CN115337222B - 一种中空胶原蛋白结构体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种中空胶原蛋白结构体及其制备方法和应用。本发明通过静电纺丝的方法制备具有特定形状的中空胶原蛋白结构体，以满足不同应用需求，操作简单，结构易于控制，特别是经过加湿后处理，使得丝线复溶为粘稠态的凝胶体，提高了中空胶原蛋白结构体外部结构的紧密性，复溶后进行交联后处理，可以提高交联的有效性。本发明制得的中空胶原蛋白结构体表面结构光滑，稳定性好，强度高，有韧性，生物相容性好，具有重要的临床意义和应用价值。

Description

一种中空胶原蛋白结构体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料及医疗器械领域，具体涉及一种中空胶原蛋白结构体及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白是哺乳动物体内的***细胞和其他类型的细胞(如肝脏、肺、脾及脑组织细胞)所分泌的纤维状、大分子蛋白质，是骨骼和皮肤的主要组成部分。胶原蛋白除了具有生物力学方面的作用以外，还具有诸如信号转导、生长因子与细胞因子的运输等功能；此外，由于其成本低、免疫原性低、生物降解性、生物相容性以及可大规模生产，在食品、化妆品、医药等行业具有广泛应用。其中，在医药行业胶原蛋白广泛用于医美、烧伤、创伤、牙科、眼科、组织修复等领域，以薄膜和海绵形态最为常见。但某些疾病的治疗或缓解往往需要具有中空结构的生物医用材料，例如，利用小直径的组织工程血管移植物进行动脉吻合等显微外科手术中的周围血管重建；通过植入导流管来治疗顽固性高眼压引起的青光眼；以及通过激光探通联合***人造泪小管治疗泪道阻塞等疾病。因此，制备一种制备方法简单高效、机械强度优异的中空胶原蛋白结构体，特别是应用于小口径的人工血管重建、眼科类疾病治疗过程中使用到的毫米级甚至微米级导管显得尤为重要。
以往制备中空结构的胶原蛋白材料时有采用模具法、电化学沉积等方法，但这些方法往往由于对精细结构的控制以及加工均存在难度、生产效率低下等问题使其在实际应用上受到限制。
中国专利CN111318237B公开了一种胶原-壳聚糖水凝胶及其制备方法，利用电化学沉积的原理，并通过改变不锈钢针直径和横截面形状控制凝胶纤维中空部分直径和形状，但此种方法制备的中空胶原-壳聚糖水凝胶结构不够致密，表面不够光滑，粗细不匀。
日本专利JP3221690B2公开了一种边使胶原蛋白溶液浓缩边模制管状或面状以制造胶原蛋白结构体的技术，使胶原蛋白溶液经由可渗透性构件与聚乙二醇等浓缩剂接触，浓缩至50～100mg/ml的胶原蛋白浓度，再将该浓缩溶液模制成环状，从而形成环状的胶原蛋白结构体，但该方法操作复杂，且浓缩的过程较为缓慢。
Li等人提出了将胶原蛋白溶液倒入直径8mm，高度12mm的圆柱形模具，模具中心放置直径0.5或1mm的涂有牛血清白蛋白的玻璃或不锈钢，制备直径≤1mm的胶原管结构物，并与20mM的京尼平交联(Li X,Xu J,Nicolescu CT,Marinelli JT,Tien J.Generation,Endothelialization,and Microsurgical Suture Anastomosis of Strong 1-mm-Diameter Collagen Tubes.Tissue Eng Part A.2017Apr；23(7-8):335-344.)，但其采用的胶原浓度为6mg/ml，需要脱水才能获得浓缩100倍的胶原管，但是浓缩倍数较大时，胶原蛋白管直径及表面容易不均匀，且耗时较长。
中国专利CN103046225B公开了静电纺丝技术制备纳米胶原蛋白膜的技术，但其纺丝后的胶原蛋白膜未进行交联处理，且其仅用静电纺丝技术制备了胶原蛋白膜，未制备具有中空结构的胶原蛋白结构体。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种用静电纺丝制备中空胶原蛋白结构体的新方法，以及所述方法制备的中空胶原蛋白结构体及其应用。
