CN113336678B - 一种富电子稠环芳基硝酮类荧光探针及其制备与应用 - Google Patents

一种富电子稠环芳基硝酮类荧光探针及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于有机合成方法学技术领域，公开了一种富电子稠环芳基硝酮类荧光探针及其制备与应用，其中富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针，结构通式如式I所示；式I中，Ar为具有荧光性质的助色团取代的咔唑、萘、芘、喹啉、或苯并吡喃类稠环芳基。本发明通过对探针的细节组成等进行改进，得到具有如式I所示化学结构通式的富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针，可有效解决现有技术缺乏对工业生产和自由基反应过程中自由基中间体监控手段等技术问题，利用该荧光探针对上述过程中产生的碳中心自由基进行监测。
Figure DDA0003063126860000011

Description

一种富电子稠环芳基硝酮类荧光探针及其制备与应用
技术领域
本发明属于有机合成方法学、有机分析、自由基荧光探针技术领域，更具体地，涉及一种富电子稠环芳基硝酮类荧光探针及其制备与应用，该荧光探针能够在识别碳中心自由基方面应用。
背景技术
稠环芳香化合物如咔唑、萘环、芘环、喹啉和苯并吡喃等，它们的支架是各种有机材料的有用构建基块，同时它们良好的发光性质被广泛应用为可拼接的荧光基团，当它们含有一些高度扭曲的烷基取代基或者一些有利于发光的取代基时，会展现出更加优越的荧光性质。
硝酮化合物作为反磁性的自由基捕获剂，与短寿命的自由基发生加成反应生成更稳定的顺磁性自旋加合物氮氧自由基(nitroxide),而后通过解析EPR谱仪检测所得的特征信号,达到鉴定短寿命自由基的目的，被广泛地应用在自由基捕获技术中。
在工业生产中，有很多有机化学反应过程中会发生自由基反应，给生产过程带来危险。例如在吡唑醚菌酯工业化生产中的重要中间体邻硝基苄基溴，其起始原料是邻硝基甲苯与溴化剂在自由基引发剂AIBN作用下反应生成，由于自由基是一种不稳定的存在状态，有较强的反应活性，易于与其它分子结合，同时产生大量的反应热。溶剂蒸发带走多余的反应热，当蒸汽不能及时冷凝或泄放掉时，就会造成超压超温的现象，对化工生产极为不利。因此，需要一种可以直观监测工艺过程和测试自由基含量的探针。目前报道的碳中心自由基荧光探针主要由荧光基上引入四甲基哌啶氮氧化物Tempo片段组成，但仍需要用EPR技术来实现定量。也就是说，现有技术中硝酮主要用来做自由基捕获剂，但需要用EPR测试定量。而将富电子稠环芳基荧光片段与硝酮结合起来的自由基荧光探针类化合物，还未见报道。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种富电子稠环芳基硝酮类荧光探针及其制备与应用，其中通过对探针的细节组成等进行改进，得到具有如式I所示化学结构通式的富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针，可有效解决现有技术缺乏对工业生产和自由基反应过程中自由基中间体监控手段等技术问题，利用该荧光探针对上述过程中产生的碳中心自由基进行监测。本发明提供的荧光探针可以有效地检测生产以及实验过程中产生的碳中心自由基物种，对反应体系中的碳中心自由基具有荧光识别(即，探针自身无荧光，识别到碳自由基时才发光)、抗干扰、检出限低(检出限浓度低至10-3g/L数量级)的特点，尤其可对反应进程中自由基的浓度进行定量分析从而判断反应进程。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针，其特征在于，其结构通式如式I所示：
Figure BDA0003063126840000021
式I中，Ar为具有荧光性质的助色团取代的咔唑、萘、芘、喹啉、或苯并吡喃类稠环芳基。
按照本发明的另一方面，本发明提供了上述富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针的制备方法，其特征在于，其合成路线如下：
Figure BDA0003063126840000022
作为本发明的进一步优选，所述制备方法具体是：首先将如式Ⅱ所示的富电子稠环芳烃与甲醛及叔丁胺一同反应制备如式Ⅴ所示的富电子稠环芳烃曼尼希碱；然后，将如式Ⅴ所示的富电子稠环芳烃曼尼希碱经氧化反应获得如式I所示的稠环芳基硝酮类荧光探针；
优选的，所述甲醛是以质量百分数为37％的甲醛溶液的形式使用的。
作为本发明的进一步优选，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将如式Ⅱ所示的富电子稠环芳烃与甲醛、叔丁胺和溶剂混合，加热反应1～36h，冷却，后处理得到如式Ⅴ所示的富电子稠环芳烃曼尼希碱；
所述加热反应的反应时间优选为24h，
