象中没有显示出不良作用(例如，毒性作用)，则不对给药方案做出任何改变。
在一些实施方案中，这样的确定靶向CLDN-18.2的药物组合物的给药方案的方法可以在各自荷人CLDN-18.2阳性异种移植瘤的动物对象(例如哺乳动物非人对象)的组中进行。在一些这样的实施方案中，如果在施用药物组合物(例如本文中所述的药物组合物)之后，少于30％的动物对象表现出肿瘤尺寸的降低和/或由动物对象表现出的肿瘤尺寸降低的程度不是治疗相关的，则可以提高剂量和/或剂量频率；或者如果在施用药物组合物(例如本文中所述的药物组合物)之后肿瘤尺寸的降低是治疗相关的，但在至少30％的动物对象中显示出显著的不良作用(例如毒性作用)，则可以降低剂量和/或给药频率。如果在施用药物组合物(例如，本文中所述的药物组合物)后肿瘤尺寸的降低是治疗相关的，并且在动物对象中没有显示出显著的不良作用(例如，毒性作用)，则不对给药方案做出改变。
附图说明
图1示出了在原代人肝细胞和CHO-K1细胞中表达由分别编码CLDN-18.2靶向抗体的重链和轻链的两种RNA编码的CLDN-18.2靶向抗体(RiboMab01)。(图A)用0.22至55.50μg/mL包含分别编码CLDN-18.2靶向抗体(RB_RMAB01)的重链和轻链的两种或更多种RNA的组合物对原代人肝细胞进行脂质体转染。(左)转染之后48小时RiboMab01浓度的ELISA分析。(右)来自指定脂质体转染的细胞培养上清液的Western印迹分析。重组纯化的IMAB362用作Western印迹分析的参考。分析是在非还原条件下并用HRP缀合的抗人抗体进行的。Fcγ片段特异性和抗κ轻链特异性抗体的混合物用于检测全长IgG、游离重链(HC)和游离轻链(LC)。未经转染的原代人肝细胞的上清液用作模拟对照。(图B)CHO-K1细胞用2.00至182.00ng/mL RB_RMAB01进行脂质体转染。示出了转染之后48小时通过ELISA所测定的RiboMab01浓度。误差条是平均值的标准误差(n＝3)。
图2示出了RiboMab01与CLDN-18.2特异的靶标结合。RiboMab01与CLDN-18.2的靶向结合通过流式细胞术结合测定来确定，该测定使用针对人IgG(H+L)的F(ab′)2片段的荧光标记抗体进行可视化。将稀释行的含有RiboMab01的CHO-K1细胞培养上清液(图A和B，左)或IMAB362参考蛋白(图A和B，右)与5×105(图A)CLDN-18.2+或(图B)CLDN18.1+HEK293转染物一起孵育。
图3示出了由体外表达的RiboMab01介导的高靶特异性细胞细胞毒性。对来自用RB_RMAB01脂质体转染的CHO-K1细胞的含有RiboMab01的细胞培养物上清液进行(图A)ADCC和(图B)CDC测定。(图A)对于ADCC测定，CLDN-18.2+NUG-C4转染物用作靶细胞，并且CLDN-18.2阴性MDA-MB-231细胞用作对照细胞。三个不同健康供体的人PBMC被用作效应细胞(E:T比30:1)。将靶细胞或对照细胞和效应细胞与指定的RiboMab01和IMAB362参考蛋白浓度一起孵育48小时。示出了如在基于萤光素酶的测定中确定的特异性细胞裂解。(图B)对于CDC测定，CLDN-18.2+CHO-K1转染物(实线)用作靶细胞，并且CLDN-18.2-阴性CHO-K1(虚线)用作对照细胞。将靶细胞和对照细胞与指定浓度的人血清和RiboMab01一起孵育2小时。示出了在基于萤光素酶的测定中确定的CDC。误差条是平均值的标准误差(n＝3)。
图4示出了由小鼠中生成的RiboMab01介导的特异性肿瘤细胞裂解。在第5次注射之后24小时对用5次重复注射1μg(约0.04mg/kg)、3μg(约0.10mg/kg)、10μg(约0.40mg/kg)和30μg(约1.20mg/kg)RB_RMAB01或80μg(约3.20mg/kg)IMAB362进行给药的小鼠的血浆进行取样，并将其用于基于萤光素酶的体外ADCC测定。未经处理小鼠的掺有IMAB362的血浆用作测定参考。CLDN-18.2+NUG-C4转染物用作靶标，以及人PBMC用作效应细胞。(图A)示出了在用1％的血浆孵育48小时之后RiboMab01介导的NUG-C4细胞的ADCC。(图B)对靶阴性MDA-MB-231细胞没有非特异性裂解。误差条是平均值的标准误差(n＝3)。
图5示出了由非人灵长类表达的RiboMab01介导剂量依赖性ADCC。非人灵长类(Non-Human Primate，NHP)每周一次接受三个重复剂量的0.1、0.4或1.6mg/kg RB_RMAB01。在第一次注射之后24小时(黑条)和168小时(白条)取样的所有猴子的含有RiboMab01的血清用于基于萤光素酶的离体ADCC测定。CLDN-18.2+NUG-C4转染物用作靶细胞。来自两个不同健康供体(24小时、供体1，168小时、供体2)的人PBMC用作效应细胞。(图A)示出了在孵育48小时之后RiboMab01介导的NUG-C4细胞的ADCC。(图B)示出了对靶阴性MDA-MB-231细胞的非特异性裂解。误差条是平均值的标准误差(n＝3)。(图C)在第三次给药之后48小时收集的NHP No.14(1.6mg/kg RB_RMAB01，RiboMab01血清浓度232μg/mL)的血清用于基于萤光素酶的离体ADCC测定。CLDN-18.2+NUG-C4转染物(实线)用作靶细胞，CLDN-18.2阴性MDA-MB-231细胞(虚线)作为对照细胞。健康供体的人PBMC用作效应细胞。示出了由含有RiboMab01的血清(红色实线)或重组体-IMAB362参考蛋白(黑色实线)介导的NUG-C4细胞的ADCC，EC50分别为66pM和151pM。红色和黑色虚线表示对MDA-MB-231对照细胞的弱的非特异性裂解。孵育时间为48小时。误差条是平均值的标准误差(n＝3)。
图6示出了RiboMab01的全身可用性在体内介导肿瘤生长抑制。仅在肿瘤细胞接种之后测试第15、22、29、36、43和50天，荷皮下CLDN-18.2+NCI-N87异种移植肿瘤的小鼠接受IV注射1μg(约0.04mg/kg)、3μg(约0.10mg/kg)、10μg(约0.40mg/kg)和30μg(约1.20mg/kg)RB_RMAB01、800μg(约32mg/kg)IMAB362参考蛋白、30μg(约1.20mg/kg)萤光素酶mRNA或盐水。示出了处理组和对照组的中位肿瘤生长。虚线指示注射。通过双因素ANOVA计算显著性。ns表示不显著。
图7示出了在单次给药之后小鼠血清中RiboMab01的浓度-时间曲线。Balb/cJRj小鼠接受单次IV注射1μg(约0.040mg/kg)、3μg(约0.10mg/kg)、10μg(约0.40mg/kg)或30μg(约1.20mg/kg)RB_RMAB01药物产品以及40μg(约1.60mg/kg)IMAB362参考蛋白。在施用之后6、24、96、168、264、336和504小时对血浆进行取样。示出了通过ELISA测量的血浆中的RiboMab01浓度。误差条是平均值的标准误差(n＝3)。
图8示出了在单次给药之后大鼠血清中RiboMab01的浓度-时间曲线。RjHan:Wister大鼠接受单次IV注射0.04、0.10、0.40或1.20mg/kg的RB_RMAB01以及3.60mg/kgIMAB362参考蛋白。在施用之后2、6、8、10、22、24、27、30、48、72、96、168、216、264和336小时对血浆进行取样。示出了通过ELISA测量的血浆中的RiboMab01浓度。误差条是平均值的标准误差(n＝3)。
图9示出了在每周注射之后小鼠中RB_RMAB1表达的动力学。在测试第1、8、15、21和29天，Balb/cJRj小鼠接受IV注射1μg(约0.04mg/kg)、3μg(约0.10mg/kg)、10μg(约0.40mg/kg)和30μg(约1.20mg/kg)RB_RMAB01以及80μg(约3.2mg/kg)IMAB362参考蛋白。在给药之前24小时和给药之后24小时对血浆进行取样。示出了通过ELISA测量的血浆中的RiboMab01浓度。虚线指示注射。误差条是平均值的标准误差(n＝3)。
图10示出了在NHP中重复给药之后RB_RMAB01表达的动力学。NHP在测试第1、8和15天接受IV注射0.1、0.4或1.6mg/kg RB_RMAB01。在第1次和第3次给药之后6、24、48、72、96和168小时，和第2次给药之后48、72和168小时以及第3次给药之后264、336和504小时对血浆进行取样。示出了通过ELISA测量的血浆中的RiboMab01浓度。误差条是平均值的标准误差(n＝3)。
图11示出了LNP配制的mRNA在体内的肝靶向。小鼠接受单次IV注射LNP配制的萤火虫萤光素酶mRNA。在施用之后6、24、48、72和144小时监测生物发光。(图A)示出了在施用之后6小时的(左)个体小鼠在腹侧位置(n＝5)和(右)小鼠#1和2的单个器官的生物发光图像。(图B)示出了所有分析时间点(n＝5或3，平均值)的萤光素酶信号(光子/秒)的量化。LN表示***。
图12示出了可用于编码多种抗体剂形式(“RiboMab”)及其制剂的RNA技术及其应用的一些示例性实施方案。(图A)
Figure BDA0003871087100000171
平台适用于提供编码多种抗体形式的RNA构建体，该抗体形式包括例如但不限于单特异性抗体IgG、双特异性抗体bi-(scFv)2和双特异性抗体Fab-(svFv)2。(图B)在一些实施方案中，治疗性抗体例如IgG可由包含经修饰的核糖核苷酸(例如，被假尿苷替代的尿苷)mRNA的经纯化mRNA编码并包封在脂质纳米粒(mRNA/LNP)中。这样的mRNA构建体还可包含一个或更多个非编码序列元件(例如，以增强RNA稳定性和/或翻译效率)。在一些实施方案中，示例性非编码序列元件包括但不限于帽结构、5′UTR、3′UTR、聚腺苷酸尾及其任意组合。在一些实施方案中，脂质纳米粒可包含缀合脂质(例如，PEG-缀合脂质)、阳离子脂质和中性辅助脂质。这样的mRNA/LNP药物产品制剂可施用于对象体内，以使得mRNA在体内翻译以表达抗体。(图C)施用本文中所述的mRNA/LNP药物产品制剂的患者自身的体细胞能够产生由mRNA编码的活性药物(例如，IgG RiboMab)。例如，在一些实施方案中，在IV注射之后，编码抗体的mRNA/LNP被肝细胞内化和翻译，产生生物活性RiboMab的全身血浆浓度。缩写：A30L70，Poly(A)尾，测量100个被第30位处的接头消除的腺苷；bi，双特异性；C，C端；CDS，编码序列；CH，恒定重链结构域；CL，恒定轻链结构域；Fab，抗原结合片段；IgG，免疫球蛋白G；LNP，脂质纳米粒；m1Ψ，1-甲基假尿苷；N，N-端；scFv，单链可变片段；TAA，肿瘤相关抗原；UTR，非翻译区；VH，可变重链结构域；VL，可变轻链结构域。
图13是分别编码抗体剂的重链(HC)和轻链(LC)的示例性RNA构建体的示意图。如图13中所示，这样的编码HC和LC的RNA构建体形成RNA组合物(RB_RMAB01)，其在一些实施方案中可配制成脂质纳米粒以形成RNA/LNP药物产品制剂。缩写：Poly A，聚腺嘌呤尾；CH，恒定重链结构域；CL，恒定轻链结构域；Sec，分泌信号；UTR，非翻译区；VH，可变重链结构域；VL，可变轻链结构域。
图14是显示在tmax时食蟹猴中RB_RMAB01的剂量-暴露相关性的图。食蟹猴(n＝3)接受IV注射0.1、0.4或1.6mg/kg RB_RMAB01。描绘了在Cmax处通过ELISA测量的血浆中剂量依赖性RiboMab01浓度(平均值，n＝3)。绿线指示可以施用于人对象的剂量及其相应预期血清浓度。
图15是示例性RNA混合物的示例性电泳图，该混合物包含编码抗体重链(HC)的第一RNA和编码抗体轻链(LC)的第二RNA。电泳图分别示出了LC和HC的两个峰。A：峰下面积，h：峰高。
某些定义
约或大约：如本文所使用的术语“大约”或“约”在应用于一个或更多个目的值时是指与所述参考值相似的值。通常，熟悉上下文的本领域技术人员将理解上下文中“约”或“大约”所涵盖的相关变化程度。例如，在一些实施方案中，术语“大约”或“约”可以涵盖在参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内。
施用：如本文所使用的术语“施用”及其变化形式通常是指将组合物施用于对象以实现将作为组合物的药剂或包含在组合物中的药剂递送至靶部位或待治疗部位。本领域普通技术人员将意识到在适当情况下可用于向对象例如人施用的多种途径。例如，在一些实施方案中，施用可以是经眼、经口、肠胃外、表面等。在一些具体实施方案中，施用可以是经支气管(例如，通过支气管滴注)、***(buccal)、经皮(其可以是或包括例如表面用于真皮、皮内、皮间(interdermal)、透皮等中的一种或更多种)、经肠、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、室内(intraventricular)、在特定器官内(例如，肝内)、经黏膜、经鼻、经口、经直肠、皮下、舌下、表面、经气管(例如，通过气管内滴注)、经***、经玻璃体等。在一些实施方案中，施用可以是肠胃外的。在一些实施方案中，施用可以是经口的。在一些实施方案中，施用可以仅涉及单剂量。在一些实施方案中，施用可涉及施加固定数量的剂量。在一些实施方案中，施用可涉及间歇性(例如，在时间上隔开的多个剂量)和/或周期性(例如，由共同时段隔开的单独剂量)给药。在一些实施方案中，施用可涉及在至少所选择的时段内连续给药(例如，灌注)。
抗体剂：如本文所使用的术语“抗体剂”是指与特定抗原特异性地结合的药剂。在一些实施方案中，该术语涵盖包括足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件的任何多肽或多肽复合物。示例性抗体剂包括但不限于单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体剂可以包括一个或更多个恒定区序列，其是小鼠、兔、灵长类或人抗体所特有的。在一些实施方案中，如本领域已知的，抗体剂可包括一个或更多个序列元件，其是人源化的、灵长类化的、嵌合的等。在许多实施方案中，术语“抗体剂”用于指一个或更多个本领域已知的或开发的用于在替代呈现中利用抗体结构和功能特征的构建体或形式。例如，一些实施方案，根据本公开内容使用的抗体剂是选自但不限于以下的形式：完整的IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性或多特异性抗体(例如
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等)；抗体片段，例如Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fd′片段、Fd片段和分离的互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)或其组；单链Fv；多肽-Fc融合体；单结构域抗体(例如，鲨鱼单结构域抗体，例如IgNAR或其片段)；骆驼抗体；掩蔽抗体(例如，
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)；小型模块化免疫药物(“SMIPsTM”)；单链或串联双抗体
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VHH；
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微抗体；
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锚蛋白重复蛋白或
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DART；TCR样抗体；
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MicroProteins；
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和
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在一些实施方案中，抗体可缺乏如果天然产生其将具有的共价修饰(例如，聚糖的连接)。在一些实施方案中，抗体可以包含共价修饰(例如，聚糖、有效负载[例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等]或其他侧基[例如，聚乙二醇等]的连接。在许多实施方案中，抗体剂是多肽或包含多肽，其氨基酸序列包含一个或更多个由本领域技术人员识别为互补决定区(CDR)的结构元件；在一些实施方案中，抗体剂是多肽或包含多肽，其氨基酸序列包含与存在于参考抗体中的CDR基本相同的至少一个CDR(例如，至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR)。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本相同，因为与参考CDR相比，其序列相同或含有1至5个氨基酸替换。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本相同，因为其显示出与参考CDR具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本相同，因为其显示出与参考CDR具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本相同，因为与参考CDR相比，所包含的CDR中的至少一个氨基酸缺失、添加或替换，但所包含的CDR具有与参考CDR的氨基酸序列在其他情况下相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本相同，因为与参考CDR相比，所包含的CDR中的1至5个氨基酸缺失、添加或替换，但所包含的CDR具有与参考CDR在其他情况下相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本相同，因为与参考CDR相比，所包含的CDR中的至少一个氨基酸被替换，但所包含的CDR具有与参考CDR的氨基酸序列在在其他情况下相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包含的CDR与参考CDR基本相同，因为与参考CDR相比，所包含的CDR中的1至5个氨基酸缺失、添加或替换，但所包含的CDR具有与参考CDR在在其他情况下相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体剂是多肽或包含多肽，其氨基酸序列包含由本领域技术人员识别为免疫球蛋白可变结构域的结构元件。在一些实施方案中，抗体剂是具有与免疫球蛋白结合结构域同源或在很大程度上同源的结合结构域的多肽蛋白。
抗体剂可由技术人员使用本领域中已知的方法和可商购获得的服务和试剂盒来制备。例如，单克隆抗体的制备方法是本领域公知的，并且包括杂交瘤技术和噬菌体展示技术。适合在本公开内容中使用的另一些抗体描述于例如以下出版物中：Antibodies ALaboratory Manual,Second edition.Edward A.Greenfield.Cold Spring HarborLaboratory Press(2013年9月30日)；Making and Using Antibodies:A PracticalHandbook,Second Edition.Eds.Gary C.Howard and Matthew R.Kaser.CRC Press(2013年7月29日)；Antibody Engineering:Methods and Protocols,Second Edition(Methodsin Molecular Biology).Patrick Chames.Humana Press(2012年8月21日)；MonoclonalAntibodies:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology).Eds.VincentOssipow and Nicolas Fischer.Humana Press(2014年2月12日)；以及Human MonoclonalAntibodies:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology).MichaelSteinitz.Humana Press(2013年9月30日))。
抗体可以通过标准技术(例如通过用合适的多肽或其部分免疫接种，或通过使用噬菌体展示文库)产生。如果期望多克隆抗体，则用带有期望的表位的免疫原性多肽(任选地与另一多肽半抗原化)对选定的哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊、马等)进行免疫接种。根据宿主物种，可以使用多种佐剂来提高免疫应答。这样的佐剂包括但不限于弗氏(Freund′s)、矿物凝胶例如氢氧化铝、和表面活性物质例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔戚血蓝蛋白和二硝基苯酚。根据已知操作收集和处理来自经免疫接种动物的血清。如果含有针对期望表位的多克隆抗体的血清含有针对其他抗原的抗体，则可以通过免疫亲和色谱或本领域中已知的任何其他方法来纯化多克隆抗体。用于产生和加工多克隆抗血清的技术在本领域中是公知的。
与......相关：如该术语在本文中使用的，如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另一事件或实体的存在、水平和/或形式相关，则这两个事件或实体彼此“相关”。例如，如果特定生物学现象(例如，CLDN-18.2的表达)的存在与特定疾病、障碍或病症(例如癌症)(例如，在相关群体中)的发生率和/或易感性或对治疗响应的可能性相关，则认为其与该疾病、障碍和病症相关。
血液来源的样品：如本文所使用的术语“血液来源的样品”是指来源于有此需要的对象的血液样品(即全血样品)的样品。血液来源的样品的实例包括但不限于血浆(其包括例如新鲜冷冻血浆)、血清、血液级分、血浆级分、血清级分、血液级分(包括红细胞(redblood cell，RBC)、血小板、白细胞等)和包括其级分的细胞裂解物(例如，可以收获细胞，例如红细胞、白细胞等并将其裂解以获得细胞裂解物)。在一些实施方案中，可用于本文所述表征的血液来源的样品是血浆样品。
癌症：本文中使用的术语“癌症”一般是指疾病或病症，其中目的组织的细胞表现出相对异常、不受控制和/或自主生长，使得其表现出异常生长表型，其特征在于对细胞增殖的控制显著丧失。在一些实施方案中，癌症可包含癌前(例如良性)、恶性、转移前、转移性和/或非转移性的细胞。在一些实施方案中，癌症可以以实体瘤为特征。在一些实施方案中，癌症可以以血液肿瘤为特征。通常，本领域中已知的不同类型癌症的实例包括例如造血***癌症，包括白血病、淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)、骨髓瘤和骨髓增生性疾病；肉瘤；黑素瘤；腺瘤；实体组织癌；口、喉、咽和肺鳞状细胞癌；肝癌；泌尿生殖***癌，例如***癌、***、膀胱癌、子宫癌和子宫内膜癌；以及肾细胞癌；骨癌；胰腺癌；皮肤癌；皮肤或眼内黑素瘤；内分泌***癌、甲状腺癌；甲状旁腺癌；头颈癌；卵巢癌；乳腺癌；胶质母细胞瘤；结直肠癌；胃肠癌和神经***癌症；良性病变例如***状瘤等。
帽：如本文所使用的术语“帽”是指包含通常与未加帽的RNA(例如，具有5′-二磷酸的未加帽的RNA)的5′-端连接的核苷-5′-三磷酸或基本上由其组成的结构。在一些实施方案中，帽是鸟嘌呤核苷酸或包含鸟嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，帽是或包含天然存在的RNA 5′帽，其包括例如但不限于7-甲基鸟苷帽，其具有定名为“m7G”的结构。在一些实施方案中，帽是或包含合成的帽类似物，其类似于RNA帽结构并且具有稳定RNA(如果与其连接的话)的能力，其包括例如但不限于本领域中已知的抗反向帽类似物(anti-reverse capanalog，ARCA)。本领域中技术人员将理解将帽与RNA 5′端连接的方法是本领域中已知的。例如，在一些实施方案中，可以通过用加帽酶***(其包括例如但不限于牛痘加帽酶***或酿酒酵母加帽酶***)在体外对具有5′三磷酸基团的RNA或具有5′二磷酸基团的RNA进行加帽来获得加帽RNA。或者，可使用本领域中已知的方法通过单链DNA模板的体外转录(invitro transcription，IVT)获得加帽RNA，其中除GTP外，IVT***还包含二核苷酸帽类似物(其包括例如m7GpppG帽类似物或N7-甲基，2′-O-甲基-GpppG ARCA帽类似物或N7-甲基，3′-O-甲基-GpppG ARCA帽类似物)。
CLDN-18.2阳性：如本文所使用的术语“CLDN-18.2阳性”或“CLDN-18.2+”是指临床相关的CLDN-18.2表达和/或活性，例如，可以与特定疾病、障碍或病症相关和/或可以在可以是或包含一个或更多个细胞或组织样品的样品中或样品上检测到。在一些实施方案中，CLDN-18.2+是指与临床相关的CLDN-18.2表达和/活性相关的癌症。在某些示例性实施方案中，CLDN-18.2阳性表达和/或活性可以是从头CLDN-18.2过表达或包含从头CLDN-18.2过表达，例如在癌细胞中；作为替代或补充，在一些实施方案中，CLDN-18.2阳性表达和/或活性可以与或已经与暴露于一种或更多种药剂或病症例如一种或更多种化学治疗剂(其包括，例如，吉西他滨和/或顺铂)相关。在一些实施方案中，相对于适当的参考(例如，“阴性对照”，例如适当可比的非癌细胞和/或组织中的CLDN-18.2水平和/或活性；“阳性对照”，例如如可以已经针对已知CLDN-18.2阳性细胞和/或组织确定的CLDN-18.2水平和/或活性；和/或与正常(例如健康、非癌症)相对于非正常(例如癌症)状态相关的CLDN-18.2水平和/或活性的既定阈值)评估CLDN-18.2“阳性”。在一些实施方案中，当样品已被确定为相对于适当的参考(例如，在被确定为或在其他情况下已知为CLDN-18.2表达呈阴性的样品中所观察到的水平)显示出可检测的CLDN-18.2蛋白表达升高时，本文中使用术语“CLDN-18.2+”指代来自癌症患者的肿瘤样品。在一些实施方案中，当如在经***固定石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织中通过免疫组织化学测定所评估的，确定样品中≥50％的肿瘤细胞具有≥2+CLDN-18.2蛋白染色强度时，样品被认为是CLDN-18.2+；本领域技术人员意识到病理学家通常使用这样的评分***用于解释关于肿瘤样品获得的IHC数据。参见例如Fedchenko andReifenrath,Diagnostic Pathology(2014)9:221，其描述了用于解释和报告IHC分析结果(其包括评分***)的不同方法。另见Zimmermann et al.,Cancer Cytopathology(2014)48-58。因此，病理学家将容易地认识到2+是指分级评分为2或更高，其表明这样的免疫组织化学测定结果是清楚的。更准确地，2+描述了负”(0)、“弱”(1)、“中度”(2)、“强”(3)的定性量表中的中度或强染色。
共施用：如本文所使用的术语“共施用”是指本文中所述的药物组合物与另一种治疗(例如，手术、放射和/或施用另一种治疗剂，例如本文中所述的化学治疗剂，和/或减轻相关疾病、障碍或病状和/或所施用的治疗[例如，化学治疗]的一个或更多个症状或属性的药剂)组合使用，使得对象接受二者。本文中所述的药物组合物和这样的其他治疗的组合施用可以同时(例如，通过重叠方案)或分开(例如，以任何顺序依次)进行。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可以包括两种或更多种活性剂，其组合在一种可药用载体中(例如，以单一剂型)。或者，在一些实施方案中，共施用涉及施用两种或更多种物理上不同的药物组合物，其各自可包含不同的活性剂或药剂组合；在一些这样的实施方案中，一个或更多个(并且在一些实施方案中，所有)剂量的这样的不同的药物组合物可以基本上同时施用。在一些实施方案中，一个或更多个(并且在一些实施方案中，所有)剂量的这样的不同的药物组合物可以分开施用，例如，根据重叠方案或顺序方案。通常，当两种或更多种治疗在足够接近的时间内递送或施用以至于每种治疗对靶细胞或其所施用的对象产生的生物学效应中至少有一些时间重叠时，可以认为其是“共施用的”。
组合治疗：如本文所使用的术语“组合治疗”是指其中对象同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如两种或更多种治疗剂)的那些情况。在一些实施方案中，可以同时施用两种或更多种方案；在一些实施方案中，这样的方案可以依次施用(例如，第一方案的所有“剂量”在第二方案的任何剂量施用之前施用)；在一些实施方案中，这样的药剂以重叠给药方案施用。在一些实施方案中，组合治疗的“施用”可以包括将一种或更多种药剂或模式施用于接受组合中的其他药剂或模式的对象。为清楚起见，组合治疗不要求单独的药剂以单一组合物(或甚至必须在同时)一起施用，但是在一些实施方案中，两种或更多种药剂或其活性部分可以以组合组合物一起施用。
相当的：本文中使用的术语“相当的”是指两种或更多种的药剂、实体、情况、条件组等，其可能彼此不相同但足够相似以允许在其之间进行比较，使得本领域技术人员将理解可基于观察到的差异或相似之处合理地得出结论。在一些实施方案中，相当的条件、环境、个体或群体的组的特征在于多个基本相同的特征和一个或少量变化的特征。本领域普通技术人员将理解，在上下文中，在任何给定情况下，两种或更多种这样的药剂、实体、情况、条件组等需要什么程度的同一性才能被认为是相当的。例如，本领域普通技术人员将理解，在以下时环境、个体或群体的组之间是彼此相当的：特征在于具有足够数目和类型的基本相同特征以保证合理的结论—在不同的环境、个体或群体的组下或情况下获得的结果或观察到的现象的差异是由这些变化的特征的变化引起的或者指示了这些变化的特征的变化。
互补的：如本文所使用的术语“互补的”用于提及与碱基配对规则相关的寡核苷酸杂交。例如，序列“C-A-G-T”与序列“G-T-C-A”互补。互补性可以是部分的或全部的。因此，任何程度的部分互补性旨在包括在术语“互补的”的范围内，条件是该部分互补性允许寡核苷酸杂交。部分互补性是根据碱基配对规则，其中一个或更多个核酸碱基不匹配。核酸之间的全部或完全互补性是其中各个和每个核酸碱基在碱基配对规则下与另一个碱基匹配。
接触：如本文可互换使用的，术语“递送”及其变化形式或“接触”是指将相关靶标(例如，细胞、组织、生物体等)暴露于ssRNA或者包含或递送其的组合物(如本文中所述的)，使得ssRNA被递送到靶细胞(例如，靶细胞的胞质溶胶)中。靶细胞可以在体外或离体培养或者存在于对象中(体内)。本领域技术人员将理解不同的接触方法可用于在体外、离体或体内应用中实现向靶细胞的这样的递送。在一些实施方案中，接触培养物中的细胞可以是或包括体外转染。在一些实施方案中，接触可以利用一种或更多种递送载剂(例如，本文中所述的脂质纳米粒)。在一些实施方案中，接触可以是向对象施用本文中所述的药物组合物或包括向对象施用本文中所述的药物组合物。
检测：术语“检测”在本文中广泛使用以包括确定在样品中是否存在目的实体或目的实体的任何测量形式的适当手段。因此，“检测”可包括确定、测量、评估或测定目的实体的存在或不存在、水平、数量和/或位置。包括定量和定性测定、测量或评估，其包括半定量。这样的测定、测量或评估可以是相对的(例如当目的实体相对于对照参考是检测到的时)，或者可以是绝对的。因此，当在量化目的实体的上下文中使用时，术语“量化”可以指绝对或相对量化。绝对量化可以通过将检测到的目的实体的水平与已知的对照标准相关联(例如，通过标准曲线的生成)来完成。或者，相对量化可以通过比较两种或更多种不同目的实体之间的检测水平或量，以提供两种或更多种不同目的实体中的每一个的相对量化(即，相对于彼此)来完成。
疾病：如本文所使用的术语“疾病”是指通常在对象(例如，人对象)中损害组织或***的正常功能并且通常表现为特征性体征和/或症状的障碍或病症。在一些实施方案中，示例性疾病是癌症。
编码：如本文所使用的术语“编码(encode)”或其变化形式是指指导具有限定的核苷酸序列(例如，mRNA)或限定的氨基酸序列的第二分子的产生的第一分子的序列信息。例如，DNA分子可以编码RNA分子(例如，通过包括DNA依赖性RNA聚合酶酶的转录过程)。RNA分子可以编码多肽(例如，通过翻译过程)。因此，如果在细胞或其他生物***中对应于基因的mRNA的转录和翻译产生多肽，则该基因、cDNA或ssRNA(例如，mRNA)编码多肽。在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA的编码区是指编码链，其核苷酸序列与这样的CLDN-18.2靶向抗体剂的mRNA序列相同。在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA的编码区是指这样的CLDN-18.2靶向抗体剂的非编码链，其可用作用于基因或cDNA的转录的模板。
表位：如本文所使用的术语“表位”包括被免疫球蛋白(例如，抗体或受体)结合组分或适配体特异性识别的任何部分。在一些实施方案中，表位由抗原上的多个化学原子或基团构成。在一些实施方案中，当抗原采用相关的三维构象时，这样的化学原子或基团是表面暴露的。在一些实施方案中，当抗原采用这样的构象时，这样的化学原子或基团在空间中彼此物理靠近。在一些实施方案中，当抗原采用替代构象(例如，是线性化的)时，至少一些这样的化学原子是彼此物理分离的基团。
表达：如本文所使用的核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或更多个：(1)从DNA序列中产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5′帽形成和/或3′端形成)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
5′非翻译区(Five prime untranslated region)：如本文所使用的术语“5′非翻译区”或“5′UTR”指的是mRNA分子的这样的序列，其开始于转录开始位点并且结束于RNA编码区的起始密码子(通常为AUG)之前的一个核苷酸(nt)。
同源的：如本文所使用的术语“同源的”或“同源物”是指多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子的序列为至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一，则认为其彼此是“同源的”。在一些实施方案中，如果多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子的序列为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％相似(例如在相应位置处含有具有相关化学性质的残基)，则认为其彼此是“同源的”。例如，如本领域普通技术人员公知的，某些氨基酸通常被分类为彼此类似于“疏水”或“亲水”氨基酸，和/或具有“极性”或“非极性”侧链。将一种氨基酸替换为相同类型的另一种氨基酸通常可被认为是“同源”替换。
同一性：如本文所使用的术语“同一性”是指多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果多核苷酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)和/或多肽分子的序列为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一，则认为其是彼此“基本同一的”。例如，两个核酸或多肽序列的同一性百分比的计算可出于最佳比较目的通过比对两个序列来进行(例如，出于最佳比对可在第一和第二序列中的一者或二者中引入空位而且出于比较目的可忽略不相同的序列)。在某些实施方案中，出于比较目的而比对的序列的长度是参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或基本上100％。然后比较相应位置处的核苷酸。当第一个序列中的位置被与第二个序列中的相应位置相同的残基(例如核苷酸或氨基酸)占据时，则分子在该位置处是相同的。考虑到空位的数目和每个空位(为了两个序列的最佳比对而需要引入)的长度，两个序列之间同一性百分比是由序列共有的相同位置的数目的函数。可使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定。例如，可以使用Meyers和Miller，1989的算法(该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0))确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。在一些示例性实施方案中，用ALIGN程序进行的核酸序列比较使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。或者，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用GCG软件包中的GAP程序使用NWSgapdna.CMP矩阵来确定。
