CN115380211A - 精制的方法和经精制的产品 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种通过柱色谱法而将化合物精制的方法、以及通过使浆料沉降并减少浆料中的沉降体积从而将对称因子和理论塔板数最优化的方法。还提供通过这些方法精制的化合物。

Description

精制的方法和经精制的产品

技术领域

本发明一般涉及提高柱色谱的性能的方法。

背景技术

色谱法是在广泛的范围的产业和研究环境中使用的精制法。色谱法用于食品产业、环境试验和制药产业中品质管理和制备的目的。化学物质的天然的来源给出有用的化合物的丰富的来源，但提取会导致不纯的混合物，为了分离目标化学物质，这往往需要进一步的精制法、例如色谱法。由于化学结构中的类似性，表明属于相同结构类别的不同化合物的混合物难以从其中精制和分离特定的化合物。制备色谱中使用的柱和固定相的方法针对柱的性能、以及将具有相近结构的类似性以及与固定相和流动相的类似相互作用的多种化合物分离的柱的能力，能够具有显著作用。如专利文献1所述那样，作为色谱用柱的填充方法，已知沉降填充法、高压浆料填充法、干式填充法等。沉降填充法是指在柱中投入填充剂和液体的浆料而静置、沉降的方法。高压浆料填充法是指在柱中投入填充剂和液体的浆料，通过送液泵将液体高压送液，使填充剂沉降的方法。此外，干式填充法是指将填充剂直接以粉状投入柱中，通过使柱振动等方法而将填充剂紧密填充后，供给液体而进行填充剂层内的脱气的方法。在专利文献2和3中，记载了在色谱用柱的制备中以浆料形式投入填充剂后，进行沉降和压缩的方法。非专利文献1中，记载了制备液相色谱中的柱的填充的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平10-253609号公报

专利文献2：WO2015/053276

专利文献3：日本特表2015-508179号公报

非专利文献

非专利文献1：YMC15 Preparative LC System手册

发明内容

发明要解决的课题

需要一种色谱方法，其通过增大峰分离度、对称性和理论塔板数，从而能够分离具有类似保留时间的类似化合物。

用于解决课题的手段

本申请的发明人发现了通过柱色谱而将化合物精制的方法、以及通过使浆料静置并减少浆料中的沉降体积从而将对称因子和理论塔板数最优化的方法，从而完成了本申请发明。本申请发明涉及通过使浆料静置一定时间长度，从而增大峰分离度、对称性、和理论塔板数的方法。本说明书中，记载了以下的发明的方式。

[1-1]一种通过柱色谱法精制一种以上的化合物的方法，其包括以下的工序：

将固定相添加至柱中，并且

使包含所述固定相的浆料在沉降时间的期间在柱中沉降。

[1-2]一种填充色谱柱的方法，其包括以下的工序：

将固定相添加至柱中，并且

使包含所述固定相的浆料在沉降时间的期间在柱中沉降。

[1-3]一种增大柱色谱的理论塔板数(N)的方法，其包括以下的工序：

将固定相添加至柱中，并且

使包含所述固定相的浆料在沉降时间的期间在柱中沉降；所述N的增大是相对于没有沉降时间的柱色谱法而言的，或者所述N的增大是相对于在小于该沉降时间的沉降时间减少的期间进行沉降的浆料而言的。

[1-4]一种柱色谱中的色谱峰的对称因子的提高方法，其包括将浆料在沉降时间的期间在该柱中沉降，

所述提高包括使所述峰的所述对称因子降低至1以上的数量，且所述降低是相对于在柱色谱法包括不存在沉降时间或小于所述沉降时间的减少了的沉降时间、且所述对称因子大于1的情况下的对称因子而言的；或者

所述提高包括使所述峰的所述对称因子增大至1以下的数量，且所述增大是相对于在所述柱色谱法包括不存在沉降时间或小于所述沉降时间的减少了的沉降时间、且所述对称因子小于1的情况下的对称因子而言的。

[1-5]根据[1-4]所述的方法，其中，在所述柱色谱法包括所述沉降时间的情况下、或者在所述柱色谱法包括不存在沉降时间或小于所述沉降时间的减少了的沉降时间的情况下，除了沉降时间之外的所有色谱法条件是相同的。

[1-6]根据[1-1]～[1-5]中任一项所述的方法，其中，该柱在沉降时间的期间处于大气压下。

[1-7]根据[1-1]～[1-6]中任一项所述的方法，其中，在沉降时间后对该柱施加压力。

[1-8]根据[1-1]～[1-7]中任一项所述的方法，其中，各个沉降时间独立地为约0.5分钟～约5分钟、约5分钟～约10分钟、约10分钟～约15分钟、约15分钟～约20分钟、约20分钟～约25分钟、约25分钟～约30分钟、约30分钟～约35分钟、约35分钟～约40分钟、约40分钟～约45分钟、约45分钟～约50分钟、约50分钟～约55分钟、约55分钟～约60分钟、约60分钟～约65分钟、约65分钟～约70分钟、约70分钟～约75分钟、约75分钟～约80分钟、约80分钟～约85分钟、约85分钟～约90分钟、约90分钟～约95分钟、或约95分钟～约100分钟、约100分钟～约105分钟、约105分钟～约110分钟、约110分钟～约115分钟、约115分钟～约120分钟。

[1-9]一种通过柱色谱法精制一种以上的化合物的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，所述沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的。

[1-10]一种填充色谱柱的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，所述沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的。

[1-11]一种增大柱色谱中的理论塔板数N的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，所述沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的，且所述N的增大是相对于所述柱被所述新的浆料填充后的柱色谱的N而言的。

[1-12]一种提高柱色谱中的色谱峰的对称因子的方法，其包括在柱填充前减少浆料中的沉降体积，所述沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的，

所述提高包括：当与在使用由新的浆料填充的柱来实施柱色谱法的情况下的所述峰相关的所述对称因子大于1时，使所述峰的所述对称因子降低至1以上的数量，或者，

所述提高包括：当与在使用由新的浆料填充的柱来实施柱色谱法的情况下的所述峰相关的所述对称因子小于1时，使所述峰的所述对称因子增大至1以下的数量。

[1-13]根据[1-12]所述的方法，其中，在所述柱色谱法包括减少了的所述沉降体积的情况下、或者在所述柱色谱法使用由新的浆料填充的柱来实施的情况下，除了沉降体积之外的全部色谱法条件是相同的。

[1-14]根据[1-12]或[1-13]所述的方法，其中，上述新的浆料包含以小于约10分钟、小于约8分钟、小于约6分钟、小于约4分钟、小于约2分钟或小于约1分钟的时间期间组合的流动相和固定相。

[1-15]根据[1-9]～[1-14]中任一项所述的方法，其中，上述沉降体积的减少以约0分钟～约2分钟、约2分钟～约4分钟、约4分钟～约6分钟、约6分钟～约8分钟、约8分钟～约10分钟、约10分钟～约12分钟、约12分钟～约14分钟、约14分钟～约16分钟、约16分钟～约18分钟、约18分钟～约20分钟、约20分钟～约22分钟、约22分钟～约24分钟、约24分钟～约26分钟、约26分钟～约28分钟、约28分钟～约30分钟、约30分钟～约32分钟、约32分钟～约34分钟、约34分钟～约36分钟、约36分钟～约38分钟或约38分钟～约40分钟的时间长度进行。

[1-16]根据[1-15]所述的方法，其中，上述沉降体积在上述时间长度之后实质上维持恒定。

[1-17]根据[1-9]～[1-16]中任一项所述的方法，其中，上述沉降体积的减少以沉降时间进行。

[1-18]根据[1-9]～[1-17]中任一项所述的方法，其中，使沉降体积减少包括使混合物在大气压中沉降。

[1-19]根据[1-9]～[1-18]中任一项所述的方法，其中，在上述沉降体积的减少后对柱施加压力。

[1-20]根据[1-1]～[1-18]中任一项所述的方法，其中，柱为轴向压缩柱。

[1-21]根据[1-1]～[1-20]中任一项所述的方法，其中，上述浆料包含固定相和选自水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类或二氯甲烷中的一种以上。

[1-22]根据[1-21]所述的方法，其中，上述浆料包含甲醇。

[1-23]根据[1-21]或[1-22]所述的方法，其中，上述固定相包含大于50μm、大于45μm、大于40μm、大于35μm、大于30μm、大于25μm、大于20μm、大于15μm、或大于10μm的通过激光衍射散射法测定的平均粒径。

[1-24]根据[1-21]或[1-23]所述的方法，其中，上述固定相包含选自C30、C22、C18、C8、C5、C4、联苯、氟苯基、亲水相互作用液相色谱(HILIC)固定相、丙烯酰胺、二氧化硅、苯基-己基固定相、极性嵌入烷基和氟苯基丙基中的至少一种中的颗粒。

[1-25]根据[1-21]～[1-24]中任一项所述的方法，其中，上述固定相包含C18的颗粒。

[1-26]根据[1-1]～[1-25]中任一项所述的方法，其中，色谱法包括使用包含水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类、或二氯甲烷中的一种以上的流动相进行洗脱。

[1-27]根据[1-26]所述的方法，其中，上述流动相包含甲醇。

[1-28]根据[1-1]～[1-27]中任一项所述的方法，其中，色谱法包括包含选自甲酸、甲酸铵、三甲基胺、氨和氢氧化铵中的一种以上中的添加剂的流动相。

[1-29]根据[1-1]～[1-28]中任一项所述的方法，其中，柱色谱法包括流动相梯度。

[1-30]根据[1-1]～[1-29]中任一项所述的方法，其中，色谱法包括选自脂肪酸或其酯化衍生物、蛋白质、核酸和小分子中的一种以上的分析物质的精制。

[1-31]根据[1-1]～[1-30]中任一项所述的方法，其中，色谱法包括一种以上的脂肪酸或其酯化衍生物的精制。

[1-32]根据[1-31]所述的方法，其中，该脂肪酸选自二十二碳六烯酸、巴豆酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、顺-6-十六碳烯酸(sapienic acid)、油酸、反油酸、11-十八碳烯酸、鳕烯酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、亚麻酸、皮诺敛酸、桐酸、5,8,11-二十碳三烯酸(mead acid)、二高-γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、肾上腺酸、伯色五烯酸(bosseopentaenoic acid)、二十碳五烯酸、全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸(osbond acid)、鰶鱼酸(clupanodonicacid)、二十四碳五烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(cervonic acid)、4,8,12,15,18,21-二十四碳六烯酸(nisinic acid)、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸、褐煤酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十八烷酸、三十九烷酸和四十烷酸中的一种以上。

[1-33]根据[1-31]或[1-32]所述的方法，其中，其酯化衍生物是甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯、庚酯、辛酯、壬酯或癸酯。

[1-34]根据[1-1]～[1-33]中任一项所述的方法，其中，色谱法包括二十碳五烯酸乙酯和/或二十二碳六烯酸乙酯的精制。

[1-35]根据[1-1]～[1-34]中任一项所述的方法，其中，上述浆料通过以下的工序形成：

a)在上述浆料向上述柱中添加之前，预先将固定相和流动相混合；或

b)将流动相添加至上述柱，接着，将固定相添加至该流动相。

[1-36]根据[1-34]所述的方法，其中，上述固定相分批添加至上述流动相。

[1-37]一种化合物或包含该化合物的组合物，其中，上述化合物通过[1-1]～[1-36]中任一项所述的方法精制而成。

[1-38]根据[1-37]所述的化合物或组合物，其中，该化合物是脂肪酸或其酯化衍生物、蛋白质、核酸或小分子。

[1-39]根据[1-37]或[1-38]所述的化合物或组合物，其中，该化合物是脂肪酸或其酯化衍生物。

[1-40]根据[1-39]所述的化合物或组合物，其中，该化合物是二十二碳六烯酸、巴豆酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、顺-6-十六碳烯酸、油酸、反油酸、11-十八碳烯酸、鳕烯酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、亚麻酸、皮诺敛酸、桐酸、5,8,11-二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、肾上腺酸、伯色五烯酸、二十碳五烯酸、全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、鰶鱼酸、二十四碳五烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、4,8,12,15,18,21-二十四碳六烯酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸、褐煤酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十八烷酸、三十九烷酸、四十烷酸或其酯化衍生物。

[1-41]根据[1-39]或[1-40]所述的化合物或组合物，其中，其酯化衍生物是甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯、庚酯、辛酯、壬酯或癸酯。

[1-42]根据[1-37]～[1-41]中任一项所述的化合物或组合物，其中，该化合物是二十碳五烯酸乙酯和/或二十二碳六烯酸乙酯。

[1-43]根据[1-37]～[1-42]中任一项所述的化合物或组合物，其具有大于约90％、大于约95％、大于约98％、大于约99％、大于约99.5％、大于约99.8％、或大于约99.9％的纯度。

[1-44]根据[1-36]～[1-43]中任一项所述的化合物或组合物，其具有大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、或大于80％的产率。

[1-45]根据[1-36]～[1-43]中任一项所述的化合物或组合物，其具有大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于98％、大于99％、或大于99.7％的回收率。

[1-46]根据[1-42]所述的化合物或组合物，其中，通过精制得到的级分以约80％以上、约85％以上、约86％以上、约90％以上、约95％以上、约96.5％以上、约98％以上、约99％以上、约99.5％以上、约99.8％以上、或约99.9％以上的含量包含二十碳五烯酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯。

[1-47]根据[1-42]所述的化合物或组合物，其中，通过精制得到的级分以约80％以上、约85％以上、约86％以上、约90％以上、约95％以上、约96.5％以上、约98％以上、约99％以上、约99.5％以上、约99.8％以上、或约99.9％以上的含量包含二十碳五烯酸乙酯或二十二碳六烯酸乙酯。

[2-1]一种通过柱色谱精制一种以上的化合物的方法，其包括以下的工序：

制备在液体中包含固定相的浆料；

使浆料在柱中在静置时间的期间静置而使固定相沉降；

对经沉降的固定相施加填充压力而形成固定相的填充层；和

使用包含固定相的填充层的柱进行柱色谱。

[2-2]一种填充色谱柱的方法，其包括以下的工序：

制备在液体中包含固定相的浆料；

使浆料在柱中在静置时间的期间静置而使固定相沉降；和

对经沉降的固定相施加填充压力而形成固定相的填充层。

[2-3]一种增大柱色谱的理论塔板数(N)的方法，其包括以下的工序：

制备在液体中包含固定相的浆料；

使浆料在柱中在静置时间的期间静置而使固定相沉降；和

对经沉降的固定相施加填充压力而形成固定相的填充层，所述N的增大是相对于未使浆料静置、或使浆料在小于该静置时间的减少了的静置时间的期间静置的柱色谱而言的。

[2-4]一种提高柱色谱中的色谱峰的对称因子的方法，其包括以下的工序：

制备在液体中包含固定相的浆料；

使浆料在柱中在静置时间的期间静置而使固定相沉降；以及

对经沉降的固定相施加填充压力而形成固定相的填充层，

所述提高包括使该峰的该对称因子降低至1以上的数量，且所述降低是相对于未使浆料静置、或使浆料在小于该静置时间的减少了的静置时间的期间静置的柱色谱中的大于1的对称因子而言的；或者

所述提高包括使该峰的该对称因子增大至1以下的数量，且该增大是相对于未使浆料静置、或使浆料在小于该静置时间的减少了的静置时间的期间静置的柱色谱中的小于1的对称因子而言的。

