CN110684824B - 一种用于检测布鲁氏菌抗原的免疫磁珠试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测布鲁氏菌抗原的免疫磁珠试剂盒，属于生物技术领域。所述试剂盒包括：免疫磁珠、qPCR反应混合液、检测布鲁氏菌的上游引物、下游引物和探针；所述免疫磁珠为鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆IgG抗体与磁珠的偶联物。本发明所述试剂盒灵敏度高、稳定性好，快速有效，与传统分离方法相比，克服了布鲁氏菌病料检出率低以及直扩抗原检测过程中布鲁氏菌病原易降解，且病原DNA提取过程中使用的待检液体体积有限导致所提取的DNA无法达到qPCR检测的最低要求。

Description

一种用于检测布鲁氏菌抗原的免疫磁珠试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测布鲁氏菌抗原的免疫磁珠试剂盒。

背景技术

布鲁氏杆菌是革兰氏阴性菌兼性细胞内寄生的细菌，具有独特的细胞内生存和免疫的机制，是一种自然疫源性疾病。布鲁氏菌不仅分布非常的广泛，而且可以寄生在多个动物宿主之间，也可以通过动物传染到人这一宿主上，导致人感染布鲁氏菌病，是一种严重危害人和动物健康的***反应性人畜共患传染病。布鲁氏菌病可以通过皮肤黏膜、消化道以及垂直传播等多种途径引起动物感染，其中最危险的传染源为患病的妊娠动物。布鲁氏菌可以伴随分娩或流产时胎儿、羊水和胎衣排出，另外乳汁也是重要的传染源之一。布鲁氏菌主要感染动物为牛、羊、猪和犬等动物。目前，采用1985年WHO所公布的分型法，按照感染动物的不同和抗原性的差异将布鲁氏菌属分为6个种19个生物型，即羊布鲁氏菌(B.melitensis，3个生物型)、牛布鲁氏菌(B.abortus，8个生物型)、猪布鲁氏菌(B.suis，5个生物型)、绵羊附睾布鲁氏菌(B.ovis，1个生物型)、沙林鼠布鲁氏菌(B.neotomae，1个生物型)、犬布鲁氏菌(B.canis，1个生物型)。2007年Bortg从鲸鱼、海豚、海豹等海洋哺乳动物分离到鲸型布鲁氏菌(B.ceti)和鳍型布鲁氏菌(B.pinnipedialis)。2008年又发现了田鼠种布鲁氏菌(B.microti)。目前，流产布氏杆菌(牛种菌，Brucella abortus)、猪种布鲁氏杆菌(B.suis)、马尔他布氏杆菌(羊种菌，B.melitensis)和犬种菌(B.canis)对人类致病，且其致病力有所差异，临床上以羊、牛、猪种三种感染意义最大，其中羊种致病力最强。另外，布鲁氏菌在感染动物和人的过程中会产生干扰现象，由于布鲁氏菌存在许多的种型，且毒力强弱也各有不同，在寄生的过程中会出现干扰现象，给布鲁氏菌病的防控带来极大的挑战。

目前，针对布鲁氏菌感染的常规检测及诊断方法很多，而病原学诊断检测方法有：检样、增菌培养、分离培养、动物试验、染色镜检、凝集反应、生化试验、染色试验和PCR检验等。由于布鲁菌生长缓慢，对营养要求高，易在培养过程中污染杂菌，且受培养环境及操作者手法等因素影响较大，从而导致分离率低、分离难度大操作繁琐，耗时长，存在一定的生物安全问题，不适用于快速诊断和大量样品的处理，而且大部分组织样品需要通过研磨呈悬液状，这样在一定程度上是稀释了样品中的细菌浓度，并且组织中的其他成分也会干扰实验结果，造成假阴性检测结果。因此，研究并发展高度敏感的布鲁氏菌检测技术是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测布鲁氏菌抗原的免疫磁珠试剂盒。本发明所述试剂盒实现了对布鲁氏菌检测的最低限为10⁵CFU/mL，对其它细菌检测为阴性，没有发生交叉反应，且组内重复的变异系数在0.97％～1.23％，组间重复的变异系数在0.24％～1.23％，具有较好的重复性。