局部晚期肿瘤：如本文所使用的术语“局部晚期肿瘤”或“局部晚期癌症”是指其本领域公认的含义，其可以随不同类型的癌症变化。例如，在一些实施方案中，局部晚期肿瘤是指较大但尚未扩散到另一身体部位的肿瘤。在一些实施方案中，局部晚期肿瘤用于描述已经在其开始的组织或器官之外生长但尚未扩散到对象体内远处部位的癌症。仅举例来说，在一些实施方案中，局部晚期胰腺癌通常是指具有肿瘤扩展至邻近器官(例如，***、肝、十二指肠、肠系膜上动脉和/或腹腔干)但没有转移性疾病迹象的III期疾病；然而，病理切缘(margin)为阴性的完全手术切除是不可能的。
核酸/多核苷酸：如本文所使用的术语“核酸”是指至少10个或更多个核苷酸的聚合物。在一些实施方案中，核酸是DNA或包含DNA。在一些实施方案中，核酸是RNA或包含RNA。在一些实施方案中，核酸是肽核酸(PNA)或包含肽核酸(PNA)。在一些实施方案中，核酸是单链核酸或包含单链核酸。在一些实施方案中，核酸是双链核酸或包含双链核酸。在一些实施方案中，核酸包含单链部分和双链部分二者。在一些实施方案中，核酸包含含有一个或更多个磷酸二酯键的骨架。在一些实施方案中，核酸包含含有磷酸二酯和非磷酸二酯键二者的骨架。例如，在一些实施方案中，核酸可包含含有一个或更多个硫代磷酸酯或5′-N-亚磷酰胺键和/或一个或更多个肽键的骨架，例如在“肽核酸”中。在一些实施方案中，核酸包含一个或更多个或所有天然残基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。在一些实施方案中，核酸包含一个或更多个或所有非天然残基。在一些实施方案中，非天然残基包含核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、6-O-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、***的碱基及其组合)。在一些实施方案中，与天然残基中的那些相比，非天然残基包含一个或更多个经修饰的糖(例如，2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、***糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能性基因产物例如RNA或多肽的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸具有包含一个或更多个内含子的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸可以通过从天然来源分离、酶促合成(例如，通过基于互补模板的聚合，例如，在体内或体外、在重组细胞或***中增殖，或化学合成来制备。在一些实施方案中，核酸为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、或20,000个或更多个残基或核苷酸长。
核苷酸：如本文所使用的术语“核苷酸”是指其本领域公认的含义。当核苷酸的数量被用作(例如多核苷酸的)尺寸的指示时，特定的核苷酸数量是指(例如多核苷酸的)单链上的核苷酸数量。
患者：如本文所使用的术语“患者”是指任何患有疾病或障碍或病症或者处于疾病或障碍或病症风险之中的生物体。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类和/或人)。在一些实施方案中，患者是人。在一些实施方案中，患者患有或易患一种或更多种疾病或障碍或病症。在一些实施方案中，患者表现出疾病或障碍或病症的一种或更多种症状。在一些实施方案中，患者已被诊断出患有一种或更多种疾病或障碍或病症。在一些实施方案中，对所提供的技术适用的疾病或障碍或病症是或包括癌症，或存在一种或更多种肿瘤。在一些实施方案中，患者正在接受或已经接受特定治疗以诊断和/或治疗疾病、障碍或病症。在一些实施方案中，患者是癌症患者。
多肽：如本文所使用的术语“多肽”通常具有其本领域公认的含义—至少三个或更多个氨基酸的聚合物。本领域普通技术人员将理解，术语“多肽”旨在充分概括以不仅涵盖具有本文所述完整序列的多肽，而且还涵盖表示这样的完整多肽的功能性、生物活性或特征性片段、部分或结构域(例如，保留至少一种活性的片段、部分或结构域)的多肽。在一些实施方案中，多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或二者和/或可含有本领域中已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一个。有用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，多肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合(例如，可以是肽模拟物或包含肽模拟物)。
参考/参考标准：如本文所使用的“参考”描述相对于其进行比较的标准或对照。例如，在一些实施方案中，将目的药剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照药剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，参考或对照与目的测试或测定基本上同时进行测试和/或测定。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地体现在有形介质中。在一些实施方案中，参考或对照是或包含一组规范(例如，相关的接受标准)。通常来说，如本领域技术人员所理解的，参考或对照在与评估下的条件或情况相当的条件或情况下进行测定或表征。当存在足够的类似性以证明对特定的可能参考或对照的依赖和/或与特定的可能参考或对照进行比较时，本领域技术人员将理解。
核糖核苷酸：如本文所使用的术语“核糖核苷酸”包括未经修饰的核糖核苷酸和经修饰的核糖核苷酸。例如，未经修饰的核糖核苷酸包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核糖核苷酸可包括一种或更多种修饰，其包括但不限于例如(a)末端修饰，例如5′端修饰(例如磷酸化、去磷酸化、缀合、反向连接等)、3′端修饰(例如，缀合、反向连接等)，(b)碱基修饰，例如，用经修饰的碱基、稳定碱基、去稳定碱基或与扩展的配偶体库碱基配对的碱基或者缀合碱基进行替换，(c)糖修饰(例如，在2′位置或4′位置处)或糖替换，以及(d)核苷间键修饰，其包括磷酸二酯键的修饰或替换。术语“核糖核苷酸”还涵盖三磷酸核糖核苷酸，其包括经修饰的和未经修饰的三磷酸核糖核苷酸。
核糖核酸(RNA)：如本文所使用的术语“RNA”是指核糖核苷酸的聚合物。在一些实施方案中，RNA是单链的。在一些实施方案中，RNA是双链的。在一些实施方案中，RNA包含单链部分和双链部分二者。在一些实施方案中，RNA可以包含如上文“核酸/多核苷酸”的定义中所述的骨架结构。RNA可以是调节RNA(例如siRNA、微RNA等)或信使RNA(mRNA)。在一些实施方案中，其中RNA是mRNA。在其中RNA是mRNA的一些实施方案中，RNA通常在其3′端包含poly(A)区。在其中RNA是mRNA的一些实施方案中，RNA通常在其5′端包含本领域公认的帽结构，例如，用于识别mRNA并将其与核糖体连接以启动翻译。在一些实施方案中，RNA是合成RNA。合成RNA包括体外(例如，通过酶促合成方法和/或通过化学合成方法)合成的RNA。
选择性的或特异性的：本领域技术人员理解，在本文中与具有活性的药剂相关使用时，术语“选择性的”或“特异性的”意指药剂区分潜在的靶标实体、状态或细胞。例如，在一些实施方案中，如果药剂在存在一种或更多种竞争替代靶标的情况下优先与其靶标结合，则称其与该靶标“特异性地”结合。在许多实施方案中，特异性相互作用取决于靶标实体的特定结构特征(例如，表位、槽(cleft)、结合位点)的存在。应当理解，特异性不必是绝对的。在一些实施方案中，特异性可以相对于一种或更多种其他潜在靶标实体(例如，竞争者)的靶标结合部分的特异性来评价。在一些实施方案中，特异性相对于参考特异性结合部分的特异性来评价。在一些实施方案中，特异性相对于参考非特异性结合部分的特异性来评价。在一些实施方案中，由一种或更多种ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)编码的CLDN-18.2靶向抗体剂在与CLDN-18.2多肽结合的条件下不与竞争替代靶标(例如，CLDN18.1多肽)可检测地结合。在一些实施方案中，CLDN-18.2靶向抗体剂与CLDN-18.2多肽以与其竞争替代靶标(包括，例如，CLDN18.1多肽)相比更高的结合率、更低的解离率、提高的亲和力、减少的解离和/或提高的稳定性结合。
特异性结合：如本文所使用的术语“特异性结合”是指在其中发生结合的环境中区分可能的结合配偶体的能力。与一个特定靶标在存在其他潜在靶标时相互作用的抗体剂被称为“特异性地结合”与其相互作用的靶标。在一些实施方案中，特异性结合通过检测或确定抗体剂的CDR与其配偶体之间的关联程度来评估；在一些实施方案中，特异性结合通过检测或确定抗体剂-配偶体复合物的解离程度来评估；在一些实施方案中，特异性结合通过检测或确定抗体剂竞争其配偶体与另一实体之间的替代相互作用的能力来评估。在一些实施方案中，特异性结合通过在一定浓度范围内进行这样的检测或测定来评估。
对象：如本文所使用的术语“对象”是指待施用本文中所述的组合物的生物体，例如，用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的对象包括动物(例如，哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔子、非人灵长类、家养宠物等)和人。在一些实施方案中，对象是人对象。在一些实施方案中，对象患有疾病、障碍或病症(例如，癌症)。在一些实施方案中，对象易患疾病、障碍或病症(例如，癌症)。在一些实施方案中，对象表现出疾病、障碍或病症(例如癌症)的一个或更多个症状或特征。在一些实施方案中，对象表现出疾病、障碍或病症(例如癌症)的一个或更多个非特定症状。在一些实施方案中，对象不表现出疾病、障碍或病症(例如，癌症)的任何症状或特征。在一些实施方案中，对象是具有对疾病、障碍或病症(例如癌症)的易感性或风险特性的一个或更多个特征的人。在一些实施方案中，对象是患者。在一些实施方案中，对象是向其施用和/或已施用诊断和/或治疗的个体。
易患有：“易患有”疾病、障碍或病症的个体是处于发生所述疾病、障碍或病症的风险之中的个体。在一些实施方案中，易患有疾病、障碍或病症的个体不表现出该疾病、障碍或病症的任何症状。在一些实施方案中，易患有疾病、障碍或病症的个体尚未被诊断出患有该疾病、障碍和/或病症。在一些实施方案中，易患疾病、障碍或病症的个体是已经暴露于与该疾病、障碍或病症的发生相关的环境的个体。在一些实施方案中，发生疾病、障碍和/或病症的风险是基于群体的风险(例如，患有该疾病、障碍或病症的个体的家庭成员；与该疾病、障碍或病症相关的遗传标志物或其他生物标志物的携带者，等)。
患有：“患有”疾病、障碍和/或病症的个体已被诊断出具有和/或表现出疾病、障碍或病症的一个或更多个症状。
合成的：如本文所使用的术语“合成的”是指是人工的实体，或通过人干预制成的实体，或由合成而非天然发生产生的实体。例如，在一些实施方案中，合成核酸或多核苷酸是指化学合成(例如在一些实施方案中通过固相合成)的核酸分子。在一些实施方案中，术语“合成的”是指在生物细胞之外制成的实体。例如，在一些实施方案中，合成的核酸或多核苷酸是指使用模板通过体外转录产生的核酸分子(例如，RNA)。
治疗剂：如本文可互换使用的，短语“治疗剂”或“治疗”是指当施用于对象或患者时，具有治疗作用和/或引发期望的生物学和/或药理学作用的药剂或干预。在一些实施方案中，治疗剂或治疗是可用于减轻、改善、缓解、抑制、预防疾病、障碍和/或病症的一个或更多个症状或特征、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发生率的任何物质。在一些实施方案中，治疗剂或治疗是医学干预(例如，手术、放射、光线治疗)，其可以被进行以减轻、缓解、抑制、预防疾病、障碍和/或病症的一个或更多个症状或特征、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发生率。
3′非翻译区：如本文所使用的术语“3′非翻译区”或“3′UTR”是指mRNA分子的在开放阅读框序列的编码区的终止密码子之后开始的序列。在一些实施方案中，3′UTR在开放阅读框序列的编码区的终止密码子之后即刻开始。在另一些实施方案中，3′UTR不在开放阅读框序列的编码区的终止密码子之后即刻开始。
阈值水平(例如，接受标准)：如本文所使用的术语“阈值水平”是指用作参考以获得关于测量结果(例如，在测定中获得的测量结果)的信息和/或对测量结果(例如，在测定中获得的测量结果)进行分类的水平。例如，在一些实施方案中，阈值水平意指在限定群体的两个子集(例如，满足品质控制标准的批次相对于不满足品质控制标准的批次)之间的分界线的测定中测量的值。因此，等于或高于阈值水平的值限定群体的一个子集，并且低于阈值水平的值限定群体的另一个子集。阈值水平可以基于一个或更多个对照样品或者在对照样品群之间确定。阈值水平可以在进行目的测量之前、同时或之后确定。在一些实施方案中，阈值水平可以是值的范围。
治疗：本文中使用的术语“治疗”及其变化形式是指用于部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防疾病、障碍和/或病症的一个或更多个症状或特征、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发生率的任何方法。治疗可向未表现出疾病、障碍和/或病症的体征的对象施用。在一些实施方案中，治疗可向仅表现出疾病、障碍和/或病症的早期体征的对象施用，例如以用于降低发生与所述疾病、障碍和/或病症相关的病理状况之风险的目的。在一些实施方案中，治疗可以向处于疾病、障碍和/或病症后期的对象施用。
不可切除的肿瘤：如本文所使用的术语“不可切除的肿瘤”通常是指这样的肿瘤，其以一个或更多个特征为特征，所述特征根据合理的医学判断被认为表明肿瘤不能安全地(例如，对对象没有过度的伤害)通过手术去除；和/或对于该肿瘤，有能力的医学专业人士已确定肿瘤切除对对象的风险超过与这样的切除相关的益处。在一些实施方案中，不可切除的肿瘤是指这样的肿瘤，其涉及和/或已经长成必需器官或组织(包括可能无法重建的血管)，和/或位于不能容易地通过手术进入否则会对一个或更多个其他关键或必需器官和/或组织(包括血管)造成不合理的损害风险的位置。在一些实施方案中，肿瘤的“不可切除性”是指实现切缘阴性(R0)切除的可能性。在胰腺癌的情况下，肿瘤对大血管例如肠系膜上动脉(superior mesenteric artery，SMA)或腹腔轴的包绕(encasement)、门静脉阻塞以及腹腔或主动脉旁***病的存在通常被认为是排除R0手术的发现。本领域技术人员将了解确定肿瘤是否是不可切除的参数。
阅读本说明书的本领域技术人员将理解，在许多实施方案中，标准技术是可用的并且可用于重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和/或转化(例如，电穿孔、脂质体转染、转染)。酶促反应和/或纯化技术通常可以根据制造商的说明或如本领域中通常实行的或如本文中所述的进行。在许多实施方案中，前述技术和操作通常可以根据本领域公知的常规方法进行，并且如在说明书通篇所引用和所讨论的多种一般和更具体的参考文献中所述。参见例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，其出于任何目的通过引用并入本文。
具体实施方式
对于许多癌症患者，并且特别是对于患有复发性或难治性晚期实体瘤的患者，标准护理(Standard of Care，SOC)治疗的结果仍然很差。治疗选择通常还包括姑息性化学治疗(其在先前反复暴露于细胞毒性化合物之后可能耐受性较差)或最佳支持性护理，以及未证实获益的研究性治疗。该群体中的治疗不是可治愈的，预计总存活为数月。免疫治疗已成为一些具有高度未满足医疗需求的癌症的有效治疗选择。具体地，免疫检查点抑制剂被批准用于治疗多种癌症适应证，并通过激活预先存在的抗肿瘤特异性T细胞发挥作用。用于多种癌症类型的医学需求仍然很高。本公开内容尤其提供了用靶向密蛋白-18.2(CLDN-18.2)的治疗用于治疗癌症(例如，胰腺癌和/或胆管癌)的见解和技术。
在一些实施方案中，本公开内容尤其提供了用于递送靶向CLDN-18.2的单克隆抗体(其将有效的抗肿瘤特征和优异的安全特性二者组合)的RNA技术，跳过了缓慢和繁琐的抗体制造过程的障碍。不希望受任何特定理论的束缚，本公开内容提出了这样的RNA递送模式可以实现一种或更多种改进，例如以降低的治疗紧急不良事件(“TEAE”)发生率(例如，频率和/或严重程度)和/或效力水平与TEAE水平之间改善的关系(例如，改善的治疗窗)的有效施用，这相对于在施用相应的(例如，编码的)蛋白质(例如，抗体)剂本身时观察到的那些。特别地，本公开内容教导了这样的改进尤其可以通过经由施用核酸并且特别是编码其的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)递送IMAB362来实现。
在一些实施方案中，本公开内容尤其提供了这样的见解：编码抗体剂(例如，IMAB362)或其功能部分的mRNA(任选地与脂质纳米粒(LNP)一起配制用于静脉内(IV)施用于对象(例如人患者、模式生物体等))可以被靶细胞(例如肝细胞)吸收以有效产生治疗相关血浆浓度的编码的抗体剂(例如IMAB362)，例如，如图14中针对由ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)表达的CLDN-18.2靶向抗体剂所示。在一些实施方案中，抗体剂由例如改造成用于最小免疫原性和/或配制在脂质纳米粒(LNP)中的mRNA表达。在一些实施方案中，编码抗体剂的mRNA可包含经修饰的核苷酸(例如，但不限于假尿苷)。
此外，本公开内容尤其提供了这样的见解：如本文所述递送的CLDN-18.2靶向抗体剂在利用接受对象的免疫***的同时可诱导针对靶细胞(例如，肿瘤细胞)的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力可以增强化学治疗和/或其他抗癌治疗的细胞毒性作用。在一些实施方案中，这样的组合治疗可以延长无进展和/或总存活，例如，相对于单独施用的个体治疗和/或相对于另一个合适的参考。
不希望受特定理论的束缚，本公开内容观察到某些化学治疗剂，例如吉西他滨、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶显示出在胰腺癌细胞系中上调现有的CLDN-18.2表达水平；此外，未观察到这些药剂在CLDN-18.2阴性细胞系中提高从头表达。参见例如Türeci et al.,(2019)“Characterization of Zolbetuximab in pancreatic cancer models.”InOncoimmunology 8(1),pp.e1523096。
本公开内容尤其提供了这样的见解：如本文中所述的靶向CLDN-18.2的治疗在施用于特征在于(例如，已确定显示和/或预期或预测显示)肿瘤细胞中CLDN-18.2表达的表达和/或活性升高(例如，可能或已经由于暴露于一种或更多种化学治疗剂所导致)的肿瘤(例如，肿瘤细胞、怀疑和/或已检测到这样的肿瘤和/或肿瘤细胞的对象等)时，可以是特别有用和/或有效的。实际上，本公开内容尤其教导了所提供的如本文中所述的靶向CLDN-18.2的治疗(例如，施用核酸例如RNA，并且更特别地，编码CLDN-18.2靶向抗体试剂的mRNA)当与一种或更多种CDLN-18.2增强剂(例如，一种或更多种特定化学治疗剂)组合施用(例如，施用于已接受和/或正在接受或在其他情况下暴露于所述一种或更多种CDLN18.2增强剂(例如，一种或更多种特定化学治疗剂)的对象)时可以提供协同治疗。因此，在一些实施方案中，如本文中所述的靶向的CLDN-18.2治疗与预期和/或已证明在肿瘤细胞中上调CLDN-18.2表达和/或活性的其他抗癌剂组合可以是有用的。
因此，本公开内容尤其提供了用于治疗癌症，特别是与CLDN-18.2的表达相关的癌症的见解和技术。在一些实施方案中，所提供的技术对于治疗胰腺癌是有效的。在一些实施方案中，所提供的技术对于治疗胃癌或胃食管癌是有效的。在一些实施方案中，所提供的技术对于治疗胆管癌是有效的。在一些实施方案中，所提供的技术对于治疗卵巢癌是有效的。在一些实施方案中，所提供的技术在应用于局部晚期肿瘤时是有效的。在一些实施方案中，所提供的技术在应用于不可切除的肿瘤时是有效的。在一些实施方案中，所提供的技术在应用于转移性肿瘤时是有效的。
I.密蛋白-18.2多肽
密蛋白-18.2(CLDN-18.2)是密蛋白-18的癌症相关剪接变体。CLDN-18.2是超过20种结构相关蛋白质的密蛋白家族的成员，这些蛋白质参与上皮和内皮中紧密连接的形成。
健康组织中的CLDN18表达。密蛋白18.2是具有四个跨膜结构域和两个小的胞外环的27.8kDa蛋白质(Niimi et al.2001)。CLDN-18.2是胃上皮细胞的紧密连接分子。胃紧密连接高度专门用于排斥胃酸，其可损伤胃内膜(lining)。
CLDN-18.2是高度选择性的胃谱系抗原(Sahin et al.2008)。通常，其表达限于胃腺的窝(pit)和基部区域的短寿命分化的胃上皮细胞。不断补充胃腺的分化的上皮细胞的干细胞区是CLDN-18.2阴性的。不希望受理论的束缚，通常认为没有其他正常的人体细胞类型在转录水平或蛋白质水平上表达CLDN-18.2。
癌中的CLDN18表达。CLDN-18.2在包括胃癌、胃食管癌(GE)和胰腺癌(PC)(Karanjawala et al.2008；Coati et al.2019)的多种人癌以及癌前病变(
Figure BDA0003871087100000361
etal.2014；Tanaka et al.2011)中表达。在卵巢癌(Sahin et al.2008)、胆道癌(Shinozakiet al.2011)和肺癌(Micke et al.2014)中也检测到肿瘤相关的CLDN-18.2表达。
约77％的原发性胃腺癌(gastric adenocarcinoma，GAC)为CLDN-18.2+。56％的GAC在至少60％的肿瘤细胞中显示出强CLDN-18.2表达(通过免疫组织化学分析限定为染色强度≥2+)。CLDN-18.2表达在弥漫性胃癌中比在肠型胃癌中更频繁。CLDN-18.2蛋白也经常在胃癌的***转移和远处转移到卵巢(所谓的克鲁肯贝格瘤(Krukenberg tumor))中检测到。此外，50％的食管腺癌显示出显著的CLDN-18.2表达。
在胰腺癌中，CLDN-18.2在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)中以60至90％的发生率表达(Karanjawala et al.2008；
Figure BDA0003871087100000362
et al.2014)。PDAC占所有胰腺肿瘤的超过80％，是欧洲第七大最常见的癌症，并且是欧盟第四大癌症相关死亡原因(Ferlay et al.2010；Jemal et al.2011；Seufferlein et al.2012)。几乎60％的患有PDAC的患者表达膜结合CLDN-18.2，并且在20％的患有胰腺神经内分泌肿瘤的患者中CLDN-18.2被异位激活。CLDN-18.2在原发性和转移性PDAC病变中表达(
Figure BDA0003871087100000363
et al.2014)。
通过siRNA技术对CLDN-18.2的下调已显示出导致对胃癌细胞增殖的抑制(Niimiet al.2001)，表明参与CLDN-18.2+肿瘤细胞的增殖。
∏.示例性的靶向密蛋白-18.2多肽的抗体剂
在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体剂与CLDN-18.2多肽特异性地结合。在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体剂与CLDN-18.2多肽的第一胞外结构域(ECD1)特异性地结合。例如，在一些实施方案中，这样的抗体剂与癌细胞中暴露的ECD1表位特异性地结合。在一些实施方案中，这样的抗体剂可以对CLDN-18.2多肽，例如CLDN-18.2多肽的ECD1表位具有至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M，或更低的结合亲和力(例如，如通过解离常数所测量的)。本领域技术人员将理解，在一些情况下，结合亲和力(例如，如通过解离常数所测量的)可以受到两个分子之间的非共价分子间相互作用(例如氢键、静电相互作用、疏水力和范德华力)的影响。作为替代或补充，配体与其靶分子之间的结合亲和力可受到其他分子的存在影响。本领域技术人员将熟悉用于根据本公开内容测量结合亲和力和/或解离常数的多种技术，其包括例如但不限于ELISA、凝胶迁移测定、下拉测定(pull-down assay)、平衡透析、分析超速离心、表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)、生物层干涉术、光栅耦合干涉术和光谱测定。
在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体可相对于CLDN18.1多肽与CLDN-18.2多肽特异性地结合。在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体不与任何其他密蛋白家族成员(包括主要在组织例如肺中表达的紧密相关的密蛋白-18剪接变体1(CLDN18.1))结合。
在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体剂可以是WO 2007/059997、WO2008/145338和WO2013/174510(出于本文中所述的目的，其各自的内容通过引用整体并入本文)中描述的CLDN-18.2靶向抗体中的任何一个。
在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体剂包含(a)具有选自以下的至少一个CDR(包括，例如，1个CDR、2个CDR和3个CDR)的可变重链结构域：(i)由氨基酸残基(GYTFTSYW)表示的CDR1；(ii)由氨基酸残基(IYPSDSYT)表示的CDR2；和(iii)由氨基酸残基(TRSWRGNSFDY)表示的CDR3；和/或(b)具有选自以下的至少一个CDR(包括，例如，1个CDR、2个CDR和3个CDR)的可变轻链结构域：(i)由氨基酸残基(QSLLNSGNQKNY)表示的CDR1；(ii)由氨基酸残基(WAS)表示的CDR2；和(iii)由氨基酸残基(QNDYSYPFT)表示的CDR3。
在一些实施方案中，如在U.S.9,751,934中所述的，靶向CLDN-18.2的抗体剂具有重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，其是或包括相关序列(例如，可变区序列，例如CDR和/或框架(framework，FR)序列)。例如，在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体剂具有：由如下所示的SEQ ID NO：1的氨基酸残基20至467表示的氨基酸序列(其中在此SEQ ID NO：1对应于U.S.9,751,934的SEQ ID NO：118，并且SEQ ID NO：1的具有下划线的氨基酸序列对应于分泌信号序列)组成或包含其的重链，以及由如下所示的SEQ ID NO：2的氨基酸残基21至240表示的氨基酸(其中在此SEQ ID NO：2对应于U.S.9,751,934的SEQ ID NO：125，并且SEQ ID NO:2的具有下划线的氨基酸序列对应于分泌信号序列)组成或包含其的轻链。
Figure BDA0003871087100000381
在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体剂包含(a)具有选自以下的至少一个CDR(包括，例如，1个CDR、2个CDR和3个CDR)的可变重链结构域：(i)由SEQ ID NO:1的氨基酸残基45至52表示的CDR1；(ii)由SEQ ID NO:1的氨基酸残基70至77表示的CDR2；和(iii)由SEQ ID NO:1的氨基酸残基116至126表示的CDR3；和/或(b)具有选自以下的至少一个CDR(包括，例如，1个CDR、2个CDR和3个CDR)的可变轻链结构域：(i)由SEQ ID NO:2的氨基酸残基47至58表示的CDR1；(ii)由SEQ ID NO:2的氨基酸残基76至78表示的CDR2；和(iii)由SEQID NO:2的氨基酸残基115至123表示的CDR3。
在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体剂具有由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成或包含其的重链和由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成或包含其的轻链。
在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体剂可以被改造以降低潜在的免疫原性和/或改善分泌。例如，在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体剂的鼠分泌信号序列可以被人分泌信号序列替代。
在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体剂具有：由如下所示的SEQ ID NO:3的氨基酸残基27至474表示的氨基酸序列(其中具有下划线的氨基酸序列对应于分泌信号序列)组成或包含其的重链；和由如下所示的SEQ ID NO:4的氨基酸残基27至246表示的氨基酸(其中具有下划线的氨基酸序列对应于分泌信号序列)组成或包含其的轻链。
Figure BDA0003871087100000391
在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体剂具有由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成或包含其的重链，和由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成或包含其的轻链。
在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2的抗体是IMAB362(也称为佐贝妥昔单抗、克劳西单抗)。IMAB362(靶向CLDN-18.2的抗体)处于后期临床开发中(NCT01630083、NCT03816163、NCT03653507、NCT03505320、NCT03504397)并且是本领域已知的(参见，例如，Sahin et al.2018；Sahin et al.2017；Al-Batran et al.2017a；Al-Batran etal.2017b；Türeci et al.2019；Trarbach et al.2014；Morlock et al.2018a；Schuler etal.2016；Lordick et al.2016；Morlock et al.2018b)。其靶标CLDN-18.2是高度选择性肿瘤相关的表面标志物。
由Ganymed Pharmaceuticals GmbH开发并被Astellas Pharma Inc.收购的IMAB362是靶向紧密连接蛋白CLDN-18.2的完整IgG1抗体并通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)介导细胞死亡。IMAB362以高亲和力和特异性识别CLDN-18.2的第一胞外结构域(ECD1)(Sahin et al.2008；Türeci et al.2011)。在抗体的正常上皮屏障中该表位是不可接近的。紧密连接的破坏和细胞极化的丧失是癌症的早期标志物。在此过程中，IMAB362的表位被暴露。IMAB362不与任何其他密蛋白家族成员(包括主要在组织例如肺中表达的紧密相关的密蛋白18剪接变体1(CLDN18.1))结合。
在患有胃癌和胃食管癌的一线患者中进行的针对EOX的2期FAST试验(NCT01630083)中对IMAB362加表柔比星、奥沙利铂和卡培他滨(EOX)进行了测试(Morlocket al.2018a；Schuler et al.2016；Al-Batran et al.2016；Lordick et al.2016；Morlock et al.2018b)。FAST患者群体包括其肿瘤具有≥40％的具有中等至强(≥2+)染色强度的表达CLDN-18.2的肿瘤细胞的患者。其肿瘤具有≥70％的具有≥2+CLDN-18.2染色强度的肿瘤细胞的患者亚群在800/600mg/kg2剂量下从IMAB362治疗中获得最大益处，其中位总存活(overall survival，OS)几乎翻倍(Al-Batran et al.2016；Lordick et al.2016)。IMAB362在≥70％CLDN-18.2表达(+33.1周；p<0.0005)的OS益处伴随着中心独立审查进展的显著延迟(+14.5周；p<0.0005)和更高的客观响应率(objective response rate，ORR)(35.1％相对于27.1％)。将IMAB362添加至EOX不会对患者相关结局产生负面影响。在整个研究中，在对全球健康状态或总ST022评分的混合效应模型重复测量(Mixed effect ModelRepeat Measurement)中，没有观察到治疗组之间的显著差异，但相对于单独使用EOX，IMAB362加EOX将全球健康评分的恶化显著延迟了2.6个月(p＝0.008)。
Astellas Pharma Inc.在患有CLDN-18.2+胃癌/胃食管癌和胰腺癌的患者中进行的全球开发计划的2期和3期试验中还对IMAB362进行了测试。
IMAB362已在多种临床试验中进行了测试，如下表1所示。
表1：涉及施用IMAB362的某些临床试验的总结
Figure BDA0003871087100000401
Figure BDA0003871087100000411
在患者中IMAB362的安全性谱得到了很好的表征，并且已耐受高至1000mg/m2 q3w(高至603μg/mL的cmax)的重复剂量，而没有剂量限制性毒性(Sahin et al.2018；Türeci etal.2019)。
不希望受特定理论束缚，IMAB362用于实施肿瘤细胞杀伤的主要药理学作用模式涉及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。基于通过体外ADCC测试获得的剂量响应曲线，在血清中IMAB362浓度为0.3至28μg/mL时观察到产生95％响应的药物浓度(Sahin et al.2018)。例如，已经报道了通过ADCC有效裂解CLDN-18.2+细胞，EC95为0.3至28μg/mL(Sahin etal.2018)。
在多种试验中，IMAB362耐受性良好，恶心和呕吐是主要的不良事件(AE)，没有观察到剂量限制性毒性(dose limiting toxicity，DLT)和作为单一药剂和与化学治疗组合的临床活性。