(2)将如式Ⅴ所示的富电子稠环芳烃曼尼希碱与过氧化氢及催化剂在溶剂中混合，在10～30℃下反应1～12h，即可得到如式I所示的稠环芳基硝酮类荧光探针；
在10～30℃下反应的反应时间优选为4h。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，
所述如式Ⅱ所示的富电子稠环芳烃、溶质甲醛与所述叔丁胺三者的摩尔比为1：1.0～1.5：1.5～2.0，优选为1：1.2：2；
所述如式Ⅱ所示的富电子稠环芳烃在所述溶剂中浓度为0.02-0.05g/mL，优选为0.04g/mL；
所述溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、正丁醇、乙腈中的至少一种，优选为异丁醇。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，
所述催化剂为钨酸钠、钼酸钠中的至少一种，优选为钨酸钠；
所述如式Ⅴ所示的富电子稠环芳烃曼尼希碱、所述催化剂与所述过氧化氢三者的摩尔比为1.0:0.1～0.4:2.0～3.0，优选为1.0:0.2:2.5；
所述溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、正丁醇、乙腈的至少一种，优选为甲醇。
按照本发明的又一方面，本发明提供了上述富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针在检测碳中心自由基中的应用。
作为本发明的进一步优选，所述应用包括以下步骤：
S1：用溶剂将富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针配成浓度为1×10-7～1×10-3g/L的荧光探针指示剂溶液；
所述荧光探针指示剂溶液的浓度优选为1×10-4g/L；
S2：将所述步骤S1得到的所述荧光探针指示剂溶液与待测样品混合后，在50～100℃下加热，在365nm光的激发下，观察混合溶液的荧光强度变化，再通过荧光光谱仪测得混合溶液荧光发射光谱的变化；
S3：若混合溶液的荧光强度增强，并且表现为在450～600nm处出现荧光强度的增大，则判定所述待测样品中含有碳中心自由基；否则，判定所述待测样品中不含碳中心自由基。
作为本发明的进一步优选，所述步骤S1中，所述溶剂为无水甲醇、无水乙醇、无水异丙醇、无水异丁醇、无水正丁醇、无水乙腈、无水四氢呋喃、无水二氯甲烷、无水二氯乙烷中的至少一种；优选为无水乙腈；
所述步骤S2中，将所述步骤S1得到的所述荧光探针指示剂溶液与待测样品混合，具体是将所述荧光探针指示剂溶液与所述待测样品按预先设定的摩尔当量比混合；优选的，所述预先设定的摩尔当量比为梯度设定的多个摩尔当量比，更优选为1:0、1:0.25、1:0.5、1:0.75、1:1、1:1.25和1:1.5。
作为本发明的进一步优选，若所述步骤S3中判定所述待测样品中含有碳中心自由基，则，所述步骤S3中还包括：
根据预先确定的荧光滴定曲线的线性关系，计算自由基的含量；
优选的，所述荧光滴定曲线的线性关系是按以下过程预先确定的：
将所述步骤S1得到的所述荧光探针指示剂溶液分别与已知碳中心自由基含量、且碳中心自由基含量呈梯度分布的多个标准待测样品按预先设定的摩尔当量比混合后，将这些混合溶液在50～100℃下加热，然后分别测试它们在450～600nm处的荧光强度，从而绘制并拟合得到荧光滴定曲线；更优选的，所述荧光滴定曲线是以自由基当量数作为自变量，以荧光强度作为因变量。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明通过构建具有如式I所示结构通式的富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针，向硝酮类化合物中引入具有荧光性质的咔唑、萘、芘、喹啉、或苯并吡喃类稠环芳基作为取代基Ar，得到的芳香杂环硝酮类自由基荧光探针(如咔唑硝酮类荧光探针)，能够有效的定性和/或定量的检测碳中心自由基(例如，可以直观地知道有无自由基，并且进一步实现定量)。并且，由于稠环芳基本身是大共轭环，自身就有富电子的特性，而进一步被助色团(如强给电子)取代的稠环芳基，将具有更强的富电子特性，利于后续MANNICH反应进行。
目前自由基捕获技术主要的研究体系常与生命科学领域相关，多用于捕获羟基自由基，而根据所需自由基研究对象设计并合成新型的自旋捕获探针的研究还较少。由于近年来荧光光谱、电化学分析以及化学发光技术对生物体ROS分析的应用比比皆是,使得新型自由基探针的设计尤为重要。现有硝酮化合物作为自由基捕获剂，都需要借助EPR测试来完成自由基的鉴定，成像和荧光的研究还未涉及。而本发明将其与荧光片段结合，在本领域首次实现在不需要EPR参与下的自由基的鉴定，并可实现荧光成像。并且，目前报道的碳中心自由基荧光探针主要由荧光基上引入四甲基哌啶氮氧化物Tempo片段组成，将富电子稠环芳基荧光片段与硝酮结合起来的自由基荧光探针类化合物，还未见报道。