本发明提供了一种用于检测布鲁氏菌的免疫磁珠试剂盒，所述试剂盒包括：免疫磁珠、qPCR反应混合液、检测布鲁氏菌的上游引物、下游引物和探针；所述免疫磁珠为鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆IgG抗体与磁珠的偶联物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述探针为如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1的物质。

优选的是，所述试剂盒还包括PBS缓冲液。

优选的是，所述免疫磁珠以免疫磁珠悬液形式保存，所述免疫磁珠在所述免疫磁珠悬液中的浓度为1mg/mL；所述免疫磁珠悬液的溶剂包括PBS缓冲液。

优选的是，所述免疫磁珠的制备方法包括以下步骤：

1)将磁珠洗涤，重悬，得到洗涤重悬后的磁珠；

2)将过量的鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆IgG抗体与步骤1)得到的洗涤重悬后的磁珠混合，37℃震荡15～60min，得到免疫磁珠混悬液；

3)将步骤2)得到的免疫磁珠混悬液进行磁力吸附，除去上清，洗涤，重悬，得到免疫磁珠。

优选的是，步骤2)所述鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆IgG抗体与步骤1)所述磁珠的质量比为100μg/6mg以上。

优选的是，步骤1)和步骤3)所述洗涤和重悬使用PBS缓冲液；所述PBS缓冲液为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。

优选的是，所述免疫磁珠试剂盒的使用方法包括以下步骤：

(1)将免疫磁珠与待检验样品混合于离心管中，37℃震荡反应20～60min；

(2)进行磁力吸附，弃去上清，洗涤，重悬，得到富集布鲁氏菌的免疫磁珠重悬液；

(3)热裂解法处理步骤(2)所述富集布鲁氏菌的免疫磁珠重悬液，得到释放的布鲁氏菌DNA；

(4)将步骤(3)得到的释放的布鲁氏菌DNA与qPCR反应混合液、检测布鲁氏菌的上游引物、下游引物和探针混合，进行qPCR扩增；

(5)当CT值<28时，则判定为布鲁氏菌阳性，当CT值≥28时，则判定为布鲁氏菌阴性。

优选的是，步骤(1)中待检验样品与免疫磁珠的混合体积比为4～6。

优选的是，步骤(3)所述热裂解法的反应程序为：95℃裂解10min后冰浴3min。

优选的是，步骤(4)所述qPCR扩增的反应体系每20μL包括：

ProbeqPCR SuperMix 10μL；DNA模板5μL；RNase Free dH₂O2.6μL；上游引物0.8μL；下游引物0.8μL，探针引物0.8μL；

所述qPCR扩增的反应程序为：95℃5min；95℃变性10s，60℃复性30s，共进行40个循环；4℃保存。

本发明提供了一种用于检测布鲁氏菌抗原的免疫磁珠试剂盒。本发明所述试剂盒能够克服现有技术中存在的布鲁氏菌抗原检测过程中由于布鲁氏菌病原易降解，且病原DNA提取过程中使用的待检毒液体积有限导致所提取的DNA无法达到qPCR检测的最低要求，而出现假阴性结果的问题。本发明所述试剂盒中的特异性引物以Omp19基因片段为靶点，实现对布鲁氏菌的检测，本发明所述试剂盒还包括可用于富集布鲁氏菌病原的特异性免疫磁珠，能够实现布鲁氏菌的高效检测，为布鲁氏菌抗原的检测提供了一种有效的技术手段。试验结果表明，本发明所述试剂盒对布鲁氏菌检测的最低限为10⁵CFU/mL，对其它细菌检测为阴性，没有发生交叉反应，且组内重复的变异系数在0.97％～1.23％，组间重复的变异系数在0.24％～1.23％，具有较好的重复性；还能够克服传统检测方法周期时间长、步骤繁琐和费时费力等缺点，使检测时间大大缩短，达到省时省力和快速灵敏的检测要求。

