CN115356318B - 一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法，采用吖啶类配位体作为荧光检测分子探针；所述吖啶类配位体为2,7‑二(吡啶‑4)吖啶分子。本发明的有益效果是：本发明将吖啶类配位体作为荧光检测的分子探针，通过抑芽丹分子与分子探针间的分子间作用力，抑制吖啶类配位体分子的非辐射跃迁，能够将其用于荧光检测，开创了用小分子荧光探针测定抑芽丹农药残留量的先河，有利于解决现有其他检测方式检测抑芽丹农药残留量的缺陷。
Description
技术领域
本发明属于烟草农药残留检测技术领域，具体涉及一种基于2,7-二(吡啶-4)吖啶分子的烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法。
背景技术
抑芽丹，又名马来酰肼，是一种低毒的植物生长调节剂，被广泛应用于烟草以抑制腋芽生长。虽然现今并无确切的研究成果证明抑芽丹的使用能够诱发癌症，但已经证实大剂量地使用抑芽丹会导致基因突变。因此抑芽丹残留量日益受到关注。我国规定，大蒜、洋葱、葱中抑芽丹的最大残留限量(MRL)为15mg/kg，马铃薯中抑芽丹的MRL为50mg/kg；国际食品法典规定，大蒜、洋葱、葱中抑芽丹的MRL为15mg/kg，马铃薯中抑芽丹的MRL为50mg/kg；欧盟规定大蒜中抑芽丹的MRL为15mg/kg；美国规定，洋葱中抑芽丹的MRL为15mg/kg，马铃薯中抑芽丹的MRL为50mg/kg；国际烟草科学研究合作中心(CORESTA)规定烟草中抑芽丹的指导性残留限量(GRL)为80mg/kg。
抑芽丹的残留分析方法有多种：蒸馏分光光度法(AOAC)、高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、气相色谱法、毛细管电泳法、极谱法等，另外也有流动注射法和脉冲伏安法等方法，其中最常用的是前3种分析方法。但是AOAC法对蒸馏装置要求高，样品前处理复杂，操作繁琐，耗碱量大，仪器腐蚀严重；HPLC-UV和HPLC-MS法测定抑芽丹不仅使用的设备昂贵、检测成本高、检测周期长，而且需要专业人士操作，因此难以普及。如何实现对抑芽丹农残的快速、简便、低成本检测就成为现有技术中亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法，采用吖啶类配位体作为荧光检测分子探针；
进一步的，所述吖啶类配位体为2,7-二(吡啶-4)吖啶分子；
进一步的，所述2,7-二(吡啶-4)吖啶分子的合成包括如下步骤：将2,7-二溴吖啶、吡啶-4-硼酸、氟化铯和四(三苯基膦)钯溶于1,2-二甲氧基乙烷，在N2气氛下80～100℃搅拌反应2～4天，通过色谱法纯化粗品，得到黄色粉末，即得2,7-二(吡啶-4)吖啶；
进一步的，所述2,7-二(吡啶-4)吖啶分子的合成步骤包括：在苄基三乙基溴化铵-甲醇溶液中加入吖啶，在50～70℃下用回流冷凝器将反应搅拌10～20小时；冷却至室温，过滤粗品，用吡啶和二氯甲烷洗涤，在40～60℃下真空蒸发，得到淡黄色固体2,7-二溴吖啶；
进一步的，具体包括有如下步骤：制备探针水溶液；烟叶样品前处理；绘制标准曲线；样品检测；
进一步的，制备探针水溶液的步骤为，将2,7-二(吡啶-4)吖啶分散于去离子水中，得探针水溶液；
进一步的，烟叶样品前处理的步骤为：称取1.5～2.5g烟末样品加入体积为15～25mL，浓度为3～5mol/L盐酸溶液，于油浴100～140℃条件下磁力搅拌萃取0.5～1.5h，冷却至室温后离心，取上清液，得待测样品；