[2-5]根据[2-4]所述的方法，在未使浆料静置、或使浆料在小于该静置时间的减少了的静置时间的期间静置的柱色谱中，除了静置时间之外的所有色谱条件是相同的。

[2-6]根据[2-1]～[2-5]中任一项所述的方法，其中，该柱在静置时间的期间处于大气压下。

[2-7]根据[2-1]～[2-6]中任一项所述的方法，其中，该静置时间是约0.5分钟～约5分钟、约5分钟～约10分钟、约10分钟～约15分钟、约15分钟～约20分钟、约20分钟～约25分钟、约25分钟～约30分钟、约30分钟～约35分钟、约35分钟～约40分钟、约40分钟～约45分钟、约45分钟～约50分钟、约50分钟～约55分钟、约55分钟～约60分钟、约60分钟～约65分钟、约65分钟～约70分钟、约70分钟～约75分钟、约75分钟～约80分钟、约80分钟～约85分钟、约85分钟～约90分钟、约90分钟～约95分钟、或约95分钟～约100分钟、约100分钟～约105分钟、约105分钟～约110分钟、约110分钟～约115分钟、约115分钟～约120分钟。

[2-8]根据[2-1]～[2-7]中任一项所述的方法，其中，使浆料静置的结果是，固定相的填充层的体积与未使浆料静置的柱色谱中的固定相的填充层的体积相比减少。

[2-9]根据[2-8]所述的方法，其中，包括在浆料的制备时，以小于约10分钟、小于约8分钟、小于约6分钟、小于约4分钟、小于约2分钟或小于约1分钟的时间期间搅拌的液体和固定相。

[2-10]根据[2-1]～[2-9]中任一项所述的方法，其中，柱为轴向压缩柱。

[2-11]根据[2-1]～[2-10]中任一项所述的方法，其中，上述浆料包含固定相和水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类或二氯甲烷中的一种以上的液体。

[2-12]根据[2-11]所述的方法，其中，上述浆料包含作为液体的甲醇。

[2-13]根据[2-11]或[2-12]所述的方法，其中，上述固定相包含具有大于50μm、大于45μm、大于40μm、大于35μm、大于30μm、大于25μm、大于20μm、大于15μm、或大于10μm的通过激光衍射散射法测定的粒径的中央值的颗粒。

[2-14]根据[2-11]或[2-13]所述的方法，其中，上述固定相包含选自C30、C22、C18、C8、C5、C4、联苯、氟苯基、亲水相互作用液相色谱(HILIC)固定相、丙烯酰胺、二氧化硅、苯基-己基固定相、极性嵌入烷基和氟苯基丙基中的至少一种中的颗粒。

[2-15]根据[2-11]～[2-14]中任一项所述的方法，其中，上述固定相包含C18的颗粒。

[2-16]根据[2-1]～[2-15]中任一项所述的方法，其中，浆料浓度是约20％～约70％、优选为约30％～约70％、更优选为约30％～约60％。

[2-17]根据[2-1]～[2-16]中任一项所述的方法，其中，色谱法包括使用包含水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类、二氯甲烷或超临界二氧化碳的一种以上的流动相进行洗脱。

[2-18]根据[2-17]所述的方法，其中，上述流动相包含甲醇。

[2-19]根据[2-1]～[2-18]中任一项所述的方法，其中，色谱法包括包含选自甲酸、甲酸铵、三甲基胺、氨和氢氧化铵中的一种以上中的添加剂的流动相。

[2-20]根据[2-1]～[2-19]中任一项所述的方法，其中，柱色谱法包括流动相梯度。

[2-21]根据[2-1]～[2-20]中任一项所述的方法，其中，色谱法包括选自脂肪酸或其酯化衍生物、蛋白质、核酸和小分子中的一种以上的分析物质的精制。

[2-22]根据[2-1]～[2-21]中任一项所述的方法，其中，色谱法包括一种以上的脂肪酸或其酯化衍生物的精制。

[2-23]根据[2-22]所述的方法，其中，该脂肪酸选自二十二碳六烯酸、巴豆酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、顺-6-十六碳烯酸、油酸、反油酸、11-十八碳烯酸、鳕烯酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、亚麻酸、皮诺敛酸、桐酸、5,8,11-二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、肾上腺酸、伯色五烯酸、二十碳五烯酸、全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、鰶鱼酸、二十四碳五烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、4,8,12,15,18,21-二十四碳六烯酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸、褐煤酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十八烷酸、三十九烷酸和四十烷酸中的一种以上。

[2-24]根据[2-21]或[2-22]所述的方法，其中，其酯化衍生物是甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯、庚酯、辛酯、壬酯或癸酯。

[2-25]根据[2-1]～[2-24]中任一项所述的方法，其中，色谱法包括二十碳五烯酸乙酯和/或二十二碳六烯酸乙酯的精制。

[2-26]根据[2-1]～[2-25]中任一项所述的方法，其中，上述浆料通过以下的工序形成：

a)在上述浆料向上述柱中添加之前，预先将固定相和液体混合；或

b)将液体添加至上述柱，接着，将固定相添加至该液体。

[2-27]根据[2-26]所述的方法，其中，上述固定相分批添加至上述液体。

[2-28]一种化合物或包含该化合物的组合物，其中，上述化合物通过[2-1]～[2-27]中任一项所述的方法精制而成。

[2-29]根据[2-28]所述的化合物或组合物，其中，该化合物是脂肪酸或其酯化衍生物、蛋白质、核酸或小分子。

[2-30]根据[2-28]或[2-29]所述的化合物或组合物，其中，该化合物是脂肪酸或其酯化衍生物。

[2-31]根据[2-30]所述的化合物或组合物，其中，该化合物是二十二碳六烯酸、巴豆酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、顺-6-十六碳烯酸、油酸、反油酸、11-十八碳烯酸、鳕鱼酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、亚麻酸、皮诺敛酸、桐酸、5,8,11-二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、肾上腺酸、伯色五烯酸、二十碳五烯酸、全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、鰶鱼酸、二十四碳五烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、4,8,12,15,18,21-二十四碳六烯酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸、褐煤酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十八烷酸、三十九烷酸、四十烷酸或其酯化衍生物。

[2-32]根据[2-30]或[2-31]所述的化合物或组合物，其中，所述脂肪酸的酯化衍生物是甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯、庚酯、辛酯、壬酯或癸酯。

[2-33]根据[2-28]～[2-32]中任一项所述的化合物或组合物，其中，该化合物是二十碳五烯酸乙酯和/或二十二碳六烯酸乙酯。

[2-34]根据[2-28]～[2-33]中任一项所述的化合物或组合物，其具有约80％以上、约85％以上、约86％以上、约90％以上、约95％以上、约96.5％以上、约98％以上、约99％以上、约99.5％以上、约99.8％以上、或约99.9％以上的纯度。

[2-35]根据[2-33]所述的化合物或组合物，其中，通过精制得到的级分以约80％以上、约85％以上、约86％以上、约90％以上、约95％以上、约96.5％以上、约98％以上、约99％以上、约99.5％以上、约99.8％以上、或约99.9％以上的含量包含二十碳五烯酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯。

[2-36]根据[2-33]所述的化合物或组合物，其中，通过精制得到的级分以约80％以上、约85％以上、约86％以上、约90％以上、约95％以上、约96.5％以上、约98％以上、约99％以上、约99.5％以上、约99.8％以上、或约99.9％以上的含量包含二十碳五烯酸乙酯或二十二碳六烯酸乙酯。

[3-1]一种通过柱色谱精制一种以上的化合物的方法，其包括以下的工序：

将固定相添加至柱中，和

使包含所述固定相的浆料在柱中在静置时间的期间静置。

[3-2]一种填充色谱柱的方法，其包括以下的工序：

将固定相添加至柱中，和

使包含所述固定相的浆料在柱中在静置时间的期间静置。

[3-3]一种增大柱色谱的理论塔板数(N)的方法，其包括以下的工序：

将固定相添加至柱中，和

使包含所述固定相的浆料在柱中在静置时间的期间静置；

所述N的增大是相对于无静置时间的柱色谱而言的，或所述N的增大是相对于在小于该静置时间的静置时间减少的期间进行静置的浆料而言的。

[3-4]一种提高柱色谱中的色谱峰的对称因子的方法，其包括使浆料在该柱中在静置时间的期间静置，

所述提高包括使所述峰的所述对称因子降低至1以上的数量，且所述降低是相对于在柱色谱法包括不存在沉降时间或小于所述沉降时间的减少了的沉降时间、且所述对称因子大于1的情况下的对称因子而言的；或者

所述提高包括使所述峰的所述对称因子增大至1以下的数量，且所述增大是相对于在所述柱色谱法包括不存在沉降时间或小于所述沉降时间的减少了的沉降时间、且所述对称因子小于1的情况下的对称因子而言的。

[3-5]根据[3-4]所述的方法，其中，在该柱色谱包括该静置时间的情况下，或者在该柱色谱包括不存在静置时间或小于该的减少了的静置时间的情况下，除了静置时间之外的所有色谱条件是相同的。

[3-6]根据[3-1]～[3-5]中任一项所述的方法，其中，该柱在静置时间的期间处于大气压下。

[3-7]根据[3-1]～[3-6]中任一项所述的方法，其中，在静置时间后对该柱施加压力。

[3-8]根据[3-1]～[3-7]中任一项所述的方法，其中，各个静置时间独立地为约0.5分钟～约5分钟、约5分钟～约10分钟、约10分钟～约15分钟、约15分钟～约20分钟、约20分钟～约25分钟、约25分钟～约30分钟、约30分钟～约35分钟、约35分钟～约40分钟、约40分钟～约45分钟、约45分钟～约50分钟、约50分钟～约55分钟、约55分钟～约60分钟、约60分钟～约65分钟、约65分钟～约70分钟、约70分钟～约75分钟、约75分钟～约80分钟、约80分钟～约85分钟、约85分钟～约90分钟、约90分钟～约95分钟、或约95分钟～约100分钟、约100分钟～约105分钟、约105分钟～约110分钟、约110分钟～约115分钟、约115分钟～约120分钟。

[3-9]一种通过柱色谱精制一种以上的化合物的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，该沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的。

[3-10]一种填充色谱柱的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，该沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的。

[3-11]一种增大柱色谱的理论塔板数(N)的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，该沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的，且所述N的增大是相对于该柱被该新的浆料填充的柱色谱的N而言的。

[3-12]一种提高柱色谱中的色谱峰的对称因子的方法，其包括在柱填充前减少浆料中的沉降体积，所述沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的，

所述提高包括：当与在使用由新的浆料填充的柱来实施柱色谱法的情况下的所述峰相关的所述对称因子大于1时，使所述峰的所述对称因子降低至1以上的数量，或者，

所述提高包括：当与在使用由新的浆料填充的柱来实施柱色谱法的情况下的所述峰相关的所述对称因子小于1时，使所述峰的所述对称因子增大至1以下的数量。

[3-13]根据[3-12]所述的方法，其中，在上述柱色谱法包括上述减少的沉降体积的情况下，或者在上述柱色谱使用被新的浆料填充的柱来实施的情况下，除了沉降体积之外的全部色谱条件是相同的。

[3-14]根据[3-12]或[3-13]所述的方法，其中，上述新的浆料包含以小于约10分钟、小于约8分钟、小于约6分钟、小于约4分钟、小于约2分钟或小于约1分钟的时间期间组合的流动相和固定相。

[3-15]根据[3-9]～[3-14]中任一项所述的方法，其中，上述沉降体积的减少以约0分钟～约2分钟、约2分钟～约4分钟、约4分钟～约6分钟、约6分钟～约8分钟、约8分钟～约10分钟、约10分钟～约12分钟、约12分钟～约14分钟、约14分钟～约16分钟、约16分钟～约18分钟、约18分钟～约20分钟、约20分钟～约22分钟、约22分钟～约24分钟、约24分钟～约26分钟、约26分钟～约28分钟、约28分钟～约30分钟、约30分钟～约32分钟、约32分钟～约34分钟、约34分钟～约36分钟、约36分钟～约38分钟或约38分钟～约40分钟的时间长度进行。

[3-16]根据[3-15]所述的方法，其中，上述沉降体积在上述时间长度之后实质上维持恒定。

[3-17]根据[3-9]～[3-16]中任一项所述的方法，其中，上述沉降体积的减少以静置时间进行。

[3-18]根据[3-9]～[3-17]中任一项所述的方法，其中，减少沉降体积包括使混合物在大气压中静置。

[3-19]根据[3-9]～[3-18]中任一项所述的方法，其中，在上述沉降体积的减少后对柱施加压力。

[3-20]根据[3-1]～[3-18]中任一项所述的方法，其中，柱为轴向压缩柱。

[3-21]根据[3-1]～[3-20]中任一项所述的方法，其中，上述浆料包含固定相和水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类或二氯甲烷中的一种以上。

[3-22]根据[3-21]所述的方法，其中，上述浆料包含甲醇。

[3-23]根据[3-21]或[3-22]所述的方法，其中，上述固定相包含大于50μm、大于45μm、大于40μm、大于35μm、大于30μm、大于25μm、大于20μm、大于15μm、或大于10μm的通过激光衍射散射法测定的平均粒径。

[3-24]根据[3-21]或[3-23]所述的方法，其中，上述固定相包含选自C30、C22、C18、C8、C5、C4、联苯、氟苯基、亲水相互作用液相色谱(HILIC)固定相、丙烯酰胺、二氧化硅、苯基-己基固定相、极性嵌入烷基和氟苯基丙基中的至少一种中的颗粒。

[3-25]根据[3-21]～[3-24]中任一项所述的方法，其中，上述固定相包含C18的颗粒。

[3-26]根据[3-1]～[3-25]中任一项所述的方法，其中，色谱法包括使用包含水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类、或二氯甲烷中的一种以上的流动相进行洗脱。

[3-27]根据[3-26]所述的方法，其中，上述流动相包含甲醇。

[3-28]根据[3-1]～[3-27]中任一项所述的方法，其中，色谱包括包含选自甲酸、甲酸铵、三甲基胺、氨和氢氧化铵中的一种以上中的添加剂的流动相。

[3-29]根据[3-1]～[3-28]中任一项所述的方法，其中，柱色谱包括流动相梯度。

[3-30]根据[3-1]～[3-29]中任一项所述的方法，其中，

色谱法包括选自脂肪酸或其酯化衍生物、蛋白质、核酸和小分子中的一种以上的分析物质的精制。

[3-31]根据[3-1]～[3-30]中任一项所述的方法，其中，色谱法包括一种以上的脂肪酸或其酯化衍生物的精制。

[3-32]根据[3-31]所述的方法，其中，该脂肪酸选自二十二碳六烯酸、巴豆酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、顺-6-十六碳烯酸、油酸、反油酸、11-十八碳烯酸、鳕烯酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、亚麻酸、皮诺敛酸、桐酸、5,8,11-二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、肾上腺酸、伯色五烯酸、二十碳五烯酸、全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、鰶鱼酸、二十四碳五烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、4,8,12,15,18,21-二十四碳六烯酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸、褐煤酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十八烷酸、三十九烷酸和四十烷酸中的一种以上。

[3-33]根据[3-31]或[3-32]所述的方法，其中，所述脂肪酸的酯化衍生物是甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯、庚酯、辛酯、壬酯或癸酯。