附图说明

图1为本发明提供的鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆IgG抗体的纯化结果；其中，M：蛋白Marker；1：流穿液；2：洗涤1；3：洗涤2；4：洗涤3；5：洗涤4；6：洗脱1；7：洗脱2；8：洗脱3；

图2本发明提供的通过qPCR方法检测免疫磁珠特异性的结果；其中，S1：M5疫苗菌液；S2：A19疫苗菌液；S3：S2疫苗菌液；S4：大肠杆菌；S5：小肠耶尔森氏菌；S6：金黄色葡萄球菌；S7：沙门氏菌菌液；

图3为本发明提供的通过qPCR方法检测免疫磁珠敏感性的结果；其中，M5菌液浓度分别1×10⁸、1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、10CFU/mL。

具体实施方式

本发明提供了一种用于检测布鲁氏菌的免疫磁珠试剂盒，所述试剂盒包括：免疫磁珠、qPCR反应混合液、检测布鲁氏菌的上游引物、下游引物和探针；所述免疫磁珠为鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆IgG抗体与磁珠的偶联物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述探针为如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1的物质。本发明优选以Omp19基因片段(SEQID NO:4所示)为靶点的，Omp19基因的选择能确保检测的可靠性和稳定性，用于检测布鲁氏菌抗原的引物对的设计与合成。在本发明中，所述上游引物(Omp19F)的核苷酸序列为CCCGGTGAACTGGCTAATC(SEQ ID NO:1所示)；下游引物(Omp19R)为TCGTAAAGGACGAGTTGCTTG(SEQ ID NO:2所示)，所述探针(Probe)为：FAM-CCTCCTGGGCCGTCAATGGCAAG-BHQ1，所述探针的核苷酸序列为CCTCCTGGGCCGTCAATGGCAAG(SEQ ID NO:3所示)。

在本发明中，所述试剂盒还包括PBS缓冲液。在本发明中，所述PBS缓冲液的作用为作为洗涤液。在本发明中，所述PBS缓冲液优选为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。

在本发明中，所述免疫磁珠以免疫磁珠悬液形式保存，所述免疫磁珠在所述免疫磁珠悬液中的浓度为1mg/mL；所述免疫磁珠悬液的溶剂包括PBS缓冲液。在本发明中，所述PBS缓冲液优选为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。

在本发明中，所述免疫磁珠的制备方法包括以下步骤：

1)将磁珠洗涤，重悬，得到洗涤重悬后的磁珠；

2)将过量的鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆IgG抗体与步骤1)得到的洗涤重悬后的磁珠混合，37℃震荡15～60min，得到免疫磁珠混悬液；

3)将步骤2)得到的免疫磁珠混悬液进行磁力吸附，除去上清，洗涤，重悬，得到免疫磁珠。

本发明将磁珠洗涤，重悬，得到洗涤重悬后的磁珠。本发明优选使用PBS缓冲液进行洗涤和重悬操作。在本发明中，所述洗涤和重悬操作优选在EP管中进行。在本发明中，所述磁珠优选为磁性纳米球，本发明所述磁性纳米球优选购自于武汉珈源量子点技术开发有限责任公司，货号：MNS-800)。在本发明中，磁珠原液优选每200μL体积中含6mg的磁珠。在本发明中，所述磁力吸附的时间优选为3～5min，所述磁力吸附优选采用磁力架进行。本发明对所述磁力架的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售磁力架即可。在本发明中，所述洗涤的次数优选为2～4次，更优选为3次。在本发明中，所述洗涤和重悬优选使用PBS缓冲液；所述PBS缓冲液为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。当本发明对每6mg磁珠进行操作时，优选使用600μLPBS缓冲液进行重悬。