进一步的，所述绘制标准曲线的步骤为，将抑芽丹储备液加入探针水溶液中，得系列浓度的抑芽丹-探针水溶液，超声处理获得稳定的悬浮液，采用荧光光谱仪，设定320nm为最大激发波长，480nm为最大发射波长，在320-690nm的范围内记录和收集荧光光谱；
进一步的，所述样品检测的步骤为，将待测样品溶液加入探针水溶液，漩涡震荡后，采用荧光光谱仪，设定320nm为最大激发波长，480nm为最大发射波长，在320-690nm的范围内记录和收集荧光光谱；
更进一步的技术方案是，
抑芽丹残留量采用下式计算得到：
式中：
R—以干基计的抑芽丹残留量，mg/Kg；
C—标准工作曲线计算得到的结果，μmol/L；
V—萃取液体积，mL；
M—抑芽丹的摩尔质量，g/mol；
m—待测样品质量，g。
本发明具有以下优点：
1、本发明将吖啶类配位体作为荧光检测的分子探针，通过抑芽丹分子与分子探针间的分子间作用力，抑制吖啶类配位体分子的非辐射跃迁，能够将其用于荧光检测，开创了用基于小分子荧光探针测定抑芽丹农药残留量的先河，有利于解决现有其他检测方式检测抑芽丹农药残留量的缺陷；
2、本发明优选的，采用自行设计合成的有机小分子2,7-二(吡啶-4)吖啶(简称DPA)作为荧光探针，抑芽丹分子(简称MH)可通过与DPA分子间的氢键作用，抑制DPA分子的非辐射跃迁，从而有效开启DPA的荧光增强机制，利用这一特点把DPA作为抑芽丹的荧光检测探针，可以快速、便捷、低成本的完成烟草农药残留抑芽丹的快速检测；
3、本发明检测方法具有检测快速、操作简便、成本低廉的优点；其中，本发明检测方法的响应时间为1min，而液相法抑芽丹出峰时间为8min；较高效液相色谱仪，荧光光谱仪操作非常简便，放置待测样品后收集和记录荧光光谱即可；可收集320-690nm范围内的荧光光谱仪仅需6万块，且检测过程无需使用仪器耗材，维护成本极低，具有良好的应用前景。
4、本发明的检测方法能抗多种农药共存物的检测干扰，方法选择性好，提取后的样品滤液无需净化便可上机检测，与现有前处理方法相比较，极大简化了抑芽丹的前处理流程。
附图说明
图1为DPA分子的制备流程图。
图2为DPA分子的核磁碳谱图。
图3为DPA分子的核磁氢谱图。
图4为DPA分子的质谱图。
图5为DPA分子的结构示意图。
图6为DPA分子的晶体结构示意图；
其中，a为晶体结构的三维图；b为从正面方向的晶体结构；c为侧面方向的晶体结构，d为纵面方向的晶体结构。
图7为MH、DPA和含MH的DPA的荧光光谱图。
图8为DPA探针浓度的优化结果。
图9为响应时间的优化结果。
图10为检测线性范围和检出限。
图11为DPA的选择性柱状图。
图12为DPA、MH及两者不同比例混合后的核磁图谱；
其中：1.DPA/MH为1：2；2.DPA/MH为1：1.5；3.DPA/MH为1：1；4.DPA/MH为1：0.5；5.MH；6.DPA。
图13为荧光寿命衰减图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施方式的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，或者是本领域技术人员惯常理解的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例1：一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法，采用吖啶类配位体作为荧光检测分子探针；本发明将吖啶类配位体作为荧光检测的分子探针，通过抑芽丹分子与分子探针间的分子间作用力，抑制吖啶类配位体分子的非辐射跃迁，能够将其用于荧光检测，，开创了用基于小分子荧光探针测定抑芽丹农药残留量的先河；有利于解决现有其他检测方式检测抑芽丹农药残留量的缺陷。
