CN110144395B - 一种监测miRNA动态变化的报告基因及其制备方法 - Google Patents
一种监测miRNA动态变化的报告基因及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种监测miRNA动态变化的报告基因及其制备方法，所述的报告基因包括PUF基因、质粒psiCHECK‑2‑HM471G、Fluc基因、与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列和与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列，所述的与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列位于PUF蛋白的终止密码子TGA下游，所述的与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列位于Fluc基因起始密码子ATG上游。该报告基因以对神经分化过程中或肌肉、心肌分化过程中产生的特异性miRNA进行实时、定量的监控。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及一种监测miRNA动态变化的报告基因及其制备方法。
背景技术
MicroRNAs(miRNA，miR)是由20到22个非编码核苷酸组成的小分子单链RNA，可通过抑制翻译或降解mRNA来调控基因的表达。这些分子与许多细胞的活动，诸如分化分生，增殖凋亡有着密切关系。又因其可诱导特定mRNA降解或抑制翻译，所以在很多临床上重要的疾病中也发挥着重要的作用。一些miRNAs已经被证实与心肌以及肌肉的分化过程有关，如miR-1，miR-133，miR-181，miR-195，miR-206，and miR-26a。还有些miRNAs被发现与神经分化进程有着密切关系，例如miR-9，miR-124等。
目前用于监控miRNAs表达的传统手段主要有Northern杂交(Northern blot)、基因芯片(microarray)、实时定量PCR(real-time polymerase chain reaction)技术等。通过传统手段，并不能将细胞活动过程内动态miRNA的表达变化得以完全以及可重复性地表现出来。而且这些传统技术在监测过程中大多要求破坏生物组织，导致细胞水平的裂解或死亡，既耗费时间精力，又不能在活体水平加以检测。目前主要用的分子成像发光手段包括生物荧光与自发荧光两方面。运用了分子信标、放射性同位素标记、报告基因***等手段。分子信标面临的问题主要是所带显色基团是否足够稳定，在不发生结合时荧光淬灭能力极其本身所带的背景荧光值过高；而放射性同位素则会对生物体造成一定程度的损伤；存在的报告基因***为switch-Off***，不能确定是随着时间的流逝所造成的荧光表达下降还是报告基因***的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无创、实时在体检测miRNA表达水平的报告基因及其构建方法，实现对神经分化过程或肌肉分化过程中相关miRNA的动态监控。为深入研究对相关神经疾病模型或肌肉萎缩疾病中，分子表达水平对其所产生的调控奠定基础。
为了实现上述技术效果，本发明具体通过以下技术方案实现：
一种监测miRNA动态变化的报告基因，所述的报告基因包括PUF基因、质粒psiCHECK-2-HM471G、Fluc基因、与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列和与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列，所述的与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列位于PUF蛋白的终止密码子TGA下游，所述的与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列位于Fluc基因起始密码子ATG上游。
本发明所述的报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了所述的监测miRNA动态变化的报告基因的制备方法，包括以下步骤：
1)将PUF基因克隆到质粒psiCHECK-2-HM471G多克隆位点上，得到质粒psiCHECK-2-HM471G-PUF；
2)将Fluc基因克隆到psiCHECK2-HM471G上，获得psiCHECK2-HM471G-Fluc；
3)利用miRNA与靶标通过碱基互补配对的形式相互作用，将与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列克隆到上，获得psiCHECK-2-HM471G-PUF-miR-Fluc；
4)利用PUF蛋白与NRE通过碱基互补配对的形式相互作用，将与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列克隆到上，获得报告基因psiCHECK-2-HM471G-PUF-miR reporter。
所述的所述的与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列位于PUF蛋白的终止密码子TGA下游。
所述的与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列位于Fluc基因起始密码子ATG上游。
在本发明的另一方面，提供了所述的报告基因在检测分化过程中miRNA动态变化的应用。
所述的分化过程包括神经分化和肌肉分化。
所述的应用的具体过程为：所述的报告基因在体内首先经过转录，翻译成为一条线性的肽链，能够同时表达PUF和Fluc这两个基因，分别受不同启动子的调控；当细胞中不存在目的miRNA时，PUF会结合到6xNRE序列上，从而抑制Fluc的表达，细胞中荧光素酶含量低；当细胞中存在目的miRNA时，目的miRNA会结合到4x miR靶序列上，抑制PUF的表达，从而解除对Fluc的抑制，使Fluc表达，产生可以检测的荧光信号。
本发明的有益效果为：
本发明的报告基因***，可以对神经分化过程中或肌肉、心肌分化过程中产生的特异性miRNA进行实时、定量的监控。作为一个正向的监测***，本身不会因时间的变化发生衰弱，所以可以长效、无创地实现在体检测。这对临床深入探索相关神经方面疾病或是肌肉萎缩疾病有着十分重要的意义。
附图说明
图1是本发明报告基因的结构图；
图2是体外模拟诱导测定荧光强度；
图3是细胞内神经分化测定荧光强度；
图4是细胞内肌肉分化测定荧光强度。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1报告基因的构建
本实施例提供了一种监测miRNA动态变化的报告基因，该报告基因通过以下方法得到：
(1)利用PUF能与靶序列结合抑制荧光表达而作为报告基因应用于体系中，将PUF基因克隆到质粒psiCHECK-2-HM471G多克隆位点上，从而得到质粒psiCHECK-2-HM471G-PUF；
(2)利用萤火虫荧光素酶可以作为报告基因生物发光的特性，将Fluc基因克隆到psiCHECK2-HM471G上，从而获得psiCHECK2-HM471G-Fluc；
(3)利用miRNA与靶标通过碱基互补配对的形式相互作用，将与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列克隆到上，并位于PUF蛋白的终止密码子TGA下游，获得psiCHECK-2-HM471G-PUF-miR-Fluc；