得到洗涤重悬后的磁珠后，本发明将过量的鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆IgG抗体与洗涤重悬后的磁珠混合，37℃震荡15～60min，得到免疫磁珠混悬液。在本发明中，所述鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆IgG抗体与所述磁珠的质量比优选为100μg/6mg以上。在本发明中，所述震荡的时间优选为30min。

得到免疫磁珠混悬液后，本发明将免疫磁珠混悬液进行磁力吸附，除去上清，洗涤，重悬，得到免疫磁珠。在本发明中，所述洗涤和重悬优选使用PBS缓冲液；所述PBS缓冲液为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。在本发明中，所述免疫磁珠的终浓度优选为1mg/mL。

在本发明中，所述免疫磁珠试剂盒的使用方法包括以下步骤：

(1)将免疫磁珠与待检验样品混合于离心管中，37℃震荡反应20～60min；

(2)进行磁力吸附，弃去上清，洗涤，重悬，得到富集布鲁氏菌的免疫磁珠重悬液；

(3)热裂解法处理步骤(2)所述富集布鲁氏菌的免疫磁珠重悬液，得到释放的布鲁氏菌DNA；

(4)将步骤(3)得到的释放的布鲁氏菌DNA与qPCR反应混合液、检测布鲁氏菌的上游引物、下游引物和探针混合，进行qPCR扩增；

(5)当CT值<28时，则判定为布鲁氏菌阳性，当CT值≥28时，则判定为布鲁氏菌阴性。

本发明将免疫磁珠与待检验样品混合于离心管中，37℃震荡反应20～60min。实现布鲁氏菌(病原)的富集。在本发明中，所述离心管优选为1.5mL的EP管。在本发明中，所述待检验样品与免疫磁珠的混合体积比优选为4～6，更优选为5，即每100μL待检样品检测时使用的免疫磁珠量优选为20μL。

本发明对病原进行富集后，进行磁力吸附，弃去上清，洗涤，重悬，得到富集布鲁氏菌的免疫磁珠重悬液。完成对富集病原免疫磁珠的洗涤。在本发明中，所述洗涤的次数优选为2～4次，更优选为3次。在本发明中，所述重悬优选加入磁珠的体积2～5倍体积的PBS缓冲液。

得到富集布鲁氏菌的免疫磁珠重悬液后，本发明采用热裂解法处理富集布鲁氏菌的免疫磁珠重悬液，得到释放的布鲁氏菌DNA。在本发明中，步骤3)所述热裂解法的反应程序为：95℃裂解10min后冰浴3min。

得到释放的布鲁氏菌DNA后，本发明将释放的布鲁氏菌DNA与qPCR反应混合液、检测布鲁氏菌的上游引物、下游引物和探针混合，进行qPCR扩增。在本发明中，所述qPCR反应混合液优选包括：(

Probe qPCR SuperMix和RNase Free dH₂O。具体的，本发明所述所述qPCR扩增的反应体系优选每20μL包括：

Probe qPCRSuperMix 10μL；DNA模板5μL；RNase Free dH₂O 2.6μL；上游引物0.8μL；下游引物0.8μL，探针引物0.8μL。在本发明中，所述qPCR扩增的反应程序优选为：95℃5min；95℃变性10s，60℃复性30s，共进行40个循环；4℃保存。

扩增后，本发明根据qPCR反应体系的CT值结果进行判断样品中是否含有布鲁氏菌。当CT值<28时，则判定为布鲁氏菌阳性，当CT值≥28时，则判定为布鲁氏菌阴性。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种用于检测布鲁氏菌抗原的免疫磁珠试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

以Omp19基因片段(SEQ ID NO:4所示)为靶点的，用于检测布鲁氏菌抗原的引物对的设计与合成，根据GenBank中布鲁氏菌流产株BRS 19kDa外膜蛋白(Omp19)基因组序列(登录号：KP101384.1)设计针对Omp19基因的特异性引物对，所述引物对的序列如下：