所述吖啶类配位体为2,7-二(吡啶-4)吖啶分子；本发明优选的，采用自行设计合成的有机小分子2,7-二(吡啶-4)吖啶(简称DPA)作为荧光探针，抑芽丹分子(简称MH)可通过与DPA分子间的氢键作用，抑制DPA分子的非辐射跃迁，从而有效开启DPA的荧光增强机制，利用这一特点，把DPA作为抑芽丹的荧光检测探针，可以快速、便捷、低成本的完成烟草农药残留抑芽丹的快速检测。
所述2,7-二(吡啶-4)吖啶分子的合成包括如下步骤：将2,7-二溴吖啶、吡啶-4-硼酸、氟化铯和四(三苯基膦)钯溶于1,2-二甲氧基乙烷，在N2气氛下80～100℃搅拌2～4天，通过色谱法纯化粗品，得到黄色粉末，即得2,7-二(吡啶-4)吖啶；其中，2,7-二溴吖啶为0.67mg，2.0mmol；吡啶-4-硼酸为0.59g，2.4mol；氟化铯(CsF)为2.8g，18mmol；四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)为0.130g，0.12mmol；
所述2,7-二(吡啶-4)吖啶分子的合成步骤包括：在苄基三乙基溴化铵-甲醇溶液中加入吖啶，在50～70℃下用回流冷凝器将反应搅拌10～20小时；冷却至室温，过滤粗品，用吡啶和二氯甲烷洗涤，在40～60℃下真空蒸发，得到淡黄色固体2,7-二溴吖啶；其中，苄基三乙基溴化铵(TEBA)为12g，44mmol；甲醇为100mL；吖啶为2.16g，12mmol。
具体包括有如下步骤：制备探针水溶液；烟叶样品前处理；绘制标准曲线；样品检测；本发明检测方法具有检测快速、操作简便、成本低廉的优点；其中，本发明检测方法的响应时间为1min，而液相法抑芽丹出峰时间为8min；较高效液相色谱仪，荧光光谱仪操作非常简便，放置待测样品后收集和记录荧光光谱即可；可收集320-690nm范围内的荧光光谱仪仅需6万块，且检测过程无需使用仪器耗材，维护成本极低，具有良好的应用前景。
制备探针水溶液的步骤为，将2,7-二(吡啶-4)吖啶分散于去离子水中，得探针水溶液。
烟叶样品前处理的步骤为：称取1.5～2.5g烟末样品加入体积为15～25mL，浓度为3～5mol/L盐酸溶液，于油浴100～140℃条件下磁力搅拌萃取0.5～1.5h，冷却至室温后离心，取上清液，得待测样品。本发明通过适宜的样品前处理方法，将烟末样品通过盐酸溶液提取，提取后的样品滤液无需净化便可上机检测，与现有前处理方法相比较，极大简化了抑芽丹的前处理流程。且本发明的检测方法，通过利用分子探针与抑芽丹的氢键作用，能避免共存物的检测干扰，方法选择性好。
所述绘制标准曲线的步骤为，将抑芽丹储备液加入探针水溶液中，得系列浓度的抑芽丹-探针水溶液，超声处理获得稳定的悬浮液，采用荧光光谱仪，设定320nm为最大激发波长，480nm为最大发射波长，在320-690nm的范围内记录和收集荧光光谱。
所述样品检测的步骤为，将待测样品溶液加入探针水溶液，漩涡震荡后，采用荧光光谱仪，设定320nm为最大激发波长，480nm为最大发射波长，在320-690nm的范围内记录和收集荧光光谱。
抑芽丹残留量采用下式计算得到：
式中：
R—以干基计的抑芽丹残留量，mg/Kg；
C—标准工作曲线计算得到的结果，μmol/L；
V—萃取液体积，mL；
M—抑芽丹的摩尔质量，g/mol；
m—待测样品质量，g。
实施例2：一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法，采用吖啶类配位体作为荧光检测分子探针；本发明将吖啶类配位体作为荧光检测的分子探针，通过抑芽丹分子与分子探针间的氢键作用，抑制吖啶类配位体分子的非辐射跃迁，能够将其用于荧光检测，开创了用基于小分子荧光探针测定抑芽丹农药残留量的先河，有利于解决现有其他检测方式检测抑芽丹农药残留量的缺陷。