[3-34]根据[3-1]～[3-33]中任一项所述的方法，其中，色谱法包括二十碳五烯酸乙酯和/或二十二碳六烯酸乙酯的精制。

[3-35]根据[3-1]～[3-34]中任一项所述的方法，其中，上述浆料通过以下的工序形成：

a)在上述浆料向上述柱中添加之前，预先将固定相和流动相混合；或

b)将流动相添加至上述柱，接着，将固定相添加至该流动相。

[3-36]根据[3-34]所述的方法，其中，上述固定相分批添加至上述流动相。

[3-37]一种化合物或包含该化合物的组合物，其中，所述化合物通过[3-1]～[3-36]中任一项所述的方法精制而成。

[3-38]根据[3-37]所述的化合物或组合物，其中，该化合物是脂肪酸或其酯化衍生物、蛋白质、核酸或小分子。

[3-39]根据[3-37]或[3-38]所述的化合物或组合物，其中，该化合物是脂肪酸或其酯化衍生物。

[3-40]根据[3-39]所述的化合物或组合物，其中，该化合物是二十二碳六烯酸、巴豆酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、顺-6-十六碳烯酸、油酸、反油酸、11-十八碳烯酸、鳕烯酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、亚麻酸、皮诺敛酸、桐酸、5,8,11-二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、肾上腺酸、伯色五烯酸、二十碳五烯酸、全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、鰶鱼酸、二十四碳五烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、4,8,12,15,18,21-二十四碳六烯酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸、褐煤酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十八烷酸、三十九烷酸、四十烷酸或其酯化衍生物。

[3-41]根据[3-39]或[3-40]所述的化合物或组合物，其中，所述脂肪酸的酯化衍生物是甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯、庚酯、辛酯、壬酯或癸酯。

[3-42]根据[3-37]～[3-41]中任一项所述的化合物或组合物，其中，该化合物是二十碳五烯酸乙酯和/或二十二碳六烯酸乙酯。

[3-43]根据[3-37]～[3-42]中任一项所述的化合物或组合物，其具有约80％以上、约85％以上、约86％以上、约90％以上、约95％以上、约96.5％以上、约98％以上、约99％以上、约99.5％以上、约99.8％以上、或约99.9％以上的纯度。

[3-44]根据[3-42]所述的化合物或组合物，其中，通过精制得到的级分以约80％以上、约85％以上、约86％以上、约90％以上、约95％以上、约96.5％以上、约98％以上、约99％以上、约99.5％以上、约99.8％以上、或约99.9％以上的含量包含二十碳五烯酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯。

[3-45]根据[3-42]所述的化合物或组合物，其中，通过精制得到的级分以约80％以上、约85％以上、约86％以上、约90％以上、约95％以上、约96.5％以上、约98％以上、约99％以上、约99.5％以上、约99.8％以上、或约99.9％以上的含量包含二十碳五烯酸乙酯或二十二碳六烯酸乙酯。

本发明的部分方式涉及包括以下的工序的通过柱色谱精制一种以上的化合物的方法：将固定相添加至柱中，和使包含固定相的浆料在柱中在沉降时间(settling time)的期间沉降。

本发明的部分方式涉及包括以下的工序的填充色谱柱的方法：将固定相添加至柱中，和使包含固定相的浆料在柱中在沉降时间的期间沉降。

本发明的部分方式涉及增大柱色谱的理论塔板数(N)的方法，其包括以下的工序：将固定相添加至柱中，以及使包含固定相的浆料在柱中在沉降时间的期间沉降，在此，N的增大是相对于没有沉降时间的柱色谱而言的，或者，在此，N的增大是相对于在小于沉降时间的减少了的沉降时间的期间沉降的浆料而言的。

本发明的部分方式涉及提高柱色谱中的色谱峰的对称因子的方法，其包括使浆料在柱中在沉降时间的期间沉降，在此，提高包括使峰的对称因子降低至1以上的数量，且在此，降低是相对于在柱色谱法包括不存在沉降时间或小于该沉降时间的减少了的沉降时间、且对称因子大于1的情况下的对称因子而言的；或提高包括使峰的对称因子增大至1以下的数量，且在此，增大是相对于在柱色谱法包括不存在沉降时间或小于该沉降时间的减少了的沉降时间、且对称因子小于1的情况下的对称因子而言的。某个方式中，在柱色谱法包括该沉降时间的情况下，或者在柱色谱法包括不存在沉降时间或小于该沉降时间的减少了的沉降时间的情况下，除了沉降时间之外的所有色谱条件是相同的。

这些方法的某个方式中，柱在沉降时间期间处于大气压下。这些方法的某个方式中，在沉降时间后对柱施加压力。这些方法的某个方式中，各个沉降时间独立地是约0.5分钟～约2分钟、约2分钟～约4分钟、约4分钟～约6分钟、约6分钟～约8分钟、约8分钟～约10分钟、约10分钟～约12分钟、约12分钟～约14分钟、约14分钟～约16分钟、约16分钟～约18分钟、约18分钟～约20分钟、约20分钟～约22分钟、约22分钟～约24分钟、约24分钟～约26分钟、约26分钟～约28分钟、约28分钟～约30分钟、约30分钟～约32分钟、约32分钟～约34分钟、约34分钟～约36分钟、约36分钟～约38分钟或约38分钟～约40分钟。某个方式中，沉降时间独立地是约0.5分钟～约5分钟、约5分钟～约10分钟、约10分钟～约15分钟、约15分钟～约20分钟、约20分钟～约25分钟、约25分钟～约30分钟、约30分钟～约35分钟、约35分钟～约40分钟、约40分钟～约45分钟、约45分钟～约50分钟、约50分钟～约55分钟、约55分钟～约60分钟、约60分钟～约65分钟、约65分钟～约70分钟、约70分钟～约75分钟、约75分钟～约80分钟、约80分钟～约85分钟、约85分钟～约90分钟、约90分钟～约95分钟或约95分钟～约100分钟、约100分钟～约105分钟、约105分钟～约110分钟、约110分钟～约115分钟、约115分钟～约120分钟。

本发明的部分方式涉及通过柱色谱精制一种以上的化合物的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，在此，沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的。

本发明的部分方式涉及填充色谱柱的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，在此，沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的。

本发明的部分方式涉及增大柱色谱的理论塔板数(N)的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，在此，沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的，并且，在此，N的增大是相对于柱被新的浆料填充的柱色谱的N而言的。

本发明的部分方式涉及提高柱色谱中的色谱峰的对称因子的方法，其包括在柱填充前减少浆料中的沉降体积，在此，沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的，在此，提高包括：当与在使用由新的浆料填充的柱来实施柱色谱法的情况下的峰相关的对称因子大于1时，使峰的对称因子降低至1以上的数量，或者，提高包括：当与在使用由新的浆料填充的柱来实施柱色谱法的情况下的峰相关的对称因子小于1时，使峰的对称因子增大至1以下的数量。

在这些方法的某个方式中，除了沉降体积之外的所有色谱条件在柱色谱法包括减少的沉降体积的情况下、和在柱色谱使用被新的浆料填充的柱而实施的情况下相同。这些方法的某个方式中，新的浆料包含以长于约0.5分钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、110分钟、120分钟、和/或小于200分钟、185分钟、175分钟、165分钟、155分钟、145分钟、135分钟、125分钟、115分钟、105分钟、95分钟、85分钟、75分钟、65分钟、55分钟、45分钟、35分钟、25分钟的时间期间组合的流动相(或溶剂)和固定相。组合流动相(或溶剂)和固定相可以包括搅拌。这些方法的部分方式中，沉降体积的减少以约0分钟～约2分钟、约2分钟～约4分钟、约4分钟～约8分钟、约8分钟～约16分钟、约16分钟～约24分钟、约24分钟～约32分钟、约32分钟～约50分钟、约50分钟～约70分钟、约70分钟～约90分钟、约90分钟～约110分钟、约110分钟～约130分钟、约130分钟～约150分钟的时间长度进行。这些方法的部分方式中，沉降体积在其时间长度之后实质上维持恒定。这些方法的部分方式中，沉降体积的减少以沉降时间进行。这些方法的部分方式中，减少沉降体积包括使混合物在大气压中沉降。这些方法的部分方式中，在沉降体积的减少后对柱施加压力。这些方法的部分方式中，柱是轴向压缩柱。这些方法的部分方式中，浆料包含固定相和选自水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类或二氯甲烷中的一种以上。这些方法的部分方式中，浆料包含甲醇。这些方法的部分方式中，固定相包含C30、C22、C18、C8、C5、C4、联苯、氟苯基、亲水相互作用液相色谱(HILIC)固定相、丙烯酰胺、二氧化硅、苯基-己基固定相、极性嵌入烷基(polar embedded alkyl)和/或氟苯基丙基的颗粒。这些方法的部分方式中，固定相是C18的颗粒。

上述任一方式的方法中，色谱法包括使用水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类、二氯甲烷或超临界二氧化碳中的一种以上的流动相进行洗脱。这些方法的部分方式中，流动相包含甲醇。这些方法的部分方式中，色谱包括包含选自甲酸、甲酸铵、三甲基胺、氨和氢氧化铵中的一种以上中的添加剂的流动相。这些方法的部分方式中，柱色谱法包括流动相梯度。这些方法的部分方式中，色谱法包括选自脂肪酸或其酯化衍生物、蛋白质、核酸和小分子中的一种以上的分析物质的精制。这些方法的部分方式中，色谱法包括一种以上的脂肪酸或其酯化衍生物的精制。这些方法的部分方式中，脂肪酸选自二十二碳六烯酸、巴豆酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、顺-6-十六碳烯酸、油酸、反油酸、11-十八碳烯酸、鳕烯酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、亚麻酸、皮诺敛酸、桐酸、5,8,11-二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、肾上腺酸、伯色五烯酸、二十碳五烯酸、全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸(ozubondo acid)、鰶鱼酸(sardine acid)、二十四碳五烯酸(tetracosanolpentaenoicacid)、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、4,8,12,15,18,21-二十四碳六烯酸(herring acid)、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸(carboceric acid)、褐煤酸、二十九烷酸(nonacosylic acid)、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸(lacceroic acid)、三十三烷酸(psyllic acid)、三十四烷酸(geddic acid)、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸(heptatriacontylic acid)、三十八烷酸(octatriacontylic acid)、三十九烷酸(nonatriacontylic ac id)和四十烷酸(tetracontylic acid)中的一种以上。这些方法的部分方式中，其酯化衍生物是甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯、庚酯、辛酯、壬酯或癸酯。这些方法的部分方式中，色谱法包括二十碳五烯酸乙酯的精制。这些方法的部分方式中，浆料通过下述而形成：a)在浆料向柱添加之前将固定相和流动相(或溶剂)预先混合；或b)将流动相(或溶剂)添加至柱，接着，将固定相添加至流动相。这些方法的部分方式中，固定相分批添加至流动相(或溶剂)。

其他方式包括化合物或包含该化合物的组合物，该化合物通过本发明的方法精制而成。部分方式中，化合物是脂肪酸或其酯化衍生物、蛋白质、核酸或小分子。部分方式中，化合物是脂肪酸或其酯化衍生物。部分方式中，化合物是二十二碳六烯酸、巴豆酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、顺-6-十六碳烯酸、油酸、反油酸、11-十八碳烯酸、鳕烯酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、亚麻酸、皮诺敛酸、桐酸、5,8,11-二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、肾上腺酸、伯色五烯酸、二十碳五烯酸、全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、鰶鱼酸、二十四碳五烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、4,8,12,15,18,21-二十四碳六烯酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸、褐煤酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十八烷酸、三十九烷酸、四十烷酸或其酯化衍生物。部分方式中，其酯化衍生物是甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯、庚酯、辛酯、壬酯或癸酯。部分方式中，化合物或组合物是二十碳五烯酸乙酯。部分方式中，化合物或组合物具有大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约85％、大于约86％、大于约90％、大于约95％、大于约96.5％、大于约98％、大于约99％、大于约99.5％、大于约99.8％、或者大于约99.9％、且/或小于约99.95％、小于约99.99％的纯度。部分方式中，产率大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、且/或小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或者小于95％。部分方式中，回收率大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于98％、大于99％、或者大于99.7％、且/或小于95％、小于97％、小于98％、小于99％、小于99.5％、小于99.7％或者小于99.9％。

附图说明

图1示出本发明的方式的沉降和填充工艺的每个工序的概略图。固定相的填充层是指浆料支撑体。

图2是用于计算理论塔板数(N)的伴随变量的色谱峰。σ是标准偏差。W是峰宽度。A是峰面积。W0.5h是峰的半高全宽(FWHM)。H是峰的高度。

图3是用于计算对称因子(As0.05或S)的伴随变量的色谱峰。W0.05h是从峰基线起算峰的高度的1/20上的位置处的峰宽度。从峰顶点画出的垂直线与从峰基线起算峰的高度的1/20上的位置处画出的水平线(W0.05h)交叉时，沿着峰的前缘(leading edge)至垂直线为止的水平线的距离为f或A0.05h。

具体实施方式

脂肪酸是具有长脂肪族链的羧酸，其为饱和或不饱和中任一者。脂肪酸通常通过源自天然来源的甘油三酯或磷脂质的水解而在工业上制造。部分通过合成而制造。无论制造的方法如何，精制法是为了得到用于食品、化妆品或工业用途的纯产品而必要的。

本发明面对的发现是，将固定相和流动相(或溶剂)的浆料添加至柱后以一定时间长度沉降，在柱的填充前促进浆料的减少的沉降体积，由此能够提高利用柱色谱的二十碳五烯酸乙酯(EPA-E)和/或二十二碳六烯酸乙酯(DHA-E)的精制。其结果是，相对于将浆料导入柱并立刻填充柱得到提高的柱性能。柱性能的提高包括增大的理论塔板数和更对称的峰。

因此，在一个方面，提供一种通过色谱法精制一种以上的化合物的方法，其包括将浆料以一定期间在柱中沉降。在另一方面中，提供一种填充色谱柱的方法，其包括将浆料以一定期间在柱中沉降。

柱是具有外径、内径和长度的圆筒形。某个方式中，柱是制备色谱柱。制备色谱柱能够包括约10mm～约2m的内径和约100mm～约5m、约2cm～约2m或约5cm～约80cm的长度。某个方式中，柱是分析用色谱柱。分析用柱能够包括约1mm～约10cm的内径和约10mm～约500mm的长度。尺寸可以以内径为长度的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约120％、约140％、约160％、约180％、约200％、约220％、约240％、约260％、约280％、约300％、约320％、约340％、约360％、约380％、约400％、约450％或约500％的方式选择。外径可以与内径相比大约0.1％、约0.5％、约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％、约3.0％、约3.5％、约4.0％、约4.5％、约5％、约7.5％、约10％、约15％、约20％、约25％或者约30％。

浆料可以由固定相和流动相(或溶剂)构成。固定相能够选自C30、C22、C18、C8、C5、C4、联苯、氟苯基、亲水相互作用液相色谱(HILIC)固定相、丙烯酰胺、二氧化硅、苯基己基固定相、极性包理烷基、氟苯基丙基或色谱的技术领域中已知的固定相。某个方式中，使用手性固定相。固定相的选择对本领域技术人员而言是显而易见的，可以取决于通过色谱法要精制的分析物质。非极性分析物质、例如脂肪酸或脂肪酸酯(例如EPA-E和/或DHA-E)可能需要使用反相固定相、例如C18(ODS)。包括完全封端的、部分封端的和碱失活的物质在内，可以使用各种各样不同的十八烷基二氧化硅(ODS)。极性更高的分析物质需要未键合二氧化硅、氨基相或氰基相那样的正相的固定相。

浆料浓度(浆料浓度(％)＝固定相(g)/溶剂(ml)×100)可以是约20％～约30％、约30％～约40％、约40％～约50％、约50％～约60％或约60％～约70％。一个方式中，浆料浓度是约20％～约70％、优选为约30％～约70％、更优选为约30％～约60％。