上游引物：CCCGGTGAACTGGCTAATC(SEQ ID NO:1所示)；

下游引物：TCGTAAAGGACGAGTTGCTTG(SEQ ID NO:2所示)；

探针：FAM-CCTCCTGGGCCGTCAATGGCAAG-BHQ1(SEQ ID NO:3所示)；

ATGGGAATTTCAAAAGCAAGTCTGCTCAGCCTCGCGGCGGCTGGCATTGTCCTGGCCGGGTGCCAGAGCTCCCGGCTTGGTAATCTCGATAATGTTTCGCCTCCGCCGCCGCCTGCACCGGTCAATGCTGTTCCGGCAGGCACGGTGCAGAAAGGCAATCTTGATTCTCCCACACAATTCCCCAATGCGCCCTCCACGGATATGAGCGCGCAATCCGGCACACAGGTCGCAAGCCTGCCGCCTGCATCCGCACCGGACCTGACGCCCGGCGCCGTGGCTGGCGTCTGGAGCGCCTCGCTTGGTGGTCAGAGCTGCAAGATCGCGACGCCGCAGACCAAATATGGCCAGGGCTATCGCGCAGGCCCGCTGCGCTGCCCCGGTGAACTGGCTAATCTTGCCTCCTGGGCCGTCAATGGCAAGCAACTCGTCCTTTACGATGCGAACGGCGGTACGGTTGCCTCGCTCTATTCTTCAGGACAGGGCCGCTTCGATGGCCAGACCACCGGCGGGCAGGCCGTGACGCTGTCGCGCTGA(SEQ ID NO:4所示)。

所述引物对交由生物公司合成。

实施例2

免疫磁珠的制备

(一)鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆抗体腹水IgG的纯化(布鲁氏菌M5抗原购自于青海生物药品厂有限公司)：

瑞典法玛西亚公司AKTA FPLC蛋白纯化***具体操作步骤：

1)将仪器的输液入口(A、B)分别放入相应所需缓冲液中，打开电脑，选择UNICORN软件，在***控制界面中，选择“manual pump wash FPLC”选择使用的入口A，执行功能冲洗纯化***的管道及泵；

2)连接G蛋白亲和层析蛋白纯化柱；

3)***设置：在***控制界面中，选择“manual pump Flow”输入流速，“insertalarm & mon alarm pressure”中输入泵的压力；

4)平衡纯化柱：用1MpH 9.0的Tris-HCl缓冲液平衡纯化柱的pH；

5)上样：将M5抗原(布鲁氏菌M5抗原)免疫的小鼠制备单克隆抗体腹水用蒸馏水做1：5稀释后，在加样管中加入10mL，Binding Buffer的电导控制在50-60mS/cm，pH 7.0-7.4，流速为1.0mL/min，流穿约0.5h左右，收集流穿液，每2ml收集1管，依次命名为流穿液1，流穿液2。

6)洗脱：待吸收峰稳定后，加Elution Buffer，Elution Buffer的pH控制在2.5-3.0左右，流速为1.0mL/min，观察吸收峰，在吸收峰急速上升时控制样品接收器接收洗脱液，收集洗脱液时每2mL收集一管，依次命名为洗脱液1，洗脱液2……收集后立即加入pH9.0的Tris-HCl缓冲液中和洗脱液的pH，使其pH保持在中性或弱碱性。

7)洗脱完毕后，先用蒸馏水冲洗泵及管道，再用20％乙醇继续冲洗。

8)用NanoDrop2000 A280测定回收纯化的IgG浓度，并跑SDS-PAGE分析纯化后的IgG纯度，纯化效果图见图1。选取流穿样品、洗涤样品和洗脱样品进行SDS-PAGE鉴定纯化效果，其结果如图1所示，蛋白得到较好的纯化。

(二)免疫磁珠的制备

1)磁珠的洗涤：取磁珠原液于EP管内，利用磁力架吸附3-5min，用PBS缓冲液洗涤3次，最后用PBS缓冲液重悬；

2)抗体的偶联：将过量的鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆IgG抗体加入到步骤1)重悬后的磁珠中，混匀，37℃震荡30-60min，得到含有免疫磁珠的混悬液；