所述吖啶类配位体为2,7-二(吡啶-4)吖啶分子；本发明优选的，采用自行设计合成的有机小分子2,7-二(吡啶-4)吖啶(简称DPA)作为荧光探针，抑芽丹分子(简称MH)可通过与DPA分子间的氢键作用，抑制DPA分子的非辐射跃迁，从而有效开启DPA的荧光增强机制，利用这一特点把DPA作为抑芽丹的荧光检测探针，可以快速、便捷、低成本的完成烟草农药残留抑芽丹的快速检测。
所述2,7-二(吡啶-4)吖啶分子的合成包括如下步骤：将2,7-二溴吖啶、吡啶-4-硼酸、氟化铯和四(三苯基膦)钯溶于1,2-二甲氧基乙烷，在N2气氛下80℃搅拌2天，通过色谱法纯化粗品，得到黄色粉末，即得2,7-二(吡啶-4)吖啶；其中，2,7-二溴吖啶为0.67mg，2.0mmol；吡啶-4-硼酸为0.59g，2.4摩尔；氟化铯(CsF)为2.8g，18mmol；四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)为0.130g，0.12mmol；
所述2,7-二(吡啶-4)吖啶分子的合成步骤包括：在苄基三乙基溴化铵-甲醇溶液中加入吖啶，在50℃下用回流冷凝器将反应搅拌10小时；冷却至室温，过滤粗品，用吡啶和二氯甲烷洗涤，在40℃下真空蒸发，得到淡黄色固体2,7-二溴吖啶；其中，苄基三乙基溴化铵(TEBA)为12g，44mmol；甲醇为100mL；吖啶为2.16g，12mmol。
具体包括有如下步骤：制备探针水溶液；烟叶样品前处理；绘制标准曲线；样品检测；本发明检测方法具有检测快速、操作简便、成本低廉的优点；其中，本发明检测方法的响应时间为1min，而液相法抑芽丹出峰时间为8min；较高效液相色谱仪，荧光光谱仪操作非常简便，放置待测样品后收集和记录荧光光谱即可；可收集320-690nm范围内的荧光光谱仪仅需6万块，且检测过程无需使用仪器耗材，维护成本极低，具有良好的应用前景。
制备探针水溶液的步骤为，将2,7-二(吡啶-4)吖啶分散于去离子水中，得探针水溶液。
烟叶样品前处理的步骤为：称取1.5g烟末样品加入体积为15mL，浓度为3mol/L盐酸溶液，于油浴100℃条件下磁力搅拌萃取0.5h，冷却至室温后离心，取上清液，得待测样品。本发明通过适宜的样品前处理方法，将烟末样品通过盐酸溶液提取，提取后的样品滤液无需净化便可上机检测，与现有前处理方法相比较，极大简化了抑芽丹的前处理流程。且本发明的检测方法，通过利用分子探针与抑芽丹的氢键作用，能避免共存物的检测干扰，方法选择性好。
所述绘制标准曲线的步骤为，将抑芽丹储备液加入探针水溶液中，得系列浓度的抑芽丹-探针水溶液，超声处理获得稳定的悬浮液，采用荧光光谱仪，设定320nm为最大激发波长，480nm为最大发射波长，在320-690nm的范围内记录和收集荧光光谱。
所述样品检测的步骤为，将待测样品溶液加入探针水溶液，漩涡震荡后，采用荧光光谱仪，设定320nm为最大激发波长，480nm为最大发射波长，在320-690nm的范围内记录和收集荧光光谱。
抑芽丹残留量采用下式计算得到：
式中：
R—以干基计的抑芽丹残留量，mg/Kg；
C—标准工作曲线计算得到的结果，μmol/L；
V—萃取液体积，mL；
M—抑芽丹的摩尔质量，g/mol；
m—待测样品质量，g。
实施例3：一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法，采用吖啶类配位体作为荧光检测分子探针；本发明将吖啶类配位体作为荧光检测的分子探针，通过抑芽丹分子与分子探针间的氢键作用，抑制吖啶类配位体分子的非辐射跃迁，能够将其用于荧光检测，开创了用基于小分子荧光探针测定抑芽丹农药残留量的先河，有利于解决现有其他检测方式检测抑芽丹农药残留量的缺陷；。