在本发明第一方面，提供一种中空胶原蛋白材料，在本发明中也称为中空胶原蛋白结构体，包括中空结构和外部结构。该结构体由胶原蛋白通过纺丝(例如相分离纺丝、闪蒸纺丝、静电纺丝、液晶纺丝或反应纺丝，特别是静电纺丝)、后处理(例如加湿处理、交联处理等)制备得到(特别是通过本发明第二方面所述的制备方法制备得到)。该结构体通过改变中空结构的形貌可以控制流量，通过改变外部结构的形貌可以调整与应用场景的适配度。且该中空胶原蛋白结构体结构稳定、生物相容性好、强度高、韧性好、抗渗漏性好。
具体地，胶原蛋白可以为来源于任何含有胶原蛋白的水生物或其他动物(例如牛、猪、鱼和鸡)的天然胶原蛋白；胶原蛋白可以为重组活性胶原蛋白，也可以为胶原蛋白衍生物。
具体地，所述胶原蛋白包括但不限于I型、III型胶原蛋白。
具体地，所述胶原蛋白衍生物是指对所述胶原蛋白分子结构进行了修饰的产物，包括但不限于琥珀酰化胶原蛋白、邻苯二甲酰化胶原蛋白、马来酰化胶原蛋白等酰基化胶原蛋白或酯化胶原蛋白。
具体地，所述中空结构可以根据实际需求进行调整，可以全部或部分优选为圆柱形结构、圆锥形结构、多棱柱形结构(例如四棱柱、五棱柱、六棱柱结构)、多角锥形结构等。
在本发明的一些实施例中，所述中空结构为圆柱形结构，所述圆柱形的直径为40-4000μm(例如40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000μm)，优选为50-2000μm。
在本发明另一些实施例中，所述中空结构为多棱柱形结构，例如四棱柱、六棱柱结构，其横截面边长为40-5000μm(例如40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000μm)，优选为200-4000μm。
具体地，所述外部结构可以根据实际需求进行调整，可以全部或部分优选为圆柱形结构、环纹结构、圆锥形结构、多棱柱形结构(例如四棱柱、五棱柱、六棱柱结构)、多角锥形结构、球形结构等。
在本发明的一些实施例中，所述外部结构为圆柱形结构，所述圆柱形的直径为50-8000μm(50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000μm)，优选为100-4000μm。
在本发明另一些实施例中，所述外部结构为多棱柱形结构，例如四棱柱、六棱柱结构，其横截面边长为50-8000μm(50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000μm)，优选为500-5000μm。
具体地，所述外部结构的平均厚度为100-2000μm(例如100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1500、1600、1800、2000μm)，优选为200-1200μm。
根据使用需要，所述中空胶原蛋白结构体也可以制成环状等其他形状的材料。
在本发明第二方面，提供一种中空胶原蛋白结构体的制备方法，其包括胶原纺丝液的制备、纺丝以及后处理的步骤。
具体地，所述胶原纺丝液为将胶原蛋白溶于溶剂中制得的胶原蛋白溶液。
具体地，所述胶原纺丝液中胶原蛋白的浓度为10-150mg/ml(例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150mg/ml)，优选为20-100mg/ml。所述胶原纺丝液中胶原蛋白的浓度不宜过高或过低，否则粘度过高或过低可能会导致无法进行纺丝。
具体地，所述胶原纺丝液中溶剂选自：六氟异丙醇、三氟乙醇以及乙酸、柠檬酸等有机酸水溶液、离子液体(例如1-丁基-3-甲基咪唑氯化物、1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐)的一种或多种；在本发明的一些实施例中，所述溶剂为有机酸水溶液，其浓度为20-60wt％(例如20wt％、25wt％、30wt％、35wt％、40wt％、45wt％、50wt％、60wt％)，特别是20-40wt％；在本发明的一个实施例中，所述溶剂为20-60wt％的乙酸溶液。