某个方式中，固定相包含具有约1μm～约20μm、约20μm～约40μm、约40μm～约60μm、约60μm～约80μm、约80μm～约1000μm、约1000μm～约2000μm、约2000μm～约3000μm、约3000μm～约4000μm、约4000μm～约5000μm的粒径的中央值的颗粒。某个方式中，固定相包含具有大于50μm、大于45μm、大于40μm、大于35μm、大于30μm、大于25μm、大于20μm、大于15μm、或者大于10μm、且/或小于500μm、小于400μm、小于300μm、小于200μm、小于100μm、小于80μm、小于60μm的粒径的中央值的颗粒。粒径的中央值如本领域技术人员所理解那样，可以通过激光衍射散射法测定。

流动相可以包含水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类、二氯甲烷、超临界二氧化碳或该技术中已知的任何其他溶剂中的一种以上。流动相的选择可能需要考虑要纯化的分析物种和所使用的固定相。针对非极性分析物种的反相固定相中，应当选择足够洗脱对象化合物但不会过快以使得洗脱接近溶剂前端的极性流动相。

流动相可以进一步包含含有缓冲剂和pH调节剂的添加剂。添加剂的选择可以基于所使用的流动相、所使用的固定相和要精制的分析物质而决定。部分方式中，流动相包含选自甲酸、甲酸铵、三甲基胺、氨和氢氧化铵中的一种以上中的添加剂。部分方式中，流动相可以不含添加剂。

某个方式中，溶剂梯度可以在洗脱期间用作流动相。梯度洗脱的主要目的是以生成被洗脱的分析物种在检测时充分分离的峰的方式，更快速地洗脱在柱上牢固保留的分析物种，另一方面更缓慢地洗脱较弱保留的分析物种。例如，反相色谱中，以低含量开始洗脱液中的非极性溶剂能够使得较弱保留的分析物种被分离。牢固保留的分析物种在柱的顶部的吸附剂表面上残留、或非常缓慢地移动。增加洗脱液中的非极性构成要素(例如乙腈)的量使得非极性溶剂针对吸附部位的竞争切实增大，因此能够使得牢固保留的构成要素更快速地移动。

因此，针对非极性分析物质使用的反相色谱中，色谱中的洗脱的开始时的溶剂可以包含选自约100％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约0％中的高百分率的极性溶剂A、例如水。溶剂B可以是与溶剂A相比非极性的溶剂、例如甲醇(溶剂A为水的情况)。溶剂B可以构成流动相的其余百分率。在柱进行运行，溶剂通过固定相和柱而洗脱时，梯度的结果是使得随着时间的经过而溶剂B的浓度中的逐渐增加。部分方式中，单一组成的溶剂也可以用作流动相。部分方式中，单一组成的溶剂可以将水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类、二氯甲烷、超临界二氧化碳或该技术中已知的任何其他溶剂中的一种或其以上单独或混合使用。

使用正相固定相和/或极性分析物质的方式中，流动相包含约100％、约90％、约80％、约70％、约60％或约50％的百分率的溶剂A，在此，溶剂A是非极性溶剂、例如己烷类。溶剂B被认为构成流动相的其余百分率，可以包含极性溶剂、例如乙酸乙酯、二乙基醚、二氯甲烷或叔丁基二甲基醚。溶剂B的百分率可以在利用梯度的洗脱期间随着时间的经过而增大。

某个方式中，经时的B的增加率可以为恒定。某个方式中，不存在梯度，流动相在洗脱期间为恒定组成。某个方式中，可以利用色谱法内的不同时间范围中的溶剂B的百分率的不同增加率。某个方式中，流动相可以是在色谱法的特定的时间范围期间为恒定组成，在其他时间范围中包括梯度。

流动相中使用的多种溶剂可以在流动相供给部中分别储存，在通过柱的洗脱之前使用泵混合。流动相供给部包含流动相源和溶剂递送***。这样的溶剂递送***是泵设备、例如商业上可获取的HPLC泵，其将溶剂或流动相提供给柱。这样的泵一般而言提供无脉冲的流动、0.1～100L/分钟的范围的流速、流速的准确控制、高压(6000psi以下)的生成以及耐腐蚀性且耐溶剂性的构成要素。往返泵由小腔室组成，其中溶剂通过电机驱动活塞的前后运动而进行泵注入。交替开关的2个止回阀控制出入缸体的溶剂的方向和流量。单活塞泵使用特殊设计的凸轮而能够实现非常迅速的补充时间，产生更连续的流动。因往返泵而导致的脉冲化的流动的缺点往往通过脉冲阻尼器而克服。通过彼此相位不同地活动的活塞而运行的双活塞泵的使用给出了用于无脉冲的流体递送的合理解决方案。柱中的线速度表示流体通过柱截面的速度。线速度(线速度(m/小时)＝流量(m³/小时)/柱截面积(m²))可以是约0.2～1.0m/小时、约1.0～3.0m/小时、约3.0～6.0m/小时、约6.0～10.0m/小时或约10.0～20.0m/小时。一个方式中，线速度是约4.0～9.0m/小时。

流动相梯度可以通过(需要用于各溶剂的泵的)高压混合或(仅需要1个泵的)低压混合而生成。高压混合***中，为了提供各溶剂而使用单独的高压泵。各泵的出口连接至混合连接器(通常具有2个入口管线和1个出口管线，因此称为“T”)或混合腔室中任一者。因此，2种溶剂在朝向柱的中途共混，即混合在泵的高压侧完成。由3种溶剂制作的流动相梯度的生成可以通过利用3个单独的泵而完成。低压***中，混合在泵之前在其低压侧完成，整体的流速通过单个的泵控制。通常，将进行螺线管操作的比例阀用于递送各个溶剂。控制装置按照各构成要素的百分率而将信号简单分割，将各阀在适当的期间被打开。通常，阀将各个溶剂递送至混合腔室中，接着，其将共混的溶剂供给至泵。部分***中，阀将流动相构成要素通过混合连接器直接供给至高压泵。可编程的流量控制对于通过这两种方法生成梯度都是可取的。

沉降时间的期间的沉降优选为在大气压(约0.101325MPa)下发生。部分方式中，沉降时间期间的压力是约0.1MPa～约0.2MPa、约0.2MPa～约0.4MPa、约0.4MPa～约0.6MPa、约0.6MPa～约0.8MPa或约0.8MPa～约1MPa。部分方式中，沉降时间期间的压力是小于约0.1MPa。部分方式中，沉降时间期间的压力是大气压。部分方式中，沉降时间期间的压力是大于0.01MPa、大于0.05MPa、或者大于0.1MPa、且/或小于1MPa、小于0.8MPa、小于0.6MPa、小于0.4MPa或者小于0.2MPa。

部分方式中，检测器为了针对分析物质(一种或多种)的存在而监测从柱洗脱的流动相而使用的。可以使用该技术中已知的检测法(例如质谱(MS)、UV/Vis吸光度、荧光、折射率或电导率)。

MS涉及基于其质量电荷比或“m/z”而过滤、检测和测定离子的方法。一般而言，将一种以上的对象的分子离子化，其离子接着被导入质谱仪器中，在此通过磁场和电场的组合，离子到达空间中的通路，其取决于质量(“m”)和电荷(“z”)。例如，参照发明名称为“MassSpectrometry From Surfaces”的美国专利第6,204,500号；发明名称为“Methods andApparatus for Tandem Mass Spectrometry”的美国专利第6,107,623号；发明名称为“DNADiagnostics Based On Mass Spectrometry”的美国专利第6,268,144号；发明名称为“Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption AndDetection Of Analytes”的美国专利第6,124,137号；Wright et al.,Prostate Cancerand Prostatic Diseases 2:264-76(1999)；和Merchant and Weinberger,Electrophoresis 21:1164-67(2000)，其各自包括所有表、图和专利权利要求书，通过参照而直接援引于本说明书中。

例如，“四极”或“四极离子阱”仪器中，振动的射频场中的离子受到与在电极间施加的DC电位、RF信号的振幅和m/z成比例的力。电压和振幅可以以仅具有特定的m/z的离子移动四极的长度而其他所有离子偏向的方式选择。因此，四极仪器可以实现与向仪器中注入的离子相关的“质量过滤器”和“质量检测器”两者的功能。

进一步，往往可以通过使用“串联质谱”或“MS/MS”而提高MS技术的分离度。该技术中，从对象的分子生成的第1离子或母离子可以在MS仪器中被过滤，这些母离子继续被碎片化而形成一种以上的第2离子或子离子，其接着在第2MS流程中被分析。通过仔细选择母离子，仅由特定的分析物质生成的离子被送至碎片化腔室，在此与不活泼气体的原子撞击而生成它们的子离子。母离子和子离子两者所给出的离子化/碎片化条件的集合下以能够重现的方式生成，因此MS/MS技术能够提供极为强力的检测工具。例如，过滤/碎片化的组合能够用于排除干扰物质，在生物学试样那样的复杂试样中可以是特别有用的。

另外，最近的技术中的进步、例如与飞行时间型分析装置(“MALDI-TOF”)组合的基质辅助激光解吸离子化能够进行以非常短的离子脉冲分析飞摩尔水平的分析物质。将飞行时间型分析装置与串联型MS组合的质谱仪也是本领域技术人员公知的。除此之外，作为“MS/MSn”而已知的方法中，可以组合多个质谱工序。可以利用各种各样的其他组合、例如MS/MS/TOF、MALDI/MS/MS/TOF或SELDI/MS/MS/TOF质谱。

离子可以使用包括电子离子化、化学离子化、快速原子轰击、电场解吸和基质辅助激光解吸离子化(“MALDI”)、表面增强激光解吸离子化(“SELDI”)、光子离子化、电喷雾离子化和电感耦合等离子体但不限于这些的各种各样的方法而生成。

术语“电子离子化”在本说明书中使用时，是指气相或蒸气相中的对象的分析物质与电子的流动相互作用的方法。电子与分析物质的撞击生成分析物质离子，接着可以对其实施质谱技术。

术语“化学离子化”在本说明书中使用时，是指试剂气体(例如氨)受到电子轰击，通过试剂气体离子和分析物质分子的相互作用而形成分析物质离子的方法。

术语“快速原子轰击”在本说明书中使用时，是指高能量原子(往往是Xe或Ar)的波束对不挥发性试验试样撞击，将试样中含有的分子解吸和离子化的方法。试样在粘性液体基质、例如甘油、硫代甘油、间硝基苯甲基醇、18-冠醚-6(18-crown-6crown ether)、2-硝基苯基辛基醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺中溶解。用于化合物或试样的适当的基质的选择是经验性的过程。

术语“电场解吸”在本说明书中使用时，是指不挥发性试验试样在离子化表面上放置，使用强电场而生成分析物质离子的方法。

术语“基质辅助激光解吸离子化”或“MALDI”在本说明书中使用时，是指将不挥发性试样用激光照射而曝露，由此将试样中的分析物质通过包含光离子化、质子化、脱质子化和簇崩塌的各种各样的离子化途径进行解吸和离子化的方法。为了MALDI，试样与促进分析物质分子的解吸的能量吸收基质混合。

术语“表面增强激光解吸离子化”或“SELDI”在本说明书中使用时，是指将不挥发性试样用激光照射而曝露，由此将试样中的分析物质通过包含光离子化、质子化、脱质子化和簇崩塌的各种各样的离子化途径进行解吸和离子化的另一方法。针对SELDI，试样典型地与优先保留对象的一种以上的分析物质的表面结合。如MALDI中那样，该过程为了促进离子化，也可以利用能量吸收材料。

术语“电喷雾离子化”或ESI在本说明书中使用时，是指溶液沿着毛细管的较短的长度通过，对其末端施加高的正或负的电位的方法。到达管的端部的溶液被气化(喷雾)而形成溶剂蒸气中的溶液的非常小的液滴的喷气或喷雾。该液滴的雾通过蒸发腔室而流动，为了防止凝聚和蒸发溶剂而将其略微加热。随着液滴变小，表面电荷密度增大，直至同种电荷间的自然排斥导致释放离子以及中性分子时为止。

术语“大气压化学离子化”或“APCI”在本说明书中使用时，是指与ESI类似的方法；然而，APCI通过在大气压下在等离子体内引起的离子-分子反应而生成离子。等离子体通过喷雾毛细管和对电极之间的放电而维持。接着，离子典型地通过使用差动泵式剪嘴台(differentially pumped skimmer stages)的套件而被提取至质谱仪中。干燥和预热N2气体的对流可以为了提高溶剂的去除而使用。APCI中的气相离子化分析极性更低的物种，因此与ESI相比可以是更有效的。

术语“电感耦合等离子体”在本说明书中使用时，是指试样在使几乎所有的元素分离为原子而离子化而言充分高的温度下，与部分离子化的气体相互作用的方法。

术语“离子化”在本说明书中使用时，是指生成具有等于1个以上的电子单位的净电荷的分析物质离子的过程。负离子是具有1个以上的电子单位的净的负电荷的离子，另一方面，正离子是具有1个以上的电子单位的净的正电荷的离子。

术语“在负离子模式下运行”是指检测负离子的质谱法。同样地，“在正离子模式下运行”是指检测正离子的质谱法。

术语“解吸”在本说明书中使用时，是指分析物质从表面的分离(removal)和/或分析物质向气相中的进入。

在母离子进一步碎片化而分离的方式、例如MS/MS中，撞击诱导解离或“CID”往往用于生成为了进一步检测的离子碎片。CID中，母离子通过与不活泼气体的撞击而获得能量，其后通过被称为“单分子分解”的工艺而碎片化。必须以可以将离子内的特定的键合通过增大的振动能量而破坏的方式，在母离子中蓄积充分的能量。

其他方式中，为了检测刚从分析柱洗脱后的分析物质而可以使用各种各样的标准的HPLC检测器中任一者。在该情况下，从柱洗脱化合物被检测为色谱图中的峰。峰的保留时间用于鉴定化合物，峰的高度(或面积)与试样中的化合物的量成比例。“保留时间”是分析物质为了通过色谱***而需要的时间，从试样的注入(或试样的负载)的时点至检测的时点测定。理想而言，对象的各分析物质可以具有特征性的保留时间。然而，分析物质的保留往往由于洗脱液、固定相、温度和色谱***的设定的变动而在实验和实验室间显著不同。因此，试验分析物质的保留时间与在相同条件下的一种以上的标准化合物的保留时间进行比较。适当的检测器显示出良好的灵敏度、良好的稳定性、重现性、跨多个数量级的大小的用于定量目的的情况的线形响应、短响应时间和操作的容易性。这样的检测器包括UV/Vis吸光度检测器、光电二极管阵列检测器、荧光检测器、折射率检测器和电导率检测器，但不限于这些。

可以使用包含具有栅格光学系的扫描型分光光度计的UV/Vis吸光度检测器。氘源(紫外范围、190～360nm)与钨源(可见范围、360～800nm)独立的或组合的使用提供了吸光物种从柱离开时对其进行检测的简单手段。

光电二极管阵列(PDA)基础的仪器是能够非常迅速地收集在所选择的光谱范围内的数据的紫外/可见吸光度检测器。可以将涉及各色谱峰的吸光度光谱数据收集和保存。所保存的数据可以与来自文库的纯的标准的光谱进行比较。PDA检测器由于未分离的构成要素各自相关的特征性光谱不同的可能性高，因此在鉴定难以分离的构成要素(重叠的峰)中是有用的。

荧光检测器在示出荧光或磷光那样的化学发光特性的分析物质的检测中是有用的。它们与UV吸光度检测器相比灵敏度高至少1个量级。荧光典型而言通过检测相对于激发波束90度的角度的被栅格分离的放射辐射(emission radiation)而观察。荧光物种的数量可以通过使用特殊试剂的经洗脱的化合物的柱后衍生物化(PCD)反应(或试样本身的柱前衍生物化反应)而增强。