将现有技术中已有的自由基荧光探针应用到工业方面难度较大(自由基反应较快，难以捕获和成像)，而本发明首次将富电子稠环芳基荧光片段与硝酮结合起来的自由基荧光探针类化合物，能够有效解决这些问题。并且，本发明还通过将硝酮基团引入合成路线设计，对于不同的稠环底物都可采用该方法实现探针的制备，得到目标化合物。
具体分析的话，本发明所提供的自由基荧光探针具有以下优点：
1)探针自身无荧光，在捕获自由基之后逐渐呈现荧光，最大发射波长为450nm。
2)探针在450nm处的荧光可随着自由基的浓度的增大而增强，同时不受其他因素的影响。
3)检出限低，识别性强，可检测出10-3g/L数量级溶液中的自由基。
4)水溶性好，可避免毒性和污染性。
综上，本发明中的富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针可用于检测研究过程(如实验操作过程)中和实际生产中产生的碳中心自由基；例如，本发明中的富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针可以应用在AIBN分解过程中的自由基的检测。
附图说明
图1为荧光探针对不同浓度的自由基的荧光响应光谱图。图1中的插图为与荧光响应光谱图相对应的4个试样的实物图(从没有荧光到有较强荧光)，其中1个试样不含自由基、无荧光，因此在荧光响应光谱图上没有体现。
图2为荧光探针对不同浓度的自由基的荧光响应滴定曲线(也即，自由基与荧光探针当量比-荧光强度变化曲线)。
图3为100℃时荧光探针对苯乙烯聚合产生自由基响应的光谱图。图3中的插图为与光谱图相对应的2个试样的实物图。
图4为荧光探针对不同当量的自由基的荧光响应滴定曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
总的来说，本发明中如式I所示的富电子稠环芳基硝酮类荧光探针(即，富电子取代稠环芳烃硝酮类自由基荧光探针)，可以由多取代稠环芳基化合物经曼尼希(Mannich)反应得到的曼尼希碱，进一步氧化后制备得到。
Figure BDA0003063126840000061
其中，Ar为具有显著荧光性质的助色团取代的咔唑、萘、芘、喹啉、苯并吡喃类稠环芳基。适用于本发明的助色团，可以是现有技术已知的任意一种助色团，如氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基、羟基等在内的强给电子基。
实施例1
式Ⅰ-1所示稠环芳基为取代咔唑的荧光探针的制备方法，其合成路线如下：
Figure BDA0003063126840000062
具体步骤可以如下：
1)将式B所示化合物4-羟基吲哚(2mmol,590mg)和AlCl3(1mmol,14mg)溶于20mL醋酸溶液中，再加入式A所示化合物(2.4mmol,350mg)，在40℃下搅拌2h。冷却后,加6mL饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，用二氯甲烷(6mL)萃取三次，将有机相萃取回收，无水硫酸钠干燥。粗产物经硅胶柱分离纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝40:1～30:1(体积比)，梯度洗脱，得到白色固体取代咔唑化合物(式II-1)；
2)将式III 37wt％甲醛溶液(溶质1.92mmol,143μL)和式IV叔丁胺(3.2mmol,337μL)溶于10mL的异丙醇溶液中，在40℃下混合搅拌30min，加入式II-1所示化合物(1.6mmol,503mg)在100℃下反应12h。冷却后，减压浓缩反应液，用饱和NaCl溶液洗涤，二氯甲烷萃取三次，得到式V-1所示化合物；
3)式V-1所示化合物(0.8mmol,323mg)溶于6mL甲醇中，加入钨酸钠(0.16mmol,48mg)，滴加30wt％过氧化氢溶液(溶质2mmol,2mL)，常温下反应6h，浓缩反应液，柱层析分离得到式Ⅰ-1所示荧光探针。将制备得到的荧光探针I-1，用于后续实施例3～4中。
实施例1中：
式Ⅰ-1化合物的光谱数据如下所示。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.21(s,1H),7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.80～7.72(m,3H),7.56(dd,J＝18.8,8.5Hz,2H),7.44～7.33(m,3H),3.90(s,3H),1.64(s,9H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ166.8,150.3,147.6,136.3,135.7,131.6,130.8,129.4,128.5,127.8,127.3,127.0,125.1,121.3,118.2,115.7,112.7,108.7,70.6,52.1,28.1.HRMS(ESI)m/z calcd for C25H25N2O4 +[M+H]+417.1809,found 417.1811.