所述吖啶类配位体为2,7-二(吡啶-4)吖啶分子；本发明优选的，采用自行设计合成的有机小分子2,7-二(吡啶-4)吖啶(简称DPA)作为荧光探针，抑芽丹分子(简称MH)可通过与DPA分子间的氢键作用，抑制DPA分子的非辐射跃迁，从而有效开启DPA的荧光增强机制，利用这一特点把DPA作为抑芽丹的荧光检测探针，可以快速、便捷、低成本的完成烟草农药残留抑芽丹的快速检测。
所述2,7-二(吡啶-4)吖啶分子的合成包括如下步骤：将2,7-二溴吖啶、吡啶-4-硼酸、氟化铯和四(三苯基膦)钯溶于1,2-二甲氧基乙烷，在N2气氛下100℃搅拌4天，通过色谱法纯化粗品，得到黄色粉末，即得2,7-二(吡啶-4)吖啶；其中，2,7-二溴吖啶为0.67mg，2.0mmol；吡啶-4-硼酸为0.59g，2.4mol；氟化铯(CsF)为2.8g，18mmol；四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)0.130g，0.12mmol；
所述2,7-二(吡啶-4)吖啶分子的合成步骤包括：在苄基三乙基溴化铵-甲醇溶液中加入吖啶，在70℃下用回流冷凝器将反应搅拌20小时；冷却至室温，过滤粗品，用吡啶和二氯甲烷洗涤，在60℃下真空蒸发，得到淡黄色固体2,7-二溴吖啶；其中，苄基三乙基溴化铵(TEBA)为12g，44mmol；甲醇为100mL；吖啶为2.16g，12mmol。
具体包括有如下步骤：制备探针水溶液；烟叶样品前处理；绘制标准曲线；样品检测；本发明检测方法具有检测快速、操作简便、成本低廉的优点；其中，本发明检测方法的响应时间为1min，而液相法抑芽丹出峰时间为8min；较高效液相色谱仪，荧光光谱仪操作非常简便，放置待测样品后收集和记录荧光光谱即可；可收集320-690nm范围内的荧光光谱仪仅需6万块，且检测过程无需使用仪器耗材，维护成本极低，具有良好的应用前景。
制备探针水溶液的步骤为，将2,7-二(吡啶-4)吖啶分散于去离子水中，得探针水溶液。
烟叶样品前处理的步骤为：称取2.5g烟末样品加入体积为25mL，浓度为5mol/L盐酸溶液，于油浴140℃条件下磁力搅拌萃取1.5h，冷却至室温后离心，取上清液，得待测样品。本发明通过适宜的样品前处理方法，将烟末样品通过盐酸溶液提取，提取后的样品滤液无需净化便可上机检测，与现有前处理方法相比较，极大简化了抑芽丹的前处理流程。且本发明的检测方法，通过利用分子探针与抑芽丹的氢键作用，能避免共存物的检测干扰，方法选择性好。
所述绘制标准曲线的步骤为，将抑芽丹储备液加入探针水溶液中，得系列浓度的抑芽丹-探针水溶液，超声处理获得稳定的悬浮液，采用荧光光谱仪，设定320nm为最大激发波长，480nm为最大发射波长，在320-690nm的范围内记录和收集荧光光谱。
所述样品检测的步骤为，将待测样品溶液加入探针水溶液，漩涡震荡后，采用荧光光谱仪，设定320nm为最大激发波长，480nm为最大发射波长，在320-690nm的范围内记录和收集荧光光谱。
抑芽丹残留量采用下式计算得到：
式中：
R—以干基计的抑芽丹残留量，mg/Kg；
C—标准工作曲线计算得到的结果，μmol/L；
V—萃取液体积，mL；
M—抑芽丹的摩尔质量，g/mol；
m—待测样品质量，g。
实施例4：一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法，采用吖啶类配位体作为荧光检测分子探针；本发明将吖啶类配位体作为荧光检测的分子探针，通过抑芽丹分子与分子探针间的氢键作用，抑制吖啶类配位体分子的非辐射跃迁，能够将其用于荧光检测，开创了用基于小分子荧光探针测定抑芽丹农药残留量的先河，有利于解决现有其他检测方式检测抑芽丹农药残留量的缺陷；。