折射率(RI)检测器对几乎所有溶质响应。参照流动相与柱流出液的折射率的差异的结果是导致作为色谱图上的峰而分离的构成要素的检测。由于其针对流动相的极高的灵敏度，因此该检测器无法在LC泵内无充分的脉冲衰减地使用，由于变化的流动相组成，其也可以适合于梯度应用。检测限通常小于通过吸光度检测器观察的检测限。

电导率检测器提供所有荷电物种的高灵敏度检测。该检测器能够至ppb水平简单且可靠地检测阴离子、阳离子、金属、有机酸和表面活性剂，因此能够与LC***一起使用。柱和电导率检测器之间的化学抑制剂的添加实现降低洗脱液的电导率的功能，能够使用梯度洗脱和以最小限度的基线漂移决定ppb水平。为了典型地决定低水平的阴离子，洗脱液转化为其较弱离子化的低电导率的酸(例如由Na2CO3转化为碳酸)，减少背景噪音。同时，分析物质的阴离子转化为它们的对应高电导率的酸(例如由NaCl转化为HCl)，相对增大分析物质的信号。

在另一方面，提供一种包括减少浆料中的沉降体积的增大柱色谱中的理论塔板数(N)的方法，在此，沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的，且在此，N的增大是相对于柱被新的浆料填充的柱色谱的N而言的。

在另一方面，提供一种包括使浆料在沉降时间的期间在柱中沉降的增大柱色谱中的理论塔板数(N)的方法，在此，增大是相对于无沉降时间、或浆料在小于该沉降时间的减少了的沉降时间的期间沉降的柱色谱而言的。

某个方式中，增大的N是约1,000～约1,500、约1,500～约2,000、约2,000～约2,500、约2,500～约3,000、约3,000～约4,000、约4,000～约5,000、约5,000～约6,000、约6,000～约8,000、约8,000～约11,000或约11,000～约15,000。某个方式中，增大的N大于约500、大于约1,000、大于约1,500、或者大于约2,000、且/或小于约20,000、小于约15,000或者小于约10,000。N的增大可以是约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或者约100％的增大或更大的增大。

另一方面中，提供一种包括使浆料在柱中在沉降时间的期间沉降的提高柱色谱中的色谱峰的对称因子(S)的方法，在此，提高包括使峰的对称因子降低至1以上的数量，且在此，降低是相对于在柱色谱法包括不存在沉降时间或小于该沉降时间的减少了的沉降时间、且对称因子大于1的情况下的对称因子而言的；或者提高包括使峰的对称因子增大至1以下的数量，且在此，增大是相对于在柱色谱法包括不存在沉降时间或小于该沉降时间的减少了的沉降时间、且对称因子小于1的情况下的对称因子而言的。

在另一方面中，提供一种包括在柱填充前减少浆料中的沉降体积的提高柱色谱中的色谱峰的对称因子(S)的方法，在此，沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的，在此，提高包括：当与在使用由新的浆料填充的柱来实施柱色谱法的情况下的峰相关的对称因子大于1时，使峰的对称因子降低至1以上的数量，或者，提高包括：当与在使用由新的浆料填充的柱来实施柱色谱法的情况下的峰相关的对称因子小于1时，使峰的对称因子增大至1以下的数量。

某个方式中，S的增大或减少可以是约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、或约80％的增大或减少。某个方式中，S的增大或减少可以是大于约1％、大于约2％、大于约3％、大于5％、或者大于10％、且/或小于约90％、小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％或者小于约40％的增大或减少。

另一方面中，提供一种通过色谱精制一种以上的化合物的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，在此，沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的。

另一方面中，提供一种填充色谱柱的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，在此，沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的。

某个方式中，沉降体积比(沉降体积比(％)＝沉降体积(ml)/ODS体积(ml)×100)在沉降时间的完成时实质上为恒定。沉降体积比在浆料向柱中的添加时，可以减少直至在沉降时间的完成时达到恒定值为止。某个方式中，沉降体积比减少至约150％～约140％、约140％～约130％、约120％～约110％或约110％～约100％。某个方式中，沉降体积比减少至小于约160％、小于约150％、小于约140％或者小于约130％且/或大于约100％、或者大于约105％的值。

某个方式中，沉降时间的结果是导致性能的提高、例如增大的N、接近1的S、增大的产率或者回收率、和/或减少的沉降体积，是约15～约25分钟、约18～约22分钟、或约20分钟。某个方式中，各沉降时间独立地是约0.5分钟～约5分钟、约5分钟～约10分钟、约10分钟～约15分钟、约15分钟～约20分钟、约20分钟～约25分钟、约25分钟～约30分钟、约30分钟～约35分钟、约35分钟～约40分钟、约40分钟～约45分钟、约45分钟～约50分钟、约50分钟～约5 5分钟、约55分钟～约60分钟、约60分钟～约65分钟、约65分钟～约70分钟、约70分钟～约75分钟、约75分钟～约80分钟、约80分钟～约85分钟、约85分钟～约90分钟、约90分钟～约95分钟、或约95分钟～约100分钟、约100分钟～约105分钟、约105分钟～约110分钟、约110分钟～约115分钟、约115分钟～约120分钟。在某个方式中，各沉降时间独立地是长于约0.5分钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、110分钟、120分钟、130分钟、140分钟、150分钟、200分钟、300分钟、400分钟、500分钟、600分钟、1200分钟、1440分钟、2880分钟、且/或小于200分钟、185分钟、175分钟、165分钟、155分钟、145分钟、135分钟、125分钟、115分钟、105分钟、95分钟、85分钟、75分钟、65分钟、55分钟、45分钟、35分钟、25分钟、15分钟、5分钟、3分钟。更长的沉降时间能够提供更良好的对称因子和/或理论塔板数，另一方面，更短的沉降时间能够提供柱的准备的增大容易性，其结果是可以得到生产率的增大。为了期望目的而可以选择适当的沉降时间。

浆料通过溶剂或流动相与固定相的混合而制备。浆料可以在柱的外部制备，接着，向柱中进行泵注入，或浆料可以将溶剂添加至柱后，将干燥固定相添加至柱中的溶剂，由此在柱内制备。添加可以一次性进行全部量，也可以分批以多次进行。或者，干燥固定相可以添加至干燥柱，接着将溶剂添加至柱，由此形成浆料。新的浆料包含以小于约10分钟、小于约8分钟、小于约6分钟、小于约4分钟、小于约2分钟或小于约1分钟的期间组合的溶剂或流动相和固定相。

新的浆料可以具有与沉降时间的完成时(或沉降的进行期间)的浆料的沉降体积比相比更高的沉降体积比。某个方式中，新的浆料的沉降体积比可以减少至约200％～约180％、约180％～约160％、约160％～约140％、约140％～约130％、约130％～约120％或约120％～约110％。某个方式中，新的浆料的沉降体积比可以减少大于约100％、大于约110％、大于约120％、或者大于约130％、且/或小于约200％、小于约180％、或者小于约160％。

方法可以进一步包括填充柱。填充优选在沉降时间的完成时、和/或沉降体积减少而实质上维持恒定时实施。填充可以包括对沉降的浆料施加填充压力，在柱内压缩浆料。一个方式中，填充压力是包含大气压的值。填充压力可以是约0.1MPa～约0.5MPa、约0.5MPa～约1MPa、约1MPa～约1.5MPa、约1.5MPa～约2MPa、约2MPa～约2.5MPa、约3MPa～约3.5MPa、约3.5MPa～约4M Pa、约4MPa～约4.5MPa、约4.5MPa～约5MPa、约5M Pa～约5.5MPa、约5.5MPa～约6MPa、约6MPa～约6.5MPa、约6.5MPa～约7MPa、约7MPa～约7.5MPa、约7.5MPa～约8MPa、约8MPa～约8.5MPa、约8.5MPa～约9MPa、或大于约9MPa。某个方式中，填充压力是约3.0MPa～约6.0MPa。某个方式中，填充压力是大于约0.1MPa、大于约0.5MPa、大于约1MPa、大于约2MPa、或者大于约3MPa、且/或小于约10MPa、小于约9MPa、小于约8MPa、小于约7MPa或者小于约6MPa。浆料可以在填充期间被压缩，柱进行排气。

某个方式中，方法进一步包括在柱上负载分析物质。柱可以在填充后和负载前用溶剂的流动相洗涤。方法可以在负载后进一步包括洗脱和分级。本说明书中记载的分析物质的检测可以在分级前、分级后或分级的期间实施。包含要精制的分析物质的试样混合物可以以基于所使用的柱的尺寸或固定相的质量的量而负载。某个方式中，试样混合物可以是约1mg～约10mg、约10mg～约100mg、约100mg～约5g、约5g～约10g、约10g～约50g、约50g～约100g、约100g～约1kg、约1kg～约10kg。某个方式中，试样混合物可以是大于约0.5mg、约1mg、约10mg、约100mg、约500mg或者约1g、且/或小于约20kg、约10kg或者约5kg。某个方式中，负载率可以是0.001％至1.0％、0.001％至5.0％、0.01％至5.0％、0.001％至0.01％、0.01％至0.1％、0.1％至1.0％、1.0％至5.0％。

含有分析物质、试样混合物构成要素和/或流动相的经洗脱的流动相的级分可以在贯穿洗脱整体的各种时点收集。例如，新的级分可以以每约5秒、每约10秒、每约15秒、每约20秒、每约25秒、每约30秒、每约35秒、每约40秒或它们的组合收集。某个方式中，最终级分可以在一定长度的期间、例如约0.5分钟～约5分钟、约5分钟～约10分钟、约10分钟～约20分钟、约20分钟～约40分钟的期间收集。某个方式中，最终级分可以从长于约0.1分钟、长于约0.3分钟、长于约0.5分钟、或者长于1分钟、且/或短于40分钟、短于30分钟、短于20分钟、或者短于10分钟的一定长度的期间收集。

要通过本发明的方法精制的分析物质包括脂肪酸、蛋白质、核酸和小分子、例如医药化合物或者合成或半合成的中间体。目标分析物质可以从含有其他不期望的构成要素、例如合成副产物、生物学物质或者基质、或与目标分析物质具有接近结构关系的物质、例如位置异构体、立体异构体、同系物或者镜像异构体的混合物中精制。

目标分析物质(单数或复数)可以包括脂肪酸或其衍生物、例如酯化脂肪酸。酯可以是甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯、庚酯、辛酯、壬酯、或癸酯。某个方式中，脂肪酸或其衍生物选自二十二碳六烯酸、巴豆酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、顺-6-十六碳烯酸、油酸、反油酸、11-十八碳烯酸、鳕烯酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、亚麻酸、皮诺敛酸、桐酸、5,8,11-二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、肾上腺酸、伯色五烯酸、二十碳五烯酸、全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、鰶鱼酸、二十四碳五烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、4,8,12,15,18,21-二十四碳六烯酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸、褐煤酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十八烷酸、三十九烷酸、四十烷酸或其酯化衍生物中的一种以上。

一个方式中，分析物质是二十碳五烯酸(EPA)或二十碳五烯酸乙酯(EPA-E)。EPA或(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸具有以下的结构：

[化学式1]

EPA-E(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸乙酯具有以下的结构：

[化学式2]

洗脱和流动相的蒸发后，分析物质可以具有大于约70％、大于约80％、大于约85％、大于约86％、大于约90％、大于约95％、大于约96.5％、大于约98％、大于约99％、大于约99.5％、大于约99.8％、或大于约99.9％的纯度。某个方式中，分析物质可以具有小于100％或小于99.9999％的纯度。某个方式中，产率是大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、或者大于80％、且/或小于100％、小于95％、小于90％或者小于85％。某个方式中，回收率是大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、且/或小于100％、小于99.9％、小于99.8％或者小于96％。

分析物质的保留时间可以是约0.5分钟～约2分钟、约2分钟～约4分钟、约4分钟～约6分钟、约6分钟～约8分钟、约8分钟～约10分钟、约10分钟～约12分钟、约12分钟～约14分钟、约14分钟～约16分钟、约16分钟～约18分钟、约18分钟～约20分钟、约20分钟～约22分钟、约22分钟～约24分钟、约24分钟～约26分钟、约26分钟～约28分钟、约28分钟～约30分钟、约30分钟～约32分钟、约32分钟～约34分钟、约34分钟～约36分钟、约36分钟～约38分钟或者约38分钟～约40分钟、或大于约0.5分钟、大于约1分钟、约1.5分大于、大于约2分钟、或者大于约5分钟、且/或小于50分钟、小于40分钟、小于30分钟或者小于20分钟。

内部标准为了决定分析物质相对于内部标准的相对的保留时间，或为了有助于分析物质的定量化，可以作为参照标记而添加至试样。内部标准以是与目标分析物质非常类似但不相同的化合物、例如目标分析物质的氘代衍生物的方式，可以由本领域技术人员适当选择。用于定量化目的的情况下，内部标准可以接着通过对分析物质的信号相对于内部标准的信号之比作为标准的分析物质浓度的函数而描点从而用于校正，在此，标准是针对所定量化的未知的分析物质试样而言用于用作参照而由本领域技术人员制备的已知的浓度的试样。

另一方面中，提供通过本说明书中记载的方法而精制的化合物或组合物。某个方式中，化合物或组合物是脂肪酸或其酯化衍生物、蛋白质、核酸或小分子、或包含它们。某个方式中，化合物或组合物是脂肪酸或其酯化衍生物、或包含它们。

某个方式中，化合物或组合物是二十二碳六烯酸、巴豆酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、顺-6-十六碳烯酸、油酸、反油酸、11-十八碳烯酸、鳕烯酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、亚麻酸、皮诺敛酸、桐酸、5,8,11-二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、肾上腺酸、伯色五烯酸、二十碳五烯酸、全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、鰶鱼酸、二十四碳五烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、4,8,12,15,18,21-二十四碳六烯酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸、褐煤酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十八烷酸、三十九烷酸、四十烷酸或其酯化衍生物、或包含这些。

某个方式中，其酯化衍生物是甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯、庚酯、辛酯、壬酯或癸酯。某个方式中，化合物是二十碳五烯酸乙酯。

某个方式中，化合物或组合物可以具有大于约70％、大于约80％、大于约85％、大于约86％、大于约90％、大于约95％、大于约96.5％、大于约98％、大于约99％、大于约99.5％、大于约99.8％、或大于约99.9％的纯度。某个方式中，化合物或组合物可以具有小于约100％或小于约99.9999％的纯度。某个方式中，化合物或组合物可以以大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、或大于80％的产率得到。某个方式中，化合物或组合物可以具有小于100％、小于95％、小于90％或小于80％的产率。某个方式中，化合物或组合物可以具有大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于98％、大于99％、或大于99.7％的回收率。某个方式中，化合物或组合物可以具有小于100％、小于99.9999％的回收率。

某个方式中，在组合物包含脂肪酸或其酯化衍生物的情况下，可以除了主成分之外还包含一种以上的成分。主成分以外的成分可以以组合物中约30％以下、约20％以下、约15％以下、约14％以下、约10％以下、约5％以下、约4.5％以下、约4％以下、约3.5％以下、约2％以下、约1％以下、约0.5％以下、约0.2％以下、或约0.1％以下的量含有。主成分为脂肪酸酯的情况下，作为除了主成分之外的成分，可以例示出其他脂肪酸酯。主成分为二十碳五烯酸酯的情况下，作为其他成分，可以举出二十二碳六烯酸酯、和本说明书中作为组合物的成分而例示的脂肪酸的酯。主成分为二十二碳六烯酸酯的情况下，作为其他成分，可以举出二十碳五烯酸酯、和本说明书中作为组合物的成分而例示的脂肪酸的酯。

某个方式中，组合物可以以一定以上的总计含量包含2种成分。总计含量例如大于约70％、大于约80％、大于约85％、大于约86％、大于约90％、大于约95％、大于约96.5％、大于约98％、大于约99％、大于约99.5％、大于约99.8％、或大于约99.9％。