当然，R基除了羟基外，还可以是其他给电子基，均可达到可观的反应效果。
实施例2
式Ⅰ-2所示稠环芳基为氨基萘环的荧光探针的制备方法，其合成路线如下：
Figure BDA0003063126840000071
具体步骤可以如下：
1)将式C所示化合物仲胺(2mmol，R1、R2均为甲基)和醋酸(4mmol,229μL)混合成盐，再加入式A所示化合物(2mmol,590mg)，在120℃下搅拌12h。冷却后,加6mL饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，用二氯甲烷(6mL)萃取三次，将有机相萃取回收，无水硫酸钠干燥。粗产物经硅胶柱分离纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝30:1～20:1(体积比)，梯度洗脱，得到白色固体芳基氨基萘环化合物(式II-2)；
2)将式(III)37wt％甲醛溶液(溶质1.92mmol,143μL)和式(IV)叔丁胺(3.2mmol,337μL)溶于10mL的异丙醇溶液中，在40℃下混合搅拌30min，加入式II-2所示化合物(1.6mmol)在100℃下反应12h。冷却后，减压浓缩反应液，用饱和NaCl溶液洗涤，二氯甲烷萃取三次，得到式V-2所示化合物；
3)将式V-2所示化合物(0.8mmol)溶于6mL甲醇中，加入钨酸钠(0.16mmol,48mg)，滴加30wt％过氧化氢溶液(溶质2mmol,2mL)，常温下反应6h，浓缩反应液，柱层析分离得到式Ⅰ-2所示荧光探针。将制备得到的荧光探针，用于后续实施例5中。
实施例2中：
式Ⅰ-2化合物的光谱数据如下所示：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.50(s,1H),8.27(dd,J＝8.4,1.4Hz,1H),8.15(s,1H),7.99–7.87(m,1H),7.55(td,J＝7.8,1.3Hz,1H),7.42(td,J＝8.0,1.3Hz,1H),3.82(s,3H),3.43(q,J＝7.3Hz,4H),1.56(s,9H),1.21(t,J＝7.2Hz,6H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ167.13,145.89,135.85,135.46,131.81,129.67,129.12,127.99,126.65,126.55,125.99,122.10,70.13,52.21,48.00,28.04,14.18.HRMS(ESI)m/z calcd for C21H29N2O3 +[M+H]+357.2016,found 357.2015.