(4)利用PUF蛋白与NRE通过碱基互补配对的形式相互作用，将与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列克隆到上，并放在Fluc基因起始密码子ATG上游。从而获得报告基因psiCHECK-2-HM471G-PUF-miR reporter(图1)。
具体的其构建方法为：
1)线性化载体psiCHECK-2-HM471G经过限制性内切酶Nhe 1和Xho 1双酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下切下目的DNA片段。目的条带用胶回收试剂盒回收纯化。
2)获得***片段：PUF序列，4x targets序列，6xNRE序列，luc2序列均由上海生化公司利用常规化学方法合成，按顺序合成得到PUF-miR。
3)***片段与载体重组：将上述扩增得到的片段与载体psiCHECK-2-HM471G混合制备成10ul的DNA溶液，加入等体积的连接酶，充分混匀反应。
4)转化：取10ul的重组反应液与0.1ml的大肠杆菌感受态细胞混合，冰上30分钟，42℃热激90秒后迅速冰上5分钟。加入800ulLB液体培养基，37℃摇床孵育1小时。取上述菌液涂在含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，正面向上半小时放置，待菌液完全吸收后倒置平板，37℃培养箱培养16小时。
5)阳性克隆鉴定：挑取单菌落培养，提取质粒。用Nhe 1和Xho 1双酶切并进行琼脂糖凝胶电泳。酶切鉴定为阳性的克隆通过测序进一步验证。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2体外模拟诱导
培养HEK 293细胞，取24孔板，使其24h后能汇聚80-90％。24h后，转染psiCHECK-2-HM471G-PUF-miR reporter质粒DNA0.8ug，不同浓度梯度的miR124a mimics，NC对照mimics。48h后，吸去废培养液，PBS洗3次，加入100ul 1x细胞裂解液，摇床摇30min，测定荧光强度。
结果如图2所示，随着所加mimics浓度的增加，荧光强度上升，而对NC对照无反应。
实施例3细胞内神经分化应用
培养P19小鼠畸胎瘤细胞，取24孔板的培养皿，加入3x104的P19细胞。分别于培养的2D，4D，6D加入诱导剂维生素A，诱导其向神经细胞分化；诱导6D时间结束后，转染psiCHECK-2-HM471G-PUF-miR reporter质粒DNA0.8ug；转染48h后，吸去废培养液，PBS洗3次，加入100ul 1x细胞裂解液，摇床摇30min，测定荧光强度。
结果如图3所示，随着诱导天数的增加，p19向神经细胞分化，产生内源性的miR-124a，结合于4xmiR124a targets，抑制PUF结合于6xNRE，从而解除对luc2的抑制，产生荧光。且随着miR-124a的增加而荧光增强。
实施例4细胞内肌肉分化应用
培养C2C12小鼠肌母细胞，取24孔板的培养皿，加入3x104的C2C12细胞。分别于培养的2D，4D，6D加入含1％胎牛血清的分化培养基，诱导其向肌肉细胞分化；诱导6D时间结束后，转染psiCHECK-2-HM471G-PUF-miR reporter质粒DNA 0.8ug；转染48h后，吸去废培养液，PBS洗3次，加入100ul 1x细胞裂解液，摇床摇30min，测定荧光强度。
结果如图4所示，随着诱导天数的增加，C2C12向肌肉细胞分化，产生内源性的miR-133a，结合于4xmiR133a targets，抑制PUF结合于6xNRE，从而解除对luc2的抑制，产生荧光。且随着miR-133a的增加而荧光增强。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 西安电子科技大学
<120> 一种监测miRNA动态变化的报告基因及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6553
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agatctgcgc agcaccatgg cctgaaataa cctctgaaag aggaacttgg ttaggtacct 60
tctgaggcgg aaagaaccag ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag 120
gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg 180
gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 240
caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc 300
attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg 360
cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa 420
agcttgattc ttctgacaca acagtctcga acttaagctg cagaagttgg tcgtgaggca 480
ctgggcaggt aagtatcaag gttacaagac aggtttaagg agaccaatag aaactgggct 540
tgtcgagaca gagaagactc ttgcgtttct gataggcacc tattggtctt actgacatcc 600
actttgcctt tctctccaca ggtgtccact cccagttcaa ttacagctct taaggctaga 660
gtacttaata cgactcacta taggctagcc accatgggcc gcagccgcct tttggaagat 720
tttcgaaaca accggtaccc caatttacaa ctgcgggaga ttgctggaca tataatggaa 780
ttttcccaag accagcatgg gtccagattc attcagctga aactggagcg tgccacacca 840
gctgagcgcc agcttgtctt caatgaaatc ctccaggctg cctaccaact catggtggat 900
gtgtttggta attacgtcat tcagaagttc tttgaatttg gcagtcttga acagaagctg 960
gctttggcag aacggattcg aggccacgtc ctgtcattgg cactacagat gtatggctgc 1020
cgtgttatcc agaaagctct tgagtttatt ccttcagacc agcagaatga gatggttcgg 1080
gaactagatg gccatgtctt gaagtgtgtg aaagatcaga atggcaatca cgtggttcag 1140
aaatgcattg aatgtgtaca gccccagtct ttgcaattta tcatcgatgc gtttaaggga 1200