某个方式中，组合物以一定以上的总计含量作为2种成分而包含脂肪酸或其酯化衍生物的情况下，可以除了以一定以上的总计含量包含的2种成分之外还包含一种以上的成分。除了以一定以上的总计含量包含的2种成分之外的成分可以以组合物中约30％以下、约20％以下、约15％以下、约14％以下、约10％以下、约5％以下、约4.5％以下、约4％以下、约3.5％以下、约2％以下、约1％以下、约0.5％以下、约0.2％以下、或约0.1％以下的量含有。以一定以上的总计含量包含的2种成分为2种脂肪酸酯的情况下，作为除了2种成分之外的成分，可以例示出其他脂肪酸酯。2种成分为二十碳五烯酸酯和二十二碳六烯酸酯的情况下，作为其他成分，可以举出除此之外的本说明书中作为组合物的成分而例示的脂肪酸的酯。

本发明的部分方式涉及包括以下的工序的通过柱色谱精制一种以上的化合物的方法：将固定相添加至柱中，和使包含固定相的浆料在柱中在静置时间(standing time)的期间静置。

本发明的部分方式涉及包括以下的工序的填充色谱柱的方法：将固定相添加至柱中，和使包含固定相的浆料在柱中在静置时间的期间静置。

本发明的部分方式涉及增大柱色谱中的理论塔板数(N)的方法，其包括以下的工序：将固定相添加至柱中，和使包含固定相的浆料在柱中在静置时间的期间静置；在此，N的增大是相对于无静置时间的柱色谱而言的，或在此，N的增大是相对于在小于静置时间的减少了的静置时间的期间静置的浆料而言的。

本发明的部分方式涉及提高柱色谱中的色谱峰的对称因子的方法，其包括使浆料在柱中在静置时间的期间静置，在此，提高包括使峰的对称因子降低至1以上的数量，且在此，降低是相对于在柱色谱法包括不存在静置时间或小于该静置时间的减少了的静置时间、且对称因子大于1的情况下的对称因子而言的；或提高包括使峰的对称因子增大至1以下的数量，且在此，增大是相对于在柱色谱法包括不存在静置时间或小于该静置时间的减少了的静置时间、且对称因子小于1的情况下的对称因子而言的。某个方式中，在柱色谱法包括该静置时间的情况下，或在柱色谱包括不存在静置时间或小于该静置时间的减少了的静置时间的情况下，除了静置时间之外的所有色谱条件是相同的。

这些方法的某个方式中，柱在静置时间的期间处于大气压下。这些方法的某个方式中，在静置时间后对柱施加压力。这些方法的某个方式中，各个静置时间独立地是约0.5分钟～约2分钟、约2分钟～约4分钟、约4分钟～约6分钟、约6分钟～约8分钟、约8分钟～约10分钟、约10分钟～约12分钟、约12分钟～约14分钟、约14分钟～约16分钟、约16分钟～约18分钟、约18分钟～约20分钟、约20分钟～约22分钟、约22分钟～约24分钟、约24分钟～约26分钟、约26分钟～约28分钟、约28分钟～约30分钟、约30分钟～约32分钟、约32分钟～约34分钟、约34分钟～约36分钟、约36分钟～约38分钟或约38分钟～约40分钟。某个方式中，静置时间独立地是约0.5分钟～约5分钟、约5分钟～约10分钟、约10分钟～约15分钟、约15分钟～约20分钟、约20分钟～约25分钟、约25分钟～约30分钟、约30分钟～约35分钟、约35分钟～约40分钟、约40分钟～约45分钟、约45分钟～约50分钟、约50分钟～约55分钟、约55分钟～约60分钟、约60分钟～约65分钟、约65分钟～约70分钟、约70分钟～约75分钟、约75分钟～约80分钟、约80分钟～约85分钟、约85分钟～约90分钟、约90分钟～约95分钟或约95分钟～约100分钟、约100分钟～约105分钟、约105分钟～约110分钟、约110分钟～约115分钟、约115分钟～约120分钟。

在这些方法的某个方式中，除了沉降体积之外的所有色谱条件在柱色谱法包括减少的沉降体积的情况下、和在柱色谱法使用被新的浆料填充的柱来实施的情况下相同。这些方法的某个方式中，新的浆料包含以长于约0.5分钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、110分钟、120分钟、和/或小于200分钟、185分钟、175分钟、165分钟、155分钟、145分钟、135分钟、125分钟、115分钟、105分钟、95分钟、85分钟、75分钟、65分钟、55分钟、45分钟、35分钟、25分钟的时间期间组合的流动相(或溶剂)和固定相。组合流动相(或溶剂)和固定相可以包括搅拌。这些方法的部分方式中，沉降体积的减少以约0分钟～约2分钟、约2分钟～约4分钟、约4分钟～约8分钟、约8分钟～约16分钟、约16分钟～约24分钟、约24分钟～约32分钟、约32分钟～约50分钟、约50分钟～约70分钟、约70分钟～约90分钟、约90分钟～约110分钟、约110分钟～约130分钟、约130分钟～约150分钟的时间长度进行。这些方法的部分方式中，沉降体积在其时间长度之后实质上维持恒定。这些方法的部分方式中，沉降体积的减少以静置时间进行。这些方法的部分方式中，减少沉降体积包括使混合物在大气压中静置。这些方法的部分方式中，在沉降体积的减少后对柱施加压力。这些方法的部分方式中，柱是轴向压缩柱。这些方法的部分方式中，浆料包含固定相和选自水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类或二氯甲烷中的一种以上。这些方法的部分方式中，浆料包含甲醇。这些方法的部分方式中，固定相包含C30、C22、C18、C8、C5、C4、联苯、氟苯基、亲水相互作用液相色谱(HILIC)固定相、丙烯酰胺、二氧化硅、苯基-己基固定相、极性嵌入烷基(polar embedded alkyl)和/或氟苯基丙基的颗粒。这些方法的部分方式中，固定相是C18的颗粒。

在静置时间的期间的静置优选为在大气压(约0.101325MPa)下发生。部分方式中，在静置时间的期间的压力是约0.1MPa～约0.2MPa、约0.2MPa～约0.4MPa、约0.4MPa～约0.6MPa、约0.6MPa～约0.8MPa或约0.8MPa～约1MPa。在部分方式中，在静置时间的期间的压力是小于约0.1MPa。部分方式中，在静置时间的期间的压力是大气压。部分方式中，在静置时间的期间的压力是大于0.01MPa、大于0.05MPa、或者大于0.1MPa、且/或小于1MPa、小于0.8MPa、小于0.6MPa、小于0.4MPa或者小于0.2MPa。

另一方面中，提供一种包括使浆料在静置时间的期间在柱中静置的增大柱色谱中的理论塔板数(N)的方法，在此，增大是相对于无静置时间、或浆料在小于该静置时间的减少了的静置时间的期间静置的柱色谱而言的。

另一方面中，提供一种包括使浆料在柱中在静置时间的期间静置的提高柱色谱中的色谱峰的对称因子(S)的方法，在此，提高包括使峰的对称因子降低至1以上的数量，且在此，降低是相对于在柱色谱法包括不存在静置时间或小于该静置时间的减少了的静置时间、且对称因子大于1的情况下的对称因子而言的；或提高包括使峰的对称因子增大至1以下的数量，且在此，增大是相对于在柱色谱法包括不存在静置时间或小于该静置时间的减少了的静置时间、且对称因子小于1的情况下的对称因子而言的。

在某个方式中，沉降体积比(沉降体积比(％)＝沉降体积(ml)/ODS体积(ml)×100)在静置时间的完成时实质上为恒定。沉降体积比在浆料向柱中的添加时，可以减少直至在静置时间的完成时达到恒定值为止。某个方式中，沉降体积比减少至约150％～约140％、约140％～约130％、约120％～约110％或约110％～约100％。某个方式中，沉降体积比减少至小于约160％、小于约150％、小于约140％或者小于约130％且/或大于约100％、或者大于约105％的值。

在某个方式中，静置时间的结果是导致性能的提高、例如增大的N、接近1的S、增大的产率或者保留、和/或减少的沉降体积，是约15～约25分钟、约18～约22分钟、或约20分钟。某个方式中，各静置时间独立地是约0.5分钟～约5分钟、约5分钟～约10分钟、约10分钟～约15分钟、约15分钟～约20分钟、约20分钟～约25分钟、约25分钟～约30分钟、约30分钟～约35分钟、约35分钟～约40分钟、约40分钟～约45分钟、约45分钟～约50分钟、约50分钟～约55分钟、约55分钟～约60分钟、约60分钟～约65分钟、约65分钟～约70分钟、约70分钟～约75分钟、约75分钟～约80分钟、约80分钟～约85分钟、约85分钟～约90分钟、约90分钟～约95分钟、或约95分钟～约100分钟、约100分钟～约105分钟、约105分钟～约110分钟、约110分钟～约115分钟、约115分钟～约120分钟。某个方式中，各静置时间独立地是长于约0.5分钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、110分钟、120分钟、130分钟、140分钟、150分钟、200分钟、300分钟、400分钟、500分钟、600分钟、1200分钟、1440分钟、2880分钟、且/或小于200分钟、185分钟、175分钟、165分钟、155分钟、145分钟、135分钟、125分钟、115分钟、105分钟、95分钟、85分钟、75分钟、65分钟、55分钟、45分钟、35分钟、25分钟、15分钟、5分钟、3分钟。更长的静置时间能够提供更良好的对称因子和/或理论塔板数，另一方面，更短的静置时间能够提供柱的准备的增大容易性，其结果是可以得到生产率的增大。为了期望目的而可以选择适当的静置时间。

新的浆料可以具有与静置时间的完成时(或静置的进行期间)的浆料的沉降体积比相比更高的沉降体积比。某个方式中，新的浆料的沉降体积比可以减少至约200％～约180％、约180％～约160％、约160％～约140％、约140％～约130％、约130％～约120％或约120％～约110％。某个方式中，新的浆料的沉降体积比可以减少大于约100％、大于约110％、大于约120％、或者大于约130％、且/或小于约200％、小于约180％、或者小于约160％。

方法可以进一步包括填充柱。填充优选在静置时间的完成时、和/或沉降体积减少而实质上维持恒定时实施。填充可以包括对静置的浆料施加填充压力，在柱内压缩浆料。一个方式中，填充压力是包含大气压的值。填充压力可以是约0.1MPa～约0.5MPa、约0.5MPa～约1MPa、约1MPa～约1.5MPa、约1.5MPa～约2MPa、约2MPa～约2.5MPa、约3MPa～约3.5MPa、约3.5MPa～约4M Pa、约4MPa～约4.5MPa、约4.5MPa～约5MPa、约5M Pa～约5.5MPa、约5.5MPa～约6MPa、约6MPa～约6.5MPa、约6.5MPa～约7MPa、约7MPa～约7.5MPa、约7.5MPa～约8MPa、约8MPa～约8.5MPa、约8.5MPa～约9MPa或大于约9MPa。某个方式中，填充压力是约3.0MPa～约6.0MPa。某个方式中，填充压力是大于约0.1MPa、大于约0.5MPa、大于约1MPa、大于约2MPa、或者大于约3MPa、且/或小于约10MPa、小于约9MPa、小于约8MPa、小于约7MPa或者小于约6MPa。浆料可以在填充期间被压缩，柱进行排气。

定义

“液相色谱”(LC)或“柱色谱法”在本说明书中使用时，是指通过含有由流体被微细分割的物质和/或具有毛细管通路的材料构成的固定材料(单数或复数)的柱而流动时的流体溶液的一种以上的构成要素的选择性保留或延迟的过程。保留是固定相和主流体相(例如流动相)之间的混合物的构成要素的相对分配的结果，后者通过固定材料而移动。LC用于2种以上的物质的混合物的分析和分离。LC包括例如高湍流液相色谱(high turbulenceliquid chromatography)(HTLC)、制备色谱、分析用色谱(例如HPLC)、模拟移动床色谱、真实移动床色谱和超临界流体色谱(SFC)。

本说明书中使用的“高湍流液相色谱”(HTLC)是指使用用于提高柱色谱之间的物质移动的速度、提高所提供的分离特征的湍流。其与以通过柱的试样的层流作为基础而进行对象的分析物质从试验试样中的分离的依赖于柱填充物的传统HPLC分析形成对照。HTLC应用于在利用质谱的分析之前用于检测药物的试样制备。参照例如Zimmer et al.,J.Chromatogr.A 854:23-35(1999)；还参照美国专利第5,968,367号；第5,919,368号；第5,795,469号；和第5,772,874号。

用于记载流动相溶剂或分析物质的“非极性”和“极性”这一术语可以用作相对于彼此的相对术语。例如，“非极性”可以是指极性最低的流动相中的溶剂，另一方面“极性”可以是指与“非极性”溶剂相比极性高的流动相中的溶剂。

“制备色谱”在本说明书中使用时，是指从含有与分析物质显著不同或甚至可以说类似的其他物质的混合物中粗分离特定的分析物质(例如小分子分析物质可以从含有蛋白质和其他大分子量种的混合物中分离)。这样的方法包括利用柱从复杂的混合物中选择性保留特定的溶质或分析物质，但不保留其他构成要素。接着，分析物质可以从柱中选择性去除，进一步为了使用或分析而被收集。制备色谱未必使用大的试样、或大的柱(虽然往往将非常大的柱用于制备色谱)。在制备色谱中，柱直径可以是数毫米～1米以上的范围，流动相体积可以是数毫升～数百升的范围。制备色谱中，从柱洗脱的分析物质可以于直列式容器(例如试样环管或管)中或容器中作为级分而收集。或者，分析物质可以在从制备柱洗脱后，导入在线分析用柱、或直接导入用于进一步分析的检测器。

“分析用色谱”在本说明书中使用时，是指密接关联的分子(例如类似的分子量的分子)的微细分离。分析用色谱中，分析物质在柱中分离，从柱洗脱，被监测或检测。术语“分析用柱”在本说明书中使用时，是指具有为了实现分析物质从试样中的其他物质中的分离而充分的理论塔板数(chromatographic plates)的色谱柱，在此，这样的分离对于能够检测和决定分析物质的存在或量而言是充分的。

“分析物质”在本说明书中使用时，是指要精制的、或要从其他构成要素的混合物中分离的一种以上的目标物质。

“峰”在本说明书中使用时，是指色谱图中的峰。色谱图是经时地示出通过检测器检测到的信号的图。分析物质被检测器检测到时，信号增大，色谱图示出图2和图3中所示那样的“峰”。色谱图中的各峰表示试样中的化学物质的存在。各峰用保留时间标记，色谱图中的时间从左向右增加。

“分离”在本说明书中使用时，是指基于相对运动中的相(例如流动相和固定相)间的它们的分配差，通过包含分析物质的混合物的构成要素的空间的分离而进行表征的过程。分离导致试样在柱上的负载和负载后的柱的洗脱的结果。

“分级”是某个量的混合物在相转移的过程中被分为多个更小的量的分离过程，在此，组成随着梯度而变动。不同级分在不同时点基于与各个构成要素(混合物或试样内的分析物质)的特定的特性、例如固定相和/或流动相相关的其亲和性的差异而收集。

“负载”在本说明书中使用时，是指将含有分析物质的试样应用于柱直至全部试样被容纳在柱内为止。典型的是，试样在所填充的柱的固定相的顶部被负载。在此，“顶部”是流动相通过柱而洗脱时最初接受流动相的固定相的末端。负载可以通过注射器、泵或试样对固定相的顶部的直接施用而实现。试样可以与最小量的流动相或者用于负载的其他溶剂混合，可以直接负载，或也可以与固定相一起干燥负载。干燥负载相当于将试样与浆料混合，从浆料中蒸发所有液体，接着，将试样和固定相的干燥混合物负载于柱中所填充的固定相的顶部。