本公开内容尤其提供了这样的见解：IMAB362或其变体(例如，共有IMAB362的一个或更多个特征(包括例如一个或更多个(并且在许多实施方案中是全部的)CDR序列、一个或更多个(并且在许多实施方案中是全部的)FR序列和/或重链和/或轻链可变序列等)的变体，和/或为例如IgG1、IgM、IgA等的一类变体的变体)可代表用于通过施用如本文中所述的核糖核酸递送的特别理想的抗体。不希望受任何特定理论的束缚，本公开内容提出，这样的递送模式相对于施用IMAB362抗体本身时所观察到那些可以实现有效施用，以及IMAB362治疗相关不良事件(TEAE)的发生率(例如，频率和/或严重程度)降低。在IMAB362的2a期MONO试验(NCT01197885)中，82％(n＝44/54)的患者发生TEAE；恶心(61％)、呕吐(50％)和疲劳(22％)是最常见的TEAE。在12名患者(22％)中报告了3级呕吐，并且在8名患者(15％)中报告了3级恶心。这些患者接受了600mg/m2的剂量。在本研究中观察到的恶心和呕吐通过暂停或减慢IMAB362的输注得到控制，表明AE与Cmax相关(Türeci et al.2019)。
特别地，本公开内容尤其表明了本文中所述的作为核糖核酸(“RiboMab01”)递送的IMAB362的药代动力学(PK)谱显示出与施用之后48至72小时的IMAB362相比，抗体浓度逐渐提高并且Cmax显著更低。RiboMab01改变的PK谱可降低在用IMAB362治疗之后在患者中看到的Cmax相关AE。本公开内容还提供了非人灵长类研究数据，其显示未观察到全身性副作用例如腹泻。
本公开内容尤其理解对于施用的IMB362抗体所观察到的有利风险/益处谱，特别是在具有高医学需求的某些适应证中，并且提出了如本文中所述的递送可以是有效的和/或特别期望的。
ΠΙ.用于递送基于抗体的治疗剂的RNA技术
重组蛋白抗体是用于治疗疾病或病症(例如癌症)的广泛使用的生物制剂，但显示出许多限制，包括例如冗长的制造过程开发以及对于抗体衍生物的短的血清半衰期。本公开内容尤其提供了通过利用RNA技术作为在患者的细胞中直接表达抗体剂(称为RiboMab)的模式来解决重组抗体技术的某些限制(包括例如冗长的制造过程开发和对于抗体衍生物的短的血清半衰期)的技术，作为一类新的基于抗体的治疗。在一些实施方案中，本公开内容尤其提供了以下见解：与脂质纳米粒(LNP)一起配制成用于静脉内(IV)施用的RiboMab可以被细胞(例如，肝细胞)吸收以有效产生治疗相关血浆浓度的编码的RiboMab抗体(图14)。在一些实施方案中，RiboMab是由例如改造成用于最小免疫原性和/或配制在脂质纳米粒(LNP)中的mRNA编码的抗体剂。在一些实施方案中，编码抗体剂的mRNA可包含经修饰的核苷酸(例如，但不限于假尿苷)。
RiboMab技术可用于递送多种抗体形式。例如，在一些实施方案中，RiboMab技术可用于表达完整免疫球蛋白(Ig)，其包括例如但不限于IgG。在一些实施方案中，完整免疫球蛋白(Ig)可由包含编码抗体重链的第一编码区和编码抗体轻链可变结构域的第二编码区的单一ssRNA编码，其中该单一ssRNA包含或编码内部核糖体进入侧(ribosome entryside，IRES)或另一个内部启动子或肽序列，例如“自切割”2A或2A样序列(参见，例如，Szymczak et al.Nat Biotechnol 22:589,May 2004；ePub April 4 2004)以产生相应的重链和轻链，然后可以对其进行加工以形成完整IgG。在一些实施方案中，完整Ig可以由以下两种单独的ssRNA编码：包含编码抗体重链的编码区的第一ssRNA；和包含编码抗体轻链的编码区的第二ssRNA。然后在靶细胞中将这样的第一和第二ssRNA翻译成相应的抗体链并形成完整Ig抗体。
在一些实施方案中，RiboMab技术可用于表达双特异性抗体变体，例如，如图12(图A)中所示或者如在Stadler et al.(2016)Oncoimmunology5(3):el091555和/或在Stadleret al.(2017)Nature Medicine 23(7):815-817中所述。例如，在一些实施方案中，二价抗体剂可由单一ssRNA编码，该单一ssRNA包含编码第一靶标的单链可变片段(scFv)的第一编码区和编码第二靶标的scFv的第二编码区。在一些实施方案中，二价抗体剂可由以下两种单独的ssRNA编码：包含编码第一靶标的scFv的编码区和编码第二靶标的重链抗原结合片段(Fab)的编码区的第一ssRNA；和包含编码相同第一靶标的scFv的编码区和编码相同第二靶标的轻链Fab的编码区第二ssRNA。然后在靶细胞中将这样的第一和第二ssRNA翻译成抗体的亚基并形成双特异性抗体。
在一些实施方案中，RNA药剂(例如，本文中所述的ssRNA)可以与载体一起递送。在一些实施方案中，RNA/LNP静脉内(IV)施用并被靶细胞(例如，肝细胞)吸收，以有效产生治疗相关血浆浓度的编码的RiboMab抗体。
A.提供的编码针对密蛋白-18.2多肽的抗体剂的单链RNA(ssRNA)及其组合物
在一些实施方案中，至少一种单链RNA(ssRNA)包含一个或更多个编码如上文题为“示例性的靶向密蛋白-18.2多肽的抗体剂”部分中所述的抗体剂的编码区。在一些实施方案中，至少一种ssRNA包含一个或更多个编码如上文所述或本文示例的抗体剂IMAB362的编码区。
不希望受任何特定理论的束缚，本公开内容尤其提供了这样的见解：在一些实施方案中，抗体剂IMAB362可以特别有用和/或有效(至少部分地)因为其与CLDN-18.2特异性地结合，并且此外，相对于CLDN18.1，优先与CLDN-18.2结合。在一些实施方案中，本文提供的教导可适用于对CLDN-18.2具有特异性的其他抗体剂，并且特别适用于甚至相对于CLDN18.1优先与CLDN-18.2结合的这样的抗体。例如，在一些实施方案中，至少一种单链RNA(ssRNA)包含一个或更多个编码区，其编码相对于CLDN18.1多肽优先与CLDN-18.2多肽结合的抗体剂。在一些实施方案中，这样的抗体剂对CLDN-18.2多肽的结合亲和力比对CLDN18.1多肽的结合亲和力高至少50％或更多，其包括例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高。在一些实施方案中，这样的抗体剂对CLDN-18.2多肽的结合亲和力为对CLDN18.1多肽的结合亲和力以下倍数高：至少1.1倍或更多，其包括例如至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少75倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍、至少5000倍、至少10,000倍或更高。在一些实施方案中，这样的抗体剂不与任何其他密蛋白家族成员(包括CLDN18.1)可检测地结合。在一些实施方案中，抗体剂可以是抗体或包含抗体。在一些实施方案中，抗体剂可以是抗原结合片段或包含抗原结合片段。
在一些实施方案中，靶向CLDN-18.2(并且可以由RNA例如ssRNA，例如本文中所述的mRNA编码)的抗体剂与CLDN-18.2多肽的第一胞外结构域(ECD1)特异性地结合。例如，在一些实施方案中，这样的抗体剂与癌细胞中暴露的ECD1表位特异性地结合。
在一些实施方案中，至少一种ssRNA编码CLDN-18.2靶向抗体剂的可变重链(VH)结构域和该抗体剂的可变轻链(VL)结构域。在一些实施方案中，CLDN-18.2靶向抗体剂的这样的VH结构域和VL结构域可由单一ssRNA构建体编码；或者，在一些实施方案中，其可以由至少两种单独的ssRNA构建体单独地编码。例如，在一些实施方案中，如本文所用的ssRNA包含两个或更多个编码区，其包含编码至少CLDN-18.2靶向抗体剂的VH结构域的重链编码区；和编码至少CLDN-18.2靶向抗体剂的VL结构域的轻链编码区。在一些替代实施方案中，组合物包含(i)包含编码至少CLDN-18.2靶向抗体剂的VH结构域的重链编码区的第一ssRNA；和(ii)包含编码至少CLDN-18.2靶向抗体剂的VL结构域的轻链编码区的第二ssRNA。
在一些实施方案中，重链编码区还可编码恒定重链(CH)结构域；和/或轻链编码区还可编码恒定轻链(CL)结构域。例如，在一些实施方案中，重链编码区可以编码免疫球蛋白形式(例如IgG)的CLDN-18.2靶向抗体剂的VH结构域、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域；和/或轻链编码区可以编码Ig形式(例如IgG)的CLDN-18.2靶向抗体剂的VL结构域和CL结构域。例如，在一些实施方案中，完整免疫球蛋白(Ig)可以由包含编码CLDN-18.2Ig抗体(例如IgG)的重链的第一编码区和编码CLDN-18.2Ig抗体(例如IgG)的轻链可变结构域的第二编码区的单一ssRNA编码，其中单一ssRNA需要蛋白质翻译以产生包含抗体的重链和轻链的融合蛋白，以及通过合适的蛋白酶将融合蛋白翻译后切割成相应的重链和轻链，然后可以对其进行加工以形成完整的Ig(例如，IgG)。在一些实施方案中，完整的Ig可以由以下两种单独的ssRNA编码：包含编码CLDN-18.2Ig抗体(例如IgG)的重链的编码区的第一ssRNA；和包含编码CLDN-18.2Ig抗体(例如IgG)的轻链的编码区的第二ssRNA。然后在靶细胞中将这样的第一和第二ssRNA翻译成相应的抗体链并形成完整的Ig抗体(例如IgG)。在一些实施方案中，由一种或更多种ssRNA编码的IgG形式的抗体剂是IgG1。
在一些实施方案中，ssRNA的重链编码区包含编码选自以下的至少一个CDR(包括，例如，1个CDR、2个CDR和3个CDR)的核苷酸序列或由其组成：(i)由氨基酸残基(GYTFTSYW)表示的CDR1；(ii)由氨基酸残基(IYPSDSYT)表示的CDR2；和(iii)由氨基酸残基(TRSWRGNSFDY)表示的CDR3。在一些实施方案中，ssRNA的轻链编码区包含编码选自以下的至少一个CDR(包括，例如，1个CDR、2个CDR和3个CDR)的核苷酸序列或由其组成：(i)由氨基酸残基(QSLLNSGNQKNY)表示的CDR1；(ii)由氨基酸残基(WAS)表示的CDR2；和(iii)由氨基酸残基(QNDYSYPFT)表示的CDR3。
在一些实施方案中，ssRNA的重链编码区由编码以SEQ ID NO：1的氨基酸残基20至467表示的氨基酸序列的核苷酸序列组成或包含编码以SEQ ID NO：1的氨基酸残基20至467表示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的一个或更多个非CDR区中可以存在一个或更多个氨基酸修饰(例如，以降低免疫原性和/或稳定性)。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO：1可包含对于一个或更多个非CDR区的至少一个或更多个(包括，例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个)氨基酸修饰(其包括例如氨基酸***、缺失和/或替换)。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的一个或更多个非CDR区中可以存在不超过50个(包括，例如，不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个、或不超过5个或更少)氨基酸修饰。在一些实施方案中，ssRNA的轻链编码区由编码以SEQ ID NO：2的氨基酸残基21至240表示的氨基酸序列的核苷酸序列组成或包含编码以SEQ ID NO：2的氨基酸残基21至240表示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2的一个或更多个非CDR区可存在一个或更多个氨基酸修饰(例如，以降低免疫原性和/或稳定性)。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO：2可包含对于一个或更多个非CDR区的至少一个或更多个(包括，例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个)氨基酸修饰(其包括例如氨基酸***、缺失和/或替换)。在一些实施方案中，SEQ ID NO：2的一个或更多个非CDR区中可以存在不超过50个(包括，例如，不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个、或不超过5个或更少)氨基酸修饰。
在一些实施方案中，ssRNA的重链编码区由编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的核苷酸序列组成或包含编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，ssRNA的轻链编码区由编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核苷酸序列组成或包含编码SEQID NO:2的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，ssRNA的重链编码区由编码以SEQ ID NO:3的氨基酸残基27至474表示的氨基酸序列的核苷酸序列组成或包含编码以SEQ ID NO:3的氨基酸残基27至474表示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的一个或更多个非CDR区可以存在一个或更多个氨基酸修饰(例如，以降低免疫原性和/或稳定性)。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO:3可包含对于一个或更多个非CDR区的至少一个或更多个(包括，例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个)氨基酸修饰(其包括例如氨基酸***、缺失和/或替换)。在一些实施方案中，SEQ ID NO:3的一个或更多个非CDR区中可以存在不超过50个(其包括，例如，不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个、或不超过5个或更少)氨基酸修饰。在一些实施方案中，ssRNA的轻链编码区由编码以SEQ ID NO:4的氨基酸残基27至246表示的氨基酸序列的核苷酸序列组成或包含编码以SEQ ID NO:4的氨基酸残基27至246表示的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的一个或更多个非CDR区可以存在一个或更多个氨基酸修饰(例如，以降低免疫原性和/或稳定性)。例如，在一些实施方案中，SEQ ID NO:4可包含对于一个或更多个非CDR区的至少一个或更多个(包括，例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个)氨基酸修饰(其包括例如氨基酸***、缺失和/或替换)。在一些实施方案中，SEQ ID NO:4的一个或更多个非CDR区中可以存在不超过50个(其包括，例如，不超过40个、不超过30个、不超过20个、不超过10个、或不超过5个或更少)氨基酸修饰。
在一些实施方案中，ssRNA的重链编码区由编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的核苷酸序列组成或包含编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，ssRNA的轻链编码区由编码SEQ ID NO:4的氨基酸序列的核苷酸序列组成或包含编码SEQID NO:4的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，ssRNA的重链编码区由编码佐贝妥昔单抗或克劳西单抗(例如，如本文所述和/或示例的)的全长重链的核苷酸序列组成或者包含编码佐贝妥昔单抗或克劳西单抗(例如，如本文所述和/或示例的)的全长重链的核苷酸序列。在一些实施方案中，ssRNA的轻链编码区由编码佐贝妥昔单抗或克劳西单抗的全长轻链的核苷酸序列组成或者包含编码佐贝妥昔单抗或克劳西单抗的全长轻链的核苷酸序列。
在一些实施方案中，一种或更多种ssRNA可用于编码双特异性或多特异性抗体剂，其与两种或更多种靶分子结合，例如，其中之一是CLDN-18.2多肽。例如，图12A示出了由一种或更多种ssRNA编码的示例性双特异性抗体。另见，例如，Stadler et al.(2016)Oncoimmunology 5(3):e1091555；和/或在Stadler et al.(2017)Nature Medicine 23(7):815-817中。在一些实施方案中，二价抗体剂可由单一ssRNA编码，该ssRNA包含编码(相对于CLDN18.1多肽)优先与CLDN-18.2多肽结合的单链可变片段(scFv)的第一编码区和编码第二靶标(例如，在一些实施方案中，其可以是T细胞受体)的scFv的第二编码区。在一些实施方案中，二价抗体剂可由以下两种单独的ssRNA编码：第一ssRNA，其包含编码(相对于CLDN18.1多肽)优先与CLDN-18.2多肽结合的scFv的编码区和编码第二靶标(例如，在一些实施方案中，其可以是T细胞受体)的重链抗原结合片段(Fab)的编码区；以及第二ssRNA，其包含编码靶向CLDN-18.2多肽的scFv的编码区和编码相同第二靶标的轻链Fab的编码区。在一些实施方案中，二价抗体剂可由以下两种单独的ssRNA编码：第一ssRNA，其包含编码第一靶标(例如，在一些实施方案中，其可以是T细胞受体)的scFv的编码区和编码(相对于CLDN18.1多肽)优先与CLDN-18.2多肽结合的重链抗原结合片段(Fab)的编码区；以及第二ssRNA，其包含编码相同第一靶标的scFv的编码区和编码靶向CLDN-18.2多肽的轻链Fab的编码区。然后在靶细胞中将这样的第一和第二ssRNA翻译成抗体的亚基并形成双特异性抗体。
分泌信号编码区：在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA可包含分泌信号编码区。在一些实施方案中，这样的分泌信号编码区允许由一种或更多种ssRNA编码的CLDN-18.2靶向抗体剂在翻译之后由例如存在于待治疗对象中的细胞分泌，从而产生一定血浆浓度的具有生物活性的CLDN-18.2靶向抗体剂。在一些实施方案中，ssRNA中包含的分泌信号编码区由编码非人分泌信号的核苷酸序列组成或包含编码非人分泌信号的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，这样的非人分泌信号可以是鼠分泌信号，其在一些实施方案中可以是或者包含MGWSCIILFLVATATGVHS或MESQTQVLMSLLFWVSGTCG的氨基酸序列。在一些实施方案中，ssRNA中包含的分泌信号编码区由编码人分泌信号的核苷酸序列组成或包含编码人分泌信号的核苷酸序列，在一些实施方案中，该核苷酸序列可以是MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS的氨基酸序列或包含MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的重链结构域的ssRNA中包含的分泌信号编码区可包含：(i)编码鼠分泌信号氨基酸序列的核苷酸序列，所述鼠分泌信号氨基酸序列在一些实施方案中可以是MGWSCIILFLVATATGVHS的氨基酸序列或包含MGWSCIILFLVATATGVHS的氨基酸序列；或(ii)编码人分泌信号氨基酸序列的核苷酸序列，所述人分泌信号氨基酸序列在一些实施方案中可以是MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS的氨基酸序列或包含MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的轻链结构域的ssRNA中包含的分泌信号编码区可以包含：(i)编码鼠分泌信号氨基酸序列的核苷酸序列，所述鼠分泌信号氨基酸序列在一些实施方案中可以是MESQTQVLMSLLFWVSGTCG的氨基酸序列或包含MESQTQVLMSLLFWVSGTCG的氨基酸序列；或(ii)编码人分泌信号氨基酸序列的核苷酸序列，所述人分泌信号氨基酸序列在一些实施方案中可以是MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS的氨基酸序列或包含MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA可包含至少一个非编码序列元件(例如，以增强RNA稳定性和/或翻译效率)。非编码序列元件的实例包括但不限于3′非翻译区(UTR)、5′UTR、用于mRNA的共转录加帽的帽结构、聚腺嘌呤(polyA)尾及其任意组合。
UTR(5’UTR和/或3’UTR)；在一些实施方案中，所提供的ssRNA可以包含编码目的5′UTR和/或目的3′UTR的核苷酸序列。本领域技术人员将理解mRNA序列的非翻译区(例如，3′UTR和/或5′UTR)可有助于mRNA稳定性、mRNA定位和/或翻译效率。
在一些实施方案中，所提供的ssRNA可以包含5′UTR核苷酸序列和/或3′UTR核苷酸序列。在一些实施方案中，这样的5′UTR序列可以与编码序列(例如，其包含一个或更多个编码区)的3′可操作地连接。作为补充或替代，在一些实施方案中，3′UTR序列可以与编码序列(例如，其包含一个或更多个编码区)的5′可操作地连接。
在本文中所述的任何方面的一些实施方案中，ssRNA中包含的5′和3′UTR序列可以由对于目的基因的开放阅读框而言天然存在或内源性的5′和3′UTR序列组成或者包含对于目的基因的开放阅读框而言天然存在或内源性的5′和3′UTR序列。或者，在一些实施方案中，ssRNA中包含的5′和/或3′UTR序列对于编码序列(例如，其包含一个或更多个编码区)不是内源的；在一些这样的实施方案中，这样的5′和/或3′UTR序列可用于修饰转录的RNA序列的稳定性和/或翻译效率。例如，技术人员将理解3′UTR序列中富含AU的元件可降低mRNA的稳定性。因此，如技术人员将理解的，可以选择或设计3′和/或5′UTR以基于本领域公知的UTR的特性来提高所转录的RNA的稳定性。
例如，本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，可以选择由目的基因或核苷酸序列的开放阅读框序列的科扎克序列(Kozak sequence)组成或者包含目的基因或核苷酸序列的开放阅读框序列的科扎克序列的核苷酸序列并将其用作编码5′UTR的核苷酸序列。如技术人员将理解的，已知科扎克序列提高一些RNA转录物的翻译效率，但并非所有RNA都必须需要科扎克序列来实现有效翻译。在一些实施方案中，所提供的ssRNA多核苷酸可以包含编码来源于RNA病毒的5′UTR的核苷酸序列，该RNA病毒的RNA基因组在细胞中是稳定的。在一些实施方案中，多种经修饰的核糖核苷酸(例如，如本文中所述的)可用于3′和/或5′UTR，例如以阻止所转录的RNA序列的外切核酸酶降解。
在一些实施方案中，ssRNA中包含的5′UTR可以来源于与科扎克区组合的人α-珠蛋白mRNA。
在一些实施方案中，ssRNA可包含一个或更多个3′UTR。例如，在一些实施方案中，ssRNA可包含来源于珠蛋白mRNA(例如，如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、β-珠蛋白(例如人β-珠蛋白)mRNA)的3′-UTR的两个拷贝。在一些实施方案中，可以使用来源于人β-珠蛋白mRNA的3′UTR的两个拷贝，例如，在一些实施方案中，其可以放置在ssRNA的编码序列与poly(A)尾之间，以提高蛋白质表达水平和/或延长mRNA的持久性。在一些实施方案中，ssRNA中包含的3′UTR可以是或者包含WO2017/060314(其全部内容出于本文中所述的目的通过引用并入本文)中所公开的3′UTR序列中的一个或更多个(例如，1、2、3个或更多个)。在一些实施方案中，3′-UTR可以是来源于“***的氨基端增强子”(amino terminal enhancer of split，AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)的至少两个序列元件的组合(FI元件)。这些是通过对赋予RNA稳定性和增强总蛋白表达的序列进行离体选择过程来鉴定的(参见WO 2017/060314，通过引用并入本文)。
PolyA尾：在一些实施方案中，所提供的ssRNA可以包含编码polyA尾的核苷酸序列。polyA尾是包含一系列腺苷核苷酸的核苷酸序列，其长度可以变化(例如，至少5个腺嘌呤核苷酸)并且可以多至数百个腺苷核苷酸。在一些实施方案中，polyA尾是包含至少30个腺苷核苷酸或更多个(其包括例如至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100或更多个)腺苷核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方案中，polyA尾是polyA同聚体尾或包含polyA同聚体尾。在一些实施方案中，polyA尾可包含一个或更多个经修饰的腺苷核苷，其包括但不限于cordiocipin和8-氮杂腺苷。在一些实施方案中，polyA尾可包含一个或更多个非腺苷核苷酸。在一些实施方案中，polyA尾可以是或包含如WO 2016/005324(其全部内容出于本文中所述的目的通过引用并入本文)中所述的被破坏的或经修饰的polyA尾。例如，在一些实施方案中，本文中所述的ssRNA中包含的polyA尾可以是或包含经修饰的polyA序列，其包含：接头序列；至少20个A连续核苷酸的第一序列，其是接头序列的5′；和至少20个A连续核苷酸的第二序列，其是接头序列的3′。在一些实施方案中，经修饰的polyA序列可包含：包含至少十个非A核苷酸(例如，T、G和/或C核苷酸)的接头序列；至少30个A连续核苷酸的第一序列，其是接头序列的5′；和至少70个A连续核苷酸的第二序列，其是接头序列的3′。
5′帽：在一些实施方案中，本文中所述的ssRNA可包含5′帽，其可在转录期间并入到这样的ssRNA中，或在转录之后与这样的ssRNA连接。在一些实施方案中，ssRNA可包含用于mRNA的共转录加帽的5′帽结构。用于共转录加帽的帽结构的实例在本领域中是已知的，其包括，例如，如在WO2017/053297中所述，其全部内容出于本文中所述的目的通过引用并入本文。在一些实施方案中，本文中所述的ssRNA中包含的5′帽是m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)pG或包含m7G(5′)ppp(5′)(2′OMeA)pG。在一些实施方案中，本文中所述的ssRNA中包含的5′帽是帽1结构[m2 7，3’-OGppp(m1 2’-O)ApG]或包含帽l结构[m2 7，3’-OGppp(m1 2’-O)ApG]。
在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA可包含至少一个经修饰的核糖核苷酸，例如，在一些实施方案中以提高这样的ssRNA的稳定性和/或降低这样的ssRNA的细胞毒性。例如，在一些实施方案中，ssRNA的A、U、C和G核糖核苷酸中的至少一个可以被经修饰的核糖核苷酸替代。例如，在一些实施方案中，ssRNA中存在的一些或所有胞苷残基可以被经修饰的胞苷替代，在一些实施方案中，该经修饰的胞苷可以是例如5-甲基胞苷。作为替代或补充，在一些实施方案中，ssRNA中存在的一些或所有尿苷残基可以被经修饰的尿苷替代，在一些实施方案中，该经修饰的尿苷可以是例如假核苷，例如，如1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，ssRNA中存在的所有尿苷残基被假尿苷，例如1-甲基假尿苷替代。
在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的重链的ssRNA在5′至3′方向上包含：(a)5′UTR编码区；(b)分泌信号编码区；(c)重链编码区；(d)3′UTR编码区；和(e)polyA尾编码区。参见例如图13。在一些实施方案中，5′UTR编码区是来源于与科扎克区组合的人α-珠蛋白mRNA的序列或包含来源于与科扎克区组合的人α-珠蛋白mRNA的序列。在一些实施方案中，分泌信号编码区是编码MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS的氨基酸序列的核苷酸序列或包含编码MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，重链编码区编码IgG形式的CLDN-18.2靶向抗体剂(例如，如本文中所述的那些，例如IMAB262)的VH结构域、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，或由SEQ ID NO：3的氨基酸残基27至474表示的氨基酸序列。在一些实施方案中，3′UTR编码区是或者包含来源于“***的氨基端增强子”(AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)的至少两个序列元件的组合(FI元件)。在一些实施方案中，polyA尾编码区是或者包含经修饰的polyA序列(例如，被紧接在30个连续腺苷之后***的接头序列破坏的100个腺苷的polyA序列)。在一些实施方案中，这样的ssRNA包含5′帽结构，其包含CAP1结构，或m2 7，3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。在一些实施方案中，这样的ssRNA包含所有被N1-甲基假尿苷替代的尿苷。
在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的轻链的ssRNA在5′至3′方向上包含：(a)5′UTR编码区；(b)分泌信号编码区；(c)轻链编码区；(d)3′UTR编码区；和(e)polyA尾编码区。参见例如图13。在一些实施方案中，5′UTR编码区是来源于与科扎克区组合的人α-珠蛋白mRNA的序列或包含来源于与科扎克区组合的人α-珠蛋白mRNA的序列。在一些实施方案中，分泌信号编码区是编码MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS的氨基酸序列的核苷酸序列或包含编码MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，轻链编码区编码IgG形式的CLDN-18.2靶向抗体剂(例如，如本文中所述的那些，例如IMAB262)的VL结构域和CL结构域，或由SEQ ID NO：4的氨基酸残基27至246表示的氨基酸序列。在一些实施方案中，3′UTR编码区是或者包含来源于“***的氨基端增强子”(AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)的至少两个序列元件的组合(FI元件)。在一些实施方案中，polyA尾编码区是或者包含经修饰的polyA序列(例如，被紧接在30个连续腺苷之后***的接头序列破坏的100个腺苷的polyA序列)。在一些实施方案中，这样的ssRNA包含5′帽结构，其包含CAP1结构，或m2 7’3-OGppp(m1 2’-O)ApG。在一些实施方案中，这样的ssRNA包含所有被N1-甲基假尿苷替代的尿苷。
在一些实施方案中，ssRNA是或者包含一种或更多种单链mRNA。
在一些实施方案中，组合物包含编码靶向CLDN-18.2的抗体剂(例如，本文中所述的靶向CLDN-18.2的抗体剂)的重链(例如，开放阅读框，ORF)的单链mRNA和编码靶向CLDN-18.2的抗体剂(例如，本文中所述的靶向CLDN-18.2的抗体剂)的轻链(例如，开放阅读框，ORF)的单链mRNA，其在引入到靶细胞中之后在靶细胞中被翻译成相应的亚基并形成完整的IgG抗体。示例性药物物质在图13中示意性地给出。
在一些实施方案中，RNA药物物质是或包含两种ssRNA的组合，其分别编码IgGCLDN-18.2靶向抗体的重链(HC)和轻链(LC)。在一些实施方案中，可以分开制造这样的两种ssRNA中的每一种，并且可以通过将分别编码IgG CLDN-18.2靶向抗体的HC和LC的ssRNA以适当的重量比(例如使得编码HC和LC的单链RNA的所得摩尔比为约1.5∶1至1∶1.5以形成适当的IgG的重量比)混合来制备RNA药物物质。
在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向IgG抗体的HC和/或LC的单链RNA可包含一个或更多个非编码序列元件，例如以增强RNA稳定性和/或翻译效率。例如，在一些实施方案中，这样的单链RNA寡核苷酸可包含帽结构，例如，可提高RNA分子对于胞外和胞内RNA酶降解的抗性并导致更高的蛋白质表达的帽结构。在一些实施方案中，示例性帽结构是或包含(m2 7，3’-OGppp(m1 2’-O))ApG(帽1)。在一些实施方案中，这样的单链RNA寡核苷酸可在5′和3′非翻译区(UTR)中的一者或二者处包含一个或更多个非编码序列元件，例如，在5′和3′UTR处的天然存在序列元件，其可显著提高分子的胞内半衰期和翻译效率(参见例如，Holtkampet al.2006；Orlandini von Niessen et al.2019)。在一些实施方案中，示例性5′UTR序列元件是来自人α-珠蛋白的特征序列和科扎克共有序列或者包含来自人α-珠蛋白的特征序列和科扎克共有序列。在一些实施方案中，示例性3′UTR序列元件是或者包含来源于“***的氨基端增强子”(AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)的两个序列元件的组合(FI元件)。对于示例性3′UTR序列元件的序列信息，参见例如WO2017/060314，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，这样的单链RNA寡核苷酸可包含poly(A)尾，例如，被设计成提高RNA稳定性和/或翻译效率的poly(A)尾。在一些实施方案中，示例性poly(A)尾是或包含长度为110个核苷酸的经修饰的poly(A)序列，其包含30个腺苷残基的段(stretch)，随后是10个核苷酸的接头序列和另一70个腺苷残基的段(A30L70)。在一些实施方案中，这样的单链RNA寡核苷酸可以包含一个或更多个经修饰的核糖核苷酸。仅举例来说，在一些实施方案中，单链RNA的尿苷可以用经修饰的类似物(例如，N1-甲基假尿苷)替代以降低和/或抑制免疫调节活性并因此增强体外转录的RNA的翻译。
在一些实施方案中，RNA药物物质是或包含具有如下表2中所公开的RNA-HC的构建体的第一单链RNA与具有如下表2中所公开的RNA-LC的构建体的第二单链RNA的组合。在一些这样的实施方案中，RNA药物物质可以通过将第一和第二单链RNA以约2:1的重量比混合来制备。
表2.编码CLDN-18.2靶向IgG抗体的单链RNA的示例性构建体
Figure BDA0003871087100000551
B.示例性制造方法
单独的单链RNA可以通过本领域已知的方法产生。例如，在一些实施方案中，单链RNA可以例如，使用DNA模板通过体外转录产生。用作体外转录模板以生成本文中所述的ssRNA的质粒DNA也在本公开内容的范围内。
在存在适当的RNA聚合酶(例如重组RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶)和三磷酸核糖核苷酸(例如ATP、CTP、GTP、UTP)的情况下，使用DNA模板用于体外RNA合成。在一些实施方案中，ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)可以在存在经修饰的三磷酸核糖核苷酸的情况下合成。仅举例来说，在一些实施方案中，三磷酸N1-甲基假尿苷(mlΨTP)可用于代替三磷酸尿苷(UTP)。如本领域技术人员将清楚的，在体外转录期间，RNA聚合酶(例如，如本文所述和/或使用的)通常沿3′→5′方向穿过单链DNA模板的至少一部分以产生沿5′→3′方向的单链互补RNA。
在其中ssRNA包含poly A尾的一些实施方案中，本领域技术人员将理解这样的poly A尾可以在DNA模板中编码，例如，通过使用适当加尾的PCR引物，或者其可以在体外转录之后，例如通过酶处理(例如，使用poly(A)聚合酶，例如大肠杆菌(E.coli)Poly(A)聚合酶)添加至ssRNA中。