当然，式C所示化合物还可以是其他仲胺(R1、R2不同时为氢)，例如，R1、R2还可以是其他链状烷烃或位阻较小的环烷烃以及给电子基团，均可得到可观的收率。
实施例3：式I-1所示荧光探针测定碳中心自由基
1)用乙醇将式I-1所示的荧光探针配制成1×10-4g/L的荧光探针指示剂溶液；
2)将偶氮二异丁腈(AIBN)溶于四氢呋喃中，配制成一定浓度梯度1×10-5～1×10-3g/L的溶液，在70℃温度下加热30分钟。
3)待溶液冷却后，分别向不同梯度的偶氮二异丁腈(AIBN)溶液中，滴定相同量的式I所示荧光探针指示剂溶液，测试荧光强度(即，直接用荧光分光光度计测得点值)，绘制荧光滴定曲线(例如，可以在荧光分光光度计中设定测试荧光滴定曲线，点值自动回归生成曲线)。
4)通过测试荧光光谱图(如图1所示)可以发现，在375nm和450nm处，溶液荧光强度明显增强，证明溶液中含有自由基。进一步绘制荧光强度与自由基浓度的曲线图，
可以发现二者有良好的线性关系(如图2所示)。
需要说明的是，加热温度除了实施例中的70℃下加热30min外，也可以采用50～100℃的其他温度(之所以采用70℃作为示例，是因为70℃是AIBN的最佳分解温度；AIBN是碳自由基源的典型代表，本发明探针产生的碳自由基类型与AIBN类似，因此尤其可以将温度设定在70℃)。
实施例4：式Ⅰ-1所示荧光探针测定制备邻硝基苄基溴过程中的自由基含量
1)从吡唑醚菌酯工业化生产中，制备邻硝基苄基溴流程的反应器中取出部分母液，用一当量的荧光探针滴定，测试荧光强度为636。
2)根据实施例3所测得的荧光滴定曲线图，可以得到该母液中所含自由基的浓度为8×10-4g/L，进一步可以指导该工艺需要降温冷凝气体排出气体，以免温度过高造成超压超温危险。
实施例5：式I-2所示荧光探针检测苯乙烯原子转移自由基聚合情况
1)用乙醇将式I-2所示的荧光探针配制成1×10-4g/L的荧光探针指示剂溶液；
2)将0.1mol苯乙烯与一定物质的量比并准确称量的α-溴代异丁酸叔丁酯(tBBiB)、五甲基二乙烯基三胺(PMDETA)或2,2′-联吡啶(bPy)和少量的苯甲醚(作内标)及搅拌子加入干燥的100mL三口圆底烧瓶中,混合均匀后除氧并在氩气的保护下加入一定量的CuBr或CuBr2,经过反复抽真空充氩气循环后置于150℃油浴中,在温和搅拌下反应,在不同温度下(80～120℃)取样。
3)将不同温度下的取样与步骤1)配制的荧光探针结合，在365nm光激发下，观察荧光探针指示剂溶液的荧光强度变化，再通过荧光光谱仪测得样品荧光发射光谱的变化。
4)记录各时间节点下的荧光强度，可以发现温度为110℃时，样品与荧光探针指示剂结合，荧光光谱波长红移且溶液荧光强度明显增强(如图3所示)，说明反应体系中含有大量自由基。也表示苯乙烯原子转移自由基聚合反应一般均在100℃以上进行，而苯乙烯在100℃或更高温度时可发生自由基热聚合。此时补加阻聚剂CuBr或CuBr2，可大大降低热聚合速率,起到阻聚的作用，以此来指导化工生产。
最后要说明的是，上述实施例仅仅举出式Ⅰ所示荧光探针的制备和应用，其余荧光探针由于结构与性质相似等均可达到预期的效果，其制备方法与测试方法等不一一列出。
本发明中的常温、室温，均是指10～30℃。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针，其特征在于，其结构通式如式I所示：
Figure FDA0003573263950000011
式I中，Ar为具有荧光性质的助色团取代的咔唑、萘、芘、喹啉、或苯并吡喃类稠环芳基；
并且，该富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针的结构式具体如式I-1或式I-2所示：
Figure FDA0003573263950000012
式I-1中，R基为烷氧基或羟基；
式I-2中，R1基为氢或链状烷烃基团，R2基为氢或链状烷烃基团，并且，R1、R2不同时为氢。
2.如权利要求1所述富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针的制备方法，其特征在于，其合成路线如下：
Figure FDA0003573263950000013
Figure FDA0003573263950000021
3.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述制备方法具体是：首先将如式Ⅱ所示的富电子稠环芳烃与甲醛及叔丁胺一同反应制备如式Ⅴ所示的富电子稠环芳烃曼尼希碱；然后，将如式Ⅴ所示的富电子稠环芳烃曼尼希碱经氧化反应获得如式I所示的稠环芳基硝酮类荧光探针。
4.如权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述甲醛是以质量百分数为37％的甲醛溶液的形式使用的。