“洗脱”在本说明书中使用时，是指为了去除在柱上未吸附的物质或要从分析物质中分离的物质，在负载后通过柱而流过溶剂(例如流动相)的过程。多次洗脱可以使用不同的流动相。

“理论塔板数”(N)是表示柱效率的指标。其记载按照塔板理论而定义的塔板的数量，可以用于基于计算而决定柱效率，在此，理论塔板数越大则峰越尖锐。理论塔板数以数值的形式包含在柱操作说明书和检查报告书中。若假定高斯分布(正态分布)，则理论塔板数通过下述的式(1)表示，在此，变量如图2的记载中定义那样。

[化学式3]

“对称因子”或“拖尾因子”(S)是表示峰对称性的程度的系数。其基于图3的记载中定义的变量而用下述的式(2)表示。S＞1的情况下，存在峰拖尾。S＝1的情况下，存在峰对称性(高斯分布)。S＜1的情况下，存在前延峰(逆拖尾)。如图4中图解那样的“峰拖尾”是指色谱图峰的后缘的伸长。

[化学式4]

“沉降的固定相”是指通过使浆料中包含的固定相沉降而形成的沉降层。典型的是，沉降层将浆料添加至柱后或在柱中形成后，在柱的底的表面形成。

“沉降体积”是指由通过使浆料中包含的固定相沉降而形成的沉降层所占的体积。

“固定相的填充层”是指将使浆料中包含的固定相沉降而形成的沉降层通过填充压力压缩而得到的层。

“固定相的填充层的体积”是指由将沉降层通过填充压力压缩而得到的固定相的填充层所占的体积。

“包含固定相的填充层的柱”是指在柱色谱中，导入包含固定相的浆料，浆料中包含的固定相沉降而形成沉降层，沉降层用填充压力挤压而形成了固定相的填充层的柱。

“沉降速度”是指静置时随着时间的经过而在浆料中形成固定相的沉降物的速度。

“浆料”是指固定相和液体的混合物。液体优选为流动相(或溶剂)，固定相优选为颗粒。某个方式中，浆料是包含固定相在其中悬浮的流动相(或溶剂)的粘性液体。溶剂可以是适合于形成浆料的任何溶剂，可以理解包括关于流动相而在本说明书中公开的溶剂(例如水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类、二氯甲烷或该技术中已知的任何其他适当的溶剂中的一种以上)。某个方式中，还可以理解浆料中的溶剂与用作流动相的溶剂为不同溶剂。

“浆料浓度”是指与浆料相关的流动相的单位体积的固定相的质量或体积。

“填充的”柱或将柱“填充”是指包括将固定相添加至柱中而制备浆料，或将在液体中包含固定相的浆料添加至柱，和对柱中的浆料施加压力的工艺。一个方式中，包括填充的色谱法使用可动活塞式柱而进行。通过施加压力，可以在色谱法之前压缩固定相。某个方式中，对柱中的浆料施加压力的工艺在沉降时间之后实施，优选为沉降时间是在大气压中，该工艺在与大气压相比更高的气压下进行。某个方式中，对柱中的浆料施加压力的工艺在静置时间之后实施，优选为静置时间在大气压中，该工艺在与大气压相比更高的气压下进行。

“静置时间”是指在将固定相和流动相预先混合而形成的浆料导入空柱的浆料填充中，全量导入浆料刚结束后起静置浆料的时间。该情况下，静置时间从全量导入浆料刚结束后起开始。此外，将流动相导入空柱后导入固定相的干燥填充中，“静置时间”是指从全量导入固定相刚结束后起使通过固定相的导入而产生的浆料静置的时间。该情况下，静置时间从全量导入固定相刚结束后起开始。进一步，“间隔静置时间”是指在分批导入浆料或固定相的情况下，导入一部分刚结束后起静置浆料的时间。在此，间隔静置时间从导入浆料或固定相的一部分刚结束后起开始。静置时间中，浆料中的固定相沉降。此外，静置时间从静置状态起在压力增加的时点结束。某个方式中，在流动相从柱排出的时点结束。本说明书中，静置时间是用于使柱导入后的固定相沉降的时间，与沉降时间一致。

“联苯”、“C30”、“C22”、“C18”、“C8”、“C5”、“C4”在本说明书中使用时，是指在柱填充材料(固定相)上存在的官能团。例如，联苯柱中，将通过柱而流动的材料暴露于未取代联苯，另一方面，C18柱中，将通过柱而流动的材料(例如流动相和分析物质)暴露于未取代的直链或分支的18-碳烷基。

与浆料的记载相关的“新的”是指最近制备的浆料、例如流动相(或溶剂)和固定相混合结束起1分钟后、5分钟后、10分钟后、15分钟后、20分钟后、40分钟后、60分钟后、120分钟后、180分钟后、240分钟后、300分钟后、360分钟后、480分钟后、960分钟后、1440分钟后的浆料。

“轴向压缩柱”包括安装在液压千斤顶上的可动活塞。活塞用于填充柱，如图1的工序3中例示那样，在动态(和可调节)的压缩下维持固定相。

“沉降”或“进行沉降”是指不搅拌浆料而使其静止的工艺。某个方式中，沉降在大气压下实施。某个方式中，沉降在小于填充的期间施加的压力的压力下实施。

“色谱条件”是指运行色谱的参数。例子包括填充压力、流动相和固定相的组成、浆料浓度、柱进行运转的压力、流动相梯度、流动相流速、所使用的柱类型、所使用的检测计和参数、所利用的试样制备方案、沉降时间和实施沉降的压力、静置时间和实施静置的压力。

“梯度”是指实施柱色谱期间的随着时间经过的流动相组成中的变化。溶剂通过柱而洗脱期间流动相的组成可能变化。可以添加洗脱期间以经时增加的百分率而不同的流动相。

“纯度”是表示组合物的主成分的含量的比率，例如可以使用内部标准而由GC的测定结果算出。

“目标物”是指由通过洗脱和分级而得到的单一的级分或多个级分的组合得到的目标组合物。

在本说明书中，特定的范围利用通过术语“约”而前缀的数值给出。术语“约”为了提供其所前缀的准确的数以及与接近该术语所前缀的数或大约为该数的数相关的文字上的支持而在本说明书中使用。在确定某一数是否接近具体记载的数或大约为该数时，与所记载的数接近或与其近似的没有记载的数可以是在呈现其的上下文中提供具体记载的数的实质上等同的量的数。某个方式中，约可以是指其所提及的数的±5％、±2.5％、或±1％。

除非另外定义，本说明书中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域中的本领域技术人员所通常理解的含义相同的含义。与本说明书中记载的方法和材料类似的或等同的所有方法和材料也可以在本发明的实施或试验中使用，代表性例示的方法和材料记载于此。

在提供值的范围的情况下，要理解处于该范围的上限～下限之间的各个值(除非上下文明确指明并非如此，至下限的单位的10分之1为止)和其记载的范围中的所有其他记载的值或处于其间的值包括在本发明的范围内。它们的更小的范围的上限和下限可以独立地包括在更小的范围中，其也包括在本发明的范围内，但受所记载的范围内任何具体排除的对象的限制。所记载的范围包括边界的一者或两者的情况下，排除它们所包含的边界中任一者或两者的范围也包括在本发明中。

本发明不限于所记载的特定的方式(这样的特定的方式当然可以变动)。本发明的范围被认为仅由随附的专利权利要求书限定，因此还应当理解本说明书中使用的术语法仅为记载特定的方式，而不是为了限定。

如若阅读本发明而由本领域技术人员明确的，本说明书中记载和图解的各个方式各自在不脱离本发明的范围和精神的情况下，具有从其他多个方式中任一特征容易分离、或与其容易组合的单独构成要素和特征。任何引用的方法可以以所引用的事件的顺序、或逻辑上可能的任何其他顺序实施。

本说明书中引用的所有出版物和专利以具体且单独表示各个单独的出版物或专利通过参照而援引的方式通过参照而在本说明书中援引，出版物为了公开和记载与其关联而引用的方法和/或材料，通过参照而在本说明书中援引。任何出版物的引用由于在申请日之前公开，因此不应当根据在先发明将本发明解释为承认不具有对所引用的出版物之前的日期的权利。进一步，所提供的出版日期可能与实时的出版日不同，其可能需要单独确认。

以下的实施例为了例示的目的而给出本发明的各种各样的方式，任何方式中均不意图限定本发明。本领域技术人员可以迅速理解为了实施本发明所提及的目的、得到所提及的最终目标和优点、以及实施本说明书中本来具有的目的、得到最终目标和优点而是充分适合的。本实施例与本说明书中记载的方法一起，代表了当前的方式，是例示性的，不意图作为对本发明的范围的限定。本领域技术人员可以想到通过专利权利要求书定义的本发明的精神内包括的其中的变更和其他使用。

实施例

实施例1：柱填充

涉及柱而使用的固相是ODS-SQ(反相C18)，具体而言是KE-ODS-50-SQ(YMC公司.、平均粒径50μm、比表面积350)。

关于轴向压缩柱，使用由YMC公司.制造的可动活塞式制备柱(型号DAU-50-700S)。内径为50mm。浆料的参数取决于与295g的ODS一起使用的甲醇溶剂(关东化学株式会社、高效液相色谱用甲醇)的量。填充溶剂量和填充的高度(300mm)如操作说明书中记载那样选择。涉及浆料的浓度如以下所述调整：浆料浓度(％)＝ODS(g)/甲醇(ml)×100。浆料浓度为42％、49％或59％的情况下，各自将700ml、600ml或500ml的甲醇与295g的ODS重量混合。

最初，研究了作为填充法的浆料填充。将295g的粉末状ODS加入1升的烧杯中，添加甲醇，将混合物用玻璃棒搅拌5分钟，制备浆料。从空柱的顶部添加悬浮状态的浆料。该工艺的方式在例如图1的工序1中图解。干燥填充的情况下，预先向柱中添加甲醇，接着，从柱的顶部分批添加ODS。各自的情况下，将ODS导入柱后，施加4MPa的填充压力，实施填充。将2柱床体积的甲醇通过柱而洗脱后，实施后续的实施例的性能试验。

实施例2：理论塔板数和对称因子

对实施例1的ODS-SQ填充柱，针对后续实施例相关的各填充技术，为了计算理论塔板数和对称因子，进行性能试验。使用的HPLC仪器是K-Prep Lab300S(YMC公司)。使用的可动活塞式制备柱是DAU-50-700S(YMC公司)。流速是65ml/分钟。线速度是2m/小时。溶剂是HPLC级别的甲醇(关东化学株式会社)。经精制的分析物质是二十碳五烯酸乙酯(EPA-E)，将其在甲醇中以0.4％(w/v)溶解，用于将1ml的甲醇溶液负载于柱。

如下所述预先制备EPA-E：对粗精制的沙丁油实施短行程蒸馏(SPD)。对SPD油在碱催化剂的存在下实施与乙醇的乙醇解反应，形成作为鱼油乙酯的EPA-E。接着，将鱼油乙酯使用精馏和反相分配型(ODS)的上述的HPLC柱进行精制。其后，若蒸馏而去除溶剂，则以面积百分比计得到97％的EPA-E。

针对GC分析使用的条件如下所述。

GC：6890N(Agilent Technologies)

柱：DB-WAX(Agilent Technologies)

30m×0.25mm ID、0.25μm膜厚

载气：调整以使得EPA达到13分钟

注入口：250℃、1μL、Split(1：50)

柱温度：210℃恒温

检测器：FID、260℃

尾吹气：氮气40mL/min.

接着，计算针对EPA-E的理论塔板数和对称因子。进行精制的3个试验，以记载各试验的结果的方式计算，取平均。理论塔板数使用半高全宽法计算。针对理论塔板数使用的式是以下的式：

理论塔板数(N/m)＝5.54×(tr/W0.5h)2/柱长(m)

式中，tr是保留时间，W0.5h是图2中图解那样的峰的高度的50％处的峰宽度。

针对对称因子的计算使用的式是以下的式：

对称因子(As0.05)＝W0.05h/(2×A0.05)

式中，W0.05h是峰高度的5％处的峰宽度，A0.05(本说明书中也称为式(2)的“f”)是作为在峰高度的5％处从峰的开始点(前缘)起算至峰振幅的顶点为止(例如通过峰顶点的y轴(垂线)为止)的水平距离而测定的峰的前半的峰宽度，其测定记载于例如图3的记载中。

实施例3：静置时间对柱性能的作用

研究将ODS-SQ导入柱中后的静置时间，决定其对理论塔板数和对称因子(如实施例2中记载那样计算)的作用。以42％或59％ODS重量/甲醇体积的浆料浓度运行柱。ODS的制造厂商的操作说明书中，未指示在ODS或包含ODS的浆料导入后放置静置时间。

从刚导入另外制备的浆料后起，使柱静置30分钟或120分钟，接着，对柱实施性能试验。结果示于表1～3。如表1～2中所示那样，理论塔板数在静置时更高，如表3中所示那样，峰对称性接近1。其可以认为原因在于，ODS沉降，能够均匀地填充。

在实验过程中，通过柱中的ODS的量、柱的内径和ODS的高度计算柱密度，可知30分钟的静置后、无静置后填充压力加压、和在30分静置后填充压力加压中不存在差异。

[表1]

浆料浓度(浆料％)	42	42	42
				静置时间(分钟)	0	30	120
理论塔板数	2533	2917	3187

[表2]

浆料浓度(浆料％)	59	59	59
				静置时间(分钟)	0	30	120
理论塔板数	2757	3287	3673

[表3]

浆料浓度(浆料％)	42	42	42	59	59	59
							静置时间(分钟)	0	30	120	0	30	120
对称因子	1.66	1.48	1.23	1.42	1.22	1.03

实施例4：干燥填充对峰性能的作用

将ODS-SQ的干燥填充设为49％的浓度下的填充法而研究。其他条件与实施例1和2中记载的浆料填充相同。结果示于表4。

[表4]

ODS SQ浓度(干燥％)	49	49
			静置时间(分钟)	0	30
理论塔板数	2533	3267
			对称因子	1.65	1.52

实施例5：间隔(interval)静置时间对柱性能的作用

研究向柱中刚导入ODS-SQ后起的间隔静置时间，决定其对理论塔板数和对称因子(如实施例2中记载那样计算)的作用。按照实施例1中记载的流程，以42％的浆料浓度，以4MPa的填充压力运行柱。ODS的制造厂商的操作说明书中，未指示在ODS或包含ODS的浆料导入后放置静置时间。

刚注入浆料的一半后起，使柱静置30分钟，接着，注入剩余的一半浆料，不设置静置时间而填充，接着，对柱实施性能试验。如表5中所示那样，理论塔板数在中途静置的情况下更高，峰对称性接近1。其可以认为原因在于，ODS的至少一半沉降，能够均匀地填充。

[表5]