3)免疫磁珠的分离：将步骤2)得到的混悬液利用磁力架吸附3-5min，除去上清，用PBS缓冲液洗涤3次，最后用PBS缓冲液重悬，即获得所需的免疫磁珠，其浓度为1mg/mL。

其中，所用的PBS缓冲液为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。

(三)免疫磁珠的特异性检测：

1)分别取20μL制备好的免疫磁珠于7个1.5mL的EP管内，分别加入100μL M5疫苗(S1)、A19疫苗(S2)、S2疫苗(S3)、大肠杆菌(S4)、小肠耶尔森氏菌(S5)、金黄色葡萄球菌(S6)和沙门氏杆菌(S7)。用移液枪吸打混匀，37℃反应30min或4℃反应过夜(反应过程中不定期用移液枪混匀)；

2)充分反应后，取出EP管，放在磁力架上吸附3-5min，用移液枪将上清液完全吸出；

3)从磁力架上取下EP管，加入600μL pH 7.4的PBS冲洗，充分混匀后，重新放置于磁力架上吸附3-5min，用移液枪将上清全部吸出，如此重复洗涤3次，最后用50μL pH 7.4的PBS将磁珠重悬。

4)利用本发明所述的方法进行qPCR的扩增。结果见图2，该方法对M5疫苗、A19疫苗和S2疫苗检测结果为阳性，说明该方法可用于多种布鲁氏菌的检测；对其它细菌检测结果为阴性，没有发生交叉反应，说明该方法具有较高的特异性，该结果说明，此免疫磁珠能够很好的结合布鲁氏菌病原。

实施例3

本发明试剂盒在检测布鲁氏菌(抗原)中的重复性实验

1、检测样本

1:10倍稀释后的布鲁氏菌疫苗(疫苗购自金宇保灵生物药品有限公司，细菌含量约为1×10⁸CFU/mL)。

2、方法

1)病原的富集：取免疫磁珠(1mg/mL)20μL于1.5mL的EP管中，加入100μL稀释后的布鲁氏菌疫苗，37℃震荡反应30min；

2)磁珠的洗涤：待病原富集完成后，将EP管放置于磁力架上吸附3-5min，弃去上清，用PBS缓冲液洗涤3次，再加入50μL的PBS缓冲液将富集病毒的免疫磁珠重悬；

3)病原DNA的提取：用热裂解法破坏病原结构，释放病原DNA；热裂解法获得病原DNA的程序为：95℃裂解10min后迅速冰浴3min；

4)qPCR扩增：利用本发明所述的方法进行qPCR的扩增(扩增体系如表1)；

表1 qPCR的扩增反应体系

5)扩增程序如表2：

表2扩增程序

6)根据qPCR反应体系的CT值结果进行判断样品中是否含有布鲁氏菌。当CT值<28时，则判定为布鲁氏菌阳性，当CT值≥28时，则判定为布鲁氏菌阴性。共进行了3个重复，结果如表3所示，该结果表明，采用本发明的方法能够很好对布鲁氏菌病原进行扩增，重复性良好。

表3重复性结果

实施例4

本发明试剂盒的灵敏度试验

布鲁氏菌疫苗1:10倍稀释后(细菌含量约为1×10⁸CFU/mL)，取1mL病原稀释液做十倍倍比稀释，分别为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³和10²CFU/mL进行十倍倍比稀释液经免疫磁珠富集后，进行qPCR扩增，方法同实施例3，结果如图3。该方法对布鲁氏菌疫苗浓度为10⁸CFU/mL～10²CFU/mL之间进行检测，当浓度为10⁵CFU/mL～10⁴CFU/mL时，检测CT值在27～29之间，结果表明，采用本发明的方法最低可检出的样本病原浓度为10⁵CFU/mL。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种用于检测布鲁氏菌抗原的免疫磁珠试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cccggtgaac tggctaatc 19

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgtaaagga cgagttgctt g 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctcctgggc cgtcaatggc aag 23