caggtatttg ccttatccac acatccttat ggctgccgag tgattcagag aatcctggag 1260
cactgtctcc ctgaccagac actccctatt ttagaggagc ttcaccagca cacagagcag 1320
cttgtacagg atcaatatgg aaattatgta atccaacatg tactggagca cggtcgtcct 1380
gaggataaaa gcaaaattgt agcagaaatc cgaggcaatg tacttgtatt gagtcagcac 1440
aaatttgcaa gcaatgttgt ggagaagtgt gttactcacg cctcacgtac ggagcgcgct 1500
gtgctcatcg atgaggtgtg caccatgaac gacggtcccc acagtgcctt atacaccatg 1560
atgaaggacc agtatgccaa ctacgtggtc cagaagatga ttgacgtggc ggagccaggc 1620
cagcggaaga tcgtcatgca taagatccgg ccccacatcg caactcttcg taagtacacc 1680
tatggcaagc acattctggc caagctggag aagtactaca tgaagaacgg tgttgactta 1740
gggtgattct aggcgatcga ctagttggca ttcaccgcgt gccttaatag tatggcattc 1800
accgcgtgcc ttaatagtat ggcattcacc gcgtgcctta atagtatggc attcaccgcg 1860
tgccttaaca tatgctcgag cccgggaatt cgtttaaacc tagagcggcc gctggccgca 1920
ataaaatatc tttattttca ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgag gatctaaatg 1980
agtcttcgga cctcgcgggg gccgcttaag cggtggttag ggtttgtctg acgcgggggg 2040
agggggaagg aacgaaacac tctcattcgg aggcggctcg gggtttggtc ttggtggcca 2100
cgggcacgca gaagagcgcc gcgatcctct taagcacccc cccgccctcc gtggaggcgg 2160
gggtttggtc ggcgggtggt aactggcggg ccgctgactc gggcgggtcg cgcgccccag 2220
agtgtgacct tttcggtctg ctcgcagacc cccgggcggc gccgccgcgg cggcgacggg 2280
ctcgctgggt cctaggctcc atggggaccg tatacgtgga caggctctgg agcatccgca 2340
cgactgcggt gatattaccg gagaccttct gcgggacgag ccgggtcacg cggctgacgc 2400
ggagcgtccg ttgggcgaca aacaccagga cggggcacag gtacactatc ttgtcacccg 2460
gaggcgcgag ggactgcagg agcttcaggg agtggcgcag ctgcttcatc cccgtggccc 2520
gttgctcgcg tttgctggcg gtgtccccgg aagaaatata tttgcatgtc tttagttcta 2580
tgatgacaca aaccccgccc agcgtcttgt cattggcgaa ttcgaacacg cagatgcagt 2640
cggggcggcg cggtcccagg tccacttcgc atattaaggt gacgcgtgtg gcctcgaaca 2700
ccgagcgacc ctgcagcgac ccgcttaaaa gcttggcatt tgtatatatg tatatatgta 2760
tatatgtata tatgtatata tgtatatacc ggtactgttg gtaaagccac catggccgat 2820
gctaagaaca ttaagaaggg ccctgctccc ttctaccctc tggaggatgg caccgctggc 2880
gagcagctgc acaaggccat gaagaggtat gccctggtgc ctggcaccat tgccttcacc 2940
gatgcccaca ttgaggtgga catcacctat gccgagtact tcgagatgtc tgtgcgcctg 3000
gccgaggcca tgaagaggta cggcctgaac accaaccacc gcatcgtggt gtgctctgag 3060
aactctctgc agttcttcat gccagtgctg ggcgccctgt tcatcggagt ggccgtggcc 3120
cctgctaacg acatttacaa cgagcgcgag ctgctgaaca gcatgggcat ttctcagcct 3180
accgtggtgt tcgtgtctaa gaagggcctg cagaagatcc tgaacgtgca gaagaagctg 3240
cctatcatcc agaagatcat catcatggac tctaagaccg actaccaggg cttccagagc 3300
atgtacacat tcgtgacatc tcatctgcct cctggcttca acgagtacga cttcgtgcca 3360
gagtctttcg acagggacaa aaccattgcc ctgatcatga acagctctgg gtctaccggc 3420
ctgcctaagg gcgtggccct gcctcatcgc accgcctgtg tgcgcttctc tcacgcccgc 3480
gaccctattt tcggcaacca gatcatcccc gacaccgcta ttctgagcgt ggtgccattc 3540
caccacggct tcggcatgtt caccaccctg ggctacctga tttgcggctt tcgggtggtg 3600
ctgatgtacc gcttcgagga ggagctgttc ctgcgcagcc tgcaagacta caaaattcag 3660
tctgccctgc tggtgccaac cctgttcagc ttcttcgcta agagcaccct gatcgacaag 3720
tacgacctgt ctaacctgca cgagattgcc tctggcggcg ccccactgtc taaggaggtg 3780
ggcgaagccg tggccaagcg ctttcatctg ccaggcatcc gccagggcta cggcctgacc 3840
gagacaacca gcgccattct gattacccca gagggcgacg acaagcctgg cgccgtgggc 3900