ODS SQ浓度(浆料％)	42	42
			间隔静置时间(分钟)	0	30
理论塔板数	2533	2671
			对称因子	1.66	1.55

实施例6：使用各种各样的ODS对柱性能的静置时间的作用

研究ODS-B(Osaka Soda公司、Daisopa k SP-120-50-ODS-B、平均粒径50μm)、ODSS-20(YMC公司、YMC*GEL ODS-AQ-HG12nm S-20μm AQG12S21、平均粒径20μm)、ODS S-10(YMC公司、YMC*GEL ODS-AQ-HG12nm S-10μm AQC12S11、平均粒径10μm)、ODS-A(AGC Si-Tech公司、M.S.GEL C18(II)-EP-DM-20-100A、平均粒径20μm)或ODS-Y(YMC公司、YMC-Omega、YMC*GE L S-20um OMG 99S21、平均粒径20μm)在柱中导入后的静置时间，确定其对理论塔板数和对称因子(如实施例2中记载那样计算)的作用。针对各ODS，以49％或59％ODS重量/甲醇体积的浆料浓度运行柱。ODS的制造厂商的操作说明书中，其未指示在ODS或包含ODS的浆料导入后放置静置时间。其他条件与实施例1和2中记载的浆料填充相同。结果示于表6～8。

[表6]

[表7]

[表8]

实施例7：产率和回收率

通过HPLC分级决定产率和回收率。针对HPLC分级的条件如下所述。使用的HPLC仪器是K-Prep Lab300S(YMC公司)。使用的动态轴向压缩柱是DAU-50-700S(YMC公司)。流速是65ml/分钟。溶剂是HPLC级别的甲醇(关东化学株式会社)。检测是230nm中的UV。以0.8％的负载率负载2.36g的EPA-E(80％)。负载率(％)＝80％EPA-E(g)/ODS(g)×100。试验用ODS(KEODS-50-SQ)固定相实施。

如下所述地制备EPA-E。对粗精制的沙丁油，实施短行程蒸馏(SPD)。对SPD油在碱催化剂的存在下实施与乙醇的乙醇解反应，形成作为鱼油乙酯的EPA-E。通过精馏鱼油乙酯，精制为80％EPA-E。

在无静置时间的色谱法和有静置时间的色谱法两者中，将级分(Fr.)0从刚注入后至EPA-E峰的上升进行分级，接着，将Fr.1～38每10秒分级，接着，将Fr.39进行35分钟分级。从制备的级分中，使用真空蒸发仪馏去甲醇，作为内部标准物质，添加C23：0甲酯1mg/ml己烷溶液后，进行气相色谱法(GC)。由GC峰面积和内部标准之间的面积比算出各级分中的化合物的洗脱的量，以EPA-E的含量达到96.5％的方式选择级分，针对通过合并所选择的级分(无静置时间的色谱法中为Fr.5～17，有静置时间的色谱法中为Fr.4～17)得到的目标物，如下所述确定其产率和目标物中的EPA-E的回收率：

产率＝目标物的重量(g)/负载量(g)、

EPA-E回收率＝(目标物的重量(g)×EPA-E含量(96.5％))/(负载量(g)×EPA-E含量(80％))。

针对GC分析使用的条件如下所述。仪器是具有DB-WAX30m×0.25mm×0.25μm柱的6890N网络GC***(Agilent)。柱温度是210℃。注入温度是250℃，分离率(split rate)是1∶50，注入量是1μl。使用250℃的FID检测器。使用具有31cm/分钟的管线速度的氦气的载气。产率和EPA的回收率的结果示于表9。

[表9]

浆料浓度(浆料％)	59	59
			静置时间(分钟)	0	120
产率	47.8％	60.8％
			EPA回收率	54.9％	70.1％

如以下那样制备含有EPA-E和DHA-E的鱼油试样。对粗精制的沙丁油和金枪鱼油，实施短行程蒸馏(SPD)。对SPD油，在碱催化剂的存在下实施与乙醇的乙醇解反应，形成乙酯(EPA-E 12.99％、DHA-E 10.44％)。通过精馏乙酯，精制为36.40％的EPA-E和30.60％的DHA-E。以1.69％的负载率负载5.0g。

在无静置时间的色谱法和有静置时间的色谱法两者中，将级分(Fr.)0从刚注入后至EPA-E峰的上升进行分级，接着，将Fr.1～46每13秒分级，接着，将Fr.47进行45分钟分级。从制备的级分中，使用真空蒸发仪馏去甲醇，添加C23：0甲酯1mg/ml己烷溶液作为内部标准物质后，进行气体色谱法(GC)。由GC峰面积和内部标准之间的面积比算出各级分中的化合物的洗脱的量，以EPA-E和DHA-E的总计含量达到86％的方式选择级分，针对通过合并所选择的级分(无静置时间的色谱法中为Fr.8～21，有静置时间的色谱法中为Fr.7～25)得到的目标物，如下所述确定其产率以及目标物中的EPA-E和DHA-E的回收率：

产率＝目标物的重量(g)/负载量(g)、

EPA-E和DHA-E回收率＝(目标物的重量(g)×EPA-E和DHA-E的总计含量(86％))/(负载量(g)×EPA-E和DHA-E的总计含量(67％))。

针对GC分析使用的条件如下所述。仪器是具有DB-WAX30m×0.25mm×0.25μm柱的6890N网络GC***(Agilent)。柱温度是210℃。注入温度是250℃，分离率是1∶50，注入量是1μl。使用250℃的FID检测器。使用具有31cm/分钟的管线速度的氦气的载气。产率和EPA-E和DHA-E的回收率的结果示于表10。

[表10]

ODS浓度(浆料％)	59	59
			静置时间(分钟)	0	120
产率(％)	72.6	77.7
			EPA回收率(％)	93.37	99.73
DHA回收率(％)	86.75	98.50

实施例8：各ODS的粒径的中央值的测定

粒径的中央值表示以体积基准计50％的粒径，通过Horiba Ltd.的激光衍射/散射式粒径分布测定装置LA-920，使用具有作为分散介质的0.2w/v％六偏磷酸钠的流动池而确定。首先，使150～200ml的缓冲液在试样槽中循环，接着，添加各ODS直至激光透过率达到70％～95％的范围内。ODS的量是70mg～120mg。添加后，通过超声使ODS颗粒散射1分钟，接着，分析体积分布，算出粒径的中央值。结果示于表11。

[表11]

	粒径的中央值(μm)
				ODS-SQ	48.1	实施例1～5、7	表1～5、9
ODS-B	54.2	实施例6	表6
				ODS-S20	27.5	实施例6	表7
ODS-S10	17.1	实施例6	表7
				ODS-A	25.8	实施例6	表8
ODS-Y	259	实施例6	表8

Claims (45)

1.一种通过柱色谱法精制一种以上的化合物的方法，其包括以下的工序：

将固定相添加至柱中，并且

使包含所述固定相的浆料在沉降时间的期间在柱中沉降。

2.一种填充色谱柱的方法，其包括以下的工序：

将固定相添加至柱中，并且

使包含所述固定相的浆料在沉降时间的期间在柱中沉降。

3.一种增大柱色谱的理论塔板数N的方法，其包括以下的工序：

将固定相添加至柱中，并且

使包含所述固定相的浆料在沉降时间的期间在柱中沉降；

所述N的增大是相对于没有沉降时间的柱色谱法而言的，或者所述N的增大是相对于在小于所述沉降时间的沉降时间减少的期间进行沉降的浆料而言的。

4.一种提高柱色谱中的色谱峰的对称因子的方法，其包括使浆料在该柱中在沉降时间的期间沉降，

所述提高包括使所述峰的所述对称因子降低至1以上的数量，且所述降低是相对于在柱色谱法包括不存在沉降时间或小于所述沉降时间的减少了的沉降时间、且所述对称因子大于1的情况下的对称因子而言的；或者

所述提高包括使所述峰的所述对称因子增大至1以下的数量，且所述增大是相对于在所述柱色谱法包括不存在沉降时间或小于所述沉降时间的减少了的沉降时间、且所述对称因子小于1的情况下的对称因子而言的。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，在所述柱色谱法包括所述沉降时间的情况下、或者在所述柱色谱法包括不存在沉降时间或小于所述沉降时间的减少了的沉降时间的情况下，除了沉降时间之外的所有色谱法条件是相同的。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述柱在沉降时间的期间处于大气压下。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，在沉降时间后对所述柱施加压力。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，各个沉降时间独立地为约0.5分钟～约5分钟、约5分钟～约10分钟、约10分钟～约15分钟、约15分钟～约20分钟、约20分钟～约25分钟、约25分钟～约30分钟、约30分钟～约35分钟、约35分钟～约40分钟、约40分钟～约45分钟、约45分钟～约50分钟、约50分钟～约55分钟、约55分钟～约60分钟、约60分钟～约65分钟、约65分钟～约70分钟、约70分钟～约75分钟、约75分钟～约80分钟、约80分钟～约85分钟、约85分钟～约90分钟、约90分钟～约95分钟、或约95分钟～约100分钟、约100分钟～约105分钟、约105分钟～约110分钟、约110分钟～约115分钟、约115分钟～约120分钟。

9.一种通过柱色谱法精制一种以上的化合物的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，所述沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的。

10.一种填充色谱柱的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，所述沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的。

11.一种增大柱色谱中的理论塔板数N的方法，其包括减少浆料中的沉降体积，所述沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的，且所述N的增大是相对于所述柱被所述新的浆料填充后的柱色谱的N而言的。

12.一种提高柱色谱中的色谱峰的对称因子的方法，其包括在柱填充前减少浆料中的沉降体积，所述沉降体积的减少是相对于新的浆料的沉降体积而言的，

所述提高包括：当与在使用由新的浆料填充的柱来实施柱色谱法的情况下的所述峰相关的所述对称因子大于1时，使所述峰的所述对称因子降低至1以上的数量，或者，

所述提高包括：当与在使用由新的浆料填充的柱来实施柱色谱法的情况下的所述峰相关的所述对称因子小于1时，使所述峰的所述对称因子增大至1以下的数量。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，在所述柱色谱法包括减少了的所述沉降体积的情况下、或者在所述柱色谱法使用由新的浆料填充的柱来实施的情况下，除了沉降体积之外的全部色谱法条件是相同的。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述新的浆料包含以小于约10分钟、小于约8分钟、小于约6分钟、小于约4分钟、小于约2分钟或小于约1分钟的时间期间组合的流动相和固定相。

15.根据权利要求9～14中任一项所述的方法，其中，所述沉降体积的减少以约0分钟～约2分钟、约2分钟～约4分钟、约4分钟～约6分钟、约6分钟～约8分钟、约8分钟～约10分钟、约10分钟～约12分钟、约12分钟～约14分钟、约14分钟～约16分钟、约16分钟～约18分钟、约18分钟～约20分钟、约20分钟～约22分钟、约22分钟～约24分钟、约24分钟～约26分钟、约26分钟～约28分钟、约28分钟～约30分钟、约30分钟～约32分钟、约32分钟～约34分钟、约34分钟～约36分钟、约36分钟～约38分钟或约38分钟～约40分钟的时间长度进行。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述沉降体积在所述时间长度之后实质上维持恒定。

17.根据权利要求9～16中任一项所述的方法，其中，所述沉降体积的减少以沉降时间进行。

18.根据权利要求9～17中任一项所述的方法，其中，减少沉降体积包括使混合物在大气压中沉降。

19.根据权利要求9～18中任一项所述的方法，其中，在所述沉降体积的减少后对柱施加压力。

20.根据权利要求1～18中任一项所述的方法，其中，柱为轴向压缩柱。

21.根据权利要求1～20中任一项所述的方法，其中，所述浆料包含固定相以及选自水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类或二氯甲烷中的一种以上。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述浆料包含甲醇。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，所述固定相包含大于50μm、大于45μm、大于40μm、大于35μm、大于30μm、大于25μm、大于20μm、大于15μm、或大于10μm的通过激光衍射散射法测定的平均粒径。

24.根据权利要求21或23所述的方法，其中，所述固定相包含选自C30、C22、C18、C8、C5、C4、联苯、氟苯基、亲水相互作用液相色谱(HILIC)固定相、丙烯酰胺、二氧化硅、苯基-己基固定相、极性嵌入烷基和氟苯基丙基中的至少一种中的颗粒。

25.根据权利要求21～24中任一项所述的方法，其中，所述固定相包含C18的颗粒。

26.根据权利要求1～25中任一项所述的方法，其中，色谱法包括使用包含选自水、甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、己烷类、二氯甲烷、或超临界二氧化碳中的一种以上的流动相进行洗脱。

27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述流动相包含甲醇。

28.根据权利要求1～27中任一项所述的方法，其中，色谱法包括流动相，所述流动相包含选自甲酸、甲酸铵、三甲基胺、氨和氢氧化铵中的一种以上的添加剂。

29.根据权利要求1～28中任一项所述的方法，其中，柱色谱法包括流动相梯度。

30.根据权利要求1～29中任一项所述的方法，其中，色谱法包括选自脂肪酸或其酯化衍生物、蛋白质、核酸和小分子中的一种以上的分析物质的精制。

31.根据权利要求1～30中任一项所述的方法，其中，色谱法包括一种以上的脂肪酸或其酯化衍生物的精制。

32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述脂肪酸选自二十二碳六烯酸、巴豆酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、顺-6-十六碳烯酸、油酸、反油酸、11-十八碳烯酸、鳕烯酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、亚麻酸、皮诺敛酸、桐酸、5,8,11-二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、肾上腺酸、伯色五烯酸、二十碳五烯酸、全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、鰶鱼酸、二十四碳五烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、4,8,12,15,18,21-二十四碳六烯酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸、褐煤酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十八烷酸、三十九烷酸和四十烷酸中的一种以上。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其中，所述脂肪酸的酯化衍生物为甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯、庚酯、辛酯、壬酯或癸酯。

34.根据权利要求1～33中任一项所述的方法，其中，色谱法包括二十碳五烯酸乙酯和/或二十二碳六烯酸乙酯的精制。

35.根据权利要求1～34中任一项所述的方法，其中，所述浆料通过以下的工序形成：

a)在所述浆料添加到所述柱之前，预先将固定相和流动相混合；或者

b)将流动相添加到所述柱中，接着，将固定相添加至所述流动相。

36.根据权利要求34所述的方法，其中，所述固定相分批添加至所述流动相。

37.一种化合物或组合物，其通过权利要求1～36中任一项所述的方法精制而成。

38.根据权利要求37所述的化合物或组合物，其中，所述化合物是脂肪酸或其酯化衍生物、蛋白质、核酸或小分子。

39.根据权利要求37或38所述的化合物或组合物，其中，所述化合物是脂肪酸或其酯化衍生物。

40.根据权利要求39所述的化合物或组合物，其中，所述化合物是二十二碳六烯酸、巴豆酸、肉豆蔻烯酸、棕榈油酸、顺-6-十六碳烯酸、油酸、反油酸、11-十八碳烯酸、鳕烯酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸、亚油酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、亚麻酸、皮诺敛酸、桐酸、5,8,11-二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、肾上腺酸、伯色五烯酸、二十碳五烯酸、全顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸、鰶鱼酸、二十四碳五烯酸、顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、4,8,12,15,18,21-二十四碳六烯酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸、褐煤酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十八烷酸、三十九烷酸、四十烷酸或其酯化衍生物。

41.根据权利要求39或40所述的化合物或组合物，其中，所述脂肪酸的酯化衍生物是甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、戊酯、己酯、庚酯、辛酯、壬酯或癸酯。

42.根据权利要求37～41中任一项所述的化合物或组合物，其中，所述化合物是二十碳五烯酸乙酯和/或二十二碳六烯酸乙酯。

43.根据权利要求37～42中任一项所述的化合物或组合物，其中，所述化合物或组合物具有约80％以上、约85％以上、约86％以上、大于约90％、大于约95％、约96.5％以上、大于约98％、大于约99％、大于约99.5％、大于约99.8％、或大于约99.9％的纯度。

44.根据权利要求36～43中任一项所述的化合物或组合物，其中，所述化合物或组合物具有大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、或大于80％的产率。

45.根据权利要求36～43中任一项所述的化合物或组合物，所述化合物或组合物具有大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于98％、大于99％、或大于99.7％的回收率。

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