KR101612139B1 - 간암 치료제 - Google Patents

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Abstract

간세포 암을 치료 또는 예방하기 위한 신규의 약제학적 조성물 및 치료 방법이 제공된다. 간암의 치료 및 예방을 위한 약제학적 조성물은 화학요법제와 항-글리피칸 3 항체를 조합하는 것에 의해 얻어진다. 또한 화학요법제와 병용하여 사용하기 위한 활성성분으로 항-글리피칸 3를 포함하거나, 또는 항-글리피칸 3 항체와 병용하여 사용하기 위한 활성성분으로 화학요법제를 포함하는 간암을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 공개된다. 화학요법제와 항-글리피칸 3 항체를 조합하여 사용하는 것은 화학요법제를 단독으로 사용하였을 때보다 더 좋은 치료 효과를 보이고, 화학요법제의 간암 치료로 인해 발생하는 부작용 줄인다.

Description

간암 치료제{LIVER CANCER DRUG}
본 발명은 간암을 효과적으로 치료하거나 예방할 수 있는 화학요법제 및 항-글리피칸 3 항체의 조합을 포함하는 약제학적 조성물뿐만 아니라 상기 약제학적 조성물을 사용하는 치료 방법에 관한 것이다. 본 출원은 2008년 4월 4일자로 출원된 일본 특허 출원 2008-98309 및 2008년 9월 26일자로 출원된 국제 출원 PCT/JP2008/002690에 기초하는 우선권을 주장하며, 본 명세서의 내용은 참조로서 여기에 병합된다.
간세포 암에 기인하는 사망은 한해에 60만 명에 달하고, 세계적으로 암으로 인한 사망 중 5위에 해당한다 (Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. : Lancet 362, 1907-17 (2003)). 간세포 암의 대부분은 질환으로 진단받은 후 1년 이내에 사망한다. 불행하게도, 간세포 암은 암종 치료가 별로 성공적이지 않은 말기에 진단되는 경우가 잦다. 이러한 환자에 있어, 화학요법, 화학 색전법, 뜸이나 전자 빔 요법을 포함한 치료 효과 여전히 불충분하다. 많은 환자가 혈관 침투 및 복합 간내 전이를 수반하는 질환의 재발을 보이고, 후기 단계로 급속하게 진행된다. 5년간 생존율은 7%에 불과하다 (Bosch F.X., Ribes J., Cleries R.: Gastroenterology, 127, S5-16 (2004)). 국소 암의 외과적 절제가 가능한 간세포 암환자의 예후는 비교적 좋지만, 5년 생존율은 15% 내지 39%에 머문다 (Takenaka K, Kawahara N, Yamamoto K, Kajiyama K, Maeda T, Itasaka H, Shirabe K, Nishizaki T, Yanaga K, Sugimachi K; Arch Surg, 131, 71-6 (1996)). 따라서, 이러한 고도의 악성 질병을 치료하기 위한 새로운 방법에 대한 당해 기술 분야의 기대가 존재한다.
간세포 암은 일본에서의 원발성 간암의 90% 이상을 차지한다. 이러한 간암에 대한 치료법은 종양에의 영양 공급 경로가 되는 간동맥에 오일계 조영제 리피오돌과 항암제, 폐색 물질 (Gelfoam)의 혼합물을 주입하여 영양 동맥을 폐색시켜 선택적으로 간 세포 암의 괴사를 유도하는 치료법인 화학요법계 경도관 동맥 색전술 (TAE)을 포함한다. 또 플루오로우라실 (5-FU), 우라실-테가푸르 (UFT), 미토마이신 C (MMC), 미톡산트론 (DHAD), 아드리아마이신 (ADR), 에피루비신 (EPI), 시스플라틴 (CDDP) 같은 화학요법제를 사용하여 단독으로, 혹은 인터페론 (IFN)과의 병용 요법으로서 전신 화학요법의 임상적 시도가 행해지고 있다 (Yeo, W., Mok, T.S., Zee, B., Leung, T.W., Lai, P.B., Lau, W.Y., Koh, J., Mo, F.K., Yu, S.C., Chan, A.T., Hui, P., Ma, B., Lam, K.C., Ho, W.M., Wong, H.T., Tang, A., Johnson P.J.; J Natl Cancer Inst . 97, 1532-8 (2005)). 그러나, 또한 간암의 표준 요법은 아직 확립되어 있지 않다 (Furuse, J., Ishii, H., Nakachi, K., Suzuki, E., Shimizu, S., Nakajima, K.; Cancer Sci., Oct 22 (E-Pub) (2007)).
최근, 성장 인자를 표적으로 하는 많은 약물이 간암 치료에 적용할 목적으로 연구되고 있다. 이러한 연구는 인간 간암 세포에서 상피 성장 인자 수용체/인간 상피 수용체 1 (EGFR/HER1)이 활성형으로 발현하고 있음을 제시하고 있다. 상피 성장 인자 수용체/인간 상피 수용체 1 및 ErbB-2 (Her2/neu)의 이중 타이로신 키나아제에 대한 저해제인 라파티닙과 상피 성장 인자 수용체/인간 상피 수용체 1의 저해제인 에를로티니브는 임상 2기에서 연구되고 있다. 에를로티니브가 투여된 환자의 응답률은 4-9%, 진행 기간은 2.1 개월 내지 3.2 개월, 생존기간은 5.8 개월 내지 13개월이었다. 그러나 라파티닙이 투여된 환자의 응답률은 0%, 진행 기간은 1.8개월이었다 (Philip, P.A., Mahoney, M.R., Allmer, C., Thomas, J., Pitot, H.C., Kim, G., Donehower, R.C., Fitch, T., Picus, J., Erlichman, C.; J. Clin. Oncol., 23, 6657-63 (2005)). 한편, 상기 키나아제의 저해제인 경구활성형의 소라페니브 (Nexavar, BAY43-9006)는 Raf 키나아제 단계에서 Raf/MEK/ERK 신호 전달을 저해하여 암 세포의 증식을 차단한다. 또한, 소라페니브는 VEGFR-2, VEGFR-3 및 PDGFR-β 타이로신 키나아제에 의해 항혈관형성 효과를 발휘하고, 앞에서 말한 화학 요법제에 비해 유리한 효과를 나타내었다. 비 일본인 및 일본인을 대상으로 한 임상 2기에서, 진행 기간은 4.2 내지 4.9개월, 응답률은 2 내지 4%, 무진행 생존기간은 9.2 내지 15.6개월이었다 (Thomas, M.B., Dutta, A., Brown, T., Charnsangavej, C., Rashid, A., Hoff, PM., Dancey, J., Abbruzzese, J.L.; J. Clin. Oncol., 2005 ASCO Annual Meeting Proceedings. 23, 16S (2005)). 수니티닙 (SU11248)은 소라페니브처럼 복수의 키나아제를 저해하는 작용을 갖는 멀티-키나아제 저해제이고 (Mendel, D.B., Laird, A.D., Xin X, Louie, S.G., Christensen, J.G., Li, G., Schreck, R.E., Abrams, T.J., Ngai, T.J., Lee, L.B., Murray, L.J., Carver, J., Chan, E., Moss, K.G., Haznedar, J.O., Sukbuntherng, J., Blake, R.A., Sun, L., Tang, C., Miller, T., Shirazian, S., McMahon, G., Cherrington, J.M.; Clin Cancer Res, 9, 327-37 (2003)) 간암의 임상 시험에 사용되고 있다. 34명의 간암 진행 환자에게 수니티닙을 투여한 상기 시험에서, 한 환자는 12주 후에 부분적인 반응을 보였고, 17명의 환자는 안정한 상태에 도달되었다. 전 생존기간 중앙값은 9.8개월, 무진행 생존기간 중앙값은 3.9개월 (95% 신뢰 구간 2.6-6.9), 3개월 무진행 생존율은 56%, 6개월 무진행 생존율은 32%로, 수니티닙은 간암에서 항종양 활성을 나타내었다 (Zhu A, Sahani D, di Tomaso E et al.,; 99th AACR annual meeting. San Diego, CA, USA 12-16 April (2008)). 일반적으로, 간암의 진행에 따라 식욕 부진 및 체중 감소, 전신 권태감, 우늑부종유촉이성, 우늑부통, 복부팽만, 발열 및 황달 같은 간기능 부전에 관련되거나 간암에 특징적인 여러 증상이 관찰된다. 그러나, 소라페니브, 라파티닙과 같은 화학요법제는 설사 또는 변비, 빈혈, 면역억제 (이로써 감염 또는 치명적인 패혈증을 일으킬 수 있는 정도), 출혈, 심독성, 간독성, 신독성, 식욕 부진 및 체중 감소처럼 일련의 부작용을 포함한 많은 합병증을 가진다.
간암의 초기에는 특별한 초기 증상이 관찰되지 않지만, 간암의 진행에 따라 식욕 부진 및 체중 감소, 전신 권태감, 우늑부종유촉이성, 우늑부통, 복부팽만, 발열, 황달 같은 간기능 부전에 관련되거나 간암에 특징적인 여러 증상이 관찰된다. 이러한 증상은 앞에서 말한 화학요법제의 사용에 의해 강화되는 것이 임상적으로 관찰된다. 예를 들면, 간세포 암이 발견되는 환자에서 식욕 부진이 관찰되고, 식욕 부진과 관련되거나 독립적으로 생기는 체중 감소 등의 증상은 상기 환자에 대한 화학요법제의 투여에 의해 증가한다. 이러한 증상이 심해지는 경우에는 상기 화학요법제의 사용을 중단되는 경우도 있다. 따라서, 상기 증상의 확대는 화학요법제를 통한 치료를 방해하는 요인이다.
따라서, 치료 효과의 향상이나 치료를 받는 환자의 삶의 질 개선의 면에서 더욱 우수한 치료법의 확립이 요구된다.
본 발명의 목적은 암의 진행에 수반되는 체중 감소 등의 간암 고유의 증상이 관찰되는 환자에 대해서 키나아제 저해제 같은 화학요법제의 투여로 발생하는 설사 또는 변비, 빈혈, 면역억제 (이로써 감염 또는 치명적인 패혈증을 일으킬 수 있는 정도), 출혈, 심독성, 간독성, 신독성, 식욕 부진 및 체중 감소 등의 화학요법제 고유의 부작용을 감소시키고, 또한 간암에 대한 치료 효과를 증대할 수 있는 간암 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 간암 세포에서 고발현되는 단백질에 결합하고 이와 같은 세포에 대해 세포독성을 발휘할 수 있는 치료 항체를, 간암 세포에 효과적인 화학요법제를 유효성분으로 포함하는 간암 치료제와 결합함으로써, 이와 같은 화학요법제가 단독 처방된 경우보다 간암 환자에게서 더 나은 치료 효과가 얻어질 수 있다는 것을 발견하였다. 또 본 발명자들은 본 발명의 약물이 상기와 같은 바람직한 효과를 가질 뿐만 아니라, 설사 또는 변비, 빈혈, 면역억제 (이로써 감염 또는 치명적인 패혈증을 일으킬 수 있는 정도), 출혈, 심독성, 간독성, 신독성, 식욕 부진 및 체중 감소 등의 화학요법제 고유의 부작용을 유의하게 줄이고, 그것에 의해 양호환 치료 효과를 나타낸다는 것을 발견하였다.
더욱이, 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, HepG2가 이식된 비-인간 동물 간암 모델을 간암의 진행에 수반되는 식욕 부진이나 체중 감소 등의 증상의 모델로 사용하였을 때, 이와 같은 체중 감소는 화학요법제, 보다 구체적으로는 소라페니브의 투여에 의해 한층 더 증폭되는 반면에, 체중 감소는 본 발명에 따른 약물의 투여에 의해 억제되었다.