具体地，纺丝为相分离纺丝、闪蒸纺丝、静电纺丝、液晶纺丝或反应纺丝，特别是静电纺丝。
具体地，静电纺丝步骤包括：将胶原纺丝液通过静电纺丝装置进行纺丝，其中静电纺丝装置包括旋转的接收装置。静电纺丝所得胶原蛋白管状体也称为初生胶原蛋白纤维管。
在本发明的一些实施例中，静电纺丝步骤包括：将胶原纺丝液转移到纺丝注射器中，离心脱泡后，将装有纺丝液的注射器放置在静电纺丝机上，调整静电纺丝机参数(包括电压、推注速度、接收装置滚筒转速、滑台移动距离、滑台扫描速度等)，开始运行，纺丝结束后取下收集装置上的管状体。
具体地，所述接收装置包括细丝，其可以为任何材质，优选为金属丝，例如钢丝、钨丝、金丝、铂金丝或铜丝等。
具体地，所述接收装置的结构可以根据实际需求进行调整，可以全部或部分优选为圆柱形结构、圆锥形结构、多棱柱形结构(例如四棱柱、五棱柱、六棱柱结构)、多角锥形结构等。
在本发明的一些实施例中，所述接收装置为圆柱形结构，所述圆柱形的直径为40-4000μm(例如40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000μm)，优选50-2000μm。
在本发明的一些实施例中，所述接收装置为多棱柱形结构，例如四棱柱、六棱柱结构，其横截面边长为40-5000μm(例如40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000μm)，优选为200-4000μm。
具体地，静电纺丝步骤中，电压为2-65kV(例如2、4、5、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65kV)，优选为4-30kV。
具体地，静电纺丝步骤中，接收距离为0.5-15cm(例如0.5、1、2、3、4、5、7.5、10、12.5、15cm)，优选为2-10cm。
具体地，静电纺丝步骤中，推注速度为0.1-3ml/h(例如0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3ml/h)，优选为0.1-1.5ml/h。
具体地，静电纺丝步骤中，接收装置滚筒转速为100-2000r/min(例如100、500、1000、1500、2000r/min)，优选为500-1500r/min。
具体地，静电纺丝步骤中，滑台移动距离为20-300mm(例如50-230mm、50-200mm)，优选为50-230mm。
具体地，静电纺丝步骤中，滑台扫描速度10-50mm/s(例如10、15、20、25、30、35、40、50mm/s)，优选为15-25mm/s。
具体地，持续静电纺丝时间为0.5-8h(例如0.5、1、2、3、4、5、6、7、8h)，优选为1-5h。
在本发明的一个优选实施方式中，后处理包括加湿处理步骤；具体地，加湿处理包括但不限于蒸汽加湿、电热式加湿、电极式加湿或高压喷雾加湿；优选地，加湿处理为蒸汽加湿，特别是水蒸汽加湿。
具体地，加湿处理的温度为25-125℃(例如，25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、125℃)，特别是60-90℃。
具体地，加湿处理时间为5-50min(例如5、10、15、20、25、30、35、40、50、60min)，特别是10-30min。
在本发明的一个优选实施方式中，后处理包括交联处理步骤；更具体地，所述交联处理为通过交联剂处理，例如将待交联材料(例如经过加湿处理的初生胶原蛋白纤维管)浸泡于交联剂溶液中。
具体地，所述交联剂可以为京尼平、醛类交联剂(例如甲醛、戊二醛)、碳二亚胺-羟基琥珀酰亚胺(例如EDC-NHS)、双醛淀粉、壳聚糖、谷氨酰胺转胺酶或环氧化物的一种或多种。
具体地，所述环氧化物可以为环氧乙烷、环氧丙烷、1,2-环氧丁烷或1,4-环氧丁烷，也可以为双环氧化合物(例如1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,2,3,4,二环氧丁烷)或多环氧化合物(多为3个或3个以上，例如甘油三(1,2-环氧)丙醚)。