所述吖啶类配位体为2,7-二(吡啶-4)吖啶分子；本发明优选的，采用自行设计合成的有机小分子2,7-二(吡啶-4)吖啶(简称DPA)作为荧光探针，抑芽丹分子(简称MH)可通过与DPA分子间的氢键作用，抑制DPA分子的非辐射跃迁，从而有效开启DPA的荧光增强机制，利用这一特点把DPA作为抑芽丹的荧光检测探针，可以快速、便捷、低成本的完成烟草农药残留抑芽丹的快速检测。
所述2,7-二(吡啶-4)吖啶分子的合成包括如下步骤：将2,7-二溴吖啶、吡啶-4-硼酸、氟化铯和四(三苯基膦)钯溶于1,2-二甲氧基乙烷，在N2气氛下80～100℃搅拌2～4天，通过色谱法纯化粗品，得到黄色粉末，即得2,7-二(吡啶-4)吖啶；其中，2,7-二溴吖啶为0.67mg，2.0mmol；吡啶-4-硼酸为0.59g，2.4mol；氟化铯(CsF)为2.8g，18mmol；四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)0.130g，0.12mmol；
所述2,7-二(吡啶-4)吖啶分子的合成步骤包括：在苄基三乙基溴化铵-甲醇溶液中加入吖啶，在50～70℃下用回流冷凝器将反应搅拌10～20小时；冷却至室温，过滤粗品，用吡啶和二氯甲烷洗涤，在40～60℃下真空蒸发，得到淡黄色固体2,7-二溴吖啶；其中，苄基三乙基溴化铵(TEBA)为12g，44mmol；甲醇为100mL；吖啶为2.16g，12mmol。
具体包括有如下步骤：制备探针水溶液；烟叶样品前处理；绘制标准曲线；样品检测；本发明检测方法具有检测快速、操作简便、成本低廉的优点；其中，本发明检测方法的响应时间为1min，而液相法抑芽丹出峰时间为8min；较高效液相色谱仪，荧光光谱仪操作非常简便，放置待测样品后收集和记录荧光光谱即可；可收集320-690nm范围内的荧光光谱仪仅需6万块，且检测过程无需使用仪器耗材，维护成本极低，具有良好的应用前景。
制备探针水溶液的步骤为，将2,7-二(吡啶-4)吖啶分散于去离子水中，得探针水溶液。
烟叶样品前处理的步骤为：称取2g烟末样品加入体积为20mL，浓度为4mol/L盐酸溶液，于油浴120℃条件下磁力搅拌萃取1h，冷却至室温后离心，取上清液，得待测样品。本发明通过适宜的样品前处理方法，将烟末样品通过盐酸溶液提取，提取后的样品滤液无需净化便可上机检测，与现有前处理方法相比较，极大简化了抑芽丹的前处理流程。且本发明的检测方法，通过利用分子探针与抑芽丹的氢键作用，能避免共存物的检测干扰，方法选择性好。
所述绘制标准曲线的步骤为，将抑芽丹储备液加入探针水溶液中，得系列浓度的抑芽丹-探针水溶液，超声处理获得稳定的悬浮液，采用荧光光谱仪，设定320nm为最大激发波长，480nm为最大发射波长，在320-690nm的范围内记录和收集荧光光谱。
所述样品检测的步骤为，将待测样品溶液加入探针水溶液，漩涡震荡后，采用荧光光谱仪，设定320nm为最大激发波长，480nm为最大发射波长，在320-690nm的范围内记录和收集荧光光谱。
抑芽丹残留量采用下式计算得到：
式中：
R—以干基计的抑芽丹残留量，mg/Kg；
C—标准工作曲线计算得到的结果，μmol/L；
V—萃取液体积，mL；
M—抑芽丹的摩尔质量，g/mol；
m—待测样品质量，g。
实施例5：DPA结构表征
利用核磁氢谱、碳谱及高分辨质谱对所合成的化合物进行了结构确定，其具体数据如下：
氢谱数据：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.29(s,1H),8.75(d,6H，J＝5.6Hz),8.31(t,4H，J＝10.8,9.5Hz),7.98(d,4H，J＝5.2Hz)；