본 발명은:
[1] 화학요법제 및 항-글리피칸 3 항체의 조합물을 포함하는 간암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물;
[2] [1]에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 배합제인 것인 약제학적 조성물;
[3] [1]에 있어서, 상기 화학요법제와 항-글리피칸 3 항체는 병용 투여되는 것인 약제학적 조성물;
[4] [3]에 있어서, 상기 화학요법제와 상기 항-글리피칸 3 항체가 동시 또는 순차적으로 투여되는 것인 약제학적 조성물;
[5] [3]에 있어서, 상기 화학요법제와 항-글리피칸 3 항체가 개별적으로 투여되는 것인 약제학적 조성물;
[6] 화학요법제와 조합하여 사용하기 위한 간암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물로, 상기 조성물은 항-글리피칸 3 항체를 활성성분으로 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[7] [6]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 상기 화학요법제와 동시에 투여되는 것인 약제학적 조성물;
[8] [6]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체가 화학요법제 투여 전 또는 투여 후 투여되는 것인 약제학적 조성물;
[9] 항-글리피칸 3 항체와 조합하여 사용하기 위한 간암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물로, 상기 조성물은 화학요법제를 활성성분으로 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[10] [9]에 있어서, 상기 화학요법제는 상기 항-글리피칸 3 항체와 동시에 투여되는 것인 약제학적 조성물;
[11] [9]에 있어서, 상기 화학요법제는 항-글리피칸 3 항체의 투여 전 또는 투여 후 투여되는 것인 약제학적 조성물;
[12] [1] 내지 [11] 중 어느 것에 있어서, 상기 화학요법제는 키나아제 저해제인 것인 약제학적 조성물;
[13] [12]에 있어서, 상기 화학요법제는 멀티-키나아제 저해제인 것인 약제학적 조성물;
[14] [12] 또는 [13]에 있어서, 상기 화학요법제는 소라페니브 (Sorafenib; BAY43-9006)인 것인 약제학적 조성물;
[15] [12] 또는 [13]에 있어서, 상기 화학요법제는 수니티닙(Sunitinib)인 것인 약제학적 조성물;
[16] [1] 내지 [15] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 세포독성을 갖는 것인 약제학적 조성물;
[17] [1] 내지 [16] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO:5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO:7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[18] [1] 내지 [17] 중 어느 것에 있어서, 항-글리피칸 3 항체는 제2의 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있고, 여기서 상기 제2의 항체는:
각각, SEQ ID NO: 5, 6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역, 및
각각, SEQ ID NO: 8, 24 및 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[19] [1] 내지 [16] 또는 [18] 중 어느 것에 있어서,
상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 9~23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[20] [1] 내지 [16] 또는 [18] 중 어느 것에 있어서,
상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[21] [1] 내지 [16], 또는 [18] 중 어느 것에 있어서,
상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[22] [1] 내지 [21] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 인간화 항체인 것인 약제학적 조성물;
[23] [22]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[24] [22]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 4의 34 번째 Gly이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[25] [22]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[26] [22]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[27] 화학요법제에 의한 간암 치료에 의해 야기된 부작용을 줄이기 위한 약제로, 상기 약제는 치료용 항체를 활성성분으로 포함하는 것인 부작용 감소제;
[28] [27]에 있어서, 상기 화학요법제는 키나아제 저해제인 것인 부작용 감소제;
[29] [27] 또는 [28]에 있어서, 상기 화학요법제는 멀티-키나아제 저해제인 것인 부작용 감소제;
[30] [28] 또는 [29]에 있어서, 상기 화학요법제는 소라페니브 (BAY43-9006)인 것인 부작용 감소제;
[31] [28] 또는 [29]에 있어서, 상기 화학요법제는 수니티닙인 것인 부작용 감소제;
[32] [27] 내지 [31] 중 어느 것에 있어서, 상기 부작용은 체중 감소인 것인 부작용 감소제;
[33] [27] 내지 [32] 중 어느 것에 있어서, 상기 치료용 항체는 항-글리피칸 3 항체인 것인 부작용 감소제;
[34] [33]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 세포독성을 갖는 것인 부작용 감소제;
[35] [33] 또는 [34]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 부작용 감소제;
[36] [33] 내지 [35] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 제2의 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있는 항체이고, 여기서 상기 제2의 항체는:
각각 SEQ ID NO: 5, 6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역, 및
각각 SEQ ID NO: 8, 24 및 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 부작용 감소제;
[37] [33], [34] 또는 [36] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 9~23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 부작용 감소제;
[38] [33], [34] 또는 [36]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 부작용 감소제;
[39] [33], [34] 또는 [36] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25로 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 부작용 감소 방지제;
[40] [33] 내지 [39] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 인간화 항체인 것인 부작용 감소제;
[41] [40]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 부작용 감소제;
[42] [40]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 4의 34 번째 글라이신 (Gly)이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 부작용 감소제;
[43] [40]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 부작용 감소제;
[44] [40]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함 항체 것인 부작용 감소제;
[45] 화학요법제에 의한 간암 치료의 효율을 강화하기 위한 약제학적 조성물로, 상기 조성물은 항-글리피칸 3 항체를 활성성분으로 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[46] [45]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 상기 화학요법제와 동시에 투여되는 것인 약제학적 조성물;
[47] [45]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 화학 요법 투여 전 또는 투여 후 투여되는 것인 약제학적 조성물;
[48] [45] 내지 [47] 중 어느 것에 있어서, 상기 화학요법제가 키나아제 저해제인 것인 약제학적 조성물;
[49] [48]에 있어서, 상기 화학요법제가 멀티-키나아제 저해제인 것인 약제학적 조성물;
[50] [45] 내지 [49] 중 어느 것에 있어서, 상기 화학요법제가 소라페니브 (BAY43-9006)인 것인 약제학적 조성물;
[51] [45] 내지 [49] 중 어느 것에 있어서, 상기 화학요법제가 수니티닙인 것인 약제학적 조성물;
[52] [45] 내지 [51] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 세포독성을 갖는 것인 약제학적 조성물;
[53] [45] 내지 [52] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[54] [45] 내지 [53] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 제2의 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있고, 여기서 상기 제2의 항체는:
각각, SEQ ID NO: 5, 6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역, 및
각각, SEQ ID NO: 8, 24 및 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[55] [45] 내지 [52], 또는 [54] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 9~23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 약제학적 조성물;
[56] [45] 내지 [52], 또는 [54] 중 어느 것에 있어서, 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[57] [45] 내지 [52] 또는 [54] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[58] [45] 내지 [57] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 인간화 항체인 것인 약제학적 조성물;
[59] [58]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[60] [58]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 4의 34 번째 Gly이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[61] [58]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물;
[62] [58]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함 항체 것인 약제학적 조성물;
[63] 개체에 유효량의 화학요법제와 항-글리피칸 3 항체의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 간암을 치료 또는 예방하기 위한 방법;
[64] [63]에 있어서, 상기 화학요법제와 상기 항-글리피칸 3 항체는 동시 또는 순차적으로 투여되는 것인 방법;
[65] [63]에 있어서, 상기 화학요법제와 상기 항-글리피칸 3 항체는 개별적으로 투여되는 것인 방법;
[66] [63] 내지 [65] 중 어느 것에 있어서, 상기 화학요법제는 키나아제 저해제인 것인 방법;
[67] [66]에 있어서, 상기 화학요법제는 멀티-키나아제 저해제인 것인 방법;
[68] [66] 또는 [67]에 있어서, 상기 화학요법제는 소라페니브 (BAY43-9006)인 것인 방법;
[69] [66] 또는 [67]에 있어서, 상기 화학요법제는 수니티닙인 것인 방법;
[70] [63] 내지 [69] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 세포독성을 갖는 것인 방법;
[71] [63] 내지 [70] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[72] [63] 내지 [71] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 제2의 항체가 결합 수 있는 에피토프에 결합할 수 있는 항체이고, 상기 제2의 항체는:
각각 SEQ ID NO: 5, 6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역, 및
각각 SEQ ID NO: 8, 24 및 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[73] [63] 내지 [70] 또는 [72] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 9~23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[74] [63] 내지 [70] 또는 [72] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[75] [63] 내지 [70] 또는 [72] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[76] [63] 내지 [75] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 인간화 항체인 것인 방법;
[77] [76]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[78] [76]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 4의 34 번째 글라이신 (Gly)이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[79] [76]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[80] [76]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함 하는 것인 방법;
[81] 개체에 유효량의 치료용 항체를 투여하는 것을 포함하여 개체에서 화학요법제에 의한 간암 치료로 인해 발생하는 부작용을 줄이기 위한 방법;
[82] [81]에 있어서, 상기 화학요법제는 키나아제 저해제인 것인 방법;
[83] [81] 또는 [82]에 있어서, 상기 화학요법제는 멀티-키나아제 저해제인 것인 방법;
[84] [82] 또는 [83]에 있어서, 상기 화학요법제는 소라페니브 (BAY43-9006)인 것인 방법;
[85] [82] 또는 [83]에 있어서, 상기 화학요법제는 수니티닙인 것인 방법;
[86] [81] 내지 [85] 중 어느 것에 있어서, 상기 부작용이 체중 감소인 것인 방법;
[87] [81] 내지 [86] 중 어느 것에 있어서, 상기 치료용 항체는 항-글리피칸 3 항체인 방법;
[88] [87]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 세포독성을 갖는 것인 방법;
[89] [87] 또는 [88]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는;
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[90] [87] 내지 [89] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 제2의 항체가 결합 수 있는 에피토프에 결합할 수 있는 항체이고, 상기 제2의 항체는:
각각, SEQ ID NO: 5, 6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역, 및
각각, SEQ ID NO: 8, 24 및 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[91] [87], [88] 또는 [90]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 9~23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[92] [87], [88] 또는 [90] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[93] [87], [88] 또는 [90] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[94] [87] 내지 [93] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 인간화 항체인 것인 방법;
[95] [94]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함한 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[96] [94]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 4의 34 번째 글라이신 (Gly)이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[97] [94]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[98] [94]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[99] 개체에 유효량의 항-글리피칸 3 항체를 투여하는 것을 포함하여 개체에서 화학요법제에 의한 간암 치료의 효과를 향상시키는 방법;
[100] [99]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 상기 화학요법제와 동시에 투여되는 것인 방법;
[101] [99]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 화학요법제의 투여 전 또는 투여 후에 투여되는 것인 방법;
[102] [99] 내지 [101] 중 어느 것에 있어서, 상기 화학요법제는 키나아제 저해제인 것인 방법;
[103] [102]에 있어서, 상기 화학요법제는 멀티-키나아제 저해제인 것인 방법;
[104] [99] 내지 [103] 중 어느 것에 있어서, 상기 화학요법제는 소라페니브 (BAY43-9006)인 것인 방법;
[105] [99] 내지 [103] 중 어느 것에 있어서, 상기 화학요법제는 수니티닙인 것인 방법;
[106] [99] 내지 [105] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 세포독성을 갖는 것인 방법;
[107] [99] 내지 [106] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[108] [99] 내지 [107] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 제2의 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있는 항체이고, 상기 제2의 항체는:
각각, SEQ ID NO: 5, 6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역, 및
각각, SEQ ID NO: 8, 24 및 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[109] [99] 내지 [106], 또는 [108] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 9~23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[110] [99] 내지 [106], 또는 [108] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[111] [99] 내지 [106] 또는 [108] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[112] [99] 내지 [111] 중 어느 것에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는 인간화 항체인 것인 방법;
[113] [112]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함한 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[114] [112]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 4의 34 번째 글라이신 (Gly)이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[115] [112]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법;
[116] [112]에 있어서, 상기 항-글리피칸 3 항체는:
SEQ ID NO: 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변영역; 및
SEQ ID NO: 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변영역을 포함하는 것인 방법을 포함한다.
도 1은 독소루비신 (DOX) 또는 미톡산트론 (MX) 및 GC33 항체와의 병용 투여에 의한 간암 세포의 증식 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 인간 간암 세포주 HuH-7 이식 마우스 모델에 대한 hGC33 항체 및 소라페니브의 항종양 효과를 종양 체적의 변화에 기초해 도시한 그래프이다.
도 3은 인간 간암 세포주 HepG2 이식 마우스 모델에 대한 hGC33 항체 및 소라페니브의 항종양 효과를 종양 체적의 변화에 기초해 도시한 그래프이다.
도 4는 hGC33 항체 및 소라페니브에 의한 인간 간암 세포주 HepG2 이식 마우스 모델의 체중 감소에 대한 효과를 상기 모델의 체중 변화 변화에 기초해 도시한 그래프이다.
도 5는 인간 간암 세포주 HepG2 이식 마우스 모델에 대한 pH7pL16 항체 및 소라페니브의 항종양 효과를 종양 체적의 변화에 기초해 도시한 그래프이다.
도 6은 pH7pL16 항체 및 소라페니브에 의한 인간 간암 세포주 HepG2 이식 마우스 모델의 체중 감소에 대한 효과를 상기 모델의 체중 변화 변화에 기초해 도시한 그래프이다.
도 7은 인간 간암 세포주 HepG2 이식 마우스 모델에 대한 hGC33 항체 및 수니티닙의 항종양 효과를 종양 체적의 변화 (평균+표준편차)에 기초해 도시한 그래프이다.
도 8은 본 발명에서 바람직하게 사용되는 인간화 항체의 H 사슬 가변영역 및 L 사슬 가변영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 9는 본 발명에서 바람직하게 사용되는 인간화 항체의 H 사슬 가변영역 및 L 사슬 가변영역의 CDR의 아미노산 서열을 나타낸다.
본 발명은 화학요법제 및 항-글리피칸 3 항체를 포함하는 간암을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "화학요법제 및 항-글리피칸 3 항체의 조합을 포함하는 간암을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물"이란, 화학요법제 및 항-글리피칸 3 항체가 간암의 치료 또는 예방에 있어서 동시에, 개별적으로, 또는 순차적으로 투여되는 약제학적 조성물을 의미한다. 본 발명의 상기 약제학적 조성물은 화학요법제 및 항-글리피칸 3 항체가 모두 함유되는 배합제의 형태로 제공될 수 있다. 대안적으로, 화학요법제를 함유하는 약제와 항-글리피칸 3 항체를 함유하는 약제가 개별적으로 제공되고, 이러한 약제가, 동시에, 개별적으로, 또는 순차적으로 사용될 수도 있다. 또 화학요법제를 함유하는 약제와 항-글리피칸 3 항체를 함유하는 약제로 구성된 키트로 제공될 수도 있다.
상기 약제학적 조성물에 있어서, 상기 화학요법제와 항-글리피칸 3 항체가 별개의 약으로 제공되는 경우, 이러한 약은 같은 제형 또는 다른 제형일 수 있다. 예를 들면, 둘 다는 비경구제제, 주사제, 링겔제, 정맥내 링겔제로 부터 선택되는 서로 다른 제형일 수 있고, 둘 다는 비경구제제, 주사제, 링겔제, 정맥내 링겔제 중에서 선택되는 동종의 제형일 수 있다. 더욱이, 상기의 약제학적 조성물에 하나 이상의 형태의 약이 결합될 수 있다.
다른 면 있어서, 본 발명은 간암을 치료 또는 예방하기 위해 화학요법제와 병용하여 사용하기 위한, 유효성분으로서 항-글리피칸 3 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 항-글리피칸 3 항체를 유효성분으로서 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 화학요법제와 병용하여 사용될 때, 화학요법제와 동시에 투여될 수 있고, 화학요법제의 투여 전 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 항-글리피칸 3 항체가 화학요법제의 투여 전 또는 투여 후에 투여되는 경우에는, 개체에서의 상기 화학요법제의 잔류 농도를 측정하여 투여 시기를 최적화할 수 있다. 상기 농도는 개체로부터 채취된 시료를 각종의 크로마토그래피 등의 분리 장치를 이용하여 당업자에게 공지의 분석 방법을 기초하여 측정할 수 있다.
또 다른 면에 있어서, 본 발명은 간암을 치료 또는 예방하기 위해 항-글리피칸 3 항체와 병용하여 사용하기 위한, 유효성분으로 화학요법제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 화학요법제를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 항-글리피칸 3 항체와 병용하여 사용될 때, 항-글리피칸 3 항체와 동시에 투여될 수 있고, 항-글리피칸 3 항체의 투여 전 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 항-글리피칸 3 항체의 투여 전 또는 투여 후에 화학요법제가 투여되는 경우에는, 개체의 상기 항-글리피칸 3 항체의 잔류 농도를 측정하여 투여 시기를 최적화할 수 있다. 상기 농도는 개체로부터 채취된 시료를 하기의 효소면역측정법 같은 주지의 면역학적 측정법으로 당업자가 결정할 수 있다.
화학요법제
본 발명에 사용되는 화학요법제는 암의 화학요법에 사용되거나 유용함이 시사된 모든 화학요법제를 포함한다. 상기 화학요법제는 국소 주사되거나, 전신 투여될 수도 있다. 국소 주사될 때, 주입은 당업자가 잘 알려진 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 경도관 동맥 색전술 (TAE)에서는, 종양에의 영양 공급 경로가 되는 간동맥에 오일계 조영제 리피오돌과 항암제, 폐색 물질 (젤폼)의 혼합물을 주입하여 영양 동맥이 폐색되는 것에 의해 선택적으로 간세포 암의 괴사가 유도된다. 반면, 전신 화학요법에 있어서는, 플루오로우라실 (5-FU), 우라실-테가푸르 (UFT), 미토마이신 C (MMC), 미톡산트론 (DHAD), 아드리아마이신 (ADR) (다른 이름으로서 독소루비신 (DXR)), 에피루비신 (EPI) 또는 시스플라틴 (CDDP)등이 단독으로 사용되거나, 인터페론 (IFN)과 병용된다. 더욱이 라파티닙 등의 키나아제를 저해하는 작용기전을 갖는 화학요법제도 본 발명에서 화학요법제로서 바람직하게 사용된다. 또한 키나아제를 저해하는 작용기전을 갖는 소라페니브도 본 발명 화학요법제로서 바람직하게 사용된다. 작용기전에 상관없이, 본 발명에서 바람직하게 사용되는 화학요법제는 간암에 걸린 개체에 투여시, 상기 개체에서 설사 또는 변비, 빈혈, 면역억제 (이로써 감염 또는 치명적인 패혈증을 일으킬 수 있는 정도), 출혈, 심독성, 간독성, 신독성, 식욕 부진 및 체중 감소 등의 화학요법제 고유의 부작용을 가져오는 것을 포함한다.