在本发明的一些实施例中，所述交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的组合。
在本发明另一些实施例中，所述交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
在本发明另一些实施例中，所述交联剂为京尼平。
在本发明另一些实施例中，所述交联剂为双醛淀粉。
在本发明另一些实施例中，所述交联剂为戊二醛。
在本发明的一个具体实施方式中，所述交联剂为双环氧化合物的溶液中还含有催化剂；具体地，所述的催化剂选自碱金属的氢氧化物或碱金属的碳酸盐。其中，所述的碱金属选自锂、钠、钾、铷、铯或钫。所述的碱金属的氢氧化物选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化铯或氢氧化钫。所述的碳酸盐可以为正盐、酸式盐或碱式盐，例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸锌、碳酸钙、碳酸镁、碳酸铁、碳酸铜等。
在本发明的一些实施例中，所述催化剂选自氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钠。
具体地，交联剂溶液的浓度为1-500mM(例如1、10、20、40、50、100、200、300、400、500mM)，优选为10-200mM。
具体地，待交联材料在交联剂溶液中的浸泡时间为2-48h(例如2、4、6、8、10、12、18、24、30、36、42、48h)，优选为4-24h。
具体地，交联剂的用量可以为胶原蛋白原料质量(即所用胶原纺丝液中的胶原蛋白的质量)的0.01-2.5倍(例如0.01、0.02、0.04、0.05、0.06、0.08、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.5倍)，特别是0.2-2.25倍。
优选地，经过后处理，所得中空胶原蛋白结构体表面结构光滑，更致密，更稳定，强度高、韧性好、抗渗漏性好。
在本发明的一个更优选的实施方式中，所述后处理包括依次进行的如下步骤：加湿处理、交联处理；具体地，各步骤如上所述。
具体地，后处理还可以包括洗涤步骤；更具体地，洗涤溶剂可以为醇类(如乙醇)、生理盐水、水等中的一种或多种的组合；更具体地，洗涤的次数可以为一次或多次；在本发明的一些实施例中，所述洗涤步骤为采用乙醇溶液、生理盐水多次清洗。
具体地，后处理还可以包括脱模步骤。
具体地，后处理还可以包括干燥步骤；更具体地，所述干燥包括但不限于冻干、真空干燥；在本发明的一些实施例中，所述干燥为真空干燥，干燥温度为4-37℃(例如4、6、8、10、15、20、25、26、30、35、37℃)优选为20-26℃，干燥时间为4-48h(例如4、6、8、10、12、18、24、30、36、42、48h)，优选为8-24h。
具体地，后处理还可以包括灭菌步骤，例如辐射灭菌。
在本发明的一些实施例中，所述后处理包括依次进行的如下步骤：加湿处理、交联处理、洗涤、脱模、干燥、灭菌；具体地，各步骤如上所述。
在本发明第三方面，提供一种植入物，其包含第一方面所述的中空胶原蛋白结构体或经第二方面所述方法制备得到的中空胶原蛋白结构体。
具体地，所述植入物在中空胶原蛋白结构体的中空结构外还包括外部结构，所述的外部结构可以根据植入部位调整形状，为了减少脱落等。
具体地，所述植入物可以为美容用植入物，也可以为疾病治疗用植入物。
具体地，所述美容用植入物包括但不限于，鼻腔植入物、眼部植入物、隐形眼镜、皮下植入物(例如面部或颈部注射后可以减少抚平皱纹)。
具体地，所述疾病治疗用植入物包括但不限于眼部植入物(例如导流管、人造泪管)、心脏植入物(例如心脏瓣膜)、口腔防护物、假牙垫料、组织替代物、输尿管修补物、筋和韧带代用物、绷带、缝线、血管植入物(例如人造血管)、骨科的板或钉、人工关节或吻合器。其中，所述吻合器例如皮肤吻合器、消化道(食道、胃肠等)圆形吻合器、直肠吻合器、圆形痔吻合器、***环切吻合器、血管吻合器、疝气吻合器、肺切割缝合器等。