在一些实施方案中，本领域技术人员将理解，将5′帽添加至RNA(例如，mRNA)可有助于RNA识别以及将RNA与核糖体连接以启动翻译并增强翻译效率。本领域技术人员还将理解，5′帽还可以保护RNA产物免受5′核酸外切酶介导的降解，并因此提高半衰期。加帽的方法是本领域已知的；本领域普通技术人员将理解，在一些实施方案中，加帽可在体外转录之后在存在加帽***(例如，基于酶的加帽***，例如，如牛痘病毒的加帽酶)的情况下进行。在一些实施方案中，可以在体外转录期间引入帽以及多个三磷酸核糖核苷酸，使得帽在转录期间并入到ssRNA(也称为共转录加帽)。在一些实施方案中，可在体外转录期间使用用于共转录加帽的5′帽类似物(例如，本文中所述的5′帽类似物，例如，如m2 7，3’-OGppp(m2’-O)ApG)。在聚合期间，用5′帽类似物(例如，m2 7，3’-OGppp(m2’-O)ApG)在5′端对RNA进行加帽。在一些实施方案中，可使用在反应过程中进行多次添加的GTP补料分批操作来维持低浓度的GTP以有效地对RNA进行加帽。
在RNA转录之后，DNA模板被消化。在一些实施方案中，消化可以在适当条件下使用DNA酶I来实现。
在一些实施方案中，体外转录的单链RNA可以在缓冲溶液中提供，例如在缓冲液例如HEPES、磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液中；在一些实施方案中，这样的溶液可以被缓冲至例如约6.5至约7.5范围内的pH；在一些实施方案中，约7.0的pH。在一些实施方案中，单链RNA的产生还可包括以下步骤中的一个或更多个：纯化、混合、过滤和/或填充。
在一些实施方案中，可以对ssRNA进行纯化(例如，在一些实施方案中，在体外转录反应之后)，例如以去除在产生过程中使用或形成的组分，如例如蛋白质、DNA片段和/或核苷酸。可以根据本公开内容使用本领域已知的多种核酸纯化。某些纯化步骤可以是或包括例如沉淀、柱色谱(其包括但不限于阴离子、阳离子、疏水相互作用色谱(HIC))、基于固体基质的纯化(例如基于磁珠的纯化)中的一个或更多个。在一些实施方案中，可以使用基于磁珠的纯化来纯化ssRNA，在一些实施方案中，所述基于磁珠的纯化可以是或包括基于磁珠的色谱。在一些实施方案中，可以使用疏水相互作用色谱(HIC)和/或渗滤来纯化ssRNA。在一些实施方案中，可以使用HIC随后是渗滤来纯化ssRNA。
在一些实施方案中，dsRNA可以作为体外转录期间的副产物获得。在一些这样的实施方案中，可以进行第二纯化步骤以去除dsRNA污染。例如，在一些实施方案中，可使用纤维素材料(例如，微晶纤维素)去除dsRNA污染，例如在一些实施方案中以色谱形式。在一些实施方案中，可以对纤维素材料(例如，微晶纤维素)进行预处理以灭活潜在的RNA酶污染，例如在一些实施方案中，通过高压灭菌随后与碱性水溶液(例如NaOH)一起孵育。在一些实施方案中，可使用纤维素材料根据WO2017/182524(其全部内容通过引用并入本文)中描述的方法纯化ssRNA。
在一些实施方案中，ssRNA批次可以通过一个或更多个过滤和/或浓缩步骤进一步加工。例如，在一些实施方案中，还可对ssRNA(例如，在去除dsRNA污染之后)进行渗滤(例如，在一些实施方案中，通过切向流过滤)，例如以将ssRNA的浓度调节至期望的RNA浓度和/或将缓冲剂更换为药物物质缓冲剂。
在一些实施方案中，其中CLDN-18.2靶向抗体剂由编码CLDN-18.2靶向抗体剂的重链的第一ssRNA和编码CLDN-18.2靶向抗体剂的轻链的第二ssRNA编码，使得二者在翻译和表达时形成完整抗体，第一ssRNA批次和第二ssRNA批次各自在纯化(例如，如本文中所述的)之后可以以合适的比例混合。例如，在一些实施方案中，这样的第一ssRNA批次和第二ssRNA批次可以以约1:1.5至约1.5:1的摩尔比混合，例如在一些实施方案中以约1:1的摩尔比混合。
在一些实施方案中，ssRNA在其填充至合适的容器之前可以通过0.2μm过滤进行处理。
在一些实施方案中，ssRNA及其组合物可以根据如本文所述或如本领域另外已知的方法制造。
在一些实施方案中，ssRNA及其组合物可以以大规模制造。例如，在一些实施方案中，ssRNA批次可以以大于1g、大于2g、大于3g、大于4g、大于5g、大于6g、大于7g、大于8g、大于9g、大于10g、大于15g、大于20g或更大的规模制造。
在一些实施方案中，可以在ssRNA和/或包含其的组合物的产生过程中的任何时间进行和/或监测RNA品质控制。例如，在一些实施方案中，可以在ssRNA制造过程的每个或某些步骤之后，例如，在体外转录之后和/或每个纯化步骤之后评估和/或监测RNA品质控制参数，包括RNA同一性(例如，序列、长度和/或RNA性质)、RNA完整性、RNA浓度、残余DNA模板和残余dsRNA中的一个或更多个。
在一些实施方案中，ssRNA(例如，通过体外转录所产生的)和/或包含两种或更多种RNA(例如，一种编码抗体的HC并且另一种编码抗体的LC)的组合物的稳定性可以是在多种测试储存条件下，例如在室温与冰箱或零下的温度下，在一段时间内(例如，至少3个月、至少6个月、至少9个月、至少12个月或更长)进行评估。在一些实施方案中，ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)和/或其组合物可以在冰箱温度(例如，约4℃至约10℃)下稳定储存至少1个月或更长时间，包括至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月或更长时间。在一些实施方案中，ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)和/或其组合物可以在零下温度(例如，-20℃或更低)下稳定储存至少1个月或更长时间，包括至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月或至少12个月或更长时间。在一些实施方案中，ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)和/或其组合物可以在室温(例如，约25℃)下稳定储存至少1个月或更长时间。
在一些实施方案中，如实施例11中所述的一种或更多种评估可以在ssRNA的制造或者其他制备或使用期间使用(例如，作为释放测试)。
在一些实施方案中，可以评估一个或更多个品质控制参数以确定本文中所述的ssRNA是否满足或超过接受标准(例如，用于随后的配制和/或释放以用于分配)。在一些实施方案中，这样的品质控制参数可包括但不限于RNA完整性、RNA浓度、残余DNA模板和/或残余dsRNA。用于评估RNA品质的某些方法是本领域已知的；例如，本领域技术人员将认识到在一些实施方案中，可使用一种或更多种分析测试进行RNA品质评估。这样的某些分析测试的实例可包括但不限于凝胶电泳、UV吸收和/或PCR测定。
在一些实施方案中，可以对ssRNA批次的如本文中所述的一个或更多个特征进行评估以确定接下来的行动步骤。例如，如果RNA品质评估表明单链RNA批次满足或超过相关接受标准，则可以将这样的单链RNA批次指定用于制造和/或配制和/或分配的一个或更多个另外的步骤。否则，如果这样的单链RNA批次不符合或未超过接受标准，则可以采取替代行动(例如丢弃该批次)。
在一些实施方案中，满足评估结果的ssRNA批次可用于制造和/或配制和/或分配的一个或更多个另外的步骤。
IV.RNA递送技术
可使用本领域已知的任何合适的方法来递送提供的ssRNA(例如，mRNA)以用于本文中所述的治疗性应用，所述方法包括，例如，作为裸RNA递送，或者通过病毒和/或非病毒载体、基于聚合物的载体、基于脂质的载体、纳米粒(例如脂质纳米粒、聚合物纳米粒、脂质-聚合物混合纳米粒等)和/或基于肽的载体介导的递送。参见，例如，Wadhwa et al.“Opportunities and Challenges in the Delivery of mRNA-Based Vaccines”Pharmaceutics(2020)102(第27页)，其内容通过引用并入本文，以获取关于可用于递送本文中所述的ssRNA的多种方法的信息。
在一些实施方案中，一种或更多种ssRNA可与脂质纳米粒一起配制以用于递送(例如，在一些实施方案中，通过静脉内注射)。
在一些实施方案中，脂质纳米粒可被设计成保护ssRNA(例如，mRNA)免受胞外RNA酶的影响和/或经改造以用于将RNA全身递送至靶细胞(例如，肝细胞)。在一些实施方案中，当将ssRNA静脉内施用于有此需要的对象时，这样的脂质纳米粒可特别可用于递送ssRNA(例如，mRNA)。
A.脂质纳米粒
在一些实施方案中，提供的ssRNA(例如，mRNA)可与脂质纳米粒一起配制。在多个实施方案中，这样的脂质纳米粒的平均尺寸(例如，平均直径)可以为：约30nm至约150nm、约40nm至约150nm、约50nm至约150nm、约60nm至约130nm、约70nm至约110nm、约70nm至约100nm、约70至约90nm或约70nm至约80nm。在一些实施方案中，根据本公开内容可使用的脂质纳米粒的平均尺寸(例如，平均直径)可以为约50nm至约100nm。在一些实施方案中，脂质纳米粒的平均尺寸(例如，平均直径)可以为约50nm至约150nm。在一些实施方案中，脂质纳米粒的平均尺寸(例如，平均直径)可以为约60nm至约120nm。在一些实施方案中，根据本公开内容可使用的脂质纳米粒的平均尺寸(例如，平均直径)可以为约30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。
在某些实施方案中，当核酸(例如，ssRNA)存在于提供的脂质纳米粒中时，其在水溶液中对用核酸酶的降解具有抗性。
在一些实施方案中，脂质纳米粒是肝靶向脂质纳米粒。
在一些实施方案中，脂质纳米粒是阳离子脂质纳米粒，其包含一种或更多种阳离子脂质(例如，本文中所述的阳离子脂质)。在一些实施方案中，阳离子脂质纳米粒可包含至少一种阳离子脂质、至少一种聚合物缀合的脂质和至少一种辅助脂质(例如，至少一种中性脂质)。
1.辅助脂质
在一些实施方案中，用于递送本文中所述的ssRNA的脂质纳米粒包含至少一种辅助脂质，其可以是中性脂质、带正电荷的脂质或带负电荷的脂质。在一些实施方案中，辅助脂质是可用于提高将基于脂质的颗粒(例如基于阳离子脂质的颗粒)递送至靶细胞的有效性的脂质。在一些实施方案中，辅助脂质可以是结构脂质或包含结构脂质，其浓度经选择以优化LNP颗粒尺寸、稳定性和/或包封。
在一些实施方案中，用于递送本文中所述的ssRNA的脂质纳米粒包含中性辅助脂质。这样的中性辅助脂质的一些实例包括但不限于磷脂酰胆碱，例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、磷脂酰乙醇胺(例如1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、鞘磷脂(sphingomyelin，SM)、神经酰胺、胆固醇、类固醇(例如固醇)及其衍生物。中性脂质可以是合成或天然来源的。本领域已知的另一些中性辅助脂质，例如，如WO 2017/075531和WO 2018/081480中所述(其各自的全部内容出于本文中所述的目的通过引用并入本文)，也可用于本文中所述的脂质纳米粒。在一些实施方案中，用于递送本文中所述的ssRNA的脂质纳米粒包含DSPC和/或胆固醇。
在一些实施方案中，用于递送本文中所述的ssRNA的脂质纳米粒包含至少两种辅助脂质(例如，本文中所述的辅助脂质)。在一些这样的实施方案中，脂质纳米粒可包含DSPC和胆固醇。
2.阳离子脂质
在一些实施方案中，用于递送本文中所述的ssRNA的脂质纳米粒包含阳离子脂质。阳离子脂质通常是具有净正电荷的脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质可包含一个或更多个带正电荷的胺基。在一些实施方案中，阳离子脂质可包含阳离子头基，意指带正电荷的头基。在一些实施方案中，阳离子脂质可具有疏水结构域(例如，中性脂质或阴离子脂质的一个或更多个结构域)，前提是阳离子脂质具有净正电荷。在一些实施方案中，阳离子脂质包含极性头基，在一些实施方案中，其可包含一种或更多种胺衍生物，例如伯胺、仲胺和/或叔胺、季铵、多种胺组合、铵盐或胍和/或咪唑基以及吡啶、哌嗪和氨基酸头基(例如赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸和/或色氨酸)。在一些实施方案中，阳离子脂质的极性头基包含一种或更多种胺衍生物。在一些实施方案中，阳离子脂质的极性头基包含季铵。在一些实施方案中，阳离子脂质的头基可包含多个阳离子电荷。在一些实施方案中，阳离子脂质的头基包含一个阳离子电荷。单阳离子脂质的一些实例包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-溴化二甲基氮(DMRIE)、双十二烷基(二甲基)溴化氮(DDAB)、1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)、3P-[N-(N\N′-二甲基氨基-乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Choi)和/或二油基醚磷脂酰胆碱(DOEPC)。
在一些实施方案中，本文中所述的带正电荷的脂质结构还可包含一种或更多种可通常用于形成囊泡(例如用于稳定化)的其他组分。这样的其他组分的一些实例包括但不限于脂肪醇、脂肪酸和/或胆固醇酯或者可影响表面电荷、膜流动性并有助于将脂质并入脂质装配体中的任何其他可药用赋形剂。固醇的一些实例包括胆固醇、胆固醇半琥珀酸酯、胆固醇硫酸酯或任何其他胆固醇衍生物。优选地，至少一种阳离子脂质包含DMEPC和/或DOTMA。
在一些实施方案中，阳离子脂质是可离子化的，使得其可根据pH以带正电荷的形式或中性形式存在。阳离子脂质的这样的电离可影响脂质颗粒在不同pH条件下的表面电荷，这在一些实施方案中可影响血浆蛋白吸收、血液清除和/或组织分布以及形成内体非双层结构的能力。因此，在一些实施方案中，阳离子脂质可以是pH响应性脂质或包含pH响应性脂质。在一些实施方案中，pH响应性脂质是脂肪酸衍生物或其他两亲性化合物，其能够形成易溶性脂质相，并且其pKa值为pH 5至pH 7.5。这意味着脂质在高于pKa值的pH下不带电荷，而在低于pKa值的pH下带正电荷。在一些实施方案中，pH响应性脂质可用于补充或代替阳离子脂质，例如通过在低pH下将一种或更多种ssRNA与脂质或脂质混合物结合。pH响应性脂质包括但不限于1,2-二烯氧基-3-二甲基氨基-丙烷(DODMA)。
在一些实施方案中，脂质纳米粒可包含一种或更多种阳离子脂质，如WO 2017/075531(例如，如其中的表1和3中所示)和WO 2018/081480(例如，如其中的表1至4中所示)中所述，其各自的全部内容出于本文中所述的目的通过引用并入本文。
在一些实施方案中，根据本公开内容可使用的阳离子脂质是氨基脂质，其包含通过酯键与至少两个饱和烷基链连接的可滴定叔氨基头基，该酯键可容易地水解以促进通过肾途径的快速降解和/或***。在一些实施方案中，这样的氨基脂质的表观pKa为约6.0至6.5(例如，在一个实施方案中的表观pKa为约6.25)，产生在酸性pH(例如，pH 5)下基本上完全带正电荷的分子。在一些实施方案中，这样的氨基脂质在并入LNP中时可赋予调节ssRNA的颗粒形成、细胞摄取、融合性(fusogenicity)和/或内体释放的不同物理化学性质。在一些实施方案中，在pH 4.0下将RNA水溶液引入至包含这样的氨基脂质的脂质混合物可导致在带负电荷的RNA骨架与带正电荷的阳离子脂质之间的静电相互作用。不希望受到任何特定理论的束缚，这样的静电相互作用导致颗粒形成与RNA药物物质的有效包封一致。在RNA包封之后，将所得LNP周围的介质的pH调节至更中性的pH(例如，pH 7.4)导致LNP表面电荷的中和。当所有其他变量保持恒定时，与被网状内皮***快速清除的带电荷颗粒相比，这样的电荷中性颗粒显示出更长的体内循环寿命和更好的向肝细胞的递送。在内体摄取之后，内体的低pH使包含这样的氨基脂质的LNP融合并允许RNA释放至靶细胞的胞质溶胶中。
在一些实施方案中，根据本公开内容可使用的阳离子脂质具有下表3中所列出的结构之一：
表3：示例性阳离子脂质
Figure BDA0003871087100000631
Figure BDA0003871087100000641
Figure BDA0003871087100000651
Figure BDA0003871087100000661
Figure BDA0003871087100000671
Figure BDA0003871087100000681
Figure BDA0003871087100000691
Figure BDA0003871087100000701
在某些实施方案中，根据本公开内容可使用的阳离子脂质是((3-羟丙基)氮烷二基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)或包含((3-羟丙基)氮烷二基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)，其化学结构在实施例14中示出。
阳离子脂质可单独使用或与中性脂质(例如胆固醇和/或中性磷脂)组合使用，或与其他已知的脂质装配组分组合使用。
3.聚合物缀合的脂质
在一些实施方案中，用于递送ssRNA的脂质纳米粒可包含至少一种聚合物缀合的脂质。聚合物缀合的脂质通常是包含脂质部分和与其缀合的聚合物部分的分子。
在一些实施方案中，聚合物缀合的脂质是PEG缀合的脂质。在一些实施方案中，PEG缀合的脂质被设计成通过形成保护性疏水性脂质层的保护性亲水层来在空间上稳定脂质颗粒。在一些实施方案中，当体内施用这样的脂质颗粒时，PEG缀合的脂质可减少其与血清蛋白的缔合和/或由此产生的网状内皮***的摄取。
多种PEG缀合的脂质是本领域已知的，并且包括但不限于聚乙二醇化二酰基甘油(pegylated diacylglycerol，PEG-DAG)(例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(pegylated phosphatidylethanoloamine，PEG-PE))、PEG二酰基甘油琥珀酸酯(PEG succinate diacylglycerol，PEG-S-DAG)(例如4-O-(2′,3′-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸二乙酯(PEG-S-DMG))、聚乙二醇化神经酰胺(pegylated ceramide，PEG-cer)或者PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯(例如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯)等。
某些PEG缀合的脂质(也称为聚乙二醇化脂质)获得了临床批准，其在临床试验中显示出安全性。已知PEG缀合的脂质影响细胞摄取，其是内体定位和有效载荷递送的前提。本公开内容尤其提供了这样的见解：可通过调节PEG-脂质锚的烷基链长度以可预测的方式来控制经包封核酸的药理学。在一些实施方案中，本公开内容尤其提供了这样的见解：可选择这样的PEG缀合的脂质用于ssRNA/LNP药物产品制剂以提供ssRNA至肝的最佳递送。在一些实施方案中，这样的PEG缀合的脂质可基于合理的溶解度特征和/或其分子量来设计和/或选择以有效地执行空间屏障的功能。例如，在一些实施方案中，这样的聚乙二醇化脂质对生物膜没有显示出明显的表面活性剂或渗透性增强或干扰作用。在一些实施方案中，这样的PEG缀合脂质中的PEG可用可生物降解的酰胺键与二酰基脂质锚连接，从而促进快速降解和/或***。在一些实施方案中，包含PEG缀合的脂质的LNP保留了完整足数的聚乙二醇化脂质。在血液区室中，这样的聚乙二醇化脂质随时间推移从颗粒中解离，显示出更容易被细胞吸收的更融合的颗粒，最终导致RNA有效载荷的释放。
在一些实施方案中，脂质纳米粒可包含一种或更多种PEG缀合的脂质或聚乙二醇化的脂质，如WO 2017/075531和WO 2018/081480中所述，其各自的全部内容出于本文中所述的目的通过引用并入本文。例如，在一些实施方案中，根据本公开内容可使用的PEG缀合的脂质可具有如WO2017/075531中所述的以下结构或者其可药用盐、互变异构体或立体异构体：
Figure BDA0003871087100000721
其中：R8和R9各自独立地是包含10至30个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烷基链，其中烷基链任选地被一个或更多个酯键中断；并且w具有范围为30至60的平均值。在一些实施方案中，R8和R9各自独立地是包含12至16个碳原子的直链饱和烷基链。在一些实施方案中，w具有范围为43至53的平均值。在另一些实施方案中，平均w为约45。在一些实施方案中，PEG缀合的脂质是2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺或包含2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺，其化学结构如实施例14中所示。
在一些实施方案中，形成本文中所述的脂质纳米粒的脂质包含：聚合物缀合的脂质；阳离子脂质；和辅助中性脂质。在一些这样的实施方案中，总聚合物缀合的脂质可以以总脂质的约0.5mol％至5mol％、约0.7mol％至3.5mol％、约1mol％至2.5mol％、约1.5mol％至2mol％或约1.5mol％至1.8mol％存在。在一些实施方案中，总聚合物缀合的脂质可以以总脂质的约1mol％至2.5mol％存在。在一些实施方案中，总阳离子脂质与总聚合物缀合的脂质(例如，PEG缀合的脂质)的摩尔比可以为约100:1至约20:1，或约50:1至约20:1，或约40:1至约20:1，或约35:1至约25:1。在一些实施方案中，总阳离子脂质与总聚合物缀合的脂质的摩尔比可以为约35:1至约25:1。
在涉及本文中所述的脂质纳米粒中的聚合物缀合的脂质、阳离子脂质和辅助中性脂质的一些实施方案中，总阳离子脂质以总脂质的约35mol％至65mol％、约40mol％至60mol％、约41mol％至49mol％、约41mol％至48mol％、约42mol％至48mol％、约43mol％至48mol％、约44mol％至48mol％、约45mol％至48mol％、约46mol％至48mol％或约47.2mol％至47.8mol％存在。在某些实施方案中，总阳离子脂质以总脂质的约47.0mol％、47.1mol％、47.2mol％、47.3mol％、47.4mol％、47.5mol％、47.6mol％、47.7mol％、47.8mol％、47.9mol％或48.0mol％存在。
在涉及本文中所述的脂质纳米粒中的聚合物缀合的脂质、阳离子脂质和辅助中性脂质的一些实施方案中，总中性脂质以总脂质的约35mol％至65mol％、约40mol％至60mol％、约45mol％至55mol％，或约47mol％至52mol％存在。在一些实施方案中，总中性脂质以总脂质的35mol％至65mol％存在。在一些实施方案中，总非类固醇中性脂质(例如，DPSC)以总脂质的约5mol％至15mol％、约7mol％至13mol％或9mol％至11mol％存在。在一些实施方案中，总非类固醇中性脂质以总脂质的约9.5mol％、10mol％或10.5mol％存在。在一些实施方案中，总阳离子脂质与非类固醇中性脂质的摩尔比范围为约4.1:1.0至约4.9:1.0、约4.5:1.0至约4.8:1.0或约4.7:1.0至4.8:1.0。在一些实施方案中，总类固醇中性脂质(例如，胆固醇)以总脂质的约35mol％至50mol％、约39mol％至49mol％、约40mol％至46mol％、约40mol％至44mol％或约40mol％至42mol％存在。在某些实施方案中，总类固醇中性脂质(例如，胆固醇)以总脂质的约39mol％、40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％、45mol％或46mol％存在。在某些实施方案中，总阳离子脂质与总类固醇中性脂质的摩尔比为约1.5:1至1:1.2或约1.2:1至1:1.2。
在一些实施方案中，包含阳离子脂质、聚合物缀合的脂质和中性脂质的脂质组合物可具有以总脂质的特定摩尔百分比或者以如WO2018/081480中所述的特定摩尔比(相对于彼此)存在的单独脂质，其各自的全部内容出于本文中所述的目的通过引用并入本文。
在一些实施方案中，形成脂质纳米粒的脂质包含：聚合物缀合的脂质(例如，PEG缀合的脂质)；阳离子脂质；和中性脂质，其中聚合物缀合的脂质以总脂质的约1mol％至2.5mol％存在；阳离子脂质以总脂质的35mol％至65mol％存在；并且中性脂质以总脂质的35mol％至65mol％存在。在一些实施方案中，形成脂质纳米粒的脂质包含：聚合物缀合的脂质(例如，PEG缀合的脂质)；阳离子脂质；和中性脂质，其中聚合物缀合的脂质以总脂质的约1mol％至2mol％存在；阳离子脂质以总脂质的45mol％至48.5mol％存在；并且中性脂质以总脂质的45mol％至55mol％存在。在一些实施方案中，形成脂质纳米粒的脂质包含：聚合物缀合的脂质(例如，PEG缀合的脂质)；阳离子脂质；和中性脂质(包含非类固醇中性脂质和类固醇中性脂质)，其中聚合物缀合的脂质以总脂质的约1mol％至2mol％存在；阳离子脂质以总脂质的45mol％至48.5mol％存在；非类固醇中性脂质以总脂质的9mol％至11mol％存在；并且类固醇中性脂质以总脂质的约36mol％至44mol％存在。在许多这样的实施方案中，PEG缀合的脂质是或包含2-[(聚乙二醇)-2000]-N，N-双十四烷基乙酰胺或其衍生物。在许多这样的实施方案中，阳离子脂质是或包含((3-羟丙基)氮烷二基)双(壬烷-9，1-二基)双(2-辛酸丁酯)或其衍生物。在许多这样的实施方案中，中性脂质包含DSPC和胆固醇，其中DSPC是非类固醇中性脂质并且胆固醇是类固醇中性脂质。
B.制备脂质纳米粒的示例性方法
包含核酸的脂质纳米粒和脂质及其制备方法是本领域已知的，包括例如如在以下中所述：美国专利No.8,569,256、5,965,542和美国专利公开No.2016/0199485，2016/0009637，2015/0273068，2015/0265708，2015/0203446，2015/0005363，2014/0308304，2014/0200257，2013/086373，2013/0338210，2013/0323269，2013/0245107，2013/0195920，2013/0123338，2013/0022649，2013/0017223，2012/0295832，2012/0183581，2012/0172411，2012/0027803，2012/0058188，2011/0311583，2011/0311582，2011/0262527，2011/0216622，2011/0117125，2011/0091525，201I/0076335，201I/0060032，2010/0130588，2007/0042031，2006/0240093，2006/0083780，2006/0008910，2005/0175682，2005/017054，2005/0118253，2005/0064595，2004/0142025，2007/0042031，1999/009076和PCT公开No.WO 99/39741，WO 2018/081480，WO 2017/004143，WO 2017/075531，WO 2015/199952，WO 2014/008334，WO 2013/086373，WO 2013/086322，WO 2013/016058，WO 2013/086373，W02011/141705，和WO 2001/07548，其全部公开内容出于本文中所述的目的通过引用整体并入本文。
例如，在一些实施方案中，阳离子脂质、中性脂质(例如，DSPC和/或胆固醇)和聚合物缀合的脂质可以以预先确定的摩尔比(例如本文中所述的摩尔比)溶解在乙醇中。在一些实施方案中，脂质纳米粒(LNP)以大约10∶1至30∶1的总脂质与ssRNA重量比制备。在一些实施方案中，这样的ssRNA可在乙酸盐缓冲液中稀释至0.2mg/mL。
在一些实施方案中，使用乙醇注射技术，可如下形成包含ssRNA的胶体脂质分散体：将包含脂质例如阳离子脂质、中性脂质和聚合物缀合的脂质的乙醇溶液注射到包含ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)的水溶液中。
在一些实施方案中，脂质和ssRNA溶液可在室温下通过以受控的流量将每种溶液泵入混合单元中(例如使用活塞泵)来混合。在一些实施方案中，脂质溶液和RNA溶液进入混合单元中的流量保持在1:3的比例。在混合之后，随着乙醇脂质溶液被水性ssRNA稀释，形成核酸-脂质颗粒。脂质溶解度降低，而带正电荷的阳离子脂质与带负电荷的RNA相互作用。
在一些实施方案中，包含包封RNA的脂质纳米粒的溶液可通过浓度调节、缓冲液更换、配制和/或过滤中的一种或更多种来处理。
在一些实施方案中，包封RNA的脂质纳米粒可通过过滤(例如0.2μm过滤)来处理。
在一些实施方案中，脂质纳米粒(具有或具有ssRNs)的颗粒尺寸和/或内部结构可通过合适的技术来监测，所述技术例如如，小角度X射线散射(small-angle X-rayscattering，SAXS)和/或透射电子低温显微术(transmission electron cryomicroscopy，CryoTEM)。
V.提供的靶向密蛋白-18.2的药物组合物
在一些实施方案中，组合物包含提供的编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA。在一些实施方案中，这样的ssRNA可与脂质纳米粒(例如，本文中所述的脂质纳米粒)一起配制以用于施用于有此需要的对象。因此，本文中提供的一个方面涉及药物组合物，其包含提供的编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA和脂质纳米粒(例如，本文中所述的脂质纳米粒)，其中这样的ssRNA被脂质纳米粒包封。
在其中药物组合物包含编码CLDN-18.2靶向抗体剂(例如，本文中所述的CLDN-18.2靶向抗体剂)的可变重链(VH)结构域的第一ssRNA和编码抗体剂(例如，本文中所述的抗体剂)的可变轻链(VL)结构域的第二ssRNA的一些实施方案中，这样的第一ssRNA和第二ssRNA可以以约1.5:1至约1:1.5的摩尔比存在，或者在一些实施方案中以约1.2:1至约1:1.2的摩尔比存在，或者在一些实施方案中以约1:1的摩尔比存在。在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂(例如，本文中所述的CLDN-18.2靶向抗体剂)的可变重链(VH)结构域的第一ssRNA和编码抗体剂(例如，本文中所述的抗体剂)的可变轻链(VL)结构域的第二ssRNA可以以3:1至1:1的重量比存在，或者在一些实施方案中以约2:1的重量比存在。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物的RNA内容物(例如，一种或更多种编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA)以约0.5mg/mL至约1.5mg/mL或者以约0.8mg/mL至约1.2mg/mL的浓度存在。
药物制剂可另外包含可药用赋形剂，如本文中所用，其包括任何且所有的溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体载剂、分散体或悬浮助剂、表面活性剂、等张剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体黏合剂、润滑剂等，如适合于所期望的特定剂型的那些。Remington′s TheScience and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；通过引用并入本文)公开了用于配制药物组合物的多种赋形剂以及用于其制备的已知技术。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不期望的生物作用或者在另一些情况下以有害方式与药物组合物的任何其他组分相互作用，否则其使用预期在本公开内容的范围内。
在一些实施方案中，赋形剂被批准用于人和用于兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂由美国食品和药物管理局(United States Food and Drug Administration)批准。在一些实施方案中，赋形剂是药用级的。在一些实施方案中，赋形剂符合美国药典(UnitedStates Pharmacopoeia，USP)、欧洲药典(European Pharmacopoeia，EP)、英国药典(British Pharmacopoeia)和/或国际药典(International Pharmacopoeia)的标准。
用于制造药物组合物的可药用赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散剂和/或制粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、黏合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油剂。这样的赋形剂可任选地包含在药物制剂中。根据配方师的判断，赋形剂例如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和/或芳香剂可存在于组合物中。
药剂的配制和/或制造中的一般考虑因素可见于例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,2005(通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，本文中所提供药物组合物可根据常规技术用一种或更多种可药用载体或稀释剂以及任何其他已知的辅料和赋形剂来配制，例如在Remington:TheScience and Practice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,2005(通过引用并入本文)中所公开的那些。
本文中所述的药物组合物可通过本领域已知的合适的方法来施用。如本领域技术人员将理解的，施用的途径和/或模式可取决于多种因素，包括例如但不限于本文中所述的药物组合物的稳定性和/或药代动力学和/或药效学。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物被配制成用于肠胃外施用，其包括除肠内和表面施用之外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物被配制成用于静脉内施用。在一些实施方案中，可用于静脉内施用的可药用载体包括无菌水溶液或分散体和用于制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。
治疗组合物通常必须是无菌的并且在制造和储存条件下是稳定的。该组合物可配制成溶液、分散体、粉末(例如，冻干粉末)、微乳剂、脂质纳米粒或适合高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，适当的流动性可通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过在分散体的情况下保持所需的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂来保持。在许多情况下，将优选在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。在一些实施方案中，可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可通过将活性化合物以所需的量与上面列举的成分中的一种或组合根据需要并入合适的溶剂中随后灭菌和/或微过滤来制备。在一些实施方案中，药物组合物可如本文中所述和/或用本领域已知的方法来制备。
在一些实施方案中，通过将活性化合物并入无菌载剂中来制备分散体，所述无菌载剂包含基本分散介质和来自以上列举那些的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的期望成分的粉末。
可用于本文中所述的药物组合物的合适的水性和非水性载体的一些实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。适当的流动性可例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、通过在分散体的情况下保持所需的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂来保持。