소라페니브 (4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카르바모일아미노]페녹시]-N-메틸피리딘-2-카르복사미드)는 분자량 464.7인 경구 활성형의 저분자량 화합물이다. 소라페니브 토실레이트 (BAY43-9006), 그들의 토실산(톨루엔술폰산) 염은 간암에 대한 전신 화학요법으로 사용되는 치료제로서 유럽 및 미국에서 승인되었다. 소라페니브와 더불어 간암의 임상 시험에 있어서 간암에 대한 항종양 활성을 보인 수니티닙 (SU11248)도 본 발명에 사용되는 화학요법제로서 사용될 수 있다. 소라페니브 또는 수니티닙은 약제학적으로 허용가능한 그들의 염으로서도 바람직하게 사용된다. 상기 염의 적합한 예시로서, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로아이오다이드, 설페이트 및 포스페이트 같은 무기산 염; 메탄술포네이트, 벤젠술포네이트 및 톨루엔술포네이트 같은 술폰산염; 포르메이트, 아세테이트, 옥살레이트, 말레에이트, 퓨마레이트, 시트레이트, 말레이트, 숙시네이트, 말로네이트, 글루코네이트, 만델레이트, 벤조에이트, 살리실레이트, 플루오로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 타르트레이트, 프로피오네이트 및 글루타레이트 같은 카르복실산 염; 리튬염, 소듐염, 포타슘염, 세슘염 및 루비듐염 같은 알칼리금속염; 마그네슘염 및 칼슘염 같은 알칼리토금속염; 암모늄염, 알킬암모늄염, 디알킬암모늄염, 트리알킬암모늄염 및 테트라알킬암모늄염 같은 암모늄염을 포함한다. 이 중에서도 토실산 (톨루엔술폰산) 염인 BAY43-9006이 특히 바람직하게 사용된다.
경구 또는 비경구 투여 경로 어느 것이라도 화학요법제에 바람직하게 사용될 수 있지만, 경구투여의 사용이 바람직하다. 경구투여에 사용되는 제형은 액상 제제, 산제, 과립제, 정제, 장용제 및 캡슐제 같은 제형으로부터 적절히 선택될 수 있다. 이러한 제형을 갖는 화학요법제는 당업자에게 공지된 방법으로 제제화된다. 예를 들면, 제제화는 멸균수나 생리식염수, 식물성 기름, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향료, 부형제, 비히클, 방부제 및 결합제 같은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 용매와 밀접한 혼합물의 일반적으로 허용되는 약제학적 관행에서 요구되는 단위 용량 형태로의 적절한 혼합, 뒤이어 동결 건조, 타정 및 기타 제제-형성 작업에 의해 수행된다.
화학요법제는 물 혹은 그외의 약제학적으로 허용가능한 액체 중의 무균성 용액 또는 현탁액과 같이, 주사제의 형태로 비경구적으로도 사용될 수 있다. 이러한 제제에서의 유효성분량은 정해진 범위 내에서 적당한 용량을 투여할 수 있도록 적당하게 선택된다. 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제 관행에 따라서 처방될 수 있다. 예시적인 주사용의 수용액은 생리식염수, 포도당 및 D-소르비톨, D-마노스, D-만니톨 및 소듐 클로라이드 같은 그 외의 보조제를 포함하는 등장액; 알코올 (예를 들면, 에탄올, 프로필렌글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 같은 폴리올, 폴리소르베이트 80TM 및 HCO-50 같은 비이온 성계면활성제) 같은 적당한 용해보조제의 병용을 포함한다.
유성 액체로서는 참깨유, 대두유가 예시되고, 용해 보조제로서 벤질 벤조에이트와 벤질 알코올 같은 수용성 보조제와 병용할 수 있다. 더욱이, 완충제 (예를 들면, 포스페이트 완충제, 소듐 아세테이트 완충제), 무통화제 (예를 들면, 프로카인 하이드로클로라이드), 안정제 (예를 들면, 벤질 알코올, 페놀) 및 산화 방지제와 적절히 제제화될 수 있다.
치료용 항체
간암 세포에서 발현되는 단백질과 결합하고 이와 같은 세포에 대해 세포독성을 발휘할 수 있는 항체는 본 발명 약제학적 조성물에 있어서 사용되는 치료용 항체로서 사용될 수 있다. 항체의 표적 분자로서 바람직한 상기 단백질은 간암 세포의 세포 표면에 발현해 있는 단백질이다. 항체 치료 효과가 얻어지는 관점에 있어서, 표적 분자가 세포 표면에 발현해 있는 수가 많은 것이 좋지만, 상기 효과는 반드시 분자수에 의존하는 것은 아니다. 정상 세포에서의 발현과의 비교에 있어서 암 세포에 특이적으로 발현된 분자를 표적으로서 선택하는 것이 바람직하다. 그와 같은 단백질의 바람직한 예로서 글리피칸 3을 들 수 있다.
글리피칸 3은 세포 표면상에 존재하는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 패밀리 중의 하나이다. 글리피칸 3이 발생에서의 세포분열이나, 암 세포 증식에 관여될 가능성이 있다는 것이 시사되고 있지만, 그 기능은 아직 잘 해명되어 있지 않다. 글리피칸 3에 결합하는 특정 유형의 항체가, 항원 의존성 세포독성 (이하 "ADCC 활성"으로 축약) 및 보체-의존성 세포독성에 의해 (이하 "CDC 활성"으로 축약) 세포 증식 억제 작용을 갖는다는 것이 발견되었다 (WO2003/000883). 또 특정의 에피토프에 결합하는 GC33 항체가 간암 세포에 대해 보다 강한 ADCC 활성 및 CDC 활성을 발휘하는 것이 알려져 있다 (WO2006/006693). 바람직하기는, 항-글리피칸 3 항체는 본 발명의 간암 치료제로 사용될 수 있다. 바람직한 항-글리피칸 3 항체의 예는 GC33 항체이다 (WO2006/006693). GC33 항체의 H 사슬 및 L 사슬 가변영역의 아미노산 서열을 각각 SEQ ID NO: 1 및 2에 기재한다.
항-글리피칸 3 항체는 공지의 방법을 기초하여 하이브리도마로부터 얻을 수 있다 (WO2006/006693). 선택적으로, 항-글리피칸 3 항체는 유전공학에 의해 제작될 수 있다. 예를 들면, 재조합 항체는 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고, 유전자를 적절한 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주에 도입하는 것을 포함하는 유전자 재조합 기술을 사용하여 만들어질 수 있다 (예를 들면, Vandamme, A.M. et al., Eur. J. Biochem., 192, 76 7-75 (1990) 참조). 구체적으로, 항-글리피칸 3 항체를 생산하는 하이브리도마로부터, 항-글리피칸 3 항체의 가변 (V)영역을 코딩하는 mRNA를 분리한다. mRNA의 분리는 구아니딘 초원심분리법 (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry 18, 5294-5299 (1979)), AGPC법 (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987))과 같은 잘 알려진 방법을 통해 하이브리도마 세포로부터 수행된 후에, mRNA 정제 키트 (Pharmacia로부터 구입 가능) 등을 사용하여 표적 mRNA를 제작한다. 선택적으로, QuickPrep mRNA 정제 키트 (Pharmacia)를 사용하여 하이브리도마로부터 mRNA를 직접 제조할 수 있다.
역전사 효소를 사용하여, 얻어진 mRNA부터 항체 V 영역의 cDNA가 합성된다. cDNA의 합성은, 예를 들면, AMV 역전사제 제1-가닥 cDNA 합성 키트 (Seikagaku Corporation으로부터 구입 가능)를 사용하여 수행될 수 있다. 선택적으로, 예를 들면, 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) 및 cDNA의 합성과 증폭을 위해 PCR을 이용하는 5'-RACE법 (Frohman, M. A. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85, 8998-9002 (1988), Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932 (1989))으로 구성된 방법이 바람직하게 사용된다. 이러한 cDNA의 합성 과정에서, cDNA의 양 말단에는 하기의 적절한 제한 효소 부위가 도입된다. 얻어진 cDNA의 서열을 확인한 후, 표적 항-글리피칸 3 항체의 V 영역을 코딩하는 cDNA는 바람직한 항체의 불변영역 (C 영역)이 C 영역을 코딩하는 DNA와 프레임에 맞게 융합되도록 하는 발현 벡터로 삽입된다.
본 발명에 사용되는 항-글리피칸 3 항체를 제조하기 위하여, 항체 유전자의 발현을 제어하는 영역, 예를 들면, 인핸서 및 프로모터가 발현 벡터에 통합된다. 그리고나서 상기 숙주 세포는 항-글리피칸 3 항체를 코딩하는 DNA를 발현하는 재조합 세포를 얻기 위해 발현 벡터을 사용하여 형질 전환된다.
항체 유전자의 발현은 항체 중사슬 (H 사슬) 또는 경사슬 (L 사슬)를 코딩하는 DNA를 개별적으로 발현 벡터에 삽입하여 숙주 세포를 동시 형질전환시킬 수도 있고, 혹은 H 사슬 및 L 사슬를 코딩하는 DNA를 단일의 발현 벡터에 삽입하여 숙주 세포를 형질전환시킬 수도 있다 (WO1994/011523).
항체 유전자를 일단 분리하고 적당한 숙주에 도입해 항체를 제작하는 경우에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합물을 사용하는 것이 바람직하다. 진핵 세포를 숙주로 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진균세포가 바람직하게 사용된다. 동물 세포로서는, CHO, COS, 미엘로마, 소아 햄스터 신장 (BHK), Hela 및 Vero 같은 포유류 세포 (1); 아프리카발톱개구리 (개구리속) 난모세포 같은 양서류 세포 (2); 및 sf9, sf21, Tn5 같은 곤충 세포 (3)가 포함된다. 식물 세포의 예는 담배 같은 Nicotiana 속 유래 세포가 포함되고, 이것들은 예를 들면, 캘러스 배양된다. 진균세포의 예시로는 사카로마이세스 (예를 들면, Saccharomyces serevisiae)속의 일종인 효모, 아스퍼질러스 (예를 들면, Aspergillus niger)속의 일종인 사상버섯이 포함된다. 원핵 세포를 사용하는 경우, 박테리아 세포를 사용하는 생산계를 사용하는 것이 바람직하다. 예시되는 박테리아 세포에는 Escherichia . coli, Bacillus subtilis가 포함된다. 표적 항체 유전자를 포함하는 발현벡터는 상기 세포에 형질 전환에 의해 도입하고 형질 전환된 세포는 생체 외 (in vitro)에서 배양된다. 목적 항체를 상기 형질 전환된 세포를 배양한 것으로부터 얻을 수 있다.
재조합형 항체의 생산을 위해 상기 숙주 세포뿐 아니라, 형질 전환 동물 역시 바람직하게 사용될 수 있다. 예를 들면, 항체 유전자는 유즙 중에서 우선적으로 생산되는 단백질 (예를 들면, 염소 β-카세인)을 코딩하는 유전자의 내부에 프레임에 맞게 삽입되어 융합 유전자로 구축될 수 있다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편이 염소의 배아에 주입되고, 상기 배아를 암컷의 염소에 착상시킨다. 배를 수용한 염소에게서 생기는 형질 전환 염소 또는 그 자손이 생산하는 유즙으로부터 목적하는 항체가 취득될 수 있다. 또 형질 전환 염소에게서 생산되는 목적하는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해서, 형질 전환 염소에 호르몬이 적당하게 사용될 수 있다 (Ebert, K.M. et al., Bio / Technology 12, 699-702 (1994)).
본 발명에서, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키기 위해 인위적으로 변환한 키메릭 항체 및 인간화 항체 같은 유전자 재조합 항체가 사용될 수 있다. 이러한 변환 항체는 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 키메릭 항체는 마우스 항체 같은 인간 이외의 포유 동물의 중사슬 및 경사슬의 가변영역과 인간 항체의 중사슬, 경사슬의 정상 영역으로 이루어지는 항체이다. 이러한 키메릭 항체는 마우스 항체의 가변영역을 코딩하는 DNA를 인간 항체의 정상 영역을 코딩하는 DNA와 연결시키고, 이것을 적당한 숙주로 발현시켜 얻어질 수 있다. 인간화 항체의 바람직한 예는 hGC33 항체 (WO2006/006693)이다. hGC33 항체의 H 사슬 및 L 사슬 가변영역의 아미노산 서열을 각각 SEQ ID NO: 3 및 4에 나타낸다.
인간 항체의 C 영역은 키메릭 항체 및 인간화 항체의 불변영역에서 사용된다. 예를 들면 H 사슬로서는, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4가, L 사슬로서는 Cκ 및 Cλ가 사용될 수 있다. 이러한 서열은 잘 알려져 있다. 상기 항체 또는 그 생산의 안정성을 개선하기 위해, 상기 인간 항체의 C 영역이 변환될 수 있다.
키메릭 항체는 인간 이외의 포유 동물 유래 항체의 V 영역과 인간 항체 유래 C 영역으로 구성된다. 한편, 인간화 항체는 인간 이외의 포유 동물 유래 항체의 상보성 결정 영역 (CDR), 인간 항체 유래 구조 형성 영역 (FR; framework region) 및 인간 항체 유래 C 영역으로 구성된다. 인간화 항체는 인간 체내에서 낮은 항원성을 갖을 것이기 때문에, 본 발명 치료제의 유효 성분으로서 유용하다.
인간화 항체는, 재구성 (reshaped) 인간 항체라고도 칭해지고, 인간 이외의 포유 동물, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 인간 항체의 CDR과 바꿔 얻을 수 있다. 이러한 대체를 위한 일반적인 유전자 재조합법은 잘 알려져 있다. 구체적으로는, DNA 서열은 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 FR을 프레임에 맞게 융합되도록 설계되고, 말단부에서 오버랩하는 부분을 갖도록 설계된 수 개의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하는 PCR법으로 합성되었다. 상기한 바와 같이 얻어진 DNA와 인간 항체 C 영역을 코딩하는 DNA를 프레임에 맞게 융합하여 발현 벡터 내로 삽입하고, 적당한 숙주 세포에 발현시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다 (EP239400, WO 96/002576 참조).