碳谱数据：13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:150.9,149.2,146.4,138.6,134.8,130.5,130.1,127.5,126.8,122.0；
质谱数据：HRMS(ESI)m/z:calculated for C23H15N3[M+H]+，334.1339；found,334.1334。
通过上述碳谱、氢谱和质谱数据，解析出DPA的分子结构图如图5所示。
通过甲苯/乙酸乙酯溶剂气相扩散法制备了DPA晶体，从晶体结构图，图6可看出，DPA分子中存在着二聚体，分子层与层之间通过有π-π相互作用堆积，距离为。
实施例6：荧光检测方法的可行性
为了验证该荧光传感方法的可行性，考察了MH水溶液、DPA水溶液和含MH的DPA水溶液的荧光光谱，结果如图7所示。DPA溶液最大发射波长为480nm，最大激发波长为320nm,而抑芽丹溶液几乎没有荧光，在10mol/L DPA探针溶液中加入目标分析物抑芽丹(100mol/L)后，能使DPA水溶液荧光明显增强，表明该方法可以实现抑芽丹的检测。
实施例7：检测条件的优化
(1)DPA探针浓度的优化
在DPA探针溶液中加入抑芽丹后，能使DPA水溶液荧光明显增强，配制浓度分别为1、5、10、50和100mol/L的DPA水溶液，对比加入0.1mol/L抑芽丹溶液前后荧光增强情况，结果如图8所示。图8结果表明当DPA探针浓度为10mol/L时，加入抑芽丹分子增强最明显，因此反应底液中DPA探针浓度最佳为10mol/L。
(2)响应时间的优化
响应时间是衡量检测方法的一个重要因素，为此考察了本检测方法的响应时间。将0.05mM抑芽丹加入到10mol/L DPA探针水溶液，记录了加入抑芽丹之后0、1、2、3、4、5、7、9、11、13、15和17min溶液的荧光强度，结果如图9所示。图9表明，随着平衡时间延长，荧光强度不断增加，1min时荧光明显增强，随后荧光强度变化较小，说明抑芽丹荧光检测时间最佳为1min，该方法具有较快的响应时间。
实施例8：检测方法的分析性能
为确定DPA检测抑芽丹分子的线性范围，探究不同抑芽丹浓度对DPA水溶液荧光强度的影响，配制抑芽丹浓度为0.1μM-1mM的DPA水溶液，并测量其荧光强度。结果如图10所示，随着抑芽丹浓度的增加，DPA水溶液的荧光强度逐渐增加，在0.5μM-0.1mM内其荧光强度与抑芽丹浓度呈线性，线性方程为I＝7.36C+750，线性相关系数R2＝0.996。
采用最低浓度抑芽丹标准溶液(0.5μM)，连续检测10次，测定结果的标准偏差(SD)为0.033，因此方法的检出限为3SD＝0.1μM(0.11mg/Kg)，定量限为10SD＝0.33μM(0.37mg/Kg)。
实施例9：方法选择性
为探究在其他农药共存的情况下DPA对抑芽丹检测性能，配制一系列干扰农药如啶虫脒，***酮，异菌脲，甲基硫菌灵，甲霜灵和***醇与抑芽丹共存的DPA水溶液(DPA和抑芽丹浓度为1×10-5mol/L，其他农药浓度为1×10-4mol/L)，测定其荧光强度，结果如图11所示。图中，从左往右依次是抑芽丹、抑芽丹+啶虫脒、抑芽丹+***酮、抑芽丹+异菌脲、抑芽丹+甲基硫菌灵、抑芽丹+甲霜灵、抑芽丹+***醇。根据图11的结果表明，在10倍浓度其他农药共存条件下，对待测液荧光强度影响不大，DPA检测抑芽丹具有较好的抗干扰能力。
实施例10：响应原理
为探究DPA对抑芽丹的检测机理，将DPA、抑芽丹以及两者不同摩尔比例混合后溶于氘代DMSO中通过核磁探索其机理。如图12所示，抑芽丹的两个羟基氢具有较大的耦合作用，抑芽丹和DPA分子混合后，抑芽丹的羟基氢耦合作用明显减弱。说明DPA分子与抑芽丹分子之间形成了氢键，使得抑芽丹分子的羟基氢之间的耦合作用减弱。测试加入抑芽丹前后的DPA水溶液的荧光寿命，如图13所示，加入抑芽丹后，溶液荧光寿命缩短，说明DPA分子与抑芽丹分子之间通过氢键作用，抑制了非辐射跃迁，从而增强DPA的荧光。