这些组合物还可包含辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌操作和通过包含多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)二者来确保防止微生物的存在。还可期望在本文中所述的药物组合物中包含等张剂，例如糖、氯化钠等。另外，可通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
本文中所述的药物组合物的制剂可通过药理学领域中已知的或此后开发的任何方法来制备。一般而言，这样的制备方法包括这样的步骤：使活性成分与稀释剂或另一赋形剂和/或一种或更多种其他辅助成分缔合，并随后如果必要和/或期望的话，进行成型，和/或将产品包装成期望的单剂量或多剂量单位。
根据本公开内容的药物组合物可作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量批量制备、包装和/或出售。本文中使用的“单位剂量”是药物组合物的离散量，其包含预先确定量的至少一种使用本文中所述的***和/或方法产生的RNA产物。
包封在LNP中的ssRNA、可药用赋形剂和/或药物组合物中的任何另外的成分的相对量可根据待治疗的对象、靶细胞、疾病或病症而变化，并且还可进一步取决于施用组合物的途径。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方法配制成可药用剂型。本文中所述的药物组合物中活性成分(例如，包封在脂质纳米粒中的ssRNA)的实际剂量水平可以变化，以便获得有效实现特定患者、组合物、和施用方式的期望治疗响应而对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本公开内容的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的***速率、治疗持续时间、与所采用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康状况和既往病史，以及医学领域中公知的类似因素。
具有本领域普通技术的医师或兽医可容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于为了实现所期望的治疗效果所需水平之药物组合物中使用的活性成分(例如，包封在脂质纳米粒中的ssRNA)的剂量开始，并逐渐提高剂量直至实现所期望的效果。例如，如实施例8中所述的示例性剂量可用于制备可药用剂型。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物被配制成(例如，用于静脉内施用)递送活性剂量，其赋予由ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)编码的CLDN-18.2靶向抗体剂的血浆浓度，所述抗体剂通过其主要作用方式ADCC来介导药理活性。对于IMAB362，ADCC的剂量响应相关性在临床上得到了良好的表征，并且据报道通过ADCC以0.3至28μg/mL的EC95来有效裂解CLDN-18.2+细胞(Sahin et al.2018)。因此，在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物被配制成(例如，用于静脉内施用)递送活性剂量，其赋予由ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)编码的CLDN-18.2靶向抗体剂的约0.3至28μg/mL的血浆浓度，所述抗体剂通过其主要作用方式ADCC来介导药理活性。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物被配制成(例如，用于静脉内施用)以预期实现抗体水平(例如，血浆水平和/或组织水平)高于约0.1μg/mL的水平递送一种或更多种编码针对CLDN-18.2的抗体剂的本文中所述的ssRNA(例如，mRNA)；在一些实施方案中，所述抗体水平高于约0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL或具有高至或高于在抗体施用下所观察到的范围。
在一些实施方案中，药物组合物被配制成(例如，用于静脉内施用)递送0.15mgRNA/kg的剂量，对应于在Cmax下大约7μg/mL CLDN-18.2靶向抗体剂。图14示出了编码CLDN-18.2靶向抗体剂的RNA药物物质在食蟹猴中在tmax(48小时)时的剂量-暴露相关性。如本领域技术人员将理解的，假定LNP转染效力和mRNA翻译在食蟹猴与人之间是相当的(Coelhoet al.2013)，则在一些实施方案中，药物组合物被配制成(例如，用于静脉内施用)递送与由ssRNA编码的CLDN-18.2靶向抗体剂的期望的血浆水平相对应的合适的剂量，如图14所示。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物被配制成(例如，用于静脉内施用)递送一定剂量的一种或更多种编码针对CLDN-18.2的抗体剂的ssRNA(例如，mRNA)，以如在实施例8中所述的剂量，包括例如以0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.6mg/kg、0.65mg/kg、0.7mg/kg、0.75mg/kg、0.80mg/kg、0.85mg/kg、0.9mg/kg、0.95mg/kg、1.0mg/kg、1.25mg/kg、1.5mg/kg、1.75mg/kg、2.0mg/kg、2.25mg/kg、2.5mg/kg、2.75mg/kg、3.0mg/kg、3.25mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、5mg/kg或更高的剂量。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物被配制成(例如，用于静脉内施用)递送一定剂量的一种或更多种编码针对CLDN-18.2的抗体剂的ssRNA(例如，mRNA)，以1.5mg/kg的剂量。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物被配制成递送一定剂量的一种或更多种编码针对CLDN-18.2的抗体剂的ssRNA(例如，mRNA)，以5mg/kg的剂量。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物还可包含一种或更多种添加剂，其例如在一些实施方案中可增强这样的组合物在特定条件下的稳定性。添加剂的一些实例可包括但不限于盐、缓冲物质、防腐剂和载体。例如，在一些实施方案中，药物组合物还可包含冷冻保护剂(例如，蔗糖)和/或水性缓冲溶液，在一些实施方案中，其可包含一种或更多种盐，包括例如碱金属盐或碱土金属盐，例如，如钠盐、钾盐和/或钙盐。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物还可包含除编码CLDN-18.2靶向剂(例如，抗体剂)的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)之外的一种或更多种活性剂。例如，在一些实施方案中，这样的另一些活性剂可以是化学治疗剂或包含化学治疗剂。在一些实施方案中，示例性化学治疗剂可以是以下或包含以下：适用于治疗胰腺癌的化学治疗剂，包括例如但不限于吉西他滨和/或紫杉醇(例如nab-紫杉醇)、亚叶酸、氟尿嘧啶、伊立替康和/或奥沙利铂等。在一些实施方案中，示例性化学治疗剂可以是以下或包含以下：适用于治疗胆道癌的化学治疗剂，包括例如但不限于吉西他滨和/或顺铂。
在一些实施方案中，可包含在本文中所述的药物组合物中的活性剂是以下或包含以下：以本文中所述的组合治疗施用的治疗剂。本文中所述的药物组合物可以以组合治疗施用，即与其他药剂组合施用。例如，在一些实施方案中，组合治疗可包含所提供药物组合物与至少一种抗炎剂或至少一种免疫抑制剂。这样的治疗剂的一些实例包括但不限于一种或更多种抗炎剂，例如甾体药物或NSAID(非甾体抗炎药)、阿司匹林(aspirin)和其他水杨酸盐、Cox-2抑制剂(例如罗非昔布(rofecoxib)(Vioxx)和塞来昔布(Celebrex)，NASID例如布洛芬(ibuprofen)(Motrin,Advil)、非诺洛芬(fenoprofen)(Nalfon)、萘普生(Naprosyn)、舒林酸(sulindac)(Clinoril)、双氯芬酸(Voltaren)、吡罗昔康(piroxicam)(Feldene)、酮洛芬(ketoprofen)(Orudis)、二氟尼柳(diflunisal)(Dolobid)、萘丁美酮(nabumetone)(Relafen)、依托度酸(etodolac)(Lodine)、奥沙普嗪(oxaprozin)(Daypro)和吲哚美辛(indomethacin)(Indocin)。在一些实施方案中，这样的治疗剂可包括导致调节性T细胞耗尽或功能失活的药剂，例如低剂量环磷酰胺、抗-CTLA4抗体、抗-IL2或抗-IL2受体抗体。
在一些实施方案中，这样的治疗剂可包括一种或更多种化学治疗剂，例如紫杉醇(Taxol)衍生物、泰索帝(taxotere)、紫杉醇(例如，nab-紫杉醇)、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、多柔比星(doxorubicin)(Adriamycin)、顺铂(Platinol)、环磷酰胺(Cytoxan,Procytox,Neosar)、亚叶酸、伊立替康、奥沙利铂。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可与一种或更多种化学治疗剂组合施用，所述化学治疗剂可提高待治疗癌症患者的肿瘤中的CLDN-18.2表达水平，例如提高至少10％或更多，包括例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可与放射治疗和/或自体外周干细胞或骨髓移植结合施用。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可与一种或更多种选自以下的抗体组合施用：抗CD25抗体、抗EPCAM抗体、抗EGFR、抗Her2/neu和抗CD40抗体。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可与抗C3b(i)抗体组合施用以增强补体激活。
在一些实施方案中，本文中所提供药物组合物是用于静脉内施用的在水性缓冲液中的不含防腐剂的无菌RNA-LNP分散体。在一些实施方案中，将包含在药物组合物中的RNA药物物质(例如，本文中所述的ssRNA)以0.8至1.2mg/mL填充至5.0mL标称填充体积。将药物组合物在-80℃至-60℃下储存。
尽管对本文中所提供药物组合物的描述主要针对适合于施用于人的药物组合物，但本领域技术人员将理解，这样的组合物通常适合于施用于所有种类的动物。对适合于施用于人的药物组合物进行修饰以使组合物适合于施用于多种动物是很好理解的，并且普通技术的兽医药理学家可仅通过普通的(如果有的话)实验来设计和/或进行这样的修饰。
A.可用组分的鉴定和/或表征
为确保本文中所述的药物组合物中可用组分(例如编码CLDN-18.2靶向抗体剂的ssRNA)的合适品质，可进行和/或监测一种或更多种品质评估和/或相关标准(例如，如实施例11至12中所述)。
此外，本公开内容提供了表征ssRNA或其组合物的一个或更多个特征的方法，所述ssRNA编码抗体剂的一部分或全部。
在一些实施方案中，ssRNA(例如，在一些实施方案中，包含各自编码CLDN-18.2靶向抗体剂的重链或轻链的至少两种ssRNA的组合物)的RNA完整性评估可通过调整毛细管凝胶电泳测定来进行。在一些实施方案中，对较长的HC编码RNA的区域比例进行评价以描述编码CLDN-18.2靶向抗体剂的不同链的两种RNA的完整性。例如，包含两种或更多种RNA的RNA组合物可通过毛细管凝胶电泳来分析，其得到电泳图作为结果。仅作为示例，包含两种不同RNA的RNA组合物在两个单独的峰中洗脱，例如，每个对应于编码抗体不同链(例如，重链或轻链)的RNA。参见，例如图15。
本公开内容尤其提供了这样的见解，即分子比强影响该参数，并且根据通过微滴式数字PCR测量的分子比来设置混合物的规格。该规格依赖于由精确序列和重量比限定的给定混合物。
作为补充或替代，在一些实施方案中，编码CLDN-18.2靶向抗体剂重链的ssRNA与编码CLDN-18.2靶向抗体剂轻链的ssRNA的RNA比可通过微滴式数字PCR来测量。
作为补充或替代，在一些实施方案中，残余的DNA模板和残余的dsRNA作为过程中控制根据关于药物物质中间体水平的接受标准来测量，以确保在混合至药物物质之前(例如，在将编码CLDN-18.2靶向抗体剂的不同链的两种ssRNA混合之前)单独RNA的品质。在一些实施方案中，相关接受标准用于单独ssRNA的过程中品质控制。
作为补充或替代，在一些实施方案中，可在包含ssRNA的组合物中测量残余的宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白。
B.有效递送的表征(例如，血浆浓度)
在一些实施方案中，可评估组合物及其组分以确定它们的效力。在一些实施方案中，可确定本文中所述的药物组合物在体外和/或在体内的主要药效学和/或药代动力学。可用药代动力学量度的一些实例可包括以下一个或更多个参数：
·Cmax对应于在施用药物之后和施用第二剂量之前在身体的特定区室或测试区域中药物实现的最大(或峰值)血浆/血清浓度。相关的药代动力学参数tmax是观察到Cmax的时间。
·Cmin对应于在给药之后药物实现的最小血浆/血清浓度。
·Ctrough对应于在稳态时给药间隔结束时的谷血浆浓度(通常在下次施用之前直接采集)
·曲线下面积(area under the curve，AUC)是描述作为时间的函数的血浆中药物浓度的变化的曲线的定积分。AUC(从零到无穷大)表示随时间的总药物暴露。
在一些实施方案中，由ssRNA编码的CLDN-18.2靶向抗体剂的功能装配可在体外和在体内以剂量依赖性方式来确定，例如，如实施例6中所述。
在一些实施方案中，可确定由本文中所述的ssRNA编码的CLDN-18.2靶向抗体剂的结合特异性、对ADCC和CDC的介导和/或抗肿瘤活性，例如，如实施例1至4中所述。
本公开内容尤其提供了这样的方法，其包括以下步骤：确定由引入到细胞中的至少一种mRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征，其中这样的至少一种mRNA包含至少一种或更多种ssRNA的一个或更多个特征，所述ssRNA包含编码相对于密蛋白-18.1多肽而优先与密蛋白-18.2(CLDN-18.2)多肽结合的抗体剂的编码区，其中这样的一个或更多个特征包含：(i)抗体剂的蛋白质表达水平；(ii)抗体剂与CLDN-18.2的结合特异性；(iii)抗体剂通过ADCC介导靶细胞死亡的效力；以及(iv)抗体剂通过补体依赖性细胞毒性(CDC)介导靶细胞死亡的效力。
在一些实施方案中，本文中提供了表征靶向CLDN-18.2的药物组合物的方法。这样的方法包括以下步骤：(a)使细胞与至少一种本文中所述的组合物或药物组合物(其编码CLDN-18.2靶向抗体剂的一部分或全部)接触；以及检测由细胞产生的抗体剂。在一些实施方案中，细胞可以是肝细胞或包括肝细胞。
在一些实施方案中，这样的方法还可包括确定由一种或更多种本文中所述的ssRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征，其中这样的一个或更多个特征包含：(i)抗体剂的蛋白质表达水平；(ii)抗体剂与CLDN-18.2多肽的结合特异性；(iii)抗体剂通过ADCC介导靶细胞死亡的效力；以及(iv)抗体剂通过补体依赖性细胞毒性(CDC)介导靶细胞死亡的效力。在一些实施方案中，确定由一种或更多种本文中所述的ssRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征的步骤可包括将CLDN-18.2靶向抗体剂的这样的特征与参考CLDN-18.2靶向抗体的特征进行比较。
在一些实施方案中，确定由一种或更多种本文中所述的ssRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征的步骤可包括评估抗体剂的蛋白质表达水平高于阈值水平。例如，在一些实施方案中，阈值水平对应于治疗相关血浆浓度。
在一些实施方案中，确定由一种或更多种本文中所述的ssRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征的步骤可包括评估抗体剂与CLDN-18.2多肽的结合。在一些实施方案中，这样的结合评估可包括确定相对于抗体剂与CLDN18.1多肽的结合，抗体剂与CLDN-18.2多肽的结合。在一些实施方案中，这样的结合评估可包括确定抗体剂的结合优先谱至少与参考CLDN-18.2靶向抗体的结合优先谱相当。例如，在一些实施方案中，参考CLDN-18.2靶向抗体是佐贝妥昔单抗或克劳西单抗。
在一些实施方案中，如果抗体剂包含以下特征：(a)由细胞表达的抗体剂的蛋白质水平高于阈值水平；(b)相对于CLDN18.1，抗体剂与CLDN-18.2的优先结合；以及(c)通过ADCC和/或CDC介导对至少50％靶细胞(例如癌细胞)的杀伤，则提供的表征靶向CLDN-18.2的药物组合物或其组分的方法还可包括将由一种或更多种本文中所述的ssRNA表达的抗体剂表征为CLDN-18.2靶向抗体剂。
在一些实施方案中，如果抗体的测试特征至少与佐贝妥昔单抗或克劳西单抗的特征相当，则提供的表征靶向CLDN-18.2的药物组合物或其组分的方法还可包括将由一种或更多种本文中所述的ssRNA表达的抗体剂表征为佐贝妥昔单抗或克劳西单抗等同抗体。
在涉及确定由一种或更多种本文中所述的ssRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征的步骤的一些实施方案中，这样的步骤可包括确定以下特征中的一个或更多个：
·在接触或施用48小时之后评估时，细胞是否表达由至少一种ssRNA编码的CLDN-18.2靶向抗体剂；
·该细胞所表达的抗体剂是否相对于CLDN18.1多肽优先与CLDN-18.2多肽结合；
·该细胞所表达的抗体剂是否表现出与参考CLDN-18.2靶向单克隆抗体相当的针对CLDN-18.2的靶特异性，如在流式细胞术结合测定中所观察到的；
·在抗体剂存在下将免疫效应细胞(例如，PBMC细胞)与CLDN-18.2阳性细胞或CLDN-18.2阴性对照细胞孵育48小时之后进行评估时，是否是CLDN-18.2阳性细胞而不是对照细胞被裂解；
·该细胞所表达的抗体剂是否表现出与在相同浓度参考CLDN-18.2靶向单克隆抗体的情况下观察到的至少相当的所靶向CLDN-18.2阳性细胞的ADCC谱；以及
·在抗体剂存在下将CLDN-18.2阳性细胞或CLDN-18.2阴性对照细胞与人血清一起孵育2小时之后进行评估时，是否是CLDN-18.2阳性细胞而不是对照细胞被裂解。
在一些实施方案中，在提供的表征靶向CLDN-18.2的药物组合物或其组分的方法中使用的细胞存在于体内，例如，在对象(例如，哺乳动物对象，例如哺乳动物非人对象，例如，小鼠或猴对象)中。在一些这样的实施方案中，确定由一种或更多种本文中所述的ssRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征的步骤可包括在这样的对象中的一个或更多个组织中确定抗体水平。在一些实施方案中，如果这样的组合物或药物组合物被表征为CLDN-18.2靶向抗体剂，则这样的表征方法还可包括将本文中所述的组合物或药物组合物施用于各自荷人CLDN-18.2阳性异种移植肿瘤的动物对象组以确定抗肿瘤活性。
在本公开内容的范围内还包括这样的制造方法，其包括以下步骤：
(A)确定ssRNA或其组合物的一个或更多个特征，所述ssRNA编码抗体剂的一部分或全部，所述一个或更多个特征选自：
(i)ssRNA的长度和/或序列；
(ii)ssRNA的完整性；
(iii)ssRNA中一个或更多个化学部分的存在和/或位置；
(iv)当将ssRNA引入到细胞中时抗体剂的表达程度；
(v)ssRNA或其组合物的稳定性；
(vi)来自已将ssRNA引入其中的生物体的生物样品中抗体剂的水平；
(vii)由ssRNA表达的抗体剂的结合特异性，任选地与CLDN-18.2且任选地相对于CLDN18.1的结合特异性；
(viii)抗体剂通过ADCC介导靶细胞死亡的效力；
(ix)抗体剂通过补体依赖性细胞毒性(CDC)介导靶细胞死亡的效力；
(x)组合物内中脂质的身份和量/浓度；
(xi)组合物内脂质纳米粒的尺寸；
(xii)组合物内脂质纳米粒的多分散性；
(xiii)组合物内ssRNA的量/浓度；
(xiv)ssRNA在脂质纳米粒内的包封程度；以及
(xv)其组合；
(B)将ssRNA或其组合物的一个或更多个特征与合适的参考标准的特征进行比较；以及
(C)(i)如果所述比较表明ssRNA或其组合物符合或超过参考标准，则将ssRNA或其组合物指定用于制造和/或分配的一个或更多个另外的步骤；或者
(ii)如果所述比较表明ssRNA或其组合物不符合或未超过参考标准，则采取替代行动。
在一些实施方案中，参考标准可以是任何品质控制标准，包括例如历史参考、规定规范。如本领域技术人员将理解的，在一些实施方案中，不需要直接比较。在一些实施方案中，参考标准是基于以下的接受标准：例如物理外观、脂质身份和/或含量、LNP尺寸、LNP多分散性、RNA包封、RNA长度、身份(作为RNA)、完整性、序列和/或浓度、pH、渗量浓度(osmolality)、RNA比(例如，HC RNA与LC RNA之比)、效力、细菌内毒素、生物负荷、残余有机溶剂、渗量浓度、pH及其组合。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可通过一种或更多种效力测定来确定，即，例如但不限于体外翻译、酶联免疫吸附测定(ELISA)和/或T细胞活化生物测定。例如，在一些实施方案中，细胞中由RNA组合物(例如本文中所述的RNA组合物)编码的CLDN-18.2靶向抗体的表达可通过ELISA在经脂质体转染的生产细胞的培养上清液中测量。在一些这样的实施方案中，可将经脂质体转染的生产细胞的上清液添加至CLDN-18.2表达靶细胞和作为效应细胞的FcRIIIa阳性萤光素酶报道细胞的共培养物。抗体与CLDN-18.2和FcγRIIIa受体的同时结合导致效应细胞的活化并导致萤光素酶表达，这通过发光读出进行量化。
在制造方法的一些实施方案中，当评估ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)并且ssRNA的一个或更多个特征符合或超过合适的参考标准时，这样的ssRNA被指定用于配制，例如，在一些实施方案中，涉及用本文中所述的脂质颗粒进行配制。
在制造方法的一些实施方案中，当评估包含ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)的组合物并且所述组合物的一个或更多个特征符合或超过合适的参考标准时，这样的组合物被指定用于组合物的释放和/或分配。
在制造方法的一些实施方案中，当ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)被指定用于配制和/或包含ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)的组合物被指定用于组合物的释放和/或分配时，这样的方法还可包括将制剂和/或组合物施用于各自荷人CLDN-18.2阳性异种移植肿瘤的动物对象组以确定抗肿瘤活性。
产生CLDN-18.2靶向抗体剂的方法也在本公开内容的范围内。在一些实施方案中，产生CLDN-18.2靶向抗体剂的方法包括向细胞施用包含至少一种ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)的组合物使得这样的细胞表达和分泌由这样的ssRNA编码的CLDN-18.2靶向抗体剂，所述ssRNA包含一个或更多个编码CLDN-18.2靶向抗体剂的编码区。在一些实施方案中，待施用或靶向的细胞是肝细胞或包括肝细胞。
在一些实施方案中，细胞存在于细胞培养物中。
在一些实施方案中，细胞存在于对象中。在一些这样的实施方案中，可将本文中所述的药物组合物施用于有此需要的对象。在一些实施方案中，可将这样的药物组合物施用于对象，使得以治疗相关血浆浓度产生CLDN-18.2靶向抗体剂。在一些实施方案中，治疗相关血浆浓度足以通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)来介导癌细胞死亡。例如，在一些实施方案中，治疗相关血浆浓度为0.3至28μg/mL。
VI.与高的CLDN-18.2表达相关的示例性癌症
A.实体瘤
癌症是全球第二主要死亡原因，并且预计在2018年将导致估计960万人死亡(Brayet al.2018)。一般而言，除了少数(例如生殖细胞肿瘤和一些类癌瘤)之外，一旦实体瘤转移，5年存活率很少超过25％。
晚期和转移性实体瘤的治疗
常规治疗(例如化学治疗、放射治疗、手术和靶向治疗)的改进以及免疫治疗的最新进展改善了患有晚期实体瘤的患者的结局。在过去的数年中，食品和药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)已批准八种检查点抑制剂(一种靶向CTLA-4途径的单克隆抗体伊匹单抗，以及七种靶向程序性死亡受体/配体[PD/PD-L1]的抗体，包括阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗、纳武单抗、西米普利单抗和派姆单抗)用于治疗患有多种癌症类型(主要是实体瘤)的患者。这些批准已极大地改变了癌症治疗的格局。然而，某些癌症例如胰腺腺癌或转移性胆道癌，仍未从现有的免疫治疗中受益。这种现象是多因素的，归因于胰腺导管腺癌(PDAC)的全身性和侵袭性性质、其复杂的突变环境、其促***增生性基质以及强效的免疫抑制性肿瘤微环境。
这两种癌症类型的不良预后突出了对另外的治疗方法的需求。本公开内容尤其提供了CLDN-18.2代表针对可靶向治疗特别有用的肿瘤相关抗原的见解。迄今为止，没有靶向CLDN-18.2的治疗被批准用于任何癌症适应证。因此，在一些实施方案中，本公开内容提供了以下见解：靶向CLDN-18.2的RNA编码的抗体可诱导ADCC和/或CDC和/或增强化学治疗和/或其他抗癌治疗的细胞毒性作用，从而转化为延长的无进展和/或总存活，例如，相对于单独施用的个体治疗和/或相对于另一合适的参考。
B.胰腺导管腺癌
胰腺导管腺癌(PDAC)是最普遍的胰腺肿瘤性疾病，占所有胰腺恶性肿瘤的超过90％(Kleeff et al.2016)。迄今为止，PDAC是世界范围内第四最常见的癌症相关死亡原因，其5年总存活率低于8％(Siegel et al.2018)。在未来PDAC的发生率预计将进一步上升，并且预测表明未来10年内无论是在新诊断方面还是在PDAC相关的死亡方面，美国和欧洲国家的病例数量将超过2倍高(Quante et al.2016；Rahib et al.2014；CancerResearch UK)。
PDAC治疗的效力和结局在很大程度上取决于在诊断时的疾病阶段。手术切除随后辅助化学治疗是唯一可能的可用治愈性治疗，但只有10％至20％的PDAC患者处于可切除的PDAC阶段，而剩余的80％至90％显示出局部晚期、不可切除的阶段或者(在大多数病例中)远端转移(Gillen et al.2010；Werner et al.2013)。全身化学治疗通常被用作患有不可切除或边界可切除的肿瘤的患者中的一线治疗。这涵盖了核苷类似物，包括吉西他滨和卡培他滨，或嘧啶类似物5-氟尿嘧啶，要么在单一治疗背景中要么与其他治疗方式(例如放射治疗)组合(Werner et al.2013；Manji et al.2017；Teague et al.2015)。据报道与单独的吉西他滨相比，由亚叶酸、5-氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂构成的多化学治疗方案FOLFIRINOX在转移阶段中的中位存活几乎是两倍(Conroy et al.2011)，并且吉西他滨和纳米粒白蛋白结合的紫杉醇(nanoparticle albumin-bound paclitaxel，nab-paclitaxel)的组合也显示出显著提高总存活(Von Hoff et al.2013)。这些治疗与相对高的毒性相关，因此通常阻止其在老年患者和/或体能状态不佳的患者中的应用，然而，据报道在使用期间总体生活品质得以提高(Gourgou-Bourgade et al.2013)。
表皮生长因子受体抑制剂厄洛替尼(eriotinib)是在美国批准与吉西他滨组合用于患有局部晚期、不可切除或转移性胰腺癌的患者的一线治疗的唯一靶向治疗。比较厄洛替尼与安慰剂的随机对照试验显示出0.4个月中位OS获益和0.3个月中位PFS获益。靶向PDAC的CLDN-18.2+亚群的BNT141可潜在地解决群体的相当高的未满足的医学需求。主办者旨在通过在首次人体研究期间确立与SOC(化学治疗)一起推进的安全剂量来加速BNT141在该适应证中的临床开发。
C.胆道癌
胆道癌构成胆道***(biliary tree)的上皮恶性肿瘤，并且包括以下：胆囊癌、法特壶腹(ampulla of Vater)癌(肝外胆管和肝内胆管)。在过去，该术语涵盖肝外胆管和肝内胆管，不包括胆囊癌和法特壶腹癌(de Groen et al.1999)。
胆道癌占所有胃肠道恶性肿瘤的大约3％(Charbel et al.2011)，并且是继肝细胞癌之后最常见的肝胆癌(Hennedige et al.2014)。遗憾的是，死亡率(每100,000人中有3.58人)非常高。这与在英国的发生率(每100,000人中有3.64人)相当(国家癌症情报网(National Cancer Intelligence Network)2015)，并相当于转移性环境中2％的5年存活率(国家癌症研究所(National Cancer Institute)Seer数据2015；Seer数据2014)。全球BTC患病率已上升22％，并且在2015年有150,000名患者被诊断出患有BTC(Vos etal.2015)。总体而言，发生率变化很大，某些地区显示出高患病率(例如，日本和韩国)。这可通过在地区(泰国东北部和中国)中的肝吸虫(泰国肝吸虫(Opisthorchis viverrini)和华支睾吸虫病(Clonorchiasis sinensis))感染来解释，在这些地区中胆管癌更常见(Parkinet al.1991；Kahn et al.2008)。具有胆石症高患病率的地区对应于具有胆囊癌高患病率地区，例如印度和智利(Randi et al.2009；Khan et al.1999；Kirstein andVogel.2016)。上述风险因素不常见的地理区域具有较少的BTC病例(Kahn et al.1999)。
除了上述风险因素外，原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、由于其他原因引起的肝硬化、丙型肝炎和先天性畸形(例如胆总管囊肿和多发性胆管***瘤病)也与患BTC的风险提高有关(Kahn et al.2008；Lee et al.2004；Chapman et al.1999)。另外，患有胚系突变导致林奇综合征(Lynch syndrome)以及BRCA1和BRCA2(乳腺癌基因1和2)遗传异常的患者也易患BTC。在BRCA2携带者中，患BTC与林奇综合征的终生风险为2％，以及患胆管癌的相对风险为4.97％(Golan et al.2017；Shigeyasu et al.2014)。
用于BTC的治疗根据疾病阶段进行分层，其中手术仍然是早期阶段治愈的支柱，尽管这占一小部分患者(10％至40％)(Cidon 2016)。对于晚期疾病的一线治疗，3期试验ABC-02确定了吉西他滨和顺铂的组合优于单一药剂吉西他滨。报道的中位OS分别为11.7个月vs8.1个月(风险比[hazard ratio，HR]0.64；95％置信区间[confidence interval，CI]0.52至0.80；p<0.001)(Valle et al.2010)，并且从那时起，这已成为用于晚期BTC的全球护理标准。尽管在随机3期试验中尚未超过从该方案获得的适度生存益处，但在吉西他滨与经口氟嘧啶S-1的组合的一项3期试验中，报道了吉西他滨与S-l组的中位OS为15.1个月vs吉西他滨/顺铂组中的13.4个月(HR 0.95；90％CI 0.78至1.15；p＝0.046，非劣效性)(Morizaneet al.2018)。该方案可被考虑作为用于其中合并症限制使用铂类药剂的患者的替代治疗。在患有晚期BTC的患者中的一线背景中评价吉西他滨、顺铂和nab-紫杉醇的组合的2期试验以中位OS为19.2个月的初步结果报道了优于与历史上相关的标准吉西他滨/顺铂方案(11.4个月与8.0个月)的中位PFS。该试验(NCT02392637)于2019年进行(Shroff etal.2017；Shroff et al.2018)。
VII.患者群体
本文中提供的技术可用于治疗与升高的CLDN-18.2的表达和/或活性相关的疾病或病症。在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于治疗CLDN-18.2阳性实体瘤。在一些实施方案中，可根据熟练的病理学家的实践通过免疫组织化学分析以染色强度评分为2或更高来确定CLDN-18.2阳性实体瘤。
本公开内容尤其认识到胰腺癌和胆管癌通常具有高的CLDN-18.2表达。因此，在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于治疗胰腺癌。例如，在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于治疗胰腺导管腺癌(PDAC)。在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于治疗胆管癌。
在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于治疗例如通过免疫组织化学分析被确定为CLDN-18.2阳性的胃食管癌。在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于治疗例如通过免疫组织化学分析被确定为CLDN-18.2阳性的非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)。
在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于治疗患有转移性CLDN-18.2+实体瘤的患者(例如，成年患者)。在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于治疗患有不可切除的CLDN-18.2+实体瘤的患者(例如，成年患者)，例如，在其中手术切除可能导致严重发生率的一些实施方案中。在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于治疗患有局部晚期CLDN-18.2+实体瘤的患者(例如成年患者)。作为补充或替代，在一些实施方案中，这样的患者中的癌症可能在治疗之后已经进展，或者这样的癌症患者可能没有令人满意的替代治疗。
在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于治疗患有局部晚期、不可切除或转移性CLDN-18.2+胰腺癌的成年患者。在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于治疗患有局部晚期、不可切除或转移性CLDN-18.2+胆道癌的成年患者。在一些实施方案中，正在接受本文中所述的治疗的患者可能已接受其他癌症治疗，例如但不限于化学治疗。