인간화 항체의 제작에 사용되는 인간 항체 유래 FR 영역은 상기 FR과 연결하였을 때 상기 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하도록 선택된다. 상기와 같이 제작된 인간화 항체의 항원에의 결합 활성이 정성적 또는 정량적으로 측정되고, 평가되며, 인간 항체의 FR이 바람직하게 선택될 수 있다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하기 위해 상기 항체의 V 영역 중의 FR의 아미노산이 치환될 수 있다. 앞에서 말한 아미노산 치환은 통상의 PCR법으로 용이하게 도입된다. 아미노산을 치환한 변이형 항체의 항원에의 결합 활성을 측정, 평가하는 것에 의해, 목적하는 성질을 갖는 변환 FR서열이 선택된다 (Sato, K. et al.: Cancer Res. 53, 851-856 (1993)).
또 인간 항체의 취득 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 인간 림프구를 생체 외에서 표적 항원 또는 표적 항원을 발현하는 세포로 감작시키고, 그리고나서 감작림프구와 U266 (일본특허공개 제H1-59878 참조) 같은 인간 미엘로마 세포와 융합하여 항원에의 결합 활성을 갖는 목적하는 인간 항체를 얻을 수 있다. 선택적으로 원하는 인간 항체는 인간 항체 유전자의 모든 레파토리 (repetoire)를 갖는 형질 전환 동물을 원하는 항원으로 면역화하여 얻을 수 있다 (국제공개 WO1993/012227, WO1992/03918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조). 이에 더하여, 인간 항체 라이브러리를 사용하고, 패닝 (panning)에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 단일사슬 항체 (scFv)로서 인간 항체의 V 영역을 세균 디스플레이법에 의해 세균의 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 것이 가능하다. 상기 항원에 결합하는 인간 항체의 V 영역을 코딩하는 DNA서열은 선택된 파아지의 유전자를 해석하는 것에 의해 결정될 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA서열이 결정되고 상기 V 영역 서열은 목적하는 인간 항체의 C 영역의 서열과 프레임에 맞게 융합된다. 융합 단백질을 적당한 세포에서 발현시켜 인간 항체를 취득할 수 있다. 이러한 방법은 이미 당해 분야에서 널리 알려져 있고, 국제공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388을 참고하여 실시될 수 있다.
상기와 같이 구축된 항체 유전자는 공지의 방법에 의해 발현되고 단리될 수 있다. 포유류 세포가 사용되는 경우, 상기 항체 유전자는 상용되는 프로모터, 발현되는 항체 유전자 및 3' 다운스트림에서의 폴리A 시그널이 기능적으로 결합되는 것에 의해 발현될 수 있다. 프로모터/인핸서의 바람직한 예는 인간 거대세포 바이러스 즉시 조기 프로모터/인핸서 (human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 들 수 있다. 그 외에 유용한 프로모터/인핸서로서는 레트로바이러스, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 시미안바이러스 40 (simian virus; SV40)등의 바이러스 프로모터/인핸서 및 인간 신장 인자 1α (HEF1α)를 포함한다.
SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우는 Mulligan 등의 방법 (Nature 277, 108 (1979))으로 용이하게 유전자 발현을 실시할 수 있다. HEF1α프로모터/인핸서를 사용하는 경우는 Mizushima 등의 방법 (Nucleic Acids Res. 18, 5322(1990))에 의해 용이하게 유전자 발현을 수행할 수 있다.
대장균을 사용하는 경우, 상기 유전자는 상용되는 프로모터, 항체 분비를 위한 신호서열 및 발현시키는 항체 유전자가 기능적으로 결합되는 것에 의해 발현될 수 있다. 상기 프로모터로서의 바람직한 예는 lacZ 프로모터, araB 프로모터를 포함한다. lacZ 프로모터를 사용하는 경우는 Ward등의 방법 (Nature 341, 544-546 (1989); FASEBJ. 6, 2422-2427 (1992))에 의해 상기 유전자가 발현된다. araB 프로모터를 사용하는 경우는 Better등의 방법 (Science 240, 1041-1043 (1988))에 의해 상기 유전자가 발현된다.
상기 항체가 대장균의 주변세포질에서 생산되는 경우에는, 항체 분비를 위한 신호서열로서 pelB 신호서열 (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. 169, 4379 (1987))이 사용될 수 있다. 주변세포질에서 생산된 항체가 분리된 후, 요소나 구아니딘 하이드로클로라이드의 같은 단백질 변성제를 사용하는 것에 의해 상기 항체의 구조가 재구성되어 표적의 결합 활성을 갖게 된다.
발현 벡터에 삽입될 복제의 기원은 바람직하기는 예를 들면, SV40, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 소 파필로마바이러스 (BPV)로부터 선택된다. 또한, 숙주 세포계에서 유전자 사본의 수를 증폭시키기 위해, 바람직하기는 아미노글리코사이드 트랜스퍼라아제 (APH)유전자, 티미딘 키나아제 (TK)유전자, 대장균 (E. coli) 잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (Ecogpt)유전자 또는 디하이드로폴레이트 리덕타아제 (dhfr)유전자가 선택 마커로서 발현 벡터에 삽입될 수 있다.
본 발명의 항체를 제조하기 위해, 진핵 세포 또는 원핵 세포계 같은 임의의 발현계가 사용될 수 있다. 진핵 세포의 바람직한 예에는 확립된 포유류 세포계, 곤충 세포계 등의 동물 세포뿐 아니라 사상 진균세포 및 효모 세포가 포함된다. 원핵 세포의 바람직한 예에는 대장균 세포 등의 박테리아 세포가 포함된다. 본 발명으로 사용되는 항체는 바람직하기는 포유류 세포, 예를 들면 CHO, COS, 미엘로마, BHK, Vero, Hela 세포를 사용하여 발현된다.
그 다음, 형질 전환된 숙주 세포가 표적 항체를 생산하기 위해 생체 외 또는 생체 내에서 배양된다. 숙주 세포의 배양은 잘 알려진 방법에 따라, 예를 들면, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM 배양액을 사용하여 수행한다. 태내 송아지 혈청 (FCS) 같은 혈청 보조액이 병용될 수 있다.
상기 발현 및 생산된 항체는 단백질의 정제에 통상적으로 사용되는 공지의 방법들의 단독 또는 결합 사용하여 정제될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체는 단백질 A 컬럼과 같은 친화성 컬럼, 크로마토그래피 컬럼, 정제, 한외여과, 염석, 투석등을 적당히 선택, 조합하여 분리 및 정제될 수 있다 (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)).
본 발명에 있어 수정된 당사슬을 갖는 항체도 바람직하게 사용될 수 있다. 항체의 당사슬을 수정함으로써 항체의 ADCC 활성이 향상될 수 있고, 이것은 아래에 상세히 기술될 것이다. 항체가 결합하는 항원의 간암 세포에서의 발현이 ADCC 활성을 강력하게 발휘할 수 있는 정도로 높지 않은 경우에는 수정된 당사슬을 갖는 항체가 유용하게 사용된다. 당사슬이 수정된 항체는 예를 들면, 당화된 항체 (예. WO1999/54342), 당사슬에 부가된 푸코스가 결손된 항체 (예. WO2000/061739, WO2002/031140), 바이섹팅 GlcNAc를 가진 당사슬을 갖는 항체 (WO2002/079255)가 알려져 있다.
항체의 표적 (즉, 항원)에 대한 결합은 공지의 방법을 통해 바람직하게 평가될 수 있다. 구체적으로는, 항원을 발현해 있는 세포에 대한 항체의 결합 활성을 측정하는 방법은 세포를 항원으로써 사용하는 효소면역측정법 또는 FACS (fluorescence activated cell sorting)에 기초하여 Antibodies : A Laboratory Manual, Ed Harlow, David Lane (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)의 359-420페이지에 기재되어 있는 방법으로 측정될 수 있다. 효소면역측정법 방식에서, 세포에 대한 항체의 결합 활성은 효소 반응에 의해 생성되는 신호 강도를 비교하여 정량적으로 평가된다. 구체적으로, 피험 항체를 항원-발현 세포를 고정한 효소면역측정법 플레이트에 더하고, 세포에 결합한 항체는 피험 항체를 인식할 수 있는 효소-표식된 이차 항체를 이용해 검출된다. 반면, FACS에서는 피험 항체의 희석 시리즈를 준비하여 항원-발현 세포에 대한 항체 역가를 판단함으로써 결합 활성을 비교할 수 있다.
FACS 방식에 있어서는, 효소면역측정법 플레이트 같은 캐리어에 세포를 결합하여 사용하는 대신에 현탁액에서 세포 표면상에 발현해 있는 항원과 항체와의 결합을 측정한다. FACS 방식에 의한 측정에 사용하는 플로우 사이트 미터에는 FACSCantoTM II, FACSAriaTM, FACSArrayTM, FACSVantageTM SE, FACSCaliburTM (모두 BD Biosciences)뿐만 아니라, EPICS ALTRA HyPerSort, Cytomics FC 500, EPICS XL-MCL ADC, EPICS XL ADC, Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC (모두 Beckman Coulter 사 제품)를 포함한다.
피검 항체의 항원에 대한 결합 활성에 관한 바람직한 측정 방법에서, 항원을 발현하는 세포와 피검 항체를 반응시키고, 피검 항체를 인식할 수 있는 FITC-표식된 2차 항체로 염색하고, 그리고나서 FACSCalibur (BD)로 결합 활성을 측정하고 형광 강도를 CELL QUEST Software (BD)를 사용하여 측정한다. 본 방법은 피검 항체를 사용하여 얻어지는 기하평균값 (피검 기하평균값)을 대조 항체를 사용하여 얻어지는 대조 기하평균값과 비교하는 것으로 피검 항체의 결합 활성을 판정한다. 기하평균값 (Geometric Mean)의 계산식은 CELL QUEST Software 사용자 지침서(BD biosciences)에 기재되어 있다.
GC33 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있는 항체는 본 발명의 항체로서 바람직하게 사용된다. 본 발명의 항체의 에피토프에 대한 결합 활성은 상기 FACS 또는 효소면역측정법으로 평가될 수 있다. 피험 항체가 GC33 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는지 즉, GC33 항체와 에피토프를 공유하는지 여부를 평가하기 위해, 동일한 에피토프에 대한 두 항체 사이의 경합을 측정할 수 있다. 본 발명에서, 항체 간의 경합은 예를 들면, FACS 또는 교차-차단 분석법에 의해 검출될 수 있다. FACS에서 상기 GC33 항체를 GPC3발현 세포에 결합시켜 형광 시그널을 측정한다. 다음으로, 후보의 경합 항체가 반응되고, 그리고나서 GC33 항체가 같은 세포와 반응되고, 상기 신호는 FACS에 의해 비슷하게 분석된다. 또는, 상기 GC33 항체와 피험 경합 항체가 동시에 같은 세포에 반응될 수 있다. 경합 항체의 존재하에 GC33 항체에 대한 FACS의 분석 패턴이 변화하면, 경합 항체가 GC33 항체와 같은 에피토프를 인식한다는 것을 말한다. 교차-차단 분석법은 본 명세서에 구체적으로 기재된 방법 또는 예를 들면, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow 및 David Lane (1988)등에 기재된 공지의 방법으로 수행될 수 있다.
예를 들면 경합 효소면역측정법 분석은 바람직하기는 교차-차단 분석이다. 교차-차단 분석에서, GPC3 단백질이 발현된 세포는 마이크로 플레이트의 웰에 고정되고, 후보 경합 항체의 존재 또는 비존재하에 상기 웰을 프리인큐베이션 하고, 그리고나서 상기 웰에 GC33 항체를 첨가한다. 상기 웰에서 GPC3 단백질 발현 세포에 결합하는 GC33 항체의 양은 동일한 에피토프에의 결합에 있어 경합하는 후보 경합 항체 (피험 항체)의 결합능과 역상관 관계에 있다. 즉 동일 에피토프에 대한 피험 항체의 친화성이 커질수록, GC33 항체의 GPC3 단백질 발현 세포를 고정한 웰에 결합하는 GC33 항체의 결합량은 저하된다. 또는, 반대로, 동일 에피토프에 대한 피험 항체의 친화성이 커질수록, GPC3 단백질 발현 세포를 고정한 웰에 대한 피험 항체의 결합량은 증가한다.
웰에 결합하는 항체량은 미리 표식해 놓은 항체에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 예를 들면, 비오틴-표식 항체는 아비딘 퍼옥시다아제 접합체 및 적절한 기질을 사용하여 측정될 수 있다. 특히, 퍼옥시다아제 등을 가지고 효소 표식을 사용하는 교차-차단 분석은 "경합적 효소면역측정법 분석"이라고 한다. 상기 항체는 검출 혹은 측정이 가능한 다른 표식 물질, 예를 들면, 방사 표식 혹은 형광 표식으로서 적당하게 표식 될 수 있다.
더욱이, 피험 항체가 GC33 항체와 다른 종에서 유래하는 정상 영역을 갖는 경우에는 종에 유래하는 정상 영역을 특이적으로 인식하는 표식 항체를 사용하여 웰에 결합하는 항체가 측정될 수 있다. 동종 유래 항체라도 클래스가 상이한 경우에는, 웰에 결합한 항체는 바람직하기는 각각의 클래스를 특이적으로 식별하는 항체에 의해 측정될 수 있다.
후보 경합 항체가 존재하지 않는 상태에서 실시되는 대조 시험에서 얻어지는 결합 활성과 비교하여, 후보 항체가 GC33 항체의 결합을 적어도 20%, 바람직하기는 적어도 20-50%, 더 바람직하기는 적어도 50% 차단할 수 있다면, 상기 후보 경합 항체는 GC33 항체와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하는 또는 동일한 에피토프에 결합하도록 경합하는 항체이다.