在本发明第四方面，提供一种细胞培养材料，其包含第一方面所述的中空胶原蛋白结构体或经第二方面所述方法制备得到的中空胶原蛋白结构体。
具体地，所述细胞培养材料具有三维结构，使细胞能够在三维立体的空间生长、增殖和迁移，从而更好地模拟细胞在体内的生长环境，可用于疾病病理、药物药理研究、体外类器官的三维培养、体内移植等。
具体地，所述细胞可以为，例如，肿瘤细胞(例如用于研究肿瘤细胞的侵袭和迁移、肿瘤球体(spheroids)形成及培养、药物药理、药效研究等)，干细胞(例如诱导多能干细胞、胚胎干细胞、成体干细胞、永生化细胞系、原代细胞系等)，神经细胞(例如用于神经细胞培养和移植)，等等。
在本发明第五方面，提供第一方面所述的中空胶原蛋白结构体或经第二方面所述方法制备得到的中空胶原蛋白结构体在制备治疗疾病的产品以及细胞培养材料的应用。
具体地，所述治疗疾病的产品包括但不限于眼部植入物(例如导流管、人造泪管)、心脏植入物(例如心脏瓣膜)、口腔防护物、假牙垫料、组织替代物、输尿管修补物、筋和韧带代用物、绷带、缝线、血管植入物(例如人造血管)、骨科的板或钉、人工关节或吻合器。其中，所述吻合器例如皮肤吻合器、消化道(食道、胃肠等)圆形吻合器、直肠吻合器、圆形痔吻合器、***环切吻合器、血管吻合器、疝气吻合器、肺切割缝合器等。
在本发明第六方面，提供第一方面所述的中空胶原蛋白结构体或经第二方面所述方法制备得到的中空胶原蛋白结构体在制备美容产品中的应用。
具体地，所述美容产品包括但不限于，鼻腔植入物、眼部植入物、隐形眼镜、皮下植入物(例如面部或颈部注射后可以减少抚平皱纹)。
本发明的突出特点是通过静电纺丝的方法制备具有特定形状的中空胶原蛋白结构体，以满足不同应用的需求，操作简单，结构易于控制，特别是经过加湿后处理，使得丝线复溶为粘稠态的凝胶体，提高了中空胶原蛋白结构体外部结构的紧密性，复溶后进行交联后处理，可以提高交联的有效性，相较纺丝后直接交联而言，本发明的结构更为致密、交联程度更高、强度更高，且能够保持中空结构体的完整形貌。本发明制得的中空胶原蛋白结构体表面结构光滑，稳定性好，强度高，有韧性，生物相容性好，具有重要的临床意义和应用价值。
附图说明
图1所示为实施例1获得的中空胶原蛋白导管的显微镜照片。
图2所示为场发射扫描电子显微镜(FESEM)观察实施例1制备导管外部形貌图。
图3所示为场发射扫描电子显微镜(FESEM)观察对比例2制备导管外部形貌图。
图4所示为实施例1和对比例2获得的样品的复水后导管形态检测结果。
图5所示为本发明实施例和对比例制备的中空胶原蛋白管的体外降解曲线。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
本发明所述的“植入物”是放置于外科操作造成的或者生理存在的体腔中，留存一定时间的可植入型物品。其可以根据疾病的类型或者外科操作造成的形状或体腔形状任意调整其形状、长短、薄厚等。
本发明所述的“交联”是线型或支型高分子链间以共价键连接成网状或体型高分子的过程，包括化学交联和物理交联。
本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
称量提取自猪皮的I型胶原蛋白海绵0.5g，依次加入5ml冰醋酸和5ml纯化水，搅拌至完全溶解，将溶液转移到注射器中，离心脱泡后，将装有纺丝液的注射器放置在静电纺丝机上，调整静电纺丝机参数：纺丝正电压：4.0KV；纺丝负电压：4.0KV；推注速度：0.15ml/h；喷嘴与收集器的距离：5cm；滑台移动距离：50～230mm；细丝接收器滚筒转速1000r/min，圆柱形细丝直径：60μm，滑台扫描速度20mm/s，运行1h后关闭仪器，将转子上的丝线取下，经80℃蒸汽加湿10min，将丝线转移到200mM的EDC溶液中(称取0.620g EDC、0.124g NHS加入到20ml纯化水中配制而得)中浸泡12h后，用乙醇溶液、生理盐水多次清洗，将所得导管从丝线上取下，放于真空干燥箱内，设置温度为26℃，干燥24h，包装后25kGy辐射灭菌获得中空胶原蛋白管，该导管的平均内径为58～60μm，平均外径为360～370μm。该导管的具体形貌如图1所示。