在一些实施方案中，患有CLDN-18.2阳性实体瘤的对象可能已接受足以提高CLDN-18.2水平/活性以使得他/她的实体瘤被表征为CLDN-18.2阳性实体瘤(例如，本文中所述的CLDN-18.2阳性实体瘤)的预治疗。例如，在一些实施方案中，这样的癌症患者可能已接受预期或预测提高CLDN-18.2的表达和/或活性或者可导致或已导致CLDN-18.2的表达和/或活性的化学治疗。例如，在一些实施方案中，这样的化学治疗可预期或预测提高CLDN-18.2的表达和/或活性或者可导致或已导致CLDN-18的表达和/或活性至少50％或更多，包括例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高，这在与不存在这样的化学治疗时CLDN-18.2的表达和/或活性相比时。在一些实施方案中，这样的化学治疗可预期或预测提高CLDN-18.2的表达和/或活性或者可导致或已导致CLDN-18的表达和/或活性至少2倍或更多，包括例如至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更高，这在与不存在这样的化学治疗时CLDN-18.2的表达和/或活性相比时。这样的化学治疗剂的一些实例包括但不限于nab-紫杉醇、吉西他滨、顺铂和/或FOLFIRINOX。
在一些实施方案中，符合如实施例16中所述疾病特异性纳入标准中一者或更多者的癌症患者适于本文中所述的治疗(例如，接受所提供药物组合物作为单一治疗或作为组合治疗的一部分)。在一些实施方案中，施用本文中所述的治疗的这样的癌症患者还可符合如实施例16中所述的其他纳入标准中的一者或更多者。
在一些实施方案中，符合如实施例16中所述的疾病特异性纳入标准中一者或更多者的癌症患者适于本文中所述的治疗(例如，接受所提供药物组合物作为单一治疗或作为组合治疗的一部分)。在一些实施方案中，施用本文中所述的治疗的这样的癌症患者还可符合如实施例16中所述的其他纳入标准中的一者或更多者。
在一些实施方案中，其肿瘤不表达CLDN-18.2或被确定为非CLDN-18.2阳性(例如，根据本文中所述的本公开内容)的癌症患者不施用本文中所述的治疗。
在一些实施方案中，患有CLDN-18.2阳性肿瘤但符合如实施例17中所述的排除标准中一者或更多者的癌症患者不施用本文中所述的治疗。
VIII.治疗(例如给药方案)
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可被靶细胞摄取进而以治疗相关血浆浓度产生编码的CLDN-18.2靶向抗体剂。在一些实施方案中，本文中所述的这样的药物组合物可以以足以诱导针对靶细胞(例如，肿瘤细胞)的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的血浆浓度递送编码的CLDN-18.2靶向抗体剂。
因此，本公开内容的另一个方面涉及使用本文中所述的药物组合物的方法。例如，本文中提供的一个方面是这样的方法，其包括向患有CLDN-18.2阳性实体瘤的对象施用所提供药物组合物。在一些实施方案中，所提供药物组合物通过静脉内注射或输注来施用。CLDN-18.2阳性实体瘤的一些实例包括但不限于胆道肿瘤、胃肿瘤、胃食管肿瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤，以及表达或表现出高于阈值水平(例如，在正常组织中观察到的CLDN-18.2水平)的CLDN-18.2多肽水平的肿瘤，例如，在一些实施方案中，高至少50％或更多，包括例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高，或者在一些实施方案中，高至少2倍或更多，包括例如至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更高。
本公开内容的另一个方面涉及在对象中递送用于癌症治疗的CLDN-18.2靶向抗体剂的方法中的某些改进，该方法包括向癌症对象施用所提供药物组合物。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可实现一种或更多种改进，例如以降低的TEAE发生率(例如，频率和/或严重程度)和/或效力水平与TEAE水平之间改善的关系(例如，改善的治疗窗)的有效施用，这相对于在施用相应的(例如，编码的)蛋白质(例如，抗体)剂本身时观察到的那些。特别地，本公开内容教导了这样的改进特别地可通过递送IMAB362来实现，这经由施用核酸，并且特别是编码其的RNA(例如，ssRNA，例如mRNA)。
给药方案：本领域技术人员知道癌症治疗剂通常以给药周期施用。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物以一个或更多个给药周期施用。
在一些实施方案中，一个给药周期是至少3天或更多天(包括，例如，至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30天。在一些实施方案中，一个给药周期是至少21天。
在一些实施方案中，一个给药周期可涉及多个剂量，例如，根据这样的模式，例如如可在一个周期内每天施用一个剂量，或者可在一个周期内每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天施用一个剂量。
在一些实施方案中，可施用多个周期。例如，在一些实施方案中，可施用至少2个周期(包括，例如，至少3个周期、至少4个周期、至少5个周期、至少6个周期、至少7个周期、至少8个周期、至少9个周期、至少10个周期或更多)。在一些实施方案中，待施用的给药周期的数量可随治疗类型(例如，单一治疗vs.组合治疗)而变化。在一些实施方案中，可施用至少3至8个给药周期。
在一些实施方案中，周期之间可存在“休止期”；在一些实施方案中，周期之间可不存在休止期。在一些实施方案中，周期之间有时可存在休止期而有时可不存在休止期。
在一些实施方案中，休止期的长度可在数天至数月的范围内。例如，在一些实施方案中，休止期的长度可以为至少3天或更长，包括例如至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天或更长。在一些实施方案中，休止期的长度可以为至少1周或更长，包括例如至少2周、至少3周、至少4周或更长。
在一些实施方案中，本文中所述的例如，用于单一治疗的药物组合物可以以至少三个周期施用，其中在一些实施方案中，每个周期为21天。在一些实施方案中，本文中所述的例如用于组合治疗的药物组合物可以以至少八个周期施用，其中在一些实施方案中每个周期为21天。
在一些实施方案中，本文中所提供药物组合物可在每个3周给药周期(21天/Q3W)的第1天施用。在一些实施方案中，患有CLDN-18.2+实体瘤的癌症患者可接受最多三个周期的治疗。在一些实施方案中，患有CLDN-18.2+实体瘤的癌症患者可接受最多八个周期。
剂量：本文中所述的药物组合物的剂量可随许多因素而变化，包括例如但不限于待治疗的对象的体重、癌症类型和/或癌症阶段、和/或单一治疗或组合治疗。在一些实施方案中，给药周期涉及施用设定数量和/或模式的剂量。例如，在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物以至少一个剂量/给药周期施用，包括例如至少两个剂量/给药周期、至少三个剂量/给药周期、至少四个剂量/给药周期或更多。
在一些实施方案中，给药周期涉及例如在特定的时间段内并且任选地通过多剂量施用设定的累积剂量，其可例如以设定的间隔和/或根据设定的模式来施用。在一些实施方案中，设定的累积剂量可以以设定的间隔通过多剂量来施用，使得在由这样的多剂量对靶细胞或对所治疗的对象产生的生物学和/或药代动力学作用至少存在一些时间重叠。在一些实施方案中，设定的累积剂量可以以设定的间隔通过多剂量来施用，使得由这样的多剂量对靶细胞或对所治疗的对象产生的生物学和/或药代动力学作用可以是相加的。仅通过实例的方式，在一些实施方案中，X mg的设定累积剂量可通过两个剂量且每个剂量为X/2mg来施用，其中这样的两个剂量施用的时间足够接近，使得由每个X/2mg剂量对靶细胞或对所治疗的对象产生的生物学和/或药代动力学作用可以是相加的。
在一些实施方案中，每个剂量或累积剂量(例如，用于静脉内施用)以这样的水平施用：该水平使得预期由提供的单链RNA表达的CLDN-18.2靶向抗体剂实现足够高以在整个给药周期中触发针对靶细胞(例如，癌细胞)的抗体依赖性细胞毒性的水平(例如，血浆水平和/或组织水平)。对于IMAB362，针对ADCC的剂量响应相关性在临床上得到了良好的表征，并且据报道以0.3至28μg/mL的EC95通过ADCC有效裂解CLDN-18.2+细胞(Sahin etal.2018)。因此，在一些实施方案中，每个剂量或累积剂量(例如，用于静脉内施用)以这样的量施用：该量赋予由ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)编码的CLDN-18.2靶向抗体剂的约0.3至28μg/mL的血浆浓度。
在一些实施方案中，每个剂量或累积剂量(例如，用于静脉内施用)以这样的水平施用：该水平使得预期由提供的单链RNA表达的CLDN-18.2靶向抗体剂实现与施用IMAB362观察到的治疗相关水平(例如，血浆水平和/或组织水平)相当的水平(例如，血浆水平和/或组织水平)。在一些实施方案中，每个剂量或累积剂量(例如，用于静脉内施用)以这样的水平施用，该水平使得预期由提供的单链RNA表达的CLDN-18.2靶向抗体剂实现以下水平(例如，血浆水平和/或组织水平)：高于约0.05至3μg/mL；在一些实施方案中，高于约0.1至10μg/mL；在一些实施方案中，高于约0.2至15μg/mL；在一些实施方案中，高于约0.3至30μg/mL；在一些实施方案中，高于约0.3至28μg/mL。在一些实施方案中，每个剂量或累积剂量(例如，用于静脉内施用)以这样的水平施用，该水平使得预期由提供的单链RNA表达的CLDN-18.2靶向抗体剂实现以下Ctrough水平(例如，血浆水平和/或组织水平)：高于约5μg/mL；在一些实施方案中，高于约10μg/mL；在一些实施方案中，高于约15μg/mL。
在一些实施方案中，每个剂量或累积剂量(例如，用于静脉内施用)以这样的水平来施用以递送一种或更多种编码CLDN-18.2靶向抗体剂的本文中所述的ssRNA(例如，mRNA)，该水平预期实现这样的抗体的以下水平(例如，血浆水平和/或组织水平)：高于约0.1μg/mL；在一些实施方案中，高于约0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL或具有高至和高于用IMAB362抗体施用观察到的范围。
不希望受到任何特定理论的束缚，本公开内容提供了以下见解：当应用于mRNA编码的抗体时，IMAB362的AUC可能无法准确阐明在给药周期内(例如，21天的给药周期内)具有药理学活性的浓度。在一些实施方案中，至少一次监测或测量AUC。在一些实施方案中，不监测或测量AUC。无论如何，在许多实施方案中，给药量和/或频率可独立于IMAB362的AUC。
不希望受到任何特定理论的束缚，本公开内容尤其提供了以下见解：达到针对IMAB362报道的Cmax可以不是必需的，并且可提高由本文中所述的药物组合物和由其表达的相应抗体剂诱导的毒性的风险。例如，在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可具有改善的药代动力学谱，其由于来自RNA的持续表达在延长的时间段内保持了所述抗体的生物活性剂量。因此，在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可以以这样的水平给药：该水平使得预期由提供的单链RNA表达的靶向CLDN-18.2的RiboMab实现低于针对IMAB362报道的Cmax的水平(例如，血浆水平和/或组织水平)。在一些实施方案中，给药量和/或频率可独立于针对IMAB362报道的Cmax。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物的每个剂量或累积剂量(例如，用于静脉内施用)可以以0.1mg RNA/kg至5mg RNA/kg待施用的对象体重范围内的量包含一种或更多种编码CLDN-18.2靶向抗体剂(无论是由单一ssRNA还是由两种或更多种ssRNA编码)的ssRNA。在一些实施方案中，每个剂量或累积剂量可以以以下量包含ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)：0.1mg RNA/kg、0.15mg RNA/kg、0.2mg RNA/kg、0.225mg RNA/kg、0.25mg RNA/kg、0.3mg RNA/kg、0.35mg RNA/kg、0.4mg RNA/kg、0.45mg RNA/kg、0.5mg RNA/kg、0.55mgRNA/kg、0.6mg RNA/kg、0.65mg RNA/kg、0.7mg RNA/kg、0.75mg RNA/kg、0.80mg RNA/kg、0.85mg RNA/kg、0.9mg RNA/kg、0.95mg RNA/kg、1.0mg RNA/kg、1.25mg RNA/kg、1.5mgRNA/kg、1.75mg RNA/kg、2.0mg RNA/kg、2.25mg RNA/kg、2.5mg RNA/kg、2.75mg RNA/kg、3.0mg RNA/kg、3.25mg RNA/kg、3.5mg RNA/kg、4mg RNA/kg、5mg RNA/kg或更高。在一些实施方案中，每个剂量或累积剂量可以以1.5mg RNA/kg的量包含ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)。在一些实施方案中，每个剂量或累积剂量可以以5mg RNA/kg的量包含ssRNA(例如，本文中所述的ssRNA)。
在一些实施方案中，施用所提供药物组合物的每个剂量或累积剂量(例如，用于静脉内施用)以递送0.15mg RNA/kg的剂量，在一些实施方案中其可对应于在Cmax时大约7μg/mL CLDN-18.2靶向抗体剂。图14示出了编码CLDN-18.2靶向抗体剂的RNA药物物质在食蟹猴中在tmax(48小时)时的剂量-暴露相关性。如本领域技术人员将理解的，假定LNP-转染效力和mRNA翻译在食蟹猴与人之间是相当的(Coelho et al.2013)，在一些实施方案中，可施用所提供药物组合物的每个剂量或累积剂量以递送与由ssRNA编码的CLDN-18.2靶向抗体剂的期望的血浆水平相对应的合适剂量，如图14中所示。
在一些实施方案中，给药可基于接受治疗的对象的响应来调整。例如，在一些实施方案中，如果用于安全性药理学评估的一个或更多个参数(例如，如实施例5中所述)表明先前剂量可能不满足根据医师的医学安全要求，则给药可涉及施用较高剂量随后施用较低剂量。在一些实施方案中，剂量递增可以以实施例8的表13中所示的水平中的一种或更多种进行；在一些实施方案中，剂量递增可涉及施用至少一种来自表13的较低剂量随后施用至少一种来自表13的较高剂量。不希望受到任何特定理论的束缚，本公开内容尤其提供了这样的见解：可应用药学指导的剂量递增(pharmaceutically guided dose escalation，PGDE)方法来确定本文中所述的药物组合物的合适剂量。示例性剂量递增研究在实施例8中提供。
本文中还提供了确定靶向CLDN-18.2的药物组合物的给药方案的方法。例如，在一些实施方案中，这样的方法包括以下步骤：(A)在预先确定的给药方案下向患有CLDN-18.2阳性实体瘤的对象施用药物组合物(例如，本文中所述的药物组合物)；(B)在一段时间内定期监测或测量对象的肿瘤尺寸；(C)基于肿瘤尺寸测量来评价给药方案。例如，如果在施用药物组合物(例如本文中所述的药物组合物)之后肿瘤尺寸的降低不是治疗相关的，则可提高剂量和/或给药频率；或者如果在施用药物组合物(例如本文中所述的药物组合物)之后肿瘤尺寸的降低是治疗相关的，但在对象中显示出不良作用(例如毒性作用)，则可降低剂量和/或给药频率。如果在施用药物组合物(例如本文中所述的药物组合物)之后肿瘤尺寸的降低是治疗相关的，并且在对象中没有显示出不良作用(例如毒性作用)，则不对给药方案做出改变。
在一些实施方案中，这样的确定靶向CLDN-18.2的药物组合物的给药方案的方法可在各自荷人CLDN-18.2阳性异种移植肿瘤的动物对象(例如，哺乳动物非人对象)组中进行。在一些这样的实施方案中，如果少于30％的动物对象在施用药物组合物(例如，本文中所述的药物组合物)之后表现出肿瘤尺寸的降低和/或动物对象表现出的肿瘤尺寸的降低程度不是治疗相关的，则可提高剂量和/或给药频率；或者如果在施用药物组合物(例如本文中所述的药物组合物)之后肿瘤尺寸的降低是治疗相关的，但在至少30％的动物对象中显示出显著的不良作用(例如毒性作用)，则可降低剂量和/或给药频率。如果在施用药物组合物(例如，本文中所述的药物组合物)之后肿瘤尺寸的降低是治疗相关的，并且在动物对象中没有显示出显著的不良作用(例如毒性作用)，则不对给药方案做出改变。
尽管本文中提供的给药方案(例如，给药时间表和/或剂量)主要适合于施用于人，但本领域技术人员将理解，可确定针对向所有种类动物施用的剂量等同方案。普通技术的兽医药理学家可仅用普通的实验(如果有的话)来设计和/或进行这样的确定。
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可作为单一治疗施用于患有CLDN-18.2+实体瘤的患者。
组合治疗：本公开内容尤其提供了以下见解：在利用接受体对象的免疫***时本文中所述的靶向CLDN-18.2的药物组合物诱导针对靶细胞(例如，肿瘤细胞)的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力可增强化学治疗和/或其他抗癌治疗的细胞毒性作用。在一些实施方案中，这样的组合治疗可延长无进展和/或总存活，例如相对于单独施用的个体治疗和/或相对于另一合适的参考。因此，在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可与其他抗癌剂组合施用于患有CLDN-18.2+实体瘤的患者。
不希望受到特定理论的束缚，本公开内容观察到某些化学治疗剂，例如如吉西他滨、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶显示出在胰腺癌细胞系中上调现有的CLDN-18.2表达水平；此外，未观察到这些药剂在CLDN-18.2阴性细胞系中提高从头表达。参见，例如，Türeci etal.(2019)“Characterization of Zolbetuximab in pancreatic cancer models”InOncoimmunology 8(1),pp.e1523096。
本公开内容尤其提供了以下见解：本文中所述的CLDN-18.2靶向治疗在施用于肿瘤(例如，肿瘤细胞、被怀疑具有和/或已检出这样的肿瘤和/或肿瘤细胞的对象)时可以是特别有用和/或有效的，所述肿瘤的特征在于(例如，已确定其显示出和/或预期或预测其显示出)肿瘤细胞(例如，由于暴露于一种或更多种化学治疗剂而可导致或已经导致)中CLDN-18.2表达的升高的表达和/或活性。实际上，本公开内容尤其教导了提供的如本文中所述的CLDN-18.2靶向治疗(例如，施用核酸例如RNA，并且更特别地，编码CLDN-18.2靶向抗体剂的mRNA)在与一种或更多种CDLN-18.2增强剂(例如，一种或更多种某些化学治疗剂)组合施用(例如，施用于已接受和/或正在接受或以其他方式暴露于所述一种或更多种CDLN-18.2增强剂的对象)时可提供协同治疗。因此，在一些实施方案中，如本文中所述的CLDN-18.2靶向治疗可用于与预期和/或已经显示出在肿瘤细胞中上调CLDN-18.2表达和/或活性的其他抗癌剂组合。例如，在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可与已经有效但不持久的细胞毒性治疗组合。
在一些实施方案中，所提供药物组合物可作为包含这样的药物组合物和化学治疗剂的组合治疗的一部分施用。因此，在一些实施方案中，所提供药物组合物可施用于患有CLDN-18.2+实体瘤的已接受化学治疗剂的对象。在一些实施方案中，所提供药物组合物可与化学治疗剂共施用于患有CLDN-18.2+实体瘤的对象。在一些实施方案中，所提供药物组合物和化学治疗剂可同时或顺序施用。例如，在一些实施方案中，可在施用所提供药物组合物之后(例如，至少四小时之后)施用第一剂量的化学治疗剂。在一些实施方案中，化学治疗剂和所提供药物组合物同时施用。
在其中预期化学治疗剂在癌症对象中提高CLDN-18.2的表达和/或活性的一些实施方案中，这样的化学治疗剂可在施用所提供药物组合物之前施用。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可一次施用，使得在响应于施用这样的化学治疗剂而使CLDN-18.2表达和/或活性升高期间，由本文中所述的ssRNA表达的CLDN-18.2靶向抗体剂达到其治疗相关血浆浓度(例如，如本文中所述)。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可一次施用，使得在响应于这样的化学治疗剂而使CLDN-18.2的表达和/或活性在与不存在这样的化学治疗剂的情况下CLDN-18.2的表达和/或活性相比时升高至少50％或更多，包括例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高时，由本文中所述的ssRNA表达的CLDN-18.2靶向抗体剂达到其治疗相关血浆浓度(例如，如本文中所述)。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可一次施用，使得在响应于这样的化学治疗剂而使CLDN-18.2的表达和/或活性在与不存在这样的化学治疗剂的情况下CLDN-18.2的表达和/或活性相比时升高至少1.5倍、至少2倍或更多，包括例如至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍或更高时，由本文中所述的ssRNA表达的CLDN-18.2靶向抗体剂达到其治疗相关血浆浓度(例如，如本文中所述)。这样的化学治疗剂的一些实例包括但不限于nab-紫杉醇、吉西他滨、顺铂和/或FOLFIRINOX。
与包含吉西他滨的抗癌治疗的组合治疗：在一些实施方案中，包含所提供药物组合物的施用的治疗可与包含吉西他滨的抗癌治疗共施用或重叠。吉西他滨杀伤正在进行脱氧核糖核酸(DNA)合成的细胞，并且阻断细胞进展通过G1/S期界线。吉西他滨被核苷激酶代谢成二磷酸和三磷酸(dCTP)核苷。吉西他滨二磷酸抑制核糖核苷酸还原酶(负责催化产生用于DNA合成的脱氧核苷三磷酸的反应的酶)，导致脱氧核苷酸浓度(包括dCTP)降低。吉西他滨三磷酸与dCTP竞争并入DNA中。二磷酸的作用对胞内dCTP浓度的降低增强吉西他滨三磷酸并入到DNA中(自增强)。在吉西他滨核苷酸并入到DNA中之后，仅有一个另外的核苷酸被添加至正在增长的DNA链，这最终导致凋亡性细胞死亡的起始。
与包含nab-紫杉醇的抗癌治疗的组合治疗：在一些实施方案中，包含所提供药物组合物的施用的治疗可与包含nab-紫杉醇的抗癌治疗共施用或重叠。nab-紫杉醇是白蛋白结合的形式的紫杉醇，其平均颗粒尺寸为约130nm。其是微管抑制剂，促进自微管蛋白二聚体装配微管，并通过阻止解聚来稳定微管。这种稳定性导致对于重要的间期和有丝***细胞功能至关重要的微管网络的正常动态重组的抑制。紫杉醇在整个细胞周期中诱导异常的微管阵列或“束”，以及在有丝***期间诱导多个微管星状体。
与包含顺铂的抗癌治疗的组合治疗：在一些实施方案中，包含所提供药物组合物的施用的治疗可与包含顺铂的抗癌治疗共施用或重叠。顺铂是包含被两个氯原子和两个氨分子以顺式位置包围的中心铂原子的重金属络合物。不希望受到理论的束缚，顺铂被认为通过与DNA结合并干扰其修复机制来杀伤癌细胞，最终导致细胞死亡。
与包含FOLFIRINOX的抗癌治疗的组合治疗：在一些实施方案中，包含所提供药物组合物的施用的治疗可与包含FOLFIRINOX的抗癌治疗共施用或重叠，所述FOLFIRINOX是癌症药物的组合，其包含：FOL-亚叶酸(也称为甲酰四氢叶酸、亚叶酸钙、或FA)；F-氟尿嘧啶(也称为5FU)；Irin-伊立替康；Ox-奥沙利铂。
甲酰四氢叶酸是四氢叶酸的5-甲酰基衍生物的非对映异构体的混合物。所述混合物的生物活性化合物是(-)-l-异构体，称为嗜橙菌因子(citrovorum factor)或(-)-亚叶酸。甲酰四氢叶酸不需要通过酶二氢叶酸还原酶进行还原以参与利用叶酸作为“单碳”部分的来源的反应。l-甲酰四氢叶酸(l-5-甲酰基四氢叶酸)被快速代谢(通过5,10-次甲基四氢叶酸，然后是5,10-亚甲基四氢叶酸)成l,5甲基四氢叶酸。l,5-甲基四氢叶酸可继而通过其他途径代谢回5,10-亚甲基四氢叶酸，其通过不可逆的酶催化的还原使用辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸磷酸转化为5-甲基四氢叶酸。
甲酰四氢叶酸可增强用于癌症治疗的氟嘧啶(例如5-氟尿嘧啶)的治疗和毒性作用。同时施用甲酰四氢叶酸不显示出对5-氟尿嘧啶的血浆PK的改变。5-氟尿嘧啶被代谢成氟脱氧尿苷酸，其结合并抑制酶胸苷酸合酶(在DNA修复和复制中重要的酶)。甲酰四氢叶酸容易转化成另一种还原的叶酸5,10-亚甲基四氢叶酸，其作用是使氟脱氧核苷酸与胸苷酸合酶的结合稳定，并从而增强对该酶的抑制。
氟尿嘧啶是核苷代谢抑制剂，其干扰DNA的合成并在较小程度上抑制RNA的形成；这些影响正在快速生长的细胞，并且可导致细胞死亡。氟尿嘧啶转化成三种主要的活性代谢物：5-氟-2′-脱氧尿苷-5′-单磷酸、5-氟尿苷-5′-三磷酸和5-氟-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸。这些代谢物具有数种作用，包括5-氟-2′-脱氧尿苷-5′-单磷酸对胸苷酸合酶的抑制、5-氟尿苷-5′-三磷酸并入到RNA中和5-氟-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸并入到DNA中。
伊立替康是喜树碱的衍生物。喜树碱与酶拓扑异构酶I特异性地相互作用，其通过诱导可逆的单链断裂来减轻DNA中的扭应变。伊立替康及其活性代谢物SN-38与拓扑异构酶I-DNA复合物结合并阻止这些单链断裂的再连接。目前的研究表明，伊立替康的细胞毒性是由于复制酶与由拓扑异构酶I、DNA，以及伊立替康或SN-38任一者形成的三元复合物相互作用时DNA合成期间产生的双链DNA损伤。哺乳动物细胞不能有效地修复这些双链断裂。
奥沙利铂在生理溶液中通过不稳定的草酸配体的置换进行非酶促转化成活性衍生物。形成了数种瞬时反应物质，包括单水和双水DACH铂，其与大分子共价结合。形成链间和链内血浆肿瘤DNA交联二者。在两个相邻的鸟嘌呤、相邻的腺嘌呤-鸟嘌呤和由间插核苷酸隔开的鸟嘌呤的N7位之间形成交联。这些交联抑制DNA复制和转录。细胞毒性是细胞周期非特异性的。
在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于施用于患有CLDN-18.2阳性胰腺肿瘤的对象。在一些实施方案中，这样的对象可正在接受所提供药物组合物作为单一治疗或作为组合治疗的一部分，所述组合治疗包含这样的所提供药物组合物和适用于治疗胰腺肿瘤的化学治疗剂。在一些实施方案中，这样的化学治疗剂可以是FOLFIRINOX或包含FOLFIRINOX，其是癌症药物的组合，其包含：亚叶酸(FOL)、氟尿嘧啶(F)、伊立替康(IRIN)和奥沙利铂(OX)。在一些实施方案中，这样的化学治疗剂可以是吉西他滨和/或紫杉醇(例如，nab-紫杉醇)或包含吉西他滨和/或紫杉醇(例如，nab-紫杉醇)。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可根据作为单一治疗用于治疗胰腺癌的吉西他滨(例如，Gemzar)的经批准剂量和治疗方案与吉西他滨组合施用，如实施例18中所述。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可与吉西他滨组合施用，所述吉西他滨以相比作为单一治疗用于治疗胰腺癌的吉西他滨(例如，Gemzar)的经批准剂量和治疗方案(如上所述)更低的剂量(例如，小于10％、小于20％、小于30％或更多)和/或以较不积极的治疗方案(例如，每10天，或每两周一次等)进行。在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可根据nab-紫杉醇/吉西他滨组合治疗的经批准剂量和治疗方案与吉西他滨和nab-紫杉醇组合施用，如实施例18中所述。在一些实施方案中，所提供的本文中所述的药物组合物可与nab-紫杉醇和吉西他滨组合施用，其中至少一种以相比nab-紫杉醇/吉西他滨组合治疗的经批准剂量和治疗方案更低的剂量(例如，小于10％、小于20％、小于30％或更多)和/或以更不积极的治疗方案(例如，每10天，或每两周一次等)进行，如实施例18中所述。在一些实施方案中，所提供的本文中所述的药物组合物可按照表17(实施例18)中所述的给药方案与nab-紫杉醇和吉西他滨组合施用。
在一些实施方案中，本文中提供的技术可用于施用于患有CLDN-18.2阳性胆道肿瘤的对象。在一些实施方案中，这样的对象可正在接受提供的组合物作为单一治疗或作为组合治疗的一部分，所述组合治疗包含这样的所提供药物组合物和适用于治疗胆道肿瘤的化学治疗剂。在一些实施方案中，这样的化学治疗剂可以是吉西他滨和/或顺铂或者包含吉西他滨和/或顺铂。
效力监测：在一些实施方案中，可在给药方案期间定期监测接受所提供治疗的患者以评估所施用治疗的效力。例如，在一些实施方案中，可定期例如每4周、每5周、每6周、每7周、每8周或更长时间通过治疗中成像来评估所施用治疗的效力。在一些实施方案中，可进行一种或更多种如实施例19中所述的效力评估。
在一些实施方案中，例如，在护理标准的情况下，可评价多种药代动力学和药效学标志物(例如，如实施例6中所述)中的一种或更多种，其可用作所提供药物组合物(例如，作为单一治疗或作为组合治疗)的抗肿瘤和安全性活性指标。
示例
实施例1：由一种或更多种示例性mRNA表达的CLDN-18.2靶向抗体剂的体外表征
本实施例表明了由一种或更多种编码CLDN-18.2靶向抗体剂的mRNA表达的示例性CLDN-18.2靶向抗体剂在引入细胞中之后的体外表征。
在RNA转染肝细胞之后完整IgG的装配。该实施例示出了在体外细胞摄取相应的mRNA之后，由一种或更多种示例性mRNA(例如，本文中所述的mRNA)表达的CLDN-18.2靶向抗体剂(下文中称为“CLDN-18.2靶向RiboMab”)的翻译、装配和分泌。在本实施例中，使用了两种不同的表达***，类似于体外靶向肝的原代人肝细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)。用包含编码本文中所述的CLDN-18.2靶向抗体剂的mRNA的组合物进行细胞的脂质体转染。例如，在48小时之后收获包含分泌的CLDN-18.2靶向RiboMab的细胞上清液并例如通过Western印迹和ELISA对其进行分析。在两种表达***中均产生了完整装配的CLDN-18.2靶向RiboMab(例如，CLDN-18.2靶向IgG抗体)(图1)。
示例性CLDN-18.2靶向RiboMab的结合特异性。为了确定由一种或更多种示例性mRNA(例如本文中所述的mRNA)表达的示例性CLDN-18.2靶向抗体剂对CLDN-18.2多肽的靶特异性，使用包含在作为靶细胞的CLDN-18.2+HEK293转染物和CHO-K1细胞中表达的CLDN-18.2靶向RiboMab的细胞培养上清液进行流式细胞术结合测定。为了评估CLDN-18.2靶向RiboMab与密切相关的剪接变体CLDN18.1的交叉反应性，对CLDN-18.2靶向RiboMab与经CLDN18.1转染细胞的结合进行测试。相对于CLDN18.1多肽，由一种或更多种示例性mRNA(例如本文中所述的mRNA)表达的CLDN-18.2靶向RiboMab优先与紧密接合的多肽CLDN-18.2多肽结合。在一些实施方案中，由一种或更多种示例性mRNA(例如本文中所述的mRNA)表达的CLDN-18.2靶向RiboMab的结合受到限制或对CLDN-18.2多肽具有特异性，并且显示出浓度依赖性，这与参考蛋白IMAB362(或称为佐贝妥昔单抗或克劳西单抗)相当(图2)。
作用模式分析：体外的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。通过分析抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)来评估一种或更多种编码CLDN-18.2靶向RiboMab(例如，本文中所述的CLDN-18.2靶向RiboMab)的mRNA在体外翻译之后由CHO-K1细胞表达的所述CLDN-18.2靶向RiboMab的生物活性。示例性ADCC测定例如使用CLDN-18.2+胃癌转染物(例如NUG-C4)和靶标-阴性乳腺癌细胞系(例如，MDA-MB-231)进行以评估特异性裂解。对于示例性CDC测定，使用CLDN-18.2+转染物(例如，CHO-K1)和CLDN-18.2阴性(例如，CHO-K1)细胞系。为了模拟体内条件，将来自三个不同健康供体的人PBMC以30:1的效应物与靶标(effector to target，E:T)比用作ADCC测定中的效应细胞，并且将人血清(例如，市售人血清)用作CDC测定中的补体来源。CLDN-18.2靶向RiboMab有效地介导与ADCC中参考蛋白IMAB362相当的靶特异性和剂量依赖性细胞毒性[图3，图A；EC50 10至127ng/mL(CLDN-18.2靶向RiboMab)、14至265ng/mL(IMAB362)]和CDC测定(图3，图B)。
实施例2：在啮齿动物中对由一种或更多种示例性mRNA在体内表达的CLDN-18.2靶 向抗体剂的表征
在离体ADCC测定中评估了由示例性mRNA(例如，本文中所述的mRNA)在体内表达的CLDN-18.2靶向RiboMab的生物活性。使用包含CLDN-18.2靶向RiboMab或包含IMAB362的Balb/cJRj小鼠血浆进行ADCC测定，所述血浆在第5次IV给药1μg(约0.04mg/kg)、3μg(约0.10mg/kg)、10μg(约0.40mg/kg)和30μg(约1.20mg/kg)药物组合物之后24小时取样，所述药物组合物包含至少一种或更多种编码CLDN-18.2靶向抗体剂的mRNA(“CLDN-18.2靶向RNA组合物”)或80μg(约3.20mg/kg)IMAB362。将未经处理小鼠的掺有IMAB362的血浆用作测定参考。将CLDN-18.2+胃癌转染物(例如，NUG-C4)用作靶标，并且将来自健康供体的人PBMC用作效应细胞。将靶细胞和效应细胞以30:1的E:T(效应物与靶标)比与包含1％的CLDN-18.2靶向RiboMab的血浆孵育48小时，并在基于萤光素酶的测定中确定ADCC。在啮齿动物中表达的CLDN-18.2靶向RiboMab表现出与80μg(约3.20mg/kg)的参考蛋白IMAB362类似的高且剂量依赖性的靶细胞裂解(图4，图A)。对于用作对照的靶标阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231未观察到非特异性裂解，表明CLDN-18.2靶向RiboMab的靶特异性(图4，图B)。结果表明，在啮齿动物中表达的CLDN-18.2靶向RiboMab可介导对靶向肿瘤细胞的高ADCC。
实施例3：在非人灵长类中对由一种或更多种示例性mRNA在体内表达的CLDN-18.2 靶向抗体剂的表征
为了在与人在种系发生和生理上密切相关的生物体中确定CLDN-18.2靶向RiboMab的生物活性，用包含CLDN-18.2靶向RiboMab的非人灵长类(NHP)(例如食蟹猴)血清进行ADCC研究，所述血清在IV给药0.1mg/kg、0.4mg/kg和1.6mg/kg CLDN-18.2靶向RNA组合物之后24小时和168小时取样。如实施例2中所述进行ADCC测定。在NHP中表达的CLDN-18.2靶向RiboMab表现出高且剂量依赖性的靶细胞裂解(图5，图A)。对于靶标阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231观察到低效应、供体依赖性非特异性裂解(图5，图B)。将在第3次注射CLDN-18.2靶向RNA组合物之后48小时收集的第14号猴(该动物具有最高的确定的CLDN-18.2靶向RiboMab浓度(232μg/mL))的血清以10点稀释行(10-point dilution row)进行基于萤光素酶的ADCC测定。将纯化的IMAB362用作测定参考蛋白。由NHP表达的CLDN-18.2靶向RiboMab以10ng/mL(66pM)的EC50介导对NUG-C4靶细胞的高且特异性的裂解(图5，图C)。这些结果表明，由NHP表达的CLDN-18.2靶向RiboMab介导可介导强效且靶特异性的ADCC。
实施例4：静脉内施用的CLDN-18.2靶向RNA组合物在体内介导肿瘤生长抑制