GC33 항체와 실질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 동일한 에피토프에 대한 결합에 경합하는 항체는 통상적으로 상기 교차-차단 분석에 의하거나 다른 방법들에 의해 선택된다. 바람직한 예시는:
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 갖는 H 사슬 가변영역;
SEQ ID NO: 9~23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 갖는 L 사슬 가변영역을 포함하는 항체, 또는
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO: 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 갖는 H 사슬 가변영역;
SEQ ID NO: 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 갖는 L 사슬 가변영역을 포함하는 항체, 또는,
SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO: 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 갖는 H 사슬 가변영역;
SEQ ID NO: 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 갖는 L 사슬 가변영역을 포함하는 항체를 포함하지만, 이로써 제한되지는 않는다. 도 8 및 도 9는 본 발명에서 바람직하게 사용될 수 있는 예시적인 인간화 항체의 H 사슬 및 L 사슬 가변영역 및 각 CDR의 아미노산 서열을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 항체는 세포 독성을 가진다. 여기에서 사용되는, "세포 독성"은 항체가 그 대응하는 항원이 발현되어 있는 표적 세포에 대해서 손상을 일으키는 활성을 의미한다. 항원 항체 복합체가 항원의 특성으로 인해, 세포내에 내재화 (internalized) 되지 않는 경우에는, 항체에 의해 발휘되는 세포 독성의 바람직한 예시는 항체-의존성 세포 독성 (Antibody-dependent cellular cytotoxicity; "ADCCc 활성") 및 보체-의존성 세포 독성("CDC 활성")을 포함한다. 반면에, 항원 항체 복합체가 항원의 특성으로 인해 세포 내에 내재화되는 경우에는, 항체와 항체에 부착된 화학요법제, 방사성 동위원소, 또는 독성 물질로 구성되는 접합체 항체가 바람직하게 사용된다. 이 경우에, 항체의 세포 독성은 접합체 항체에 결합 된 화학요법제, 방사성 동위원소, 또는 독성 물질에 의해 발휘된다.
본 발명에서 사용되는 항체가 ADCC 활성을 발휘하는지 및 CDC 활성을 발휘하는지 측정하기 위해, 공지의 방법을 적절히 사용할 수 있다 (예를 들면, Current Protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.; 1993)).
우선, 이펙터 세포, 보체 용액 및 표적 세포를 다음 과정에 따라 제조한다.
(1) 이펙터 세포의 제조
CBA/N마우스 등에서 비장을 적출하고, RPMI1640 배지 (Invitrogen)에서 비장 세포를 단리한다. 10% 소 태아 혈청 (FBS; HyClone)을 포함하는 동일 배지로 세척 한 후, 세포 농도를 5×106/mL로 조정하여 이펙터 세포를 제조할 수 있다.
(2) 보체 용액의 제조
유아 토끼 보체 (CEDARLANE)를 10% FBS함유 배지 (Invitrogen)에서 10배 희석하여 보체 용액을 제조할 수 있다.
(3)표적 세포의 제조
표적 세포를 방사성 표식하기 위해 항원-발현 세포를 0.2 mCi의 51Cr-소듐 크로메이트 (GE Healthcare Bio-Science)와 함께 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지 중에서 37℃에서 1시간 배양한다. 본 발명에 사용할 수 있는 항원-발현 세포의 바람직한 예는 항원을 코딩하는 유전자에 형질 전환된 세포, 초기 간세포 암 세포, 전이성 간세포 암 세포를 포함한다. 방사성 표식 후, 세포를 10% FBS 함유 RPMI1640 배지에서 3회 세척하고 세포 농도를 2×105세포/mL로 조정하여 표적 세포를 제조한다.
ADCC 활성 및 CDC 활성은 하기의 방법으로 측정될 수 있다. ADCC 활성 측정시, 96웰 U자형 바닥 플레이트 (Becton Dickinson)에 표적 세포와 본 발명에 따른 항체를 한 웰당 50 ㎕씩 첨가하고, 얼음 중에서 15분간 반응시킨다. 그 다음, 이펙터 세포를 한 웰당 100 ㎕씩 첨가한다. 플레이트를 이산화탄소 배양기 내에서 4시간 동안 배양한다. 항체의 최종 농도는 0 또는 10 μg/mL로 설정되지만, 상기 항체의 활성에 기초해 적절히 조정한다. 배양 후, 한 웰당 상징액 100 ㎕를 회수하여, 감마 카운터 (COBRAII AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company)로 방사 활성을 측정한다. 얻어진 방사 활성의 값을 식 (A-C)/(B-C)×100 식을 따라 세포 독성 (%)을 계산하고, 상기 A는 상기 샘플의 방사 활성 (cpm), B는 1% NP-40 (Nacalai Tesque)가 더해진 경우의 샘플의 방사 활성 (cpm), C는 표적 세포만을 포함하는 샘플의 방사 활성 (cpm)을 나타낸다.
CDC 활성의 측정시, 96웰 U자형 바닥 플레이트 (Becton Dickinson)에 표적 세포와 본 발명에 따른 항체를 한 웰당 50 ㎕씩 첨가하고, 얼음 중에서 15분간 반응시킨다. 그 다음, 보체 용액을 한 웰당 100 ㎕씩 첨가한다. 플레이트는 이산화탄소 배양기 내에서 4시간 동안 배양한다. 항체의 최종 농도는 0 또는 3 μg/mL로 설정되지만, 상기 항체의 활성에 기초해 적당하게 조정된다. 배양 이후에, 한 웰당 상징액 100 ㎕를 회수하여, 감마 카운터로 방사 활성을 측정한다. 세포 독성은 ADCC 활성의 측정시 사용된 방법과 동일하게 계산될 수 있다.
컨쥬게이트된 항체에 의해 나타나는 세포 독성은 바람직하게는 항체 컨쥬게이트에 결합된 화학요법제, 방사성 동위원소, 또는 독성 물질이 발휘하는 세포 독성을 측정하는 것으로 평가될 수 있다. 컨쥬게이트된 항체에 결합된 화학요법제, 방사성 동위원소, 또는 독성 물질이 발휘하는 세포 독성을 측정하는 경우에는, 표적 세포와 본 발명에 따른 컨쥬게이트된 항체를 96-웰 평평한 바닥 플레이트 (Becton Dickinson)에 한 웰당 50 ㎕씩 첨가하고, 얼음 중에서 15분간 반응시킨다. 그 후, 플레이트를 이산화탄소 배양기에서 1 내지 4시간 동안 배양시킨다. 항체의 최종 농도는 0 또는 3μg/mL로 설정되지만, 상기 컨쥬게이트된 항체의 활성에 기초해 적당하게 조정된다. 배양 이후에, 한 웰당 상징액 100 ㎕를 회수하여, 감마 카운터로 방사 활성을 측정한다. 세포 독성은 ADCC 활성의 측정시 사용된 방법과 동일하게 계산될 수 있다.
본 발명의 항체에 컨쥬게이트될 수 있고 세포 독성 효과를 갖는 화학요법제의 개략적인 예시는 다음을 포함한다:
아자리빈, 아나스트로졸, 아자사이티딘, 블레오마이신, 보르데조밉, 브리오스타틴-1, 부설판, 캄포테신, 10-하이드록시캄포테신, 카르무스틴, 세레브렉스, 클로람부칠, 시스플라틴, 이리노테칸, 카르보플라틴, 클라드리빈, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다카르다진, 도세탁셀, 닥티노마이신, 다우노마이신 글루쿠로나이드, 다우노루비신, 덱사메타손, 디에틸스틸베스트롤, 독소루비신, 독소루비신 글루쿠로나이드, 에피루비신, 에티닐 에스트라디올, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 에토포사이드 글루쿠로나이드, 플록스우리딘, 플루다라빈, 플루타미아드, 플루오로우라실, 플루옥시메스테론, 젬시타빈, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 류코보린, 로무스틴, 메클로에타민, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토산트론, 미트라마이신, 미토마이신, 미토테인, 페닐부티레이트, 프레드니손, 프로카바진, 파클리탁셀, 펜토스타틴, 세무스틴, 스트렙토조신, 타목시펜, 탁산, 탁솔, 테스토스테론, 프로피오네이트, 탈리도마이드, 치오구아닌, 치오테파, 테니포사이드, 토포테칸, 우라실 머스타드, 빈블라스틴, 비노렐빈 및 빈크리스틴.
본 발명에서, 바람직한 화학요법제는 저-분자량 화학요법제이다. 저분자량 화학요법제는, 항체와 컨쥬게이트된 후 항체의 기능을 간섭할 가능성이 낮다. 본 발명에서, 저분자량 화학요법제의 분자량은 통상 100~2000, 바람직하기는 200~1000이다. 상기 예시된 화학요법제는 모두 저분자량 화학요법제이다. 본 발명에서 사용된 화학요법제는 생체 내에서 활성형 화학요법제로 변환되는 프로드럭을 포함한다. 프로드럭은 바람직하기는 효소적 변환 또는 비효소적 변환에 의해 활성화될 수 있다.
또, 상기 항체는 바람직하기는 리신 (ricin), 아부린 (abrin), 리보뉴클레아제, 온코나제 (onconase), 디엔아제 (DNase I), 스타필로코칼 엔테로톡신-A, 포크위드 (pokeweed) 항바이러스 단백질, 겔로닌 (gelonin), 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 (Pseudomonas exotoxin), 슈도모나스 내독소 (Pseudomonas endotoxin), L-아스파라기나제 및 PEG L-아스파라기나제 같은 독성 펩타이드를 사용하여 변환될 수 있다. 또 다른 면에서는, 1 또는 2 이상의 저분자 화학요법제와 독성 펩티드를 각각 조합하여 항체를 변환하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는 상기 저분자량 화학요법제와 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 컨쥬게이트될 수 있다. 화학요법제와 컨쥬게이트된 항체의 제작 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다.
이에 더하여, 단백질성 약물이나 독소는 바람직하기는 유전 공학적 방법에 의해 항체와 컨쥬게이트될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 항체를 코딩하는 DNA를 상기 독성 펩티드를 코딩하는 DNA와 융합 및 적절한 숙주 세포에 발현시키는 것에 의해 독성 펩티드와 컨쥬게이트된 상기 항체는 융합 단백질로서 바람직하게 얻어진다. 항체와의 융합 단백질은 일반적으로 단백질성 약물이나 독소가 항체의 C 말단 측에 배치되도록 고안된다. 바람직하기는 펩티드 링커가 항체와 단백질성 약물이나 독소 사이에 삽입될 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명은 화학요법제 및 항-글리피칸 3 항체의 조합물을 포함하는, 간암의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물, 그리고 상기 약제학적 조성물을 사용하여 효과적으로 간암을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 면에서, 본 발명은 화학요법제를 사용하여 간암 환자를 치료함에 있어 상기 화학요법제의 치료 효과를 향상하고 상기 화학요법제에 의한 부작용을 감소시키는데, 항-글리피칸 3 항체를 사용하는 방법을 제공한다. 여기서 사용된, "치료 효과의 향상"이란 반응 속도의 상승, 치료를 위해서 투여되는 화학요법제의 양의 감소, 및/또는 상기 화학요법제에 의한 치료 기간의 단축을 의미한다. 또 다른 면에서는, 본 발명은 간암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 항-글리피칸 3 항체의 사용방법을 제공하고, 상기 조성물은 화학요법제 및 항-글리피칸 3 항체를 유효성분으로 포함한다. 이에 더하여, 본 발명은 화학요법제 및 항-글리피칸 3 항체를 사용하는, 간암 환자의 치료 또는 예방법을 제공한다.
본 발명에서, "화학요법제 및/또는 항-글리피칸 3 항체를 유효성분으로 포함한다"는 화학요법제 및/또는 항-글리피칸 3 항체를 주요 활성성분으로서 포함한다는 의미이고, 화학요법제 및/또는 항-글리피칸 3 항체의 함유량은 특별히 제한되지 않는다. 용어 "치료"는, 본 발명의 상기 약제학적 조성물을 개체에 투여하여, 간암 세포의 사멸 또는 그 세포 수의 감소, 간암 세포의 증식 억제, 또는 간암에 기인하는 여러 가지 증상의 개선을 의미한다. 용어 "예방"은 간암 세포의 재증식으로 그 수가 증가하는 것을 방지 또는 증식이 억제된 간암 세포의 재증식을 방지하는 것을 의미한다.
본 발명의 치료용 항체는 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여가 특히 바람직하다. 투여 방법의 개략적 예시는 주사 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여를 포함한다. 주사에 의한 투여의 예는 정맥 주사, 근육 주사, 복강스캔 및 피하 주사를 포함하며 본 발명 치료용 항체는 전신 또는 국소에 투여될 수 있다. 또 투여 방법은 환자의 연령 및 증상에 따라 적당하게 선택될 수 있다. 투여량은 1회의 투여에 대해서 체중 킬로그램당 0.0001 mg 내지 1000 mg의 범위에서 선택될 수 있다. 선택적으로, 환자당 0.001 내지 100000 mg/개체의 범위에서 투여량이 선택될 수 있다. 그러나, 본 발명 치료용 항체의 용량이 상기 투여량으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 화학요법제와 항-글리피칸 3 항체와의 병용은 화학요법제와 항-글리피칸 3 항체가 함께 투여 또는 사용 (이하, 투여라고만 칭한다)되는 것을 의미하고; 투여 순번이나 투여 간격 등의 제한을 의미하는 것은 아니다. 또 본 발명 화학요법제와 항-글리피칸 3 항체는 두 성분을 둘 다 함유하는 키트로서 사용될 수도 있다. 본 발명에 따라, 상기 화학요법제와 상기 항-글리피칸 3 항체는 병용될 수 있고, 필요에 따라, 단독으로 사용되는 각각의 투여량보다 적게 사용될 수 있다.
본 발명의 화학요법제와 항-글리피칸 3 항체의 투여 순번은: 항-글리피칸 3 항체의 투여 후에 화학요법제가 투여; 화학요법제와 항-글리피칸 3 항체가 동시에 투여; 또는, 화학요법제의 투여 후에 항-글리피칸 3 항체가 투여되는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 화학요법제와 항-글리피칸 3 항체가 각각 투여되는 경우에는, 상기 화학요법제와 상기 항-글리피칸 3 항체의 투여 간격은 투여 경로나 제형을 포함하여 여러 요인을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 투여 간격은 통상적으로 0~168시간, 바람직하기는 0~72시간, 더 바람직하기는 0~24시간, 더욱 더 바람직하기는 0~12시간이다. 또 투여 경로나 제형 등의 요인의 외에, 본 발명의 상기 화학요법제와 상기 항-글리피칸 3 항체의 개체에서의 각각의 잔류 농도도 고려될 수 있다. 즉, 항-글리피칸 3 항체의 투여 전에 화학요법제가 투여되는 경우, 항-글리피칸 3 항체는 개체에서의 상기 화학요법제의 잔류 농도가 항-글리피칸 3 항체의 목적하는 효과를 얻을 수 있기에 충분한 시점에 투여될 수 있다. 상기 농도는 개체로부터 시료를 채취하고 각종의 크로마토그래피 등의 분리 장치를 이용하여 당업자에게 익숙한 방법으로 시료를 분석하여 결정할 수 있다.
반대로, 화학요법제의 투여 전에 항-글리피칸 3 항체가 먼저 투여되는 경우, 개체에서의 상기 항-글리피칸 3 항체의 잔류 농도가 화학요법제의 목적하는 효과를 얻을 수 있기에 충분한 시점에 투여될 수 있다. 상기 농도는 개체로부터 시료를 채취하고 하기의 효소면역측정법 방법 같이 당업자에게 익숙한 면역학적 측정법으로 분석하여 결정할 수 있다.