5.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将如式Ⅱ所示的富电子稠环芳烃与甲醛、叔丁胺和溶剂混合，加热反应1～36h，冷却，后处理得到如式Ⅴ所示的富电子稠环芳烃曼尼希碱；
(2)将如式Ⅴ所示的富电子稠环芳烃曼尼希碱与过氧化氢及催化剂在溶剂中混合，在10～30℃下反应1～12h，即可得到如式I所示的稠环芳基硝酮类荧光探针。
6.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述加热反应的反应时间为24h；
所述步骤(2)中，在10～30℃下反应的反应时间为4h。
7.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，
所述如式Ⅱ所示的富电子稠环芳烃、溶质甲醛与所述叔丁胺三者的摩尔比为1：1.0～1.5：1.5～2.0；
所述如式Ⅱ所示的富电子稠环芳烃在所述溶剂中浓度为0.02-0.05g/mL；
所述溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、正丁醇、乙腈中的至少一种。
8.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，
所述催化剂为钨酸钠、钼酸钠中的至少一种；
所述如式Ⅴ所示的富电子稠环芳烃曼尼希碱、所述催化剂与所述过氧化氢三者的摩尔比为1.0:0.1～0.4:2.0～3.0；
所述溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、正丁醇、乙腈的至少一种。
9.如权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中：
所述如式Ⅱ所示的富电子稠环芳烃、溶质甲醛与所述叔丁胺三者的摩尔比为1：1.2：2；
所述如式Ⅱ所示的富电子稠环芳烃在所述溶剂中浓度为0.04g/mL；
所述溶剂为异丁醇；
所述步骤(2)中：
所述催化剂为钨酸钠；
所述如式Ⅴ所示的富电子稠环芳烃曼尼希碱、所述催化剂与所述过氧化氢三者的摩尔比为1.0:0.2:2.5；
所述溶剂为甲醇。
10.如权利要求1所述富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针在检测碳中心自由基中的应用。
11.如权利要求10所述应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
S1：用溶剂将富电子稠环芳基硝酮类自由基荧光探针配成浓度为1×10-7～1×10-3g/L的荧光探针指示剂溶液；
S2：将所述步骤S1得到的所述荧光探针指示剂溶液与待测样品混合后，在50～100℃下加热，在365nm光的激发下，观察混合溶液的荧光强度变化，再通过荧光光谱仪测得混合溶液荧光发射光谱的变化；
S3：若混合溶液的荧光强度增强，并且表现为在450～600nm处出现荧光强度的增大，则判定所述待测样品中含有碳中心自由基；否则，判定所述待测样品中不含碳中心自由基。
12.如权利要求11所述应用，其特征在于，所述步骤S1中，所述荧光探针指示剂溶液的浓度为1×10-4g/L。
13.如权利要求11所述应用，其特征在于，所述步骤S1中，所述溶剂为无水甲醇、无水乙醇、无水异丙醇、无水异丁醇、无水正丁醇、无水乙腈、无水四氢呋喃、无水二氯甲烷、无水二氯乙烷中的至少一种；
所述步骤S2中，将所述步骤S1得到的所述荧光探针指示剂溶液与待测样品混合，具体是将所述荧光探针指示剂溶液与所述待测样品按预先设定的摩尔当量比混合；所述预先设定的摩尔当量比为梯度设定的多个摩尔当量比。
14.如权利要求13所述应用，其特征在于，所述步骤S1中，所述溶剂为无水乙腈；
所述步骤S2中，所述预先设定的摩尔当量比具体为1:0、1:0.25、1:0.5、1:0.75、1:1、1:1.25和1:1.5。
15.如权利要求11所述应用，其特征在于，若所述步骤S3中判定所述待测样品中含有碳中心自由基，则所述步骤S3中还包括：
根据预先确定的荧光滴定曲线的线性关系，计算自由基的含量；
所述荧光滴定曲线的线性关系是按以下过程预先确定的：
将所述步骤S1得到的所述荧光探针指示剂溶液分别与已知碳中心自由基含量、且碳中心自由基含量呈梯度分布的多个标准待测样品按预先设定的摩尔当量比混合后，将这些混合溶液在50～100℃下加热，然后分别测试它们在450～600nm处的荧光强度，从而绘制并拟合得到荧光滴定曲线；所述荧光滴定曲线是以自由基当量数作为自变量，以荧光强度作为因变量。
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