为了在CLDN-18.2+人胃癌异种移植肿瘤模型中确定静脉内(IV)施用的CLDN-18.2靶向RNA组合物的抗肿瘤活性，将Hsd:无胸腺裸-Foxn1nu/nu小鼠皮下接种5×106个CLDN-18.2+NCI-N87转染物。在第15、22、29、36、43和50测试日，使具有已建立肿瘤(平均>30mm3)的小鼠接受六次单IV推注注射3μg、10μg和30μg CLDN-18.2靶向RNA组合物、30μg编码萤光素酶的对照mRNA、盐水或800μg的参考蛋白IMAB362。在用30μg CLDN-18.2靶向RNA组合物的第3个给药周期之后观察到与对照相比显著的肿瘤生长抑制。30μg CLDN-18.2靶向RNA组合物的抗肿瘤活性与用800μg参考蛋白IMAB362获得的肿瘤生长阻滞相当(图6)。
实施例5：CLDN-18.2靶向RNA组合物的安全性药理学评估
在重复给药之后，在小鼠中进行了符合GLP的CNS和呼吸***安全性评估。在非GLPPK/耐受性研究中评估了在重复施用之后CLDN-18.2靶向RNA组合物对非人灵长类(NHP)血压的潜在作用。所有研究均以符合ICH S7A的方式设计(表4)。
表4：示例性安全性药理学研究概述。
Figure BDA0003871087100001071
中枢神经和呼吸***安全性。进行了符合GLP的亚慢性毒性研究，以在雄性和雌性小鼠中评估重复静脉内推注注射CLDN-18.2靶向RNA组合物的作用。该研究包括对附属动物(satellite animal)的安全性药理学评估，如下所示(表5)。
表5：GLP亚慢性重复剂量毒性研究内的神经***和呼吸***安全性评估
Figure BDA0003871087100001072
Figure BDA0003871087100001081
a以总mRNA剂量表示的剂量水平
为了评估CLDN-18.2靶向RNA组合物的呼吸***安全性，在第二次和第四次注射之给药之前、给药之后4小时和24小时进行体积描记术。自10分钟至60分钟(给药之前和给药之后)每10分钟评估呼吸速率、潮气量、分钟通气量、吸气流量峰值、呼气流量峰值、吸气时间、呼气时间和气道阻力指数，并且在测试项目施用之后自1至4小时(给药之后)每30分钟对其进行测量，以给出针对每个时间段的平均值。
在给药之前以及第一次和第四次注射之后48小时对动物进行神经***测试。测试了意识、情绪、运动活动、CNS兴奋、姿态、肌张力、反射和自主体温、后腿展开、握力和自主活动。
看到一个参数的统计学上显著的变化(p≤0.05)：接受100μgCLDN-18.2靶向RNA组合物/动物的雄性小鼠在第一次给药之后48小时显示出握力降低(p≤0.01)；接受100μgCLDN-18.2靶向RNA组合物/动物的雌性小鼠在第一次注射之后显示出类似的握力降低(p≤0.05)。
胃安全性。不希望受到理论束缚，CLDN-18.2靶标在人和鼠的健康胃组织中表达(Türeci et al.2011)。胃的宏观和组织病理学评估包括在于小鼠中进行的符合GLP的重复剂量毒性研究中(参见实施例7)。
心血管***安全性。在PK/耐受性研究中，在对动物第一次给药之前和第三次给药之后24小时进行血压测量(所设计的研究描述于实施例7中)。
外周动脉收缩期血压和舒张期血压以及所得平均血压在经测试项目处理的动物的正常生理限度内。
实施例6：CLDN-18.2靶向RNA组合物的药代动力学评估
脂质纳米粒(LNP)配制的RNA的药代动力学可分为两个阶段：静脉内注射之后，LNP在循环中全身分布，并将RNA递送至预期的靶器官肝。其次，肝细胞被LNP制剂转染，翻译RNA并分泌编码的蛋白质。
在三种不同物种中在单剂量施用[在小鼠中(图7)和在大鼠中(图8)以及重复剂量施用[在小鼠中(图9)和在非人灵长类中(图10)]之后对CLDN-18.2靶向RiboMab的药代动力学谱进行表征。
表6：对药代动力学的示例性研究的总结。
Figure BDA0003871087100001091
Figure BDA0003871087100001101
为了评估自CLDN-18.2靶向RNA组合物翻译的CLDN-18.2靶向RiboMab的PK，在Balb/c JRj小鼠中进行了单剂量PK研究。处理组接受IV推注注射1μg(约0.040mg/kg)、3μg(约0.10mg/kg)、10μg(约0.40mg/kg)或30μg(约1.20mg/kg)CLDN-18.2靶向RNA组合物和40μg(约1.60mg/kg)作为内部对照的IMAB362参考蛋白。在施用之后6、24、96、168、264、336和504小时对血浆进行取样，并且通过ELISA来评估CLDN-18.2靶向RiboMab浓度。CLDN-18.2靶向RiboMab浓度表现出CLDN-18.2靶向RNA组合物浓度依赖性表达，其中在施用之后24小时时达到峰值，并在此之后逐渐降低。在最高剂量下达到约450μg/mL的峰值浓度，并在施用之后多至504小时可检出CLDN-18.2靶向RiboMab浓度(图7)。结果表明，在单次给药之后CLDN-18.2靶向RiboMab在小鼠中以剂量依赖性方式表达。
为了在较大啮齿动物生物体中评估自CLDN-18.2靶向RNA组合物翻译的CLDN-18.2靶向RiboMab的PK，在RjHan:Wister大鼠中进行了单剂量研究。处理组接受IV推注剂量的0.04mg/kg、0.10mg/kg、0.40mg/kg或1.20mg/kg CLDN-18.2靶向RNA组合物和3.60mg/kgIMAB362参考蛋白。在施用之后2、6、8、10、22、24、27、30、48、72、96、168、216、264和336小时对血浆进行取样，并通过ELISA来确定CLDN-18.2靶向RiboMab浓度。CLDN-18.2靶向RiboMab显示出CLDN-18.2靶向RNA组合物浓度的依赖性表达，其中在施用之后24小时时达到峰值，并在此之后逐渐降低。在最高剂量下达到与小鼠(图7)相似的为大约450μg/mL峰值浓度，并且在所有剂量组中，直至施用之后336小时研究终止可检出CLDN-18.2靶向RiboMab浓度(图8)。结果表明，在大鼠中的CLDN-18.2靶向RiboMab表达水平可类似于小鼠。
在Balb/cJRj小鼠中进行了重复剂量PK研究，以评估CLDN-18.2靶向RiboMab浓度是否得以通过每周施用CLDN-18.2靶向RNA组合物来维持。处理组以每周间隔接受五个IV推注剂量1μg(约0.04mg/kg)、3μg(约0.10mg/kg)、10μg(约0.40mg/kg)或30μg(约1.20mg/kg)CLDN-18.2靶向RNA组合物和80μg(约3.20mg/kg)作为内部对照的IMAB362参考蛋白。分别在给药之前24小时和给药之后24小时(Cmax)对血浆进行取样，并通过ELISA来确定CLDN-18.2靶向RiboMab的浓度。CLDN-18.2靶向RNA组合物的重复施用导致持续的CLDN-18.2靶向RiboMab水平，其峰值浓度高至约1000μg/mL(30μg CLDN-18.2靶向RNA组合物)而没有翻译损失(图9)。结果表明，在小鼠中通过每周施用CLDN-18.2靶向RNA组合物，可实现持续的CLDN-18.2靶向RiboMab浓度。
在作为与人在种系发生和生理上密切相关的生物体NHP中进行了CLDN-18.2靶向RNA组合物的重复剂量PK研究(关于对示例性研究设计的描述，参见表7)。
表7：NHP中PK/耐受性研究的示例性研究设计
Figure BDA0003871087100001111
Figure BDA0003871087100001121
a表示为总mRNA剂量的剂量水平
处理组以每周间隔接受3次IV推注注射0.1mg/kg、0.4mg/kg或1.6mg/kg。作为对照，同样施用盐水或空LNP。在第1次和第3次给药之后6、24、48、72、96和168小时以及第2次给药之后48、72和168小时以及第3次给药之后264、336和504小时对血清进行取样。通过ELISA来分析CLDN-18.2靶向RiboMab的浓度。CLDN-18.2靶向RiboMab显示出CLDN-18.2靶向RNA组合物的剂量依赖性表达，其中在施用之后48至72小时之间达到峰值，并在此之后逐渐降低。在最高剂量下在第3次施用CLDN-18.2靶向RNA组合物之后48至72小时达到231.7μg/mL的峰值血清浓度，并且直至第1次给药之后840小时研究终止可检出CLDN-18.2靶向RiboMab(图10)。结果表明，在NHP中每周施用CLDN-18.2靶向RNA组合物可导致可持续的CLDN-18.2靶向RiboMab表达。
分布：在单IV注射之后，在小鼠中研究了CLDN-18.2靶向RNA组合物的生物分布。分别通过数字微滴PCR(mRNA)或液体闪烁光谱(放射性标记的LNP)对鼠组织中的信使RNA和脂质纳米粒(LNP)进行定量。通过生物发光成像来研究包封萤光素酶编码mRNA的LNP的器官靶向和表达。
mRNA分布：将单剂量的100μg CLDN-18.2靶向RNA组合物/动物IV施用于Balb/c小鼠(3/性别/时间点)，并在施用之后0.083(5分钟)、0.5、6、24、72和168小时对血液和组织(脾、肺、肝、肾、心脏和脑)进行取样。
表8：mRNA生物分布研究的示例性设计
Figure BDA0003871087100001131
a表示为总mRNA剂量的剂量水平
LNP分布：通过用脂质纳米粒(LNP)配制的编码萤火虫萤光素酶的经修饰的mRNA来评估脂质纳米粒(LNP)的生物分布，以评估体内翻译的mRNA的肝靶向和动力学。在IV施用之后，萤光素酶蛋白显示出主要位于肝中的高生物发光信号的时间依赖性翻译(图11)。结果表明，LNP包封的mRNA可靶向肝并在肝中表达。
在以1mg/kg单IV推注注射之后，在CD-1小鼠(4/性别/时间点)中研究了CLDN-18.2靶向RNA组合物的LNP的组织分布谱。[3H]-CLDN-18.2靶向RNA组合物用于该分析，并且所述颗粒包含不可交换、不可代谢的LNP标志物[3H]-胆固醇十六烷基醚([3H]-cholesterylhexadecyl ether，[3H]-CHE)。示例性研究设计在下面的表9中示出。
表9：LNP生物分布研究的示例性研究设计
Figure BDA0003871087100001141
a表示为总mRNA剂量的剂量水平
b在粗体时间点，除血液和血浆之外还收集组织
对小鼠实施安乐死，在给药之后0.083(5分钟)、0.25、0.5、1、2、4、8和24小时，收集血液和血浆。仅在给药之后0.25、1、4和24小时对组织进行取样。通过标准液体闪烁计数(liquid scintillation counting，LSC)来确定所有样品中的放射性，并将所得值用于计算总脂质浓度和相对脂质浓度。
[3H]-CLDN-18.2靶向RNA组合物在小鼠的血液和血浆中表现出双相动力学，其中血液/血浆浓度的初始下降快速，随后是较慢的消除阶段。[3H]-CLDN-18.2靶向RNA组合物向组织中的分布是迅速的，在给药之后0.5至2小时在所有组织中观察到峰值水平。[3H]-CLDN-18.2靶向RNA组合物的主要分布组织/器官是肝和脾(在注射之后4小时时，存在于肝和脾中的注射剂量分别为约70％至74％和约0.8％至1.2％)，并且观察到其他组织中的分布极小。对[3H]-CLDN-18.2靶向RNA组合物在多种组织中的计算总脂质浓度(即，所有4种所施用脂质的计算总脂质浓度)和计算注射剂量(％)的总结在表10中示出。
表10：在CD-1小鼠中IV推注注射之后4小时时总脂质(来自CLDN-18.2靶向RNA组合物)的组织水平
Figure BDA0003871087100001151
代谢和***：信使RNA(包括经假尿苷修饰的mRNA)通常对通过细胞RNA酶的降解敏感并进行核酸代谢。核苷酸代谢在细胞内连续发生，其中核苷被降解为废物并且被***或回收以用于核苷酸合成。
在本文中所述的CLDN-18.2靶向RNA组合物的一些实施方案中，这样的组合物包含多种脂质，其中的一些可以是天然存在的(例如，在一些实施方案中，中性脂质例如如胆固醇和DSPC)。阅读本公开内容的技术人员可预期天然存在的脂质的代谢和***可类似于内源性脂质的代谢和***。阅读本公开内容的技术人员还将理解，可使用本领域已知的方法来表征CLDN-18.2靶向RNA组合物内的其他脂质(例如，缀合的脂质和阳离子脂质)的代谢和***。
在一些实施方案中，所表达的CLDN-18.2靶向RiboMab的结构是基于IgG1抗体。在一些这样的实施方案中，其代谢可类似于内源性IgG1分子的代谢。示例性代谢包括但不限于降解为小肽和氨基酸。
实施例7：CLDN-18.2靶向RNA组合物的毒理学评估
CLDN-18.2靶向RNA组合物的毒理学评估可包括使用人血液组分进行的体外研究以及在小鼠和食蟹猴中进行的体内研究。可在体外评估药物产品与人血液的血液相容性，同时可在选择的体内模型中检测由CLDN-18.2靶向RNA组合物(RNA和LNP)以及由翻译的CLDN-18.2靶向RiboMab(蛋白质)介导的毒性。下表11中给出了在非临床研究中评估的某些特征的总结。
表11：CLDN-18.2靶向RNA组合物和编码的抗体的示例性非临床安全性和毒理学研究。
Figure BDA0003871087100001161
Figure BDA0003871087100001171
在一些实施方案中，用于评估抗体(CLDN-18.2靶向RiboMab)介导的毒性的相关物种是小鼠和食蟹猴，因为在这些物种中CLDN-18.2靶标的高度保守的蛋白质序列和相同的表达模式(Türeci et al.2011)。
单剂量毒理学。在雄性和雌性CD-1小鼠中进行了单剂量毒性研究以：i)表征CLDN-18.2靶向RNA组合物的潜在毒性，ii)比较CLDN-18.2靶向RNA组合物与相应对照项目(例如，空脂质纳米粒)的毒性，以及iii)评估4周观察期(第29天终止)之后CLDN-18.2靶向RNA组合物的可逆性、进展和/或潜在延迟作用。
在第1天通过IV施用使小鼠接受单IV剂量的CLDN-18.2靶向RNA组合物(以1、2或4mg/kg的总mRNA剂量水平)或对照项目(例如，空纳米粒或盐水对照)。在第3天(主要动物)和第29天(恢复/延迟调查结果)对动物实施安乐死。研究终点包括死亡率、临床观察、体重变化、临床化学、尸检观察、器官重量和组织病理学(肝、脾和胃)。
单IV剂量的1、2和4mg/kg的CLDN-18.2靶向RNA组合物或空LNP通常在雄性和雌性CD-1小鼠中具有良好的耐受性。28天观察期期间没有死亡。在第3天注意到关于肝参数和脾重量增加的次要调查结果。肝和脾的微观评估中的次要调查结果被认为是非不良的。在第29天恢复期之后，解析所有调查结果。
重复剂量毒理学。在Balb/c小鼠中进行了21天符合GLP的重复剂量毒性研究，每周静脉内推注施用CLDN-18.2靶向RNA组合物随后是2周恢复期(示例性研究设计参见表12)。研究读出包括但不限于不耐受的临床体征(例如，眼睑下垂、竖毛、降低的运动性和/或触感冷凉)、死亡率、体重和食物消耗、局部耐受性、血液学、临床化学(例如，球蛋白、白蛋白、胆固醇、肌酐、总蛋白、血糖、碱性磷酸酶(aP)、乳酸脱氢酶(LDH)和天冬氨酸氨基转移酶(ALAP)以及谷氨酸脱氢酶(GLDH)血液水平)、尿分析、眼科和听觉***、宏观死后调查结果、器官重量、骨髓、组织病理学和细胞因子(例如，IL-6、TNF-α、IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-10和/或IL-12p70)。
表12：符合GLP的重复剂量毒性研究的示例性设计
Figure BDA0003871087100001181
Figure BDA0003871087100001191
免疫毒性：在人血清和血液中体外确定CLDN-18.2靶向RNA组合物的血液相容性，分别测试药物产品介导的补体激活和细胞因子释放。此外，评估了体内免疫毒性，作为小鼠中重复剂量毒性研究和食蟹猴中药代动力学研究的一部分。所有研究均根据ICH S8指南(人用药物免疫毒性研究)进行设计。
毒性研究的初步结果表明，在空LNP对照组和两种剂量组(30和100μg CLDN-18.2靶向RNA组合物/动物)中，在施用之后6小时IL-6和TNF-α瞬时升高，同时在两种剂量组中IFN-α和IFN-γ瞬时升高。血浆水平在施用之后48小时恢复到基线。在任何组中均未观察到IL-1β、IL-2、IL-10或IL-12p70的升高。
如实施例6中所述在食蟹猴中进行的PK/耐受性研究中，在任何组中均未观察到细胞因子升高。
人血清的体外补体激活。CLDN-18.2靶向RNA组合物在体外激活人补体的潜能通过在正常人血清中孵育来评价，其中药物产品浓度基于与施用于人的类似的脂质纳米粒产品(例如，包含siRNA)的毒性相关的剂量下的血浆Cmax水平来选择(Fitzgerald et al.2014；Coelho et al.2013；Tabernero et al.2013；Patisaran FDA批准2017)。使用多重流式微珠阵列通过评价补体***产物C3a、C4a、C5a的水平以及使用酶免疫测定评价终末补体复合物SCSb-9的水平来评估补体激活。
当与阴性对照相比时，CLDN-18.2靶向RNA组合物与正常人血清补体的体外孵育未导致补体***产物或终末补体复合物提高，然而阳性对照诱导了预期的激活。总之，在所测试的条件下，CLDN-18.2靶向RNA组合物在体外没有激活人补体。
全血细胞因子释放。在一些实施方案中，可肠胃外施用本文中所述的CLDN-18.2靶向RNA组合物。在这样的一些实施方案中，CLDN-18.2靶向RNA组合物可在血液中循环期间与外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)接触。阅读本公开内容的本领域普通技术人员将理解药物产品与血液组分之间的相互作用可导致对细胞因子分泌的诱导。因此，使用人全血研究了示例性CLDN-18.2靶向RNA组合物的体外耐受性。例如，在代表人血液中预期浓度的稀释范围的孵育之后评价促炎细胞因子(例如，但不限于IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL2、IL-6、IL-8、IL-12p70、IP-10和/或TNF-α)的分泌。在该测定中未检出与测试项目相关的对细胞因子分泌的诱导，并且可显示出体外耐受性。
实施例8：示例性给药(例如剂量递增)
在一些实施方案中，本文中所提供药物组合物可作为单一治疗和/或与其他抗癌治疗组合施用于患有CLDN-18.2阳性癌症的患者。
在一些实施方案中，施用涉及一个或更多个周期。在一些实施方案中，本文中所提供药物组合物可以以至少3至8个周期施用。
在一些实施方案中，给药方案，并且特别是单一治疗给药方案，可以是每21天(Q3W)给药或包括每21天(Q3W)给药。
在一些实施方案中，可进行剂量递增。在一些这样的实施方案中，可以以一种或更多种下表13中所示的水平进行给药；在一些实施方案中，剂量递增可涉及施用至少一种来自表13的较低剂量随后施用至少一种来自表13的较高剂量。
表13：示例性给药
Figure BDA0003871087100001201
Figure BDA0003871087100001211
1如表13中所示，“剂量”是指总RNA剂量。
2表13中呈现了相对于紧接着上面的剂量的剂量增量，从指示的示例性起始剂量开始
在一些实施方案中，可评价另外的或替代的剂量水平，例如，包括例如以0.2、0.225、0.25、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.65、0.7、0.75、0.80、0.85、0.9、0.95、1.25、1.75、2.25、2.75、3.25、3.5和4mg/kg的剂量水平。
治疗的效力可通过例如在第6周(+7天)时、每6周(±7天)持续24周和在此之后每12周(±7天)的治疗中成像来评估。
实施例9：用于治疗某些癌症的批准治疗
经批准的治疗可用于与CLDN-18.2表达相关的某些癌症。例如，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制剂厄洛替尼是在美国批准与吉西他滨组合用于患有局部晚期、不可切除或转移性胰腺癌的患者的一线治疗的唯一的靶向治疗。然而，一项比较厄洛替尼与安慰剂的随机对照试验(randomized controlled trial，RCT)显示出0.4个月的中位总存活(OS)益处和0.3个月的中位无进展存活(progression-freesurvival，PFS)益处。
在一些实施方案中，用于治疗胰腺癌的厄洛替尼(例如，厄洛替尼盐酸盐)的推荐日剂量为约109mg，在至少摄取食物之前一小时或摄取食物之后两小时与吉西他滨组合服用。在一些实施方案中，用于治疗胰腺癌的吉西他滨(Gemzar)的推荐剂量为30分钟内1000mg/m2，前7周每周一次，然后为一周休止，再每周一次，持续每28天周期的3周。
实施例10：示例性不良事件
在一些实施方案中，可在治疗方案的一段时间内监测施用如本文中所述的药物组合物的对象的潜在不良事件的一个或更多个指标。例如，在一些实施方案中，可监测对象的一种或更多种血液***毒性(例如，中性粒细胞减少、血小板减少和/或贫血等的存在)和/或非血液***毒性(例如，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和/或胆红素等的升高)。
实施例11：用于本文中所述的单链RNA的示例性评估和/或标准
在一些实施方案中，可在单链RNA的制造或其他制备或使用期间使用一种或更多种如本文中所述的评估(例如，作为释放测试)。
在一些实施方案中，可评估一种或更多种品质控制参数以确定本文中所述的单链RNA是否符合或超过接受标准(例如，用于随后的配制和/或释放以用于分配)。在一些实施方案中，这样的品质控制参数可包括但不限于RNA完整性、RNA浓度、残余DNA模板和/或残余dsRNA。用于评估RNA品质的方法是本领域已知的；例如，本领域技术人员将认识到在一些实施方案中，一种或更多种如表14中所述的分析测试可用于RNA品质评估。
在一些实施方案中，可针对以下在表14中列出的特征来评估单链RNA批次以确定下一个行动步骤。例如，如果RNA品质评估表明单链RNA批次符合或超过表14中列出的接受标准，则这样的单链RNA批次可被指定用于制造和/或配制和/或分配的一个或更多个另外的步骤。否则，如果这样的单链RNA批次不符合或未超过接受标准，则可采取替代行动(例如，丢弃该批次)。
在一些实施方案中，具有如表14中所示的示例性评估结果的单链RNA批次可用于制造和/或配制和/或分配的一个或更多个另外的步骤。
表14：单独RNA的示例性测试和规格。
Figure BDA0003871087100001221
Figure BDA0003871087100001231
实施例12：包含两种或更多种RNA的组合物的示例性评估和/或标准
在一些实施方案中，可在药物物质的制造或其他制备或使用期间使用一种或更多种如本文中所述的评估(例如，作为释放测试)。
在一些实施方案中，针对一种或更多种如实施例11中所述的特征来评估编码CLDN-18.2靶向抗体重链的第一单链RNA批次和编码CLDN-18.2靶向抗体轻链的第二单链RNA批次。在一些这样的实施方案中，然后将符合或超过如表14中列出的接受标准两种情况的第一ssRNA和第二ssRNA批次例如以约1.5:1至约1:1.5的摩尔比混合在一起，以形成RNA药物物质。在一些实施方案中，可针对一种或更多种品质控制参数(例如，用于释放和/或用于进一步制造)来评估这样的RNA药物物质，所述参数包括例如但不限于物理外观、RNA长度、身份(作为RNA)、完整性、序列和/或浓度、pH、渗量浓度、RNA比(例如，HC RNA与LC RNA之比)、效力、细菌内毒素、生物负荷及其组合。这样的品质控制参数可通过一种或更多种本领域已知的特定分析方法，例如如目视检查、凝胶电泳(例如琼脂糖凝胶电泳、毛细管凝胶电泳)、酶促降解、测序、UV吸收分光光度法、PCR方法、细菌内毒素测试(例如，鲎变形细胞裂解物(LAL)测试)来评估。
实施例13：示例性RNA产品制剂
在一些实施方案中，示例性RNA产品制剂是例如用于静脉内施用的在水性缓冲液中的无菌RNA-脂质纳米粒(RNA-LNP)分散体。例如，在一些实施方案中，可将这样的RNA产品制剂以约0.8至约1.2mg/mL填充至5.0mL标称填充体积。在一些实施方案中，每个小瓶可旨在用于单次使用。在一些实施方案中，RNA产品制剂(例如，如本文中所述)可在-80至-60℃下冷冻储存。
在一些实施方案中，这样的示例性RNA产品制剂可包含各自编码CLDN-18.2靶向抗体的一部分的两种或更多种不同的RNA(例如，编码CLDN-18.2靶向抗体重链的RNA和编码CLDN-18.2靶向抗体轻链的RNA)、至少一种阳离子脂质、至少一种缀合脂质、至少一种中性脂质和包含一种或更多种盐的水性缓冲液。在一些实施方案中，聚合物缀合的脂质(例如，PEG缀合的脂质，例如如在一些实施方案中，PEG缀合的脂质是2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺或包含2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺)可以以总脂质的约1mol％至2.5mol％存在。在一些实施方案中，阳离子脂质(例如，在一些实施方案中，是((3-羟丙基)氮烷二基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)或包含((3-羟丙基)氮烷二基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)的阳离子脂质)可以以总脂质的约35mol％至65mol％存在。在一些实施方案中，中性脂质(例如，在一些实施方案中，是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱和/或合成胆固醇或者包含1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱和/或合成胆固醇的中性脂质)可以以总脂质的约35mol％至65mol％存在。在一些实施方案中，示例性RNA产品制剂的组成可如表15中所示进行表征。
表15.示例性RNA产品制剂的定量组成
Figure BDA0003871087100001241
Figure BDA0003871087100001251
[1]阳离子脂质A＝((3-羟丙基)氮烷二基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)
[2]PEG缀合的脂质A＝2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺
[3]DSPC＝1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱
q.s.＝足量(quantum satis)(尽可能多)
实施例14：本文中所述的RNA/LNP药物产品制剂中的示例性脂质赋形剂
在药物产品制造过程中使用的材料可从合格的供应商处购买、经检、取样、鉴定、测试和释放。根据预先确定的规格或根据Ph.Eur./USP进行赋形剂的测试。
在一些实施方案中，RNA/LNP药物产品制剂包含表16中所示的四种脂质赋形剂，表16提供了关于脂质赋形剂的进一步信息。所有赋形剂均以GMP级材料提供。
表16：本文中所述的示例性RNA/LNP药物产品中的脂质赋形剂
Figure BDA0003871087100001252
Figure BDA0003871087100001261
阳离子脂质A：((3-羟丙基)氮烷二基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)
在一些实施方案中，氨基脂质((3-羟丙基)氮烷二基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯))是本文中所述的RNA/LNP药物产品制剂的功能性阳离子脂质组分。其旨在促进体内生物降解、代谢和清除。所述氨基脂质包含通过酯键与两条饱和烷基链键合的可滴定的叔氨基头基，在并入LNP中时赋予调节RNA的颗粒形成、细胞摄取、融合性和/或内体释放的不同的物理化学特性。酯键可被容易地水解，以促进快速降解和通过肾途径***。所述氨基脂质的表观pKa为大约6.25，在pH 5下产生基本上完全带正电荷的分子。在制造过程期间，在pH 4下将水性RNA溶液引入至包含所述氨基脂质的乙醇脂质混合物导致带负电荷的RNA骨架与带正电荷的阳离子脂质之间产生静电相互作用。该静电相互作用导致颗粒形成与RNA药物物质的有效包封一致。在RNA包封之后，将所得LNP周围的介质的pH调节至7.4导致LNP的表面电荷中和。当所有其他变量保持恒定时，与被网状内皮***快速清除的带电荷颗粒相比，电荷中性颗粒显示出更长的体内循环寿命和更好的向肝细胞的递送。在内体摄取之后，内体的低pH使LNP融合并允许RNA释放至靶细胞的胞质溶胶中。
PEG缀合的脂质A：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺
在一些实施方案中，本文中所述的RNA/LNP药物产品制剂包含功能性脂质赋形剂2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺。该聚乙二醇化脂质在结构上与其他临床批准的聚乙二醇化脂质类似，其安全性在临床试验中得到证实。聚乙二醇化脂质的主要功能是通过形成保护性疏水性脂质层的保护性亲水层来在空间上稳定颗粒。此外，当体内施用颗粒时，聚乙二醇化脂质减少了与血清蛋白的缔合以及由此产生的网状内皮***的摄取。已知PEG脂质影响细胞摄取，其是内体定位和有效载荷递送的前提。已经发现，可通过调节PEG-脂质锚的烷基链长度以可预测的方式来控制经包封核酸的药理学。在一些实施方案中，选择这样的聚乙二醇化脂质用于RNA/LNP药物产品制剂，以提供RNA至肝的最佳递送。在一些实施方案中，这样的选择还基于合理的溶解度特征及其分子量以有效地发挥空间屏障的功能。这样的聚乙二醇化脂质对生物膜没有显示出明显的表面活性剂或渗透性增强或干扰作用。此外，在这样的聚乙二醇化脂质中的PEG通过可生物降解的酰胺键与二酰基脂质锚连接，促进了快速降解和***。在小瓶中，颗粒保留了完整足数的聚乙二醇化脂质。在血液区室中，这样的聚乙二醇化脂质随时间推移从颗粒中解离，显示出更容易被细胞吸收的更融合的颗粒，最终导致RNA有效载荷的释放。
中性脂质：DSPC和胆固醇
在一些实施方案中，RNA/LNP药物产品制剂包含两种或更多种中性脂质。在一些这样的实施方案中，RNA/LNP药物产品制剂可包含两种或更多种中性脂质，包括DSPC和/或胆固醇。在一些实施方案中，这样的中性脂质(例如，DSPC和/或胆固醇)可被称为结构脂质，其浓度经选择以优化LNP颗粒尺寸、稳定性和包封。例如，DSPC和胆固醇已用于经批准的药物产品，例如DSPC被用作
Figure BDA0003871087100001271
和
Figure BDA0003871087100001272
中的赋形剂。胆固醇被用作
Figure BDA0003871087100001273
和
Figure BDA0003871087100001274
中的赋形剂。
Figure BDA0003871087100001275
包含DSPC和胆固醇二者。
实施例15：用于本文中所述的RNA/LNP药物产品制剂的示例性评估和/或标准
在一些实施方案中，可在药物产品的制造或其他制备或使用期间使用一种或更多种如本文中所述的评估(例如，作为释放测试)。
在一些实施方案中，可针对一种或更多种品质控制参数(例如，用于释放和/或用于进一步处理)来评估RNA/LNP药物产品，所述参数包括但不限于物理外观、脂质特性和/或含量、LNP尺寸、LNP多分散性、RNA包封、RNA长度、身份(作为RNA)、完整性、序列和/或浓度、pH、渗量浓度、RNA比(例如，HC RNA与LC RNA之比)、效力、细菌内毒素、生物负荷、残余有机溶剂、渗量浓度、pH及其组合。这样的品质控制参数可通过一种或更多种本领域已知的特定分析方法，例如如目视检查、凝胶电泳(例如琼脂糖凝胶电泳、毛细管凝胶电泳)、酶促降解、测序、UV吸收分光光度法、RNA标记染料、PCR方法、细菌内毒素测试(例如，鲎变形细胞裂解物(LAL)测试)、动态光散射、带有带电荷气溶胶检测器的液相色谱、气相色谱和/或体外翻译***(例如，兔网织红细胞裂解物翻译***和35S-甲硫氨酸)来评估。
在一些实施方案中，可针对品质控制参数(例如，本文中所述的品质控制参数)来评估RNA/LNP药物产品制剂(例如，本文中所述的RNA/LNP药物产品制剂)批次以确定下一步的行动步骤。例如，如果品质评估表明RNA/LNP药物产品制剂(例如，本文中所述的RNA/LNP药物产品制剂)批次符合或超过列出的相关释放标准，则这样的批次可被指定用于制造和/或分配的一个或更多个另外的步骤。否则，如果这样的批次不符合或未超过释放标准，则可采取替代行动(例如，丢弃该批次)。
实施例16：示例性纳入标准
在一些实施方案中，可选择其肿瘤表达CLDN-18.2的癌症患者用本文中所述的组合物和/或方法进行治疗。在一些实施方案中，癌症患者是胰腺癌患者。在一些实施方案中，癌症患者是胆管癌患者。
在一些实施方案中，选择符合以下疾病特异性纳入标准中一者或更多者的癌症患者用本文中所述的组合物和/或方法进行治疗：
1.CLDN-18.2阳性肿瘤(无论肿瘤组织学如何)，其限定为≥50％的肿瘤细胞具有≥2+CLDN-18.2蛋白染色强度，如在经***固定石蜡包埋(FFPE)的肿瘤组织中使用经验证的免疫组织化学测定通过中央测试所评估；
2.FFPE肿瘤组织样品对于CLDN-18.2测试呈可用性。允许新的活检和档案生物样品。如果数个时间点的档案组织样品可用，则优选最近的档案组织样品；
3.通过病理报告对原始原发性肿瘤的组织学记录。
a.这样的经组织学确定的实体瘤：其为转移性或不可切除的，并且对于所述实体瘤没有可能赋予临床益处的可用标准治疗，或者患者不是这样的可用治疗的候选者；并且任选的根据RECIST 1.1为可测量或可评价的疾病；或者
b.在没有先前的姑息性化学治疗的情况下，经组织学确定的不可切除的局部晚期或转移性胰腺导管腺癌；并且任选的根据RECIST 1.1为可测量或可评价的疾病；或者
c.在没有先前的姑息性化学治疗的情况下符合用nab-紫杉醇+吉西他滨或FOLFIRINOX进行治疗的条件的经组织学确定的不可切除的局部晚期或转移性PDAC；并且任选的根据RECIST 1.1为可测量或可评价的疾病；或者
d.在没有先前的姑息性化学治疗的情况下符合用顺铂+吉西他滨进行治疗的条件的经组织学确定的局部晚期或转移性BTC；并且任选的根据RECIST 1.1为可测量或可评价的疾病。
在一些实施方案中，选择符合上述疾病特异性纳入标准中至少一者并且进一步符合以下另一些纳入标准中至少一者的癌症患者用本文中所述的组合物和/或方法进行治疗：
1.年龄≥18岁。
2.东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)表现状态为0至1。
3.筛选时足够的凝血功能，如由以下所确定：
a.国际标准化比率(International normalized ratio，INR)或凝血酶原时间≤1.5×正常上限(upper limit normal，ULN；除了治疗性抗凝剂，其值在治疗窗内)。
b.激活部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastin time，aPTT)≤1.5×ULN(除了治疗性抗凝剂，其值在治疗窗内)。
4.筛选时足够的血液学功能，如由以下所确定：
a.白细胞计数(white blood count，WBC)≥3×109/L。
b.绝对中性粒细胞计数(absolute neutrophil count，ANC)≥1.5×109/L(患者在过去7天中不可使用粒细胞集落刺激因子或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子来实现这些WBC和ANC水平)。
c.血小板计数≥100×109/L。
d.血红蛋白≥9.0g/dL(过去7天中不可输入或使用***以实现该水平)。
5.筛选时足够的肝功能，如由以下所确定：
a.总胆红素≤1.5mg/dL(或者对于患有已知吉尔伯特综合征(Gilbert′ssyndrome)或肝转移癌的患者，≤2.0mg/dL)。
b.天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)≤2.5×ULN；对于患有肝转移癌的患者，≤3ULN。
6.筛查时足够的肾功能，如由以下所确定：
a.肾小球滤过率≥45mL/分钟/1.73m2-根据简化的肾病饮食修改(Modificationof Diet in Renal Disease)的等式：
GFR＝186×(S肌酐 -1.154)×(年龄-0.203)
(其中血清肌酐水平以mg/dL表示；如果患者是女性，则乘以0.742；如果患者是非裔美国人，则乘以1.212(Levey et al.1999)。