본 발명의 치료용 항체는 통상적인 방법에 따라서 제제화될 수 있는데 (예를 들면, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mack Publishing Company, Easton, U. S. A 참조), 약제학적으로 허용되는 담체나 첨가물이 모두 포함될 수 있다. 사용되는 첨가제의 예는 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕해제, 활택제, 유동성 개선제 및 풍미제 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 이에 더하여, 통상의 담체를 적절히 사용할 수 있다. 이와 같은 담체의 개략적인 예로서 침강 실리카, 락토스, 결정성 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카멜로스 칼슘, 카멜로스 소듐, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 아세탈 디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐 피롤리돈, 겔라틴, 중사슬 지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌-경화 피마자유 60, 백설탕, 카르복시메틸셀룰로오스, 옥수수 전분 및 무기염이 포함된다.
본 명세서에 있어서 인용되는 모든 특허 및 참고 문헌의 모든 내용은 전부 참조로서 여기에 병합된다.
본 발명을 하기 예에서 구체적으로 자세하게 설명하지만, 그것들은 분명히 보여주는 것일 뿐이고 발명의 제한으로 해석되지 않는다.
실시예
실시예 1
글리피칸 3 발현 인간 간암 세포주가 이식된 마우스 모델에서 항-글리피칸 3 항체와 화학요법제 (미톡산트론 또는 독소루비신 하이드로클로라이드)의 병용 효과
(1) 세포주
HuH-7 세포 (Human Science Research Resource Bank) 및 HepG2 세포 (ATCC)를 글리피칸 3을 발현하는 인간 간암 세포주로 사용하였다. HuH-7 세포를 10% FBS (BIONET)를 함유하는 둘베코 변형 이글스 배지 (SIGMA)에서 유지 및 계대배양 하였고, HepG2는 10% FBS, 1 mmol/L MEM 소듐 피루베이트 (Invitrogen) 및 1 mmol/L MEM 비-필수아미노산 (Invitrogen)을 함유하는 최소 필수 배양 이글 배지 (SIGMA)에서 유지 및 계대배양 하였다.
(2) 인간 간암 세포가 이식된 마우스 모델의 제조
각각의 세포를 각각의 세포 계대용 배지와 MATRIGEL 매트릭스 (BD Bioscience)를 동량 포함하는 용액 1ml 당 5×107개의 세포가 되도록 제조하였다. 그 다음, 세포 이식에 앞서 당일에 항-아시알로 GM1 항체 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; 한 바이알 내에 액체 5ml이 용해됨.) 100 ㎕가 복강 투여된 SCID 마우스 (5주령, 수컷;CLEA Japan, Inc.)의 복부 피하에 세포 분산액 100 ㎕를 이식하였다. 종양 체적을 아래의 식으로 계산하였고, 평균 종양 체적이 237-298 mm3가 된 시점에서 모델이 성립된 것으로 판단하였다.
종양 체적=장경×단경×단경/2
(3) 항체 및 화학요법제의 제조
마우스 항 인간 글리피칸 3 모노클로날 항체 (클론명: GC33, WO2006/006693에 기재됨)를 PBS (-)를 사용하여 0.5 mg/mL (5 mg/kg 군) 및 0.1 mg/mL (1 mg/kg 군)의 농도로 제조하였다. 독소루비신 하이드로클로라이드 (Adriacin Injection, Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 제품)를 주사용 증류수 (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)에서 10 mg/mL 농도가 되도록 용해시킨 후에, PBS (-)를 사용하여 0.5 mg/mL농도가 되도록 희석하였다. 미톡산트론 하이드로클로라이드 (Novantrone Injection; Wyeth 제품)를 생리식염수 (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.)에서 10 mg/mL 농도가 되도록 용해시킨 후, PBS (-)를 사용하여 0.1 mg/mL가 되도록 희석하였다.
(4) 화학요법제의 투여
상기 (2)에서 만들어진 인간 간암-이식 마우스 모델에서, 상기 (3)에서 제조된 항체시료 10 mL/kg을 HuH-7 세포 이종 이식 모델에 대해 이식 후 제11일로부터 시작하여, HepG2 이종 이식 모델에 대해 이식 후 제20일로부터 시작하여 각각 1주에 1회씩, 3주간 꼬리정맥에 투여하였다. 음성 대조군으로서, 여과 멸균된 10 mL/kg의 용량의 PBS (-) (Vehicle)를 매주 1회씩, 3주에 걸쳐 꼬리정맥에 투여하였다. 또 HuH-7 세포 이종 이식 모델은 이식 후 제10일에 10 mL/kg의 용량으로 상기 (3)에서 제조된 독소루비신 하이드로클로라이드 (DOX) 혹은 음성 대조군으로서 PBS (-)를 꼬리정맥에 투여하였다. 또 HepG2 세포 이종 이식 모델은 이식 후 제20일로부터 10 mL/kg의 용량으로 상기 (3)에서 제조한 미톡산트론 하이드로클로라이드 (MX) 또는, 음성 대조군로서 PBS (-)를 매주 1회씩, 3주에 걸쳐 꼬리정맥에 투여하였다. 각 군은 6마리로 구성되었다. 화학요법제의 투여에 관한 상세한 사항은 표 1 및 2에 나타내었다.
HuH-6 이종 이식 모델
군 동물수 약물 투여량(mg/kg) 투여 방법 투여일
1 6 PBS (-) -- 꼬리정맥 이식 후 제10, 제17, 제24일
PBS (-) -- 꼬리정맥 이식 후 제10일
2 6 GC33 5 꼬리정맥 이식 후 제10, 제17, 제24일
PBS (-) -- 꼬리정맥 이식 후 제10일
3 6 PBS (-) -- 꼬리정맥 이식 후 제10, 제17, 제24일
DOX 5 꼬리정맥 이식 후 제10일
4 6 GC33 5 꼬리정맥 이식 후 제10, 제17, 제24일
DOX 5 꼬리정맥 이식 후 제10일
HepG2 이종 이식 모델
군 동물수 약물 투여량( mg/kg) 투여 방법 투여일
1 6 PBS (-) -- 꼬리정맥 이식 후 제20, 제27, 제34일
PBS (-) -- 꼬리정맥 이식 후 제20, 제27, 제34일
2 6 GC33 1 꼬리정맥 이식 후 제20, 제27, 제34일
PBS (-) -- 꼬리정맥 이식 후 제20, 제27, 제34일
3 6 PBS (-) -- 꼬리정맥 이식 후 제20, 제27, 제34일
MX 1 꼬리정맥 이식 후 제20, 제27, 제34일
4 6 GC33 1 꼬리정맥 이식 후 제20, 제27, 제34일
MX 1 꼬리정맥 이식 후 제20, 제27, 제34일
(5) 항암 효과의 평가
인간 간암 이식 마우스 모델에서의 GC33 항체와 화학요법제와의 조합에 의한 항종양 효과를 최종 투여 일주일 후 종양 체적으로 평가하였다. 통계 분석은 최종 측정일의 종양 체적을 사용하여 t-test에 의해 실시하였다. 통계 분석을 위해서 SAS 전임상 패키지 (SAS Institute, Inc.)를 사용하였다. 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1A는 인간 간암 세포주 HuH-7 세포주가 이식된 마우스 모델에서 GC33 항체와 독소루비신 (DOX)을 병용 투여하였을 때의 종양 체적의 변화를 나타내는 그래프이다. 마름모꼴은 비히클을 투여한 군의 종양 체적의 변화를 의미한다. 동그라미는 GC33 항체만 투여한 군의 종양 체적의 변화를 의미한다. 삼각형은 독소루비신 (DOX)만을 투여한 군의 종양 체적의 변화를 의미한다. 별모양은 GC33 항체와 독소루비신 (DOX)를 병용 투여한 군의 종양 체적의 변화를 의미한다. 도 1B는 HepG2 세포주가 이식된 마우스 모델에서 GC33 항체와 미톡산트론 (MX)을 병용 투여한 군의 종양 체적의 변화를 나타내는 그래프이다. 마름모꼴은 비히클을 투여한 군의 종양 체적의 변화를 의미한다. 동그라미는 GC33 항체만 투여한 군의 종양 체적의 변화를 의미한다. 삼각형은 미톡산트론 (MX)만 투여한 군의 종양 체적의 변화를 의미한다. 별모양은 GC33 항체와 미톡산트론 (MX)을 병용 투여한 군의 종양 체적의 변화를 의미한다.
도 1에 나타낸 바와 같이, GC33 단독 투여군에서의 종양 증식에 비하여, GC33과 독소루비신 (DOX, 도 1A) 혹은 미톡산트론 (MX, 도 1B)과의 병용 투여군에서의 종양 증식이 유의성 있게 억제되었다.
실시예 2
글리피칸 3을 발현하는 인간 간암 세포주가 이식된 마우스 모델에 대한 항-글리피칸 3 항체 및 화학요법제 (소라페니브)의 병용 효과
6 주령의 수컷 CB-17 SCID 마우스를 CLEA Japan Inc.으로부터 구입하였다. 종양 이식 직전에, 마우스에 200μg의 항-아시알로 GM1 항체 (WAKO)를 복강 내 투여하였다. 50% 마트리겔 (Becton Dickinson)에 분산된 HepG2 세포 또는 HuH-7 세포(5×105 세포)를 피하에 이식하였다. 종양 체적이 250mm3로 달한 시점에서, 마우스를 여러 군으로 나누고, 투여를 개시하였다. 인간화 항-글리피칸 3 항체 (hGC33, WO2006/006693)를 PBS (-)에서 적절한 농도로 제조하였고, 그리고 3주간 주 1회로 정맥 내 투여하였다. 소라페니브를 Organic Process Research & Development (2002) 6, 777-781에 기재된 방법에 따라서 합성하였고, 10% 에탄올, 10% 크레모포르 EL을 포함하는 순수 (pure water)에 현탁시켜, 3주간 주 5회로 경구 투여하였다. PBS (-), 10% 에탄올 및 10% 크레모포르 EL을 포함하는 순수를 비히클 대조군으로 사용하였다. 종양 체적 V (mm3)를 실시예 1에 기재된 식으로 계산하였다. 그 결과를 도 2-4에 나타내었다.
도 2는 인간 간암 세포주 HuH-7의 세포가 이식된 마우스 모델에서 hGC33 항체 및 소라페니브의 항종양 효과를 종양 체적의 변화 (평균+표준편차)에 기초해 도시한 그래프이다. 열린 동그라미는 비히클을 투여한 군의 종양 체적의 변화를 의미한다. 닫힌 동그라미는 hGC33 항체만 5 mg/kg의 용량으로 투여한 군의 종양 체적 변화를 의미한다. 열린 정사각형은 소라페니브만 80 mg/kg의 용량으로 투여한 군의 종양 체적의 변화를 의미한다. 닫힌 정사각형은 hGC33 항체 5 mg/kg과 소라페니브 80 mg/kg를 투여한 군의 종양 체적의 변화를 의미한다. 도 3은 인간 간암 세포주 HepG2가 이식된 마우스 모델에 대한 hGC33 항체 및 소라페니브의 항종양 효과를 종양 체적의 변화 (평균+표준편차)에 기초해 도시한 그래프이다. 열린 동그라미는 비히클을 투여한 군의 종양 체적의 변화를 의미한다. 닫힌 동그라미는 hGC33 항체만 5 mg/kg의 용량으로 투여한 군의 종양 체적 변화를 의미한다. 열린 정사각형은 소라페니브만 80 mg/kg의 용량으로 투여한 군의 종양 체적 변화를 의미한다. 닫힌 정사각형은 hGC33 항체 5 mg/kg 및 소라페니브 80 mg/kg를 병용 투여한 군의 종양 체적의 변화를 의미한다. 도면 중의 별모양은 Dunnett's test에 기초하여 P 값이 P<0.05인 것을 의미한다. 도 4는 인간 간암 세포주 HepG2 세포가 이식된 마우스 모델의 체중 감소에 대한 hGC33 항체 및 소라페니브의 효과를 상기 모델의 체중 변화 (평균±표준편차)에 의해 나타낸 그래프이다. 열린 동그라미는 비히클을 투여한 군의 체중의 변화를 의미한다. 닫힌 동그라미는 hGC33 항체만 5 mg/kg의 용량으로 투여한 군의 체중 변화를 의미한다. 열린 정사각형은 소라페니브만 80 mg/kg의 용량으로 투여한 군의 체중 변화를 의미한다. 닫힌 정사각형은 hGC33 항체 5 mg/kg 및 소라페니브 80 mg/kg를 병용 투여한 군의 체중 변화를 의미한다. 도 중의 별모양은 Dunnett's test에 기초해 P값이 P<0.05인 것을 의미한다.
그 결과, 종양 증식은 HuH-7 세포 이종 이식 모델에서 hGC33 5 mg/kg의 단독투여, 또는 소라페니브 80 mg/kg의 단독 투여에 의해 억제되었다. 더욱이, 둘 다의 병용 투여시, 종양 증식은 hGC33 또는 소라페니브를 단독 투여한 경우에 비해 현저하게 억제되는 것을 관찰하였다 (도 2).
종양 증식 억제 효과는 측정의 최종일(즉, 제42일)의 종양 크기로 확인하였다. HepG2 이종 이식 모델에서, 인간화 GC33 1 mg/kg와 소라페니브 80 mg/kg (최대 내용량)가 병용 투여된 군에서의 종양 증식 억제 효과는 hGC33 또는 소라페니브를 동일한 양으로 단독 투여받은 군들 보다 현저하게 높았다. 또 이 모델에서는 종양의 증식에 따른 체중 감소가 관찰되지만, 소라페니브 단독 투여시 이 체중 감소는 향상된다. 소라페니브와 인간화 GC33과의 병용 투여시 소라페니브 단독 투여군에 비해 약효가 강해지는 것뿐만 아니라, 체중 감소가 유의하게 감소하였다 (특히, 제39일 및 제42일 (도 3)의 결과를 참조).