实施例11：实际样品检测
将待测烟叶样品先用HPLC(高效液相色谱)测得样本原含量后，再用本发明方法进行MH检测，并进行加标回收，结果见表1。从表1可以看出，在检测烟叶样品时，高、中、低浓度MH加标回收率为98.3％～106.7％，相对标准偏差(RSD)为1.4％～4.1％，表明该方法可用于实际样品的检测。
表1实际样品中MH的检测(n＝5)
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法，其特征在于：具体包括有如下步骤：制备探针水溶液；烟叶样品前处理；绘制标准曲线；样品检测，采用吖啶类配位体作为荧光检测分子探针；所述吖啶类配位体为2,7-二(吡啶-4)吖啶分子；所述2,7-二(吡啶-4)吖啶分子的合成包括如下步骤：将2,7-二溴吖啶、吡啶-4-硼酸、氟化铯和四(三苯基膦)钯溶于1,2-二甲氧基乙烷，在N2气氛下80～100℃搅拌反应2～4天，通过色谱法纯化粗品，得黄色粉末，即得2,7-二(吡啶-4)吖啶；所述2,7-二(吡啶-4)吖啶分子的合成步骤包括：在苄基三乙基溴化铵-甲醇溶液中加入吖啶，在50～70℃下用回流冷凝器将反应搅拌10～20小时；冷却至室温，过滤粗品，用吡啶和二氯甲烷洗涤，在40～60℃下真空蒸发，得到淡黄色固体2,7-二溴吖啶。
2.根据权利要求1所述的一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法，其特征在于：制备探针水溶液的步骤为，将2,7-二(吡啶-4)吖啶分散于去离子水中，得探针水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法，其特征在于：烟叶样品前处理的步骤为：称取1.5～2.5g烟末样品加入体积为15～25mL，浓度为3～5mol/L盐酸溶液，于油浴100～140℃条件下磁力搅拌萃取0.5～1.5h，冷却至室温后离心，取上清液，得待测样品。
4.根据权利要求1所述的一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法，其特征在于：所述绘制标准曲线的步骤为，将抑芽丹储备液加入探针水溶液中，得系列浓度的抑芽丹-探针水溶液，超声处理获得稳定的悬浮液，采用荧光光谱仪，设定320nm为最大激发波长，480nm为最大发射波长，在320-690nm的范围内记录和收集荧光光谱。
5.根据权利要求1所述的一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法，其特征在于：所述样品检测的步骤为，将待测样品溶液加入探针水溶液，漩涡震荡后，采用荧光光谱仪，设定320nm为最大激发波长，480nm为最大发射波长，在320-690nm的范围内记录和收集荧光光谱。
6.根据权利要求1所述的一种烟草农药残留抑芽丹的荧光检测方法，其特征在于：抑芽丹残留量采用下式计算得到：
式中：
R—以干基计的抑芽丹残留量，mg/Kg；
C—标准工作曲线计算得到的结果，μmol/L；
V—萃取液体积，mL；
M—抑芽丹的摩尔质量，g/mol；
m—待测样品质量，g。
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| 王春琼等.基于2,7-二（4-吡啶基）吖啶的荧光探针灵敏检测烟草农药残留抑芽丹.《烟草科技》.2023,全文. * |
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