aaggtggtgc cattcttcga ggccaaggtg gtggacctgg acaccggcaa gaccctggga 3960
gtgaaccagc gcggcgagct gtgtgtgcgc ggccctatga ttatgtccgg ctacgtgaat 4020
aaccctgagg ccacaaacgc cctgatcgac aaggacggct ggctgcactc tggcgacatt 4080
gcctactggg acgaggacga gcacttcttc atcgtggacc gcctgaagtc tctgatcaag 4140
tacaagggct accaggtggc cccagccgag ctggagtcta tcctgctgca gcaccctaac 4200
attttcgacg ccggagtggc cggcctgccc gacgacgatg ccggcgagct gcctgccgcc 4260
gtcgtcgtgc tggaacacgg caagaccatg accgagaagg agatcgtgga ctatgtggcc 4320
agccaggtga caaccgccaa gaagctgcgc ggcggagtgg tgttcgtgga cgaggtgccc 4380
aagggcctga ccggcaagct ggacgcccgc aagatccgcg agatcctgat caaggctaag 4440
aaaggcggca agatcgccgt gtaataattc tagagtcggg gcggccggcc gcttcgagca 4500
gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa 4560
tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat 4620
aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg 4680
gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta aaatcgataa ggatccaggt 4740
ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 4800
aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 4860
aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 4920
cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 4980
ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 5040
cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 5100
ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 5160
gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 5220
gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 5280
acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 5340
cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 5400
acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 5460
ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 5520
ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 5580
gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 5640
atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 5700
ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 5760
attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 5820
ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 5880
aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 5940
aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 6000
ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg 6060
tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 6120
ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 6180
cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 6240
agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 6300
gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 6360
ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 6420
tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 6480
tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 6540
cacatggctc gac 6553
Claims (3)
1.一种监测miRNA动态变化的报告基因，其特征在于，包括质粒psiCHECK-2-HM471G、PUF基因和Fluc基因，还包括位于PUF基因终止密码子TGA下游与目的miRNA完全互补配对的四段串联重复序列，和位于Fluc基因起始密码子ATG上游与PUF完全互补配对的六段NRE串联重复序列；
所述的报告基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的报告基因在检测神经分化miR-124a动态变化中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，当细胞中不存在目的miR-124a时，PUF会结合到6xNRE序列上，从而抑制Fluc的表达，细胞中荧光素酶含量低；当细胞中存在目的miR-124a时，目的miR-124a会结合到4x miR靶序列上，抑制PUF的表达，从而解除对Fluc的抑制，使Fluc表达，产生可以检测的荧光信号。
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