참조예 3
(1) 인간화 HOLO 항체의 점돌연변이의 제작
인간화 H0L0 항체의 CDR을 포함하는 항-글리피칸 3 항체를 코딩하는 유전자로부터 다양한 점-돌연변이 유전자를 제조했다. 변환 부위를 포함하는 센스 및 안티센스의 서열을 기초하여 설계된 올리고 DNA를 합성하였다. 시판되는 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)를 사용하여 복수의 점-돌연변이 유전자를 제조하였다. 점-돌연변이 유전자의 제조는 하기 조건에 따라서 PCR법에 의해 실시하였다. 10 ng의 주형 플라스미드와 10 pmol의 전방향사슬 및 역방향사슬 합성 올리고-DNA 및 키트에 제공된 10x 완충액, dNTP 믹스 및 Pfu Turbo DNA 폴리머라제의 반응 혼합물을 95℃에서 30초간, 55℃에서 1분, 68℃에서 4분의 순환을 18회 실시하였다. 키트에 첨부된 DpnI을 반응 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 제한 효소에 의한 제한 소화 반응을 수행하였다. 상기 반응액으로 DH5α컴피턴트 세포 (TOYOBO)를 형질 전환하여 형질 전환체를 얻었다. 점-돌연변이의 도입을 상기 형질 전환체로부터 분리된 플라스미드 DNA의 염기 서열을 결정함으로써 확인하였다. 각각의 점-돌연변이 유전자를 동물 세포에서 삽입 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터로 복제하였다. 변환 유전자는 하기와 같은 변환에 의해 제조하였다.
인간화 H0L0 항체 및 그것의 점 돌연변이 변환 항체의 일시적 발현은 폴리에틸렌이민 (Polysciences Inc.)을 사용하여 수행하였다. 트립신 EDTA (Invitrogen)으로 HEK293 세포를 분리하고, 10cm2 배양 접시에 6 x 106 세포/10 mL이 되도록 파종하였다. 다음날, SFMII 배지와 폴리에틸렌이민을 H 사슬 발현 플라스미드 DNA 및 L 사슬 발현 플라스미드 DNA와 제조사의 지침에 따라 혼합하였고, 생성된 혼합물을 실온에서 10분간 방치하였다. 혼합액의 전량을 상기와 같이 HEK293 세포가 파종된 배양 접시에 첨가하였다. 상기 배양 상징액을 약 72시간 후에 회수하여 발현된 인간화 H0L0 항체 및 그것의 점-돌연변이 변환 항체를 rProteinA sepharoseTM Fast Flow (GE Healthcare)를 제조사 지침에 따라 사용하여 정제하였다.
(1-1)인간화 H0L0 항체의 Tm 값의 변형
열변성 중심 온도 (Tm)는 일정 프로그램된 가열 속도로 테스트 샘플 용액을 가열한 후에 얻어진 온도기록도 (Cp 대 T)에서의 변성 피크의 정점으로 결정하였다. 인간화 H0L0 항체의 Tm값은 하기와 같이 제조된 DSC 측정용 샘플 용액을 사용하여 측정하였다. 투석막에 채워진 항체 용액 (50 내지 100 ㎍에 상응)은 150 mmol/L의 염화 나트륨을 포함하는 20 mol/L의 아세트산 나트륨 완충 용액 (pH 6.0)의 투석 외액에 대하여 24시간 동안 우선 투석되었다. 그 후에, 상기 샘플 용액을 그것의 항체 농도가 50-100 μg/mL이 되도록 투석 외액을 사용하여 조정하였고 DSC 측정용 샘플 용액으로서 사용하였다.
적절한 DSC 장치, 예를 들면, DSC-II (Calorimetry Sciences Corporation)을 본 실험에 사용한다. 상기 방법으로 제조된 샘플 용액 및 참조 용액 (투석외액)을 충분히 탈기시키고, 각각의 피검체를 열량계 셀에 놓고 40℃에서 열적 평형화하였다. 그리고 나서 DSC 스캔을 40℃~100℃에서 약 1K/분의 스캔 속도로 행하였다. 상기 측정 결과는 온도 함수로서 변성 피크의 정점으로서 제공된다. 인간화 H0L0 항체의 열변성 중심 온도를 Rodolfo et al., Immunology Letters (1999), 47-52에 따른 Fab 도메인의 파장 선정에 의해 계산하였다.
SEQ ID NO: 3으로 기재되는 H 사슬, 및 SEQ ID NO: 4로 기재되는 L 사슬을 포함하는 인간화 H0L0 항체의 Tm값은 상기 방법에 의해 76.6℃였다. 기존 항체의 예로서 제공되는 시나지스(Synagis) 및 허셉틴(Herceptin)의 Tm값은 각각 85.4℃ 및 81.8℃로 측정되었다. 그러므로 인간화 H0L0 항체의 Tm값은 기존 항체의 Tm 값보다 낮다는 것이 나타났다.
그러므로 상기 Tm 값을 상승시키기 위해, 인간화 H0L0 항체로부터 변환 항체를 제작했다. 항체 H15 (SEQ ID NO: 34)를 제조하기 위해 V37I, A40P, M48I 및 L51I의 변환을 SEQ ID NO: 3으로 기재되는 인간화 HOLO 항체 H 사슬의 FR2에 도입하였고, 여기서 그것의 서브 클래스는 VH1b에서 VH4로 바뀌었다. 상기 Tm값은 79.1℃로 개선되었다. 또한 L42Q, S48A 및 Q50R의 변환이 SEQ ID NO: 4로 기재되는 상기 인간화 HOLO 항체 L 사슬의 FR2에 도입되어 서브클래스가 VK2에서 VK3로 변하였고, I (생식선 시퀀스)를 가진 FR1의 V2를 대체하기 위한 V2I 변환의 도입으로 L4 (SEQ ID NO: 35)를 제조하였다. 각 항체의 Tm값을 상기 방법와 같이 측정하였다. H15L0 및 H0L4의 Tm값은 H0L0의 Tm값인 76.6℃보다 개선된 79.2℃ 및 77.2℃로 각각 측정되었다. 이 2개 변이체의 조합을 포함하는 H15L4 항체의 Tm값은 80.5℃로 개선되었다.
(1-2) 인간화 HOLO 항체의 pI값의 변환
항체가 갖는 pI값이 감소되면 항체의 혈장 중 반감기는 늘어난다. 그러므로, pI값이 감소한 인간화 H0L0 항체의 변환 항체를 제조하였고, 상기 변환이 더 높은 종양 억제 활성을 제공하는지 여부를 평가하였다.
각 항체의 pI값을 등전점 전기 영동에 의한 분석에 기초하여 계산하였다. 전기영동을 아래와 같이 수행하였다. Phastsystem Cassette (AmerchamBioscience)를 사용하여, Phast-Gel Dry IEF (AmerchamBioscience)겔을 하기 조성을 갖는 팽윤액으로 약 60분 동안 팽윤시켰다.
(a) 고 pI용 팽윤 용액의 조성:
1.5 ml의 10% 글리세롤
IEF용 100 ㎕의 Pharmalyte 8-10.5 (AmerchamBioscience)
(b) 저 pI용 팽윤 용액의 조성:
1.5 ml의 정제 수
IEF용 20 ㎕의 Pharmalyte 8-10.5 (AmerchamBioscience)
IEF용 80 ㎕의 Pharmalyte 5-8 (AmerchamBioscience)
약 0.5μg의 항체를 팽윤된 겔에 장전하고 아래의 프로그램에 의해 제어된PhastSystem (AmerchamBioscience)을 사용하여 등전점 전기영동을 행하였다. 샘플을 이 프로그램의 단계 2에서 겔에 첨가하였다. pI용 보정 키트를 (AmerchamBioscience)를 pI 마커로서 사용하였다.
단계 1:2000 V, 2.5 mA, 3.5 W, 15℃, 75 Vh
단계 2:200 V, 2.5 mA, 3.5 W, 15℃, 15 Vh
단계 3:2000 V, 2.5 mA, 3.5 W, 15℃, 410 Vh
전기영동 후, 상기 겔을 20% TCA로 고정시켰고, 실버 염색 키트, Protein (AmerchamBioscience)을 사용하여 키트에 첨부된 설명서에 따라 실버 염색을 실시하였다. 염색 후, 각각의 항체 (테스트 샘플)의 등전점을 상기 pI 마커가 갖는 공지의 등전점을 근거로 하여 계산하였다.
Hspd1.8 (Hd1.8) (SEQ ID NO: 27)을 제조하였고, 여기서 K19T, Q43E, K63S, K65Q, 및 G66D 변환이 하기의 변환 제작에 의해 H15.Lspd1.6 (Ld1.6) (SEQ ID NO: 29)에 추가적으로 시행되었다; L4에서의 Q27E 변환; L4에서 FR3의 79-84의 서열인 KISRVE을 TISSLQ로 변환; 및 S25A 변환. Hspd1.8 (Hd1.8)과 Lspd1.6 (Ld1.6)로 이루어진 항체인 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6)의 pI값은 7.4로 측정하였다. 인간화 H0L0 항체의 pI값은 8.9이므로, Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체의 pI값은 1.5감소했다.
(2) 경쟁적 효소면역측정법에 의한 인간화 HOLO 항체로부터 점-돌연변이 변환된 항체의 결합 활성의 측정
(1)에서 정제된 인간화 HOLO 항체 및 그것의 점 돌연변이-변환 항체를 경쟁적 효소면역측정법 (경쟁적 ELISA)에 의해 평가하였다. 1㎍/mL 가용성 GPC3 코어 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 36)를 96-웰 플레이트의 각 웰당 100 ㎕씩 첨가하였다. 상기 플레이트를 4℃에서 밤새 방치하여 가용성 GPC3 코어 폴리펩티드를 상기 플레이트에 고정시켰다. 상기 플레이트에 고정된 가용성 GPC3 코어 폴리펩티드를 Skan WASHER400 (Molecular Devices)를 사용하여 세척 완충액으로 3회 세척하였고; 그리고 200 ㎕의 블로킹 완충액을 가하여 적어도 30분 동안 4℃에서 블로킹하였다. 상기 가용성 GPC3 코어 폴리펩티드가 고정된 블록 플레이트를 Skan WASHER400을 사용하여 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 그 후, 상기 플레이트의 각각의 웰에 비오틴화된 인간화 HOLO 항체 (최종 농도=0.3 ㎍/mL) 100 ㎕ 및 인간화 HOLO 항체 또는 점-돌연변이-변환 항체 (다양한 농도) 100 ㎕의 혼합물 200 ㎕를 넣었다.
인간화 H0L0 항체를 키트에 제공된 설명서를 따라 비오틴 라벨링 키트 (Roche)를 사용하여 비오틴화 하였다. 상기 플레이트를 실온에서 1시간 방치 후, Skan WASHER400 (Molecular Devices)를 사용하여 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 각각의 웰에, 기질 완충액으로 20,000배 희석된 염소 항-스트렙타비딘 알칼리성 포스파타아제 (ZYMED) 100 ㎕를 첨가하였고, 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 방치 후 Skan WASHER400을 사용하여 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 포스파타아제 기질 (Sigma)을 기질용 완충액 중에 1 mg/mL로 제조하였고, 각 웰당 100 ㎕씩 첨가하고 1시간 동안 방치하였다. 655 nm에서의 흡광도를 대조로 하여, Benchmark Plus (BIO-RAD)를 사용하여 405 nm에서 각각의 웰의 반응액의 흡광도를 측정하였다.
H15L4 항체 및 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체의 항원에 대한 결합 활성은 변환된 인간화 H0L0 항체의 결합활성과 거의 동일하게 나타났다.
참조예 4
(1) pI를 감소시키기 위해 점-돌연변이를 통해 pI가 변환된 항체의 제조를 위한 변환 부분의 선택
Hd1.8Ld1.6 항체의 종양 억제 효과를 한층 더 향상시키기 위해, 가변영역의 pI값의 감소를 가능하게 하는 변환 부위를 선택하였다. 가변영역의 pI값의 저하와 관련되는 아미노산 잔기를 발견하였다. pI값 감소를 위한 이러한 변환의 구체적인 예시는 하기와 같이 제조된 pH7pL16 항체이다.
변환 부위는 Assemble PCR에 의해 제작된다. 변환 부위를 함유하는 센스 및 안티센스의 서열에 기초하여 설계된 올리고 DNA를 합성하였다. 변환 부위를 함유하는 안티센스 올리고 DNA와 유전자의 변환에 적합한 벡터와 상응하는 센스 올리고 DNA 한쌍, 또는 변환 부위를 함유하는 센스 올리고 DNA와 유전자 변환에 적합한 벡터와 상응하는 안티센스 올리고 DNA를 변환부위를 함유하는 5'-측, 3'-측 단편을 얻기 위해 PrimeSTAR (TAKARA)을 갖는 PCR에 사용하였다. 두 단편을 Assemble PCR을 이용하여 결합하여 각각의 돌연변이를 제조하였다.
이와같이 얻은 돌연변이를 동물 세포에서 삽입된 유전자가 발현되도록 하는 발현 벡터에 삽입하였다. 발현 벡터의 염기 서열을 본 분야의 공지의 방법에 의해 결정하였다. 점-돌연변이의 도입은 플라스미드 DNA의 염기 서열 결정에 의해 확인되었다. 점 돌연변이를 함유하는 유전자를 동물 세포에 삽입된 유전자의 발현 허용하는 발현 벡터에 클로닝하였다. 항체의 발현 및 정제를 실시예 1에 기술된 방법 또는 이와 비슷한 방법을 사용하여 실시하였다.
Hspd1.8 (Hd1.8)로부터 시작하여, Hspd1.8 (Hd1.8)의 CDR2에 존재하는 61번째 글루타민 (Q) (kabatnumbering에 따름)을 글루타민산 (E)으로 치환하여 pH7 (SEQ ID NO: 31)을 제조하였다. Ld1.6로부터 시작하여, Ld1.6의 CDR1에 존재하는 24번째 아르기닌 (R) (kabatnumbering에 따름)을 글루타민 (Q)으로, FR2 및 FR3에 존재하는 37번째의 글루타민 (Q)을 류신 (L)으로, 43번째 알라닌 (A)을 세린 (S)으로, 45번째 아르기닌 (R)을 글루타민 (Q)으로, 74번째 트레오닌 (T)을 라이신 (K)으로, 77번째 세린 (S)을 아르기닌 (R)으로, 78번째 류신 (L)을 발린 (V)으로, 그리고 79번째 글루타민 (Q)을 글루타민산 (E)으로 치환하여 pL14를 제조하였다. 그리고나서 PL14로부터 시작하여, pL14의 FR4에 존재하는 104번째 류신 (L)을 발린 (V)으로, 107번째 라이신 (K)을 글루타민산 (E)으로 치환하여 pL16 (SEQ ID NO: 33)을 제조하였다.
(2) 점 돌연변이 pI 변환 항체의 pI값의 측정
Hd1.8Ld1.6 항체 및 pH7pL16 항체의 pI값을 참고예 3에 기재된 방법 또는 이와 유사한 방법을 사용하여 PhastGel IEF 4-6. 5 (GE Healthcase)을 사용하여 전기영동에 의해 측정하였다. Hd1.8Ld1.6 항체 및 pH7pL16 항체의 pI값은 각각 7.47 및 6.52였는데, pH7pL16 항체의 pI값이 Hd1.8Ld1.6 항체의 pI값 보다 0.95 감소한 것을 의미한다.