7.有生育潜能的女性(women of childbearing potential，WOCBP)在筛选时必须具有阴性血清(β-人绒毛膜***)测试/值。绝经后或永久绝育的患者可被视为不具有生殖潜能。
8.有生育潜能的女性必须同意在治疗方案期间直至本文中所述的最后一次CLDN-18.2靶向治疗之后6个月不捐献卵(***，***)以用于辅助生殖的目的。
9.在试验期间并且在接受本文中所述CLDN-18.2靶向治疗最后一个剂量之后6个月，与WOCBP性活跃且未进行输精管结扎术的男性必须同意使用生育控制的屏障方法，例如，使用具有杀***泡沫/凝胶/膜/乳膏/栓剂的避孕套，或者伴侣带有具有杀***泡沫/凝胶/膜/乳膏/栓剂的闭塞帽(隔膜或宫颈/穹窿帽)。
10.男性必须同意在治疗方案期间并且在接受本文中所述CLDN-18.2靶向治疗最后一个剂量之后6个月不捐献***。
实施例17：示例性排除标准
在一些实施方案中，其肿瘤不表达CLDN-18.2的癌症患者不适合本文中所述和/或使用的组合物和/或方法。
在一些实施方案中，(i)最近接受了癌症治疗；(ii)同时接受全身性类固醇治疗；(iii)最近接受了大手术；(iv)患有活动性感染且正在用抗感染治疗进行治疗；和/或(v)被诊断患有正在生长的脑或软脑膜转移癌的癌症患者，不适合本文中所述和/或使用的组合物和/或方法。
在一些实施方案中，可不推荐以下癌症患者进行本文中所述的CLDN-18.2靶向治疗(例如，施用本文中所述的组合物和/或本文中所述的治疗方法)。
先前和伴随治疗
1.自本文中所述的CLDN-18.2靶向治疗开始2周或5个半衰期(以较长者为准)内接受放射治疗、化学治疗或分子靶向药剂或酪氨酸激酶抑制剂；自本文中所述CLDN-18.2靶向治疗开始3周内接受免疫治疗/单克隆抗体；自本文中所述CLDN-18.2靶向治疗开始6周内接受亚硝基脲、抗体-药物缀合物或放射性同位素。
2.每日接受>10mg***的同时全身性(经口或IV)类固醇治疗或其等同物用于潜在病症。
3.在本文中所述CLDN-18.2靶向治疗第一剂量之前4周内进行大手术。
4.需要用抗感染治疗进行IV治疗的进行中或活动性感染，所述抗感染治疗在本文中所述CLDN-18.2靶向治疗的第一剂量之前少于2周施用。
5.任何医学病症的任何先前治疗或操作的副作用未恢复至国家癌症研究所AE的通用术语标准(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for AE，NCICTCAE)v.5级≤1。应注意的是，周围神经病变级≤2是允许的；允许任何级别的脱发。
医学病症
6.筛选期间新的或正在生长的脑或软脑膜转移癌的当前证据。患有已知脑或软脑膜转移癌的患者可以是符合条件的，如果其具有：
a.针对脑或软脑膜转移癌的放射治疗、手术或立体定向手术。
b.无神经症状(排除级别≤2的神经病变)。
c.在签署知情同意书之前4周内，计算机断层扫描(computer tomography，CT)或磁共振成像(magnet resonance imaging，MRI)扫描显示脑或软脑膜疾病稳定。
d.未进行急性皮质类固醇治疗或类固醇渐减。
应注意的是，患有中枢神经***症状的患者应进行脑CT扫描或MRI以排除新的或进行性脑转移癌。除非预计即将发生脊髓压迫的骨折，否则脊骨转移癌是允许的。
7.儿童期间除孤立性高热惊厥之外的惊厥史；在筛选之前少于6个月有脑血管意外或短暂性脑缺血发作史。
8.需要引流的积液(胸腔、心包或腹水)。
9.活动性或过去自身免疫病史，包括但不限于炎性肠病、***性红斑狼疮、强直性脊柱炎、硬皮病或多发性硬化。
10.需要用类固醇或其他免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤、环孢素A)进行免疫抑制的活动性免疫病症，但患有孤立性白癜风、消退的儿童哮喘或特应性皮炎、受控的肾上腺功能减退或垂体功能减退的患者以及有格雷夫斯病(Grave′s disease)史的甲状腺功能正常的患者除外。甲状腺功能亢进经受控的患者在施用试验治疗之前必须对甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶抗体和甲状腺刺激免疫球蛋白呈阴性。
11.已知对人免疫缺陷病毒具有CD4+T细胞计数<350个细胞/μL的血清阳性史，以及具有获得性免疫缺陷综合征定义的机会性感染的病史。
12.已知需要主动抗病毒治疗的乙型肝炎史/阳性血清学(除非由于疫苗接种或消退的天然感染的免疫或者除非由于免疫球蛋白治疗的被动免疫接种)。具有阳性血清学的患者必须具有低于定量限的乙型肝炎病毒载量。
13.活动性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染；允许完成治愈性抗病毒治疗具有低于定量限的HCV载荷的患者。
14.已知对本文中所述的CLDN-18.2靶向治疗的组分具有超敏反应。
15.持续至少2年尚未减轻的另一些原发性恶性肿瘤，但转移或死亡风险可忽略不计的那些除外(例如经充分治疗的宫颈原位癌、基底或鳞状细胞皮肤癌、局部性***癌或导管原位癌)。
其他共病
16.有临床意义的异常心电图，例如Fridericia校正的QT间期延长>480ms。
17.据治疗实践者的见解，有可造成过度医学危害或干扰治疗结果解释的任何并发病症；这些病症包括但不限于：
a.需要抗生素/抗病毒/抗真菌治疗的进行中或活动性感染。
b.并发充血性心力衰竭(纽约心脏协会功能分级(New York Heart AssociationFunctional Classification Class)III或IV级)。
c.并发不稳定型心绞痛。
d.需要治疗的并发心律失常(排除无症状性心房颤动)。
e.过去6个月内发生急性冠脉综合征。
f.重大的肺疾病(静止或轻度运动时呼吸短促)，例如由于并发严重的阻塞性肺疾病。
18.认知、心理或社会心理障碍，其将损害患者接受根据方案的治疗的能力，或者对患者遵守知情同意过程和遵守方案必需的访视和操作产生不良影响。
19.妊娠或哺育。
实施例18：本文中所述的CLDN-18.2靶向组合物与nab-紫杉醇和/或吉西他滨组合 的示例性给药方案
在一些实施方案中，本文中所提供药物组合物可与其他抗癌治疗组合施用于患有CLDN-18.2阳性癌症的患者。在一些实施方案中，施用涉及一个或更多个周期。在一些实施方案中，本文中所提供药物组合物可以以至少3至8个周期来施用。
在一些实施方案中，对于本文中所述的CLDN-18.2靶向组合物的给药可以以一种或更多种上表13中所示的水平进行(参见实施例8)；在一些实施方案中，给药可涉及施用至少一种来自表13的较低剂量随后施用至少一种来自表13的较高剂量。
当与nab-紫杉醇和吉西他滨组合给予时，在一些实施方案中，CLDN-18.2靶向组合物可在细胞毒性治疗的第一次输注之前施用。例如，在一些实施方案中，CLDN-18.2靶向组合物可在细胞毒性治疗(例如，nab-紫杉醇和吉西他滨)的第一次输注之前最少4小时施用。在一些实施方案中，CLDN-18.2靶向组合物可以以Q3W施用，并且化学治疗将遵循根据当地指南批准的方案。例如，在一些实施方案中，包含CLDN-18.2靶向组合物和nab-紫杉醇和/或吉西他滨的组合治疗可施用至少八个周期，例如，在一些实施方案中，根据如表17中所示的方案。
表17.施用CLDN-18.2靶向组合物和nab-紫杉醇和吉西他滨的示例性给药方案
Figure BDA0003871087100001341
如表17中所示，用于CLDN-18.2靶向治疗的周期长度限定为21天(q3w)，并且CLDN-18.2靶向组合物在每个周期的第1天给予。Nab-紫杉醇和吉西他滨每28天在第1、8和15天给予。当第1天施用nab-紫杉醇/吉西他滨与施用抗CLDN18.1组合物相匹配时，用粗体“x”突出显示。
单独的吉西他滨已用于治疗胰腺癌。例如，吉西他滨(例如，Gemzar)的推荐剂量为静脉内30分钟内1000mg/m2。在一些实施方案中，推荐的治疗方案是：
·第1至8周：前7周每周给药，随后1周休止。
·第8周之后：在28天周期的第1、8和15天每周给药。
在一些实施方案中，本文中所述的CLDN-18.2靶向组合物可根据作为单一治疗用于治疗胰腺癌的吉西他滨(例如，Gemzar)的经批准剂量和治疗方案与吉西他滨组合施用，如上所述。在一些实施方案中，本文中所述的CLDN-18.2靶向组合物可与吉西他滨组合施用，所述吉西他滨以相比作为单一治疗用于治疗胰腺癌的吉西他滨(例如，Gemzar)的经批准剂量和治疗方案(如上所述)更低的剂量(例如，小于10％、小于20％、小于30％或更多)和/或以更不积极的治疗方案(例如，每10天，或每两周一次等)进行。
已知Nab-紫杉醇与吉西他滨组合用于治疗转移性胰腺腺癌。例如，在每个28天周期的第1、8和15天在30至40分钟内以IV输注来施用nab-紫杉醇
Figure BDA0003871087100001351
的推荐剂量125mg/m2，然而吉西他滨应在每个28天周期的第1、8和15天nab-紫杉醇之后立即施用。
在一些实施方案中，本文中所述的CLDN-18.2靶向组合物可根据nab-紫杉醇/吉西他滨组合治疗的经批准剂量和治疗方案与吉西他滨和nab-紫杉醇组合施用，如上所述。在一些实施方案中，本文中所述的CLDN-18.2靶向组合物可与nab-紫杉醇和吉西他滨组合施用，其中至少一种以相比nab-紫杉醇/吉西他滨组合治疗的经批准剂量和治疗方案(如上所述)更低的剂量(例如，小于10％、小于20％、小于30％或更多)和/或以更不积极的治疗方案(例如，每10天，或每两周一次等)进行。
在一些实施方案中，可允许根据药物/监管指南用退热剂(例如，对乙酰氨基酚、非甾体抗炎药)、止吐剂、质子泵抑制剂和抗焦虑剂的术前用药和术后用药。在一些实施方案中，在施用本文中所述的CLDN-18.2靶向组合物之前，患者应适当地预水合化。在一些实施方案中，皮质类固醇不应用作本文中所述的CLDN-18.2靶向组合物的术前用药。
实施例19：示例性效力评估和/或监测
在一些实施方案中，可针对治疗效力和/或治疗剂量/时间表的调整来定期监测施用有作为单一治疗或与另外的抗癌治疗组合的本文中所述的CLDN-18.2靶向组合物的癌症患者。
在一些实施方案中，治疗效力可通过计算机断层扫描和/或磁共振成像扫描来评估。在一些实施方案中，MRI扫描可使用3特斯拉全身仪器进行。在一些实施方案中，当评价病灶以用于效力评估时，可使用以下标准中的一者或更多者：
ο完全响应：所有靶标病灶均消失。任何病理性***(无论是靶标还是非靶标)的短轴必须减小至<10mm。
ο部分响应(partial response)：靶标病灶的直径总和降低至少30％，以基线总直径作为参考。
ο进行性疾病：靶标病灶的直径总和增加至少20％，以研究中的最小总和作为参考(如果这是研究中的最小总和，则其包括基线总和)。除了20％的相对增加之外，所述总和还必须显示出绝对增加为至少5mm。一个或更多个新病灶的出现也被认为是进展。
ο稳定的疾病：既没有符合PR的足够的缩减，也没有符合进行性疾病的足够的增加，以研究中最小总和直径作为参考。
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Türeci
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Mitnacht-Kraus R，
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等同方案
本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文中所述本发明的具体实施方案的许多等同方案。应当理解，本发明涵盖其中将所列出权利要求中一个或更多个中的一个或更多个限制、要素、条款、描述性术语等引入到从属于同一基础权利要求的另一权利要求(或作为相关的任何其他权利要求)中的所有变化、组合和排列，除非另有说明，或者除非对本领域的普通技术人员明显的是将出现矛盾或不一致。此外，还应当理解，本发明的任何实施方案或方面可明确地从权利要求中排除，而不管说明书中是否记载了具体排除。本发明的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所阐述的那样。
序列表
<110> BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH
<120> 靶向密蛋白-18.2的RNA组合物
<130> 674-358 PCT
<150> US 63/002,287
<151> 2020-03-30
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 1
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460
Pro Gly Lys
465
<210> 2
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 2
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr
20 25 30
Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
<210> 3
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 3
Met Arg Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
20 25 30
Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys
35 40 45
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Asn Trp Val Lys
50 55 60
Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser
65 70 75 80
Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu
85 90 95
Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro
100 105 110
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Trp Arg Gly
115 120 125
Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
145 150 155 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
210 215 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
370 375 380
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 4
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体序列
<400> 4
Met Arg Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
20 25 30
Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser
35 40 45
Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr
50 55 60
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
65 70 75 80
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
100 105 110
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe
115 120 125
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
130 135 140
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
165 170 175
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
180 185 190
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
210 215 220
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
225 230 235 240
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 5
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 6
Ile Tyr Pro Ser Asp Ser Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 7
Thr Arg Ser Trp Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 8
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 9
Trp Ala Ser
1
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 10
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分泌信号
<400> 11
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 分泌信号
<400> 12
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Ser Leu Leu Phe Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Thr Cys Gly
20
<210> 13
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 13
Met Arg Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser
20 25

Claims (88)

1.药物组合物，其包含：
a.至少一种单链RNA，其包含一个或更多个编码相对于密蛋白-18.1多肽优先与密蛋白-18.2(CLDN-18.2)多肽结合的抗体剂的编码区；和
b.脂质纳米粒；
其中所述至少一种单链RNA被包封在至少一个所述脂质纳米粒内。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗体剂与CLDN-18.2多肽的第一胞外结构域(ECD1)特异性地结合。
3.权利要求2所述的药物组合物，其中所述抗体剂与癌细胞中暴露的ECD1的表位特异性地结合。
4.权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述抗体剂是抗体或其抗原结合片段或者包含抗体或其抗原结合片段。
5.权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种单链RNA编码以下二者：所述抗体剂的可变重链(VH)结构域；和所述抗体剂的可变轻链(VL)结构域。
6.权利要求5所述的药物组合物，其中所述至少一种单链RNA是第一单链RNA，其包含编码至少所述抗体剂的VH结构域的重链编码区；并且
a.其中所述第一单链RNA还包含编码至少所述抗体剂的VL结构域的轻链编码区；或者
b.其中所述药物组合物还包含第二单链RNA，其包含编码至少所述抗体剂的VL结构域的轻链编码区。
7.权利要求6所述的药物组合物，其中所述重链编码区还编码恒定重链(CH)结构域；和/或所述轻链编码区还编码恒定轻链(CL)结构域。
8.权利要求6所述的药物组合物，其中所述重链编码区编码免疫球蛋白G(IgG)形式的所述抗体剂的VH结构域、CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域；和/或所述轻链编码区编码IgG形式的所述抗体剂的VL结构域和CL结构域。
9.权利要求8所述的药物组合物，其中所述IgG是IgG1。
10.权利要求6至9中任一项所述的药物组合物，其中所述重链编码区由编码佐贝妥昔单抗或克劳西单抗的全长重链的核苷酸序列组成或者包含编码佐贝妥昔单抗或克劳西单抗的全长重链的核苷酸序列。
11.权利要求6至9中任一项所述的药物组合物，其中所述轻链编码区由编码佐贝妥昔单抗或克劳西单抗的全长轻链的核苷酸序列组成或者包含编码佐贝妥昔单抗或克劳西单抗的全长轻链的核苷酸序列。
12.权利要求6至11中任一项所述的药物组合物，其中所述第一单链RNA和/或所述第二单链RNA各自独立地包含分泌信号编码区。
13.权利要求6至12中任一项所述的药物组合物，其中所述第一单链RNA和/或所述第二单链RNA各自独立地包含至少一个非编码序列元件(例如，以增强RNA稳定性和/或翻译效率)。
14.权利要求13所述的药物组合物，其中所述至少一个非编码序列元件包含3'非翻译区(UTR)、5'UTR、用于mRNA的共转录加帽的帽结构和/或聚腺嘌呤(polyA)尾。
15.权利要求6至14中任一项所述的药物组合物，其中所述第一单链RNA在5'至3'方向上包含：
a.5'UTR编码区；
b.分泌信号编码区；
c.重链编码区；
d.3'UTR编码区；和
e.polyA尾编码区。
16.权利要求6至15中任一项所述的药物组合物，其中所述第二单链RNA在5'至3'方向上包含：
a.5'UTR编码区；
b.分泌信号编码区；
c.轻链编码区；
d.3'UTR编码区；和
e.polyA尾编码区。
17.权利要求14或15所述的药物组合物，其中所述polyA尾是经修饰的polyA序列或包含经修饰的polyA序列。
18.权利要求6至16中任一项所述的药物组合物，其中所述第一单链RNA和/或所述第二单链RNA包含5'帽。
19.权利要求6至18中任一项所述的药物组合物，其中所述第一单链RNA和/或所述第二单链RNA包含至少一个经修饰的核糖核苷酸。
20.权利要求19所述的药物组合物，其中所述经修饰的核糖核苷酸包含假尿苷。
21.权利要求6至20中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种单链RNA包含所述第一单链RNA和所述第二单链RNA。
22.权利要求6至21中任一项所述的药物组合物，其中所述第一单链RNA和所述第二单链RNA以3:1至1:1的重量比存在。
23.权利要求1至22中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质纳米粒是肝靶向脂质纳米粒。
24.权利要求1至23中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质纳米粒是阳离子脂质纳米粒。
25.权利要求24所述的药物组合物，其中形成所述脂质纳米粒的脂质包含：
-聚合物缀合的脂质；
-阳离子脂质；和
-中性脂质。
26.权利要求25所述的药物组合物，其中：
a.所述聚合物缀合的脂质以总脂质的约1至2.5mol％存在；
b.所述阳离子脂质以总脂质的35至65mol％存在；并且
c.所述中性脂质以总脂质的35至65mol％存在。
27.权利要求25或26所述的药物组合物，其中所述聚合物缀合的脂质是PEG缀合的脂质(例如，2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺)。
28.权利要求25至27中任一项所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质是((3-羟丙基)氮杂二基)双(壬烷-9,1-二基)双(2-辛酸丁酯)。
29.权利要求25至28中任一项所述的药物组合物，其中所述中性脂质包含1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPSC)和/或胆固醇。
30.权利要求1至29中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质纳米粒的平均尺寸为约50至150nm。
31.权利要求1至30中任一项所述的药物组合物，其还包含冷冻保护剂(例如，蔗糖)。
32.权利要求1至31中任一项所述的药物组合物，其包含水性缓冲溶液。
33.权利要求32所述的药物组合物，其中所述水性缓冲溶液包含钠离子。
34.权利要求1至33中任一项所述的药物组合物，其还包含化学治疗剂。
35.权利要求34所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂是适用于治疗胰腺癌的化学治疗剂。
36.权利要求1至35中任一项所述的药物组合物，其中所述至少一种单链RNA以0.5mg/mL至1.5mg/mL的浓度存在。
37.方法，其包括向患有CLDN-18.2阳性实体瘤的对象施用权利要求1至36中任一项所述的药物组合物。
38.权利要求37所述的方法，其中所述CLDN-18.2阳性肿瘤是胰腺肿瘤。
39.权利要求37所述的方法，其中所述CLDN-18.2阳性肿瘤是胃肿瘤。
40.权利要求37所述的方法，其中所述CLDN-18.2阳性肿瘤是胆道肿瘤。
41.权利要求37至40中任一项所述的方法，其中所述CLDN-18.2阳性实体瘤是局部晚期的、不可切除的或转移性的。
42.权利要求37至41中任一项所述的方法，其中所述对象已经接受了足以提高CLDN-18.2水平以使得所述对象所患的实体瘤被表征为CLDN-18.2阳性实体瘤的预治疗。
43.权利要求37至42中任一项所述的方法，其中所述CLDN-18.2阳性肿瘤的特征在于≥50％的肿瘤细胞显示出≥2+CLDN-18.2蛋白染色强度，根据在经***固定石蜡包埋的来自所述对象的肿瘤组织中通过免疫组织化学测定所评估的。
44.权利要求37至43中任一项所述的方法，其中所述药物组合物作为单一治疗施用。
45.权利要求37至44中任一项所述的方法，其中所述药物组合物作为包含所述药物组合物和化学治疗剂的组合治疗的一部分来施用。
46.权利要求37至45中任一项所述的方法，其中所述对象已经接受了所述化学治疗剂。
47.权利要求45所述的方法，其还包括向所述对象施用所述化学治疗剂以使得所述对象接受所述组合治疗。
48.权利要求47所述的方法，其中所述化学治疗剂在施用所述药物组合物之后至少四小时施用。
49.权利要求45至48中任一项所述的方法，其中对于患有CLDN-18.2阳性胰腺肿瘤的对象，所述化学治疗剂是吉西他滨和/或紫杉醇(例如，nab-紫杉醇)或者包含吉西他滨和/或紫杉醇(例如，nab-紫杉醇)。
50.权利要求45至48中任一项所述的方法，其中对于患有CLDN-18.2-阳性胰腺肿瘤的对象，所述化学治疗剂是FOLFIRINOX或者包含FOLFIRINOX。
51.权利要求45至48中任一项所述的方法，其中对于患有CLDN-18.2阳性胆道癌的对象，所述化学治疗剂是吉西他滨和/或顺铂或者包含吉西他滨和/或顺铂。
52.权利要求37至51中任一项所述的方法，其中所述对象是成年对象。
53.权利要求37至52中任一项所述的方法，其中所述施用通过静脉内注射进行。
54.权利要求37至53中任一项所述的方法，其中所述药物组合物以至少一个、至少两个、至少三个或更多个给药周期施用。
55.权利要求54所述的方法，其中所述药物组合物作为每个给药周期的一个或更多个剂量施用。
56.权利要求55所述的方法，其中每个给药周期是三周给药周期。
57.权利要求55或56所述的方法，其中所述一个或更多个剂量包含在0.1mg/kg至5mg/kg对象体重的范围内的所述至少一种单链RNA。
58.在对象中递送CLDN-18.2靶向抗体以用于癌症治疗的方法中，改进包括向所述对象施用权利要求1至36中任一项所述的药物组合物。
59.产生CLDN-18.2靶向抗体的方法，其包括向细胞施用权利要求1至35中任一项所述的药物组合物，以使得所述细胞表达并分泌由该药物组合物中至少一种单链RNA编码的CLDN-18.2靶向抗体。
60.权利要求59所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
61.权利要求59或60所述的方法，其中所述细胞是在对象中。
62.权利要求61所述的方法，其中所述CLDN-18.2靶向抗体以治疗相关血浆浓度产生。
63.权利要求62所述的方法，其中所述治疗相关血浆浓度足以通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导癌细胞死亡。
64.权利要求63所述的方法，其中所述治疗相关血浆浓度为0.3至28μg/mL。
65.方法，其包括以下步骤：
确定由引入到细胞中的至少一种mRNA表达的抗体剂的一个或更多个特征，其中所述至少一种mRNA包含至少一种或更多种单链RNA的一个或更多个特征，所述单链RNA包含编码相对于密蛋白-18.1多肽优先与密蛋白-18.2(CLDN-18.2)多肽结合的抗体剂的编码区，其中所述一个或更多个特征包含：(i)所述抗体剂的蛋白质表达水平；(ii)所述抗体剂与CLDN-18.2的结合特异性；(iii)所述抗体剂通过ADCC介导靶细胞死亡的效力；以及(iv)所述抗体剂通过补体依赖性细胞毒性(CDC)介导靶细胞死亡的效力。
66.表征靶向CLDN-18.2的药物组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
使细胞与至少一种根据权利要求1至35中任一项所述的药物组合物接触；以及
检测由所述细胞产生的抗体剂。
67.权利要求66所述的方法，其还包括确定所述抗体剂的一个或更多个特征，其中所述一个或更多个特征包含：(i)所述抗体剂的蛋白质表达水平；(ii)所述抗体剂与CLDN-18.2多肽的结合特异性；(iii)所述抗体剂通过ADCC介导靶细胞死亡的效力；以及(iv)所述抗体剂通过补体依赖性细胞毒性(CDC)介导靶细胞死亡的效力。
68.权利要求65至67中任一项所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
69.权利要求65或67所述的方法，其中确定步骤包括将所述抗体剂的所述一个或更多个特征与参考CLDN-18.2靶向抗体的特征进行比较。
70.权利要求65和67至69中任一项所述的方法，其中确定步骤包括评估所述抗体剂的蛋白质表达水平高于阈值水平。
71.权利要求70所述的方法，其中所述阈值水平是足以诱导ADCC的水平。
72.权利要求65和67至71中任一项所述的方法，其中确定步骤包括评估所述抗体剂与CLDN-18.2多肽的结合。
73.权利要求72所述的方法，其中所述评估包含确定相对于所述抗体剂与CLDN18.1多肽的结合，所述抗体剂与CLDN-18.2多肽的结合。
74.权利要求72或73所述的方法，其中所述评估包含确定所述抗体剂的结合优先谱至少与参考CLDN-18.2靶向抗体的结合优先谱相当。
75.权利要求69或74所述的方法，其中所述参考CLDN-18.2靶向抗体是佐贝妥昔单抗或克劳西单抗。
76.权利要求65至75中任一项所述的方法，如果所述抗体剂包含以下特征，则进一步将所述抗体剂表征为CLDN-18.2靶向抗体剂：
a.该细胞所表达的抗体剂的蛋白质水平高于足以诱导ADCC的阈值水平；
b.所述抗体剂相对于CLDN18.1优先与CLDN-18.2结合；
以及
c.通过ADCC和/或CDC介导对至少50％靶细胞的杀伤。
77.权利要求76所述的方法，如果所述抗体的特征与佐贝妥昔单抗或克劳西单抗的特征至少相当，则进一步将所述抗体剂表征为佐贝妥昔单抗或克劳西单抗等同抗体。
78.权利要求65至77中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。
79.权利要求65和66至78中任一项所述的方法，其中确定步骤包括确定当在接触48小时之后评估时，所述细胞是否表达由所述至少一种单链RNA编码的抗CLDN18-2抗体剂。
80.权利要求65和66至79中任一项所述的方法，其中确定步骤包括确定以下特征中的一个或更多个：
-该细胞所表达的抗体剂是否相对于CLDN18.1多肽优先与CLDN-18.2多肽结合；
-该细胞所表达的抗体剂是否表现出与参考CLDN-18.2靶向单克隆抗体相当的针对CLDN-18.2的靶特异性，根据在流式细胞术结合测定中所观察到的；
-在所述抗体剂存在下将免疫效应细胞(例如，PBMC细胞)与CLDN-18.2阳性细胞或CLDN-18.2阴性对照细胞孵育48小时之后进行评估时，是否是所述CLDN-18.2阳性细胞而不是所述对照细胞被裂解；
-该细胞所表达的抗体剂是否表现出与在相同浓度的参考CLDN-18.2靶向单克隆抗体的情况下观察到的至少相当的所靶向CLDN-18.2阳性细胞的ADCC谱；以及
-在所述抗体剂存在下将CLDN-18.2阳性细胞或CLDN-18.2阴性对照细胞与人血清一起孵育2小时之后进行评估时，是否是所述CLDN-18.2阳性细胞而不是所述对照细胞被裂解。
81.权利要求66至80中任一项所述的方法，其中所述细胞存在于对象(例如，小鼠或猴对象)中。
82.权利要求81所述的方法，其中所述一个或更多个特征包括所述对象的一个或更多个组织中的抗体水平。
83.权利要求66至82中任一项所述的方法，其还包括：
如果所述药物组合物被表征为CLDN-18.2靶向，则将所述药物组合物施用于各自荷人CLDN-18.2阳性异种移植肿瘤的动物对象的组，以确定抗肿瘤活性。
84.制造方法，所述方法包括以下步骤：
(A)确定单链RNA(ssRNA)或其组合物的一个或更多个特征，所述ssRNA编码抗体剂的一部分或全部，所述一个或更多个特征选自：
(i)所述ssRNA的长度和/或序列；
(ii)所述ssRNA的完整性；
(iii)所述ssRNA中一个或更多个化学部分的存在和/或位置；
(iv)当所述ssRNA被引入到细胞中时，所述抗体剂的表达程度；
(v)所述ssRNA或其组合物的稳定性；
(vi)来自已将所述ssRNA引入其中的生物体的生物样品中抗体剂的水平；
(vii)由所述ssRNA表达的抗体剂的结合特异性，任选地与CLDN-18.2且任选地相对于CLDN18.1的结合特异性；
(viii)所述抗体剂通过ADCC介导靶细胞死亡的效力；
(ix)所述抗体剂通过补体依赖性细胞毒性(CDC)介导靶细胞死亡的效力；
(x)所述组合物中脂质的身份和量/浓度；
(xi)所述组合物内脂质纳米粒的尺寸；
(xii)所述组合物内脂质纳米粒的多分散性；
(xiii)所述组合物内所述ssRNA的量/浓度；
(xiv)所述ssRNA在脂质纳米粒内的包封程度；和
(xv)其组合；
(B)将所述ssRNA或其组合物的所述一个或更多个特征与适当的参考标准的特征进行比较；以及
(C)(i)如果比较表明所述ssRNA或其组合物达到或超过所述参考标准，则将所述ssRNA或其组合物指定用于制造和/或分配的一个或更多个另外的步骤；或者
(ii)如果比较表明所述ssRNA或其组合物不符合或未超过所述参考标准，则采取替代行动。
85.权利要求84所述的方法，其中评估所述ssRNA并且步骤(C)(i)的所述一个或更多个另外的步骤是或者包括至少配制所述ssRNA。
86.权利要求84或85所述的方法，其中评估所述组合物并且所述组合物包含脂质纳米粒，并且步骤(C)(i)的所述一个或更多个另外的步骤是或者包含包括所述组合物的释放和分配。
87.权利要求85所述的方法，其还包括将制剂施用于各自荷人CLDN-18.2阳性异种移植肿瘤的动物对象的组，以确定抗肿瘤活性。
88.确定靶向CLDN-18.2靶向的药物组合物的给药方案的方法，所述方法包括以下步骤：
(A)在预先确定的给药方案下将权利要求1至35中任一项所述的药物组合物施用于各自荷人CLDN-18.2阳性异种移植肿瘤的动物对象的组；
(B)定期测量所述动物对象的肿瘤尺寸；
(C)(i)如果在施用所述药物组合物之后肿瘤尺寸的降低不是治疗相关的，则提高剂量和/或给药频率；或者
(ii)如果在施用所述药物组合物之后肿瘤尺寸的降低是治疗相关的，并且在至少30％的所述动物对象中显示出毒性作用，则降低剂量和/或给药频率；或者
(iii)如果在施用所述药物组合物之后肿瘤尺寸的降低是治疗相关的，并且在所述动物对象中没有显示出毒性作用，则不对给药方案做出改变。
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