<210> 4

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggaattt caaaagcaag tctgctcagc ctcgcggcgg ctggcattgt cctggccggg 60

tgccagagct cccggcttgg taatctcgat aatgtttcgc ctccgccgcc gcctgcaccg 120

gtcaatgctg ttccggcagg cacggtgcag aaaggcaatc ttgattctcc cacacaattc 180

cccaatgcgc cctccacgga tatgagcgcg caatccggca cacaggtcgc aagcctgccg 240

cctgcatccg caccggacct gacgcccggc gccgtggctg gcgtctggag cgcctcgctt 300

ggtggtcaga gctgcaagat cgcgacgccg cagaccaaat atggccaggg ctatcgcgca 360

ggcccgctgc gctgccccgg tgaactggct aatcttgcct cctgggccgt caatggcaag 420

caactcgtcc tttacgatgc gaacggcggt acggttgcct cgctctattc ttcaggacag 480

ggccgcttcg atggccagac caccggcggg caggccgtga cgctgtcgcg ctga 534

Claims (8)

1.一种用于检测布鲁氏菌的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：免疫磁珠、qPCR反应混合液、PBS缓冲液、检测布鲁氏菌的上游引物、下游引物和探针；所述免疫磁珠为鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆IgG抗体与磁珠的偶联物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述探针为如SEQ IDNO:3所示核苷酸序列，其中探针5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1的物质；所述免疫磁珠以免疫磁珠悬液形式保存，所述免疫磁珠在所述免疫磁珠悬液中的浓度为1mg/mL；所述免疫磁珠悬液的溶剂包括PBS缓冲液。

2.根据权利要求1所述的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠的制备方法包括以下步骤：

1)将磁珠洗涤，重悬，得到洗涤重悬后的磁珠；

2)将过量的鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆IgG抗体与步骤1)得到的洗涤重悬后的磁珠混合，37℃震荡15～60min，得到免疫磁珠混悬液；

3)将步骤2)得到的免疫磁珠混悬液进行磁力吸附，除去上清，洗涤，重悬，得到免疫磁珠。

3.根据权利要求2所述的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，步骤2)所述鼠抗布鲁氏菌M5抗原单克隆IgG抗体与步骤1)所述磁珠的质量比为100μg/6mg以上。

4.根据权利要求2所述的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，步骤1)和步骤3)所述洗涤和重悬独立地使用PBS缓冲液；所述PBS缓冲液为10mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。

5.根据权利要求1～4任一项所述的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠试剂盒的使用方法包括以下步骤：

(1)将免疫磁珠与待检验样品混合于离心管中，37℃震荡反应20～60min；

(2)进行磁力吸附，弃去上清，洗涤，重悬，得到富集布鲁氏菌的免疫磁珠重悬液；

(3)热裂解法处理步骤(2)所述富集布鲁氏菌的免疫磁珠重悬液，得到释放的布鲁氏菌DNA；

(4)将步骤(3)得到的释放的布鲁氏菌DNA与qPCR反应混合液、检测布鲁氏菌的上游引物、下游引物和探针混合，进行qPCR扩增；

(5)当CT值<28时，则判定为布鲁氏菌阳性，当CT值≥28时，则判定为布鲁氏菌阴性。

6.根据权利要求5所述的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，步骤(1)中待检验样品与免疫磁珠的混合体积比为4～6。

7.根据权利要求5所述的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，步骤(3)所述热裂解法的反应程序为：95℃裂解10min后冰浴3min。

8.根据权利要求5所述的免疫磁珠试剂盒，其特征在于，步骤(4)所述qPCR扩增的反应体系每20μL包括：

Probe qPCR SuperMix 10μL；DNA模板5μL；RNase FreedH₂O 2.6μL；上游引物0.8μL；下游引物0.8μL，探针引物0.8μL；

所述qPCR扩增的反应程序为：95℃5min；95℃变性10s，60℃复性30s，共进行40个循环；4℃保存。

Images