(3) 점 돌연변이 pI 변환 항체의 Tm값 측정
Hd1.8Ld1.6 항체 및 pH7pL16 항체로부터 얻어진 Fab의 Tm값을 참조예 3과 유사한 방법을 사용하여 VP-DSC (Micro Cal)로 측정하였다. 본 실험에서, PBS를 투석액으로 사용하였고, DSC 측정용 테스트 용액 중의 항체 농도를 25-100 μg/mL로 조절하였다. DSC 스캐닝은 기준 용액 (투석액) 및 DSC 측정 테스트 용액을 사용하여, 20℃~115℃에서 약 4K/분의 스캔 속도로 설정하였다. Hd1.8Ld1.6 항체 및 pH7pL16 항체의 Fab열 변성 중심 온도는 각각 77.5 및 74.7℃였다.
(4) 경쟁적 효소면역측정법에 의한 점 돌연변이 pI 변환 항체의 항체에 대한 결합 활성 평가
각각의 점 돌연변이 pI 변환 항체의 항원 글리피칸 3에 대한 결합 활성을 참조예 3에 기재된 방법을 사용하여 측정하였다. pH7pL16 항체의 글리피칸 3에 대한 결합 활성은 인간화 H0L0 항체의 결합활성과 거의 동등한 것으로 나타났다.
실시예 5
(1) 글리피칸 3을 발현하는 인간 간암 세포주를 이식한 마우스 모델에서 화학요법제 (소라페니브)와 인간 항-글리피칸 3 항체의 조합 처방 테스트
6 주령의 수컷 CB-17 SCID 마우스를 CLEA Japan Inc.로 부터 구입하였다. 마우스에 종양 이식 직전에 200 μg의 항-아시알로 GM1 항체 (WAKO)를 복강 내 투여하였고, 그리고 나서 50% 마트리겔 (Becton Dickinson) 중에 분산된 5×105 개의 HepG2 세포를 피하 이식하였다. 종양 체적이 250 mm3에 달한 시점에, 마우스를 여러 그룹으로 나누고, 투여를 개시하였다. 적당한 농도로 PBS (-) 중에서 제조한 pH7pL16 항체를 3주간 주1회 투여하였다. 소라페니브를 Organic Process Research & Development (2002) 6, 777-781에 기재된 방법에 따라 합성하였다. 소라페니브를 10% 에탄올, 10% 크레모포르 EL을 함유하는 순수에 현탁시키고, 3주간 주 5회 경구투여하였다. PBS (-), 10% 에탄올 및 10% 크레모포르 EL을 함유하는 순수를 비히클 대조군으로 제공하였다. 종양 체적 V (mm3)을 실시예 1에 기재된 식으로 계산하였다.
(2) 글리피칸 3을 발현하는 인간 간암 세포주를 이식한 마우스 모델에서 화학요법제 (소라페니브)와 인간 항-글리피칸 3 항체의 조합 처방 테스트 결과
도 5는 인간 간암 세포주 HepG2 이식 마우스 모델에서 pH7pL16 항체 및 소라페니브의 조합의 항종양 효과를 나타내는 그래프이다. 데이타를 종양 체적의 변화 (평균±표준편차)로 표현하였다. 열린 동그라미는 비히클 군을 나타내고; 닫힌 동그라미는 pH7pL16 항체만을 1 mg/kg의 용량으로 투여한 군을 나타내고; 열린 정사각형은 소라페니브만 80 mg/kg의 용량으로 투여한 군을 나타내고; 그리고 닫힌 정사각형은 pH7pL16 항체와 소라페니브를 각각 1 mg/kg 및 80 mg/kg의 용량으로 병용 투여한 군을 나타낸다. 별모양은 Dunnett's test에 기초해 P<0.05인 것을 의미한다.
도 6은 인간 간암 세포주 HepG2 이식 마우스 모델에서 pH7pL16 항체 및 소라페니브의 조합의 체중 감소에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 데이타를 마우스의 시간별 체중 (평균±표준편차)으로 표현하였다. 열린 동그라미는 비히클 군을 나타내고; 닫힌 동그라미는 pH7pL16 항체만을 1 mg/kg의 용량으로 투여한 군을 나타내고; 열린 정사각형은 소라페니브만 80 mg/kg의 용량으로 투여한 군을 나타내고; 그리고 닫힌 정사각형은 pH7pL16 항체와 소라페니브를 각각 1 mg/kg 및 80 mg/kg의 용량으로 병용 투여한 군을 나타낸다. 별모양은 Dunnett's test에 기초해 P<0.05인 것을 의미한다.
종양 증식 억제 효과는 본 테스트의 마지막 (제47일)에 종양의 크기로 표현하였다. HepG2 이종 이식 모델에서, pH7pL16 항체 (1 mg/kg)와 소라페니브 (최대 내용량인 80 mg/kg)을 조합하여 투여받은 군에서의 종양 증식 억제 효과는 항체 또는 소라페니브를 단독으로 투여한 군에서의 억제 효과보다 훨씬 높았다 (도 5). 본 모델에 있어서 종양의 증식과 관련된 체중 감소가 통상 관찰되었지만, 체중 감소는 소라페니브 단독 투여시 강화되었다. 소라페니브와 pH7pL16의 병용 투여시는, 소라페니브 단독 투여군에 비해 약효의 강화뿐만 아니라, 체중 감소가 상당히 약화되었다 (도 6).
실시예 6
(1) 글리피칸 3을 발현하는 인간 간암 세포주가 이식된 마우스 모델에서 화학요법제 (수니티닙)와 인간 항-글리피칸 3 항체의 조합 처방 테스트
6 주령의 수컷 CB-17 SCID 마우스를 CLEA Japan Inc.로 부터 구입하였다. 마우스에 종양 이식 직전에 200μg의 항-아시알로 GM1 항체 (WAKO)를 복강 내 투여하였고, 그 후 50% 마트리겔 (Becton Dickinson)에 분산된 5×105개의 HepG2 세포를 피하이식하였다. 종양 체적이 250mm3에 달한 시점에, 마우스를 여러 그룹으로 나누고, 투여를 개시하였다.
적절한 농도에서 PBS (-) 중에 제조된 인간화 항-글리피칸 3 항체 (hGC33, WO2006006693)를 3주간 주1회씩 정맥 투여하였다. 수니티닙 (Seqouia Research Products로 부터 구입; cat. #SRP01785S)을 10% 에탄올, 10% 크레모포르 EL을 포함하는 순수에 현탁시키고, 3주간 주5회 경구투여하였다. PBS (-), 10% 에탄올 및 10% 크레모포르 EL을 포함하는 순수를 비히클 대조군으로 제공하였다. 종양 체적 V (mm3)을 실시예 1에 기재된 식으로 계산하였다.
(2) 글리피칸 3을 발현하는 인간 간암 세포주를 이식한 마우스 모델에서 화학요법제 (수니티닙)와 인간 항-글리피칸 3 항체의 조합 처방 테스트 결과
도 7는 인간 간암 세포주 HepG2 이식 마우스 모델에서 hCG33 항체 및 수니티닙의 조합의 항종양 효과를 나타내는 도면이다. 본 데이타는 종양 체적의 변화 (평균±표준편차)로 표현된다. 열린 동그라미는 비히클 군을 나타내고; 닫힌 동그라미는 hCG33 항체만을 1 mg/kg의 용량으로 투여한 군을 나타내고; 열린 정사각형은 수니티닙만 80 mg/kg의 용량으로 투여한 군을 나타내고; 그리고 닫힌 정사각형은 hCG33 항체와 수니티닙을 각각 1 mg/kg 및 80 mg/kg의 용량으로 병용 투여한 군을 나타낸다. 별모양은 Dunnett's test에 기초해 P<0.05인 것을 의미한다.
종양 증식 억제 효과는 본 테스트의 마지막 (53일째)에 종양의 크기로 표현된다. HepG2 이종 이식 모델에서, hCG33 항체 (1 mg/kg)와 수니티닙 (최대 내용량인 80 mg/kg)의 조합을 투여한 군에서의 종양 증식 억제 효과는 항체 또는 소라페니브를 단독으로 투여받은 군에서의 억제 효과보다 훨씬 높았다 (도 7).
SEQUENCE LISTING <110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha <120> combination therapy <130> PCG-9026WO <150> JP 2008-098309 <151> 2008-04-04 <150> PCT/JP2008/002690 <151> 2008-09-26 <160> 36 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 2 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 4 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 5 Asp Tyr Glu Met His 1 5 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 6 Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 7 Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr 1 5 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 8 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 9 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 10 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Asp Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 11 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Glu Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 12 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Phe Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 13 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn His Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 14 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Asn Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 15 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Thr Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 16 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gln Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 17 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Ile Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 18 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Lys Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 19 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Leu Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 20 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Ser Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 21 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Trp Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 22 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Tyr Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 23 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 24 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 25 Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr 1 5 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 26 Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Ser Phe Gln 1 5 10 15 <210> 27 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Ser Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 28 Arg Ala Ser Glu Ser Leu Val His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 29 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 29 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 30 Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe Gln 1 5 10 15 <210> 31 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 32 Gln Ala Ser Glu Ser Leu Val His Ser Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 33 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 33 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ala Ser Glu Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu 100 105 110 <210> 34 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 35 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 36 <211> 545 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 36 Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser 1 5 10 15 Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro 20 25 30 Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys 35 40 45 Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn 50 55 60 Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile 65 70 75 80 Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg 85 90 95 His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser 100 105 110 Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val 115 120 125 Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn 130 135 140 Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn 145 150 155 160 Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly 165 170 175 Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met 180 185 190 Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala 195 200 205 Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe 210 215 220 Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr 225 230 235 240 Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val 245 250 255 Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp 260 265 270 Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg 275 280 285 Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His 290 295 300 Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr 305 310 315 320 Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala 325 330 335 Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala 340 345 350 His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile 355 360 365 Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr 370 375 380 Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn 385 390 395 400 Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly 405 410 415 Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu 420 425 430 Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu 435 440 445 Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu 450 455 460 Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ala Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu 465 470 475 480 Cys Ile Gly Gly Ala Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu 485 490 495 Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro 500 505 510 Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe 515 520 525 His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys His His His His His 530 535 540 His 545

Claims (116)

  1. 멀티-키나아제 저해제 및 세포독성 항-글리피칸 3 항체의 조합물을 포함하고, 상기 멀티-키나아제 저해제가 소라페니브(Sorafenib), 수니티닙(Sunitinib) 또는 약제학적으로 허용가능한 그들의 염인 간암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 배합제인 것인 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 멀티-키나아제 저해제와 세포독성 항-글리피칸 3 항체는 병용 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 멀티-키나아제 저해제와 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체가 동시 또는 순차적으로 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 멀티-키나아제 저해제와 세포독성 항-글리피칸 3 항체가 개별적으로 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  6. 멀티-키나아제 저해제와 조합하여 사용하기 위한 간암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물로, 상기 조성물은 세포독성 항-글리피칸 3 항체를 활성성분으로 포함하고, 상기 멀티-키나아제 저해제가 소라페니브, 수니티닙 또는 약제학적으로 허용가능한 그들의 염인 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는 상기 멀티-키나아제 저해제와 동시에 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체가 멀티-키나아제 저해제 투여 전 또는 투여 후 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  9. 세포독성 항-글리피칸 3 항체와 조합하여 사용하기 위한 간암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물로, 상기 조성물은 멀티-키나아제 저해제를 활성성분으로 포함하고, 상기 멀티-키나아제 저해제가 소라페니브, 수니티닙 또는 약제학적으로 허용가능한 그들의 염인 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 멀티-키나아제 저해제는 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체와 동시에 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 멀티-키나아제 저해제는 세포독성 항-글리피칸 3 항체의 투여 전 또는 투여 후 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
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  16. 삭제
  17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO:5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO:6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO:7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 항-글리피칸 3 항체는 제2의 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있고, 여기서 상기 제2의 항체는:
    각각, SEQ ID NO: 5, 6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역, 및
    각각, SEQ ID NO: 8, 24 및 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 9~23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는 인간화 항체인 것인 약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 4의 34 번째 Gly이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  26. 제22항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  27. 멀티-키나아제 저해제에 의한 간암 치료에 의해 야기된 부작용을 줄이기 위한 약제로, 상기 약제는 세포독성 항-글리피칸 3 항체를 활성성분으로 포함하고, 상기 멀티-키나아제 저해제가 소라페니브(Sorafenib), 수니티닙(Sunitinib) 또는 약제학적으로 허용가능한 그들의 염인 부작용 감소제.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 제27항에 있어서, 상기 부작용은 체중 감소인 것인 부작용 감소제.
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 제27항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 부작용 감소제.
  36. 제27항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는 제2의 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있는 항체이고, 여기서 상기 제2의 항체는:
    각각 SEQ ID NO: 5, 6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역, 및
    각각 SEQ ID NO: 8, 24 및 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 부작용 감소제.
  37. 제27항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 9~23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 부작용 감소제.
  38. 제27항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 부작용 감소제.
  39. 제27항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 25로 명시된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 부작용 감소제.
  40. 제27항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는 인간화 항체인 것인 부작용 감소제.
  41. 제40항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 부작용 감소제.
  42. 제40항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 4의 34 번째 글라이신 (Gly)이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 부작용 감소제.
  43. 제40항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 부작용 감소제.
  44. 제40항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함 항체 것인 부작용 감소제.
  45. 멀티-키나아제 저해제에 의한 간암 치료의 효율을 강화하기 위한 약제학적 조성물로, 상기 조성물은 세포독성 항-글리피칸 3 항체를 활성성분으로 포함하고, 상기 멀티-키나아제 저해제가 소라페니브(Sorafenib), 수니티닙(Sunitinib) 또는 약제학적으로 허용가능한 그들의 염인 약제학적 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는 상기 멀티-키나아제 저해제와 동시에 투여되는 것인 약제학적 조성물.
  47. 제45항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는 멀티-키나아제 저해제 투여 전 또는 투여 후 투여되는 것인 약제학적 조성물.
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  51. 삭제
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  53. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  54. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는 제2의 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 결합할 수 있고, 여기서 상기 제2의 항체는:
    각각, SEQ ID NO: 5, 6 및 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역, 및
    각각, SEQ ID NO: 8, 24 및 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  55. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 9~23 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 약제학적 조성물.
  56. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 26에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 28에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  57. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 30에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1,
    SEQ ID NO: 24에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및
    SEQ ID NO: 25에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 CDR3의 CDR1, 2 및 3을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  58. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는 인간화 항체인 것인 약제학적 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  60. 제58항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 4의 34 번째 글라이신 (Gly)이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  61. 제58항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 27에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
  62. 제58항에 있어서, 상기 세포독성 항-글리피칸 3 항체는:
    SEQ ID NO: 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 H 사슬 가변 영역; 및
    SEQ ID NO: 33에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 L 사슬 가변 영역을 포함 항체 것인 약제학적 조성물.
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