实施例2
称量提取自牛跟腱组织的I型胶原蛋白海绵0.4g，加入4ml六氟异丙醇，搅拌至完全溶解，将溶液转移到注射器中，离心脱泡后，将装有纺丝液的注射器放置在静电纺丝机上，调整静电纺丝机参数：纺丝正电压：10.0KV；纺丝负电压：10.0KV；推注速度：0.75ml/h；喷嘴与收集器的距离：10cm；滑台移动距离：50～230mm；细丝接收器滚筒转速1500r/min，圆柱形细丝直径：2000μm，滑台扫描速度25mm/s，运行3h后关闭仪器，将转子上的丝线取下，经60℃蒸汽加湿30min，将丝线转移到1mM的1,4-丁二醇二缩水甘油醚溶液(BDDE)中(称量10.1mg的BDDE加入到50ml的15wt.％氢氧化钠溶液配制而得)浸泡2h，用乙醇溶液、生理盐水多次清洗，将所得导管从丝线上取下，放于真空干燥箱内，设置温度为20℃，干燥24h，包装后25kGy辐射灭菌获得中空胶原蛋白管，该导管的平均内径为1990～2000μm，平均外径为3000～3100μm。
实施例3
称量重组人源III型胶原蛋白海绵0.5g，加入40wt％柠檬酸溶液，配制成20mg/ml的胶原蛋白纺丝液，搅拌至完全溶解，将溶液转移到注射器中，离心脱泡后，将装有纺丝液的注射器放置在静电纺丝机上，调整静电纺丝机参数：纺丝正电压：30.0KV；纺丝负电压：30.0KV；推注速度：1.5ml/h；喷嘴与收集器的距离：15cm；滑台移动距离：50～200mm；细丝接收器滚筒转速500r/min，四棱柱细丝截面边长：500μm，滑台扫描速度20mm/s，运行5h后关闭仪器，将转子上的丝线取下，经90℃蒸汽加湿5min，将丝线转移到100ml 50mM的京尼平溶液(称取京尼平1.125g，加入到温度为37℃的100ml水中溶解后得到)浸泡24h，用乙醇溶液、生理盐水多次清洗，将所得导管从丝线上取下，放于真空干燥箱内，设置温度为30℃，干燥24h，包装后25kGy辐射灭菌获得中空胶原蛋白管，该导管的中空结构为中空四棱柱，横截面边长为490～500μm，外部结构为四棱柱形，平均边长为1500～1600μm。
实施例4
称量琥珀酰化胶原蛋白1.0g，加入40wt％的乙酸溶液，配制成150mg/ml的胶原蛋白纺丝液，搅拌至完全溶解，将溶液转移到注射器中，离心脱泡后，将装有纺丝液的注射器放置在静电纺丝机上，调整静电纺丝机参数：纺丝正电压：15.0KV；纺丝负电压：15.0KV；推注速度：0.1ml/h；喷嘴与收集器的距离：2cm；滑台移动距离：50～230mm；细丝接收器滚筒转速2000r/min，圆柱形细丝直径：100μm，滑台扫描速度25mm/s，运行8h后关闭仪器，将转子上的丝线取下，经60℃蒸汽加湿30min，将丝线转移到50ml 10mM双醛淀粉溶液(称取双醛淀粉0.17g，加入到50ml水中溶解后得到)中，浸泡48h后，用乙醇溶液、生理盐水多次清洗，将所得导管从丝线上取下，放于真空干燥箱内，设置温度为25℃，干燥24h，包装后25kGy辐射灭菌获得中空胶原蛋白管，该导管的平均内径为90～100μm，平均外径为400～500μm。
实施例5
称量酯化胶原蛋白0.5g，加入三氟乙醇，配制成1mg/ml的胶原蛋白纺丝液，搅拌至完全溶解，将溶液转移到注射器中，离心脱泡后，将装有纺丝液的注射器放置在静电纺丝机上，调整静电纺丝机参数：纺丝正电压：5.0KV；纺丝负电压：5.0KV；推注速度：0.30ml/h；喷嘴与收集器的距离：7.5cm；滑台移动距离：50～200mm；细丝接收器滚筒转速100r/min，定制六角不锈钢细丝边长：4000μm，滑台扫描速度25mm/s，运行0.5h后关闭仪器，将转子上的丝线取下，经70℃蒸汽加湿15min，将丝线转移到50ml 20mM戊二醛溶液(称取戊二醛0.10g，加入到50ml水中得到)中浸泡4h后，用乙醇溶液、生理盐水多次清洗，将所得导管从丝线上取下，放于真空干燥箱内，设置温度为25℃，干燥24h，包装后25kGy辐射灭菌获得中空胶原蛋白管，该导管的六棱柱中空结构边长3990～4000μm，外部的平均边长为4400～4500μm。
对比例1
称量提取自猪皮的I型胶原蛋白海绵0.5g，依次加入6ml冰醋酸和54ml纯化水，搅拌至完全溶解，将溶液转移到注射器中，离心脱泡后，将装有纺丝液的注射器放置在静电纺丝机上，调整静电纺丝机参数：纺丝正电压：4.0KV；纺丝负电压：4.0KV；推注速度：0.15ml/h；喷嘴与收集器的距离：5cm；滑台移动距离：50～230mm；细丝接收器滚筒转速1000r/min，圆柱形细丝直径：60μm，滑台扫描速度20mm/s，运行过程中，发现纺丝液粘度低，呈液滴状滴下，无法纺丝。
对比例2
工艺步骤与实施例1相同，仅在纺丝结束后不进行经80℃蒸汽加湿10min的工艺步骤。该导管的平均内径为58～60μm，平均外径为400～420μm。
对比例3
工艺步骤与实施例1相同，在纺丝结束后不进行“经80℃蒸汽加湿10min，将丝线转移到200mM的EDC溶液中(称取0.620g EDC、0.124g NHS加入到20ml纯化水中配制而得)中浸泡12h后，用乙醇溶液、生理盐水多次清洗”的工艺步骤，直接将导管从丝线上取下，干燥和灭菌的工艺步骤采用实施例1的操作方法，制得导管的平均内径为58～60μm，外径的平均内径为420～430μm。
致密度检测
通过FESEM观察实施例1、对比例2制备得到的中空胶原蛋白结构体表面形态，分别如图2-3所示。从图3可以看出，未经过蒸汽加湿的中空胶原蛋白结构体表面结构为多纤维重叠多孔结构，丝线间的空隙大，这是由于纺丝后的丝线较难溶于水，浸泡交联时仅发生在纳米丝线内，丝线间很难彼此交联；而图2表明，经过蒸汽加湿后的中空胶原蛋白结构体表面结构由多纤维重叠多孔结构变为无空隙、无纤维丝状的整体均一形态，表面较为光滑，表明经过蒸汽加湿后处理可使丝线在溶剂体系下复溶，形成高致密层的表面，其空隙率远低于无蒸汽加湿后处理的植入物丝线的空隙率(或间隙率)，有利于提升结构体的拉伸强度和结构的稳定。
拉伸强度性能的检测
将实施例1～5和对比例2-3中获得的样品，放于设置温度为37℃的生理盐水中浸泡5min，取出吸去表面游离的水，采用深圳三思纵横科技股份有限公司的UTM6202电子万能拉力试验机，测定拉伸强度。样品的检测结果如表1所示：
表1样品的拉伸强度检测结果
样品 拉伸强度(MPa)
实施例1 15
实施例2 13
实施例3 17
实施例4 16
实施例5 13
对比例1 样品无法纺丝
对比例2 9
对比例3 6
由表1中的拉伸强度的检测结果可以看出，交联后的导管(即实施例1～5获得的导管)的拉伸强度均大于未经蒸汽加湿处理的导管(即对比例2获得的导管)，这是由于蒸汽加湿会让非交联的纳米纤维在水蒸汽的作用下复溶，有利于后续交联反应，提高了结构体整体的交联程度，相比于将纺丝的纳米纤维直接浸泡交联而言，本发明的结构更为致密，交联程度更高。上述结果说明，本发明中的加湿后交联能够提高导管的机械强度，特别是在将管状物复水浸湿后，加湿后交联的聚合物凝胶拉伸强度高于未经蒸汽加湿处理。
复水后导管形态检测
取适量长度的实施例1和对比例2获得的样品完全浸没于纯化水中，室温浸泡60min，在浸泡5min和60min时观察形态的变化并记录，其结果如图4所示。
通过图4可以看出，实施例1获得的样品在浸泡60min后仍可保持原有的形态，呈现表面光滑的圆柱体(如图2)，但对比例2获得的样品在浸泡时间相同的情况下出现较为明显的溶胀，导管尺寸增加，形貌弯曲变形严重，无法维持结构的稳定，并且表面较为松散。因此，通过本发明制备得到的中空胶原蛋白结构体的表面结构光滑、复水后更稳定。
稳定性测试
分别称取实施例1～5及对比例2～3的样品0.1g，精密称定，记录样品质量(m1)，将称取的样品完全浸没于10％乙酸溶液(v/v)中，浸泡30min，取出烘干至恒重，记录烘干后的质量(m2)，计算样品的损失率＝(m1-m2)/m1×100％，其检测结果如下表2所示：
表2样品损失率的检测结果
样品名称 损失率(％)
实施例1 1.3
实施例2 0.7
实施例3 0.9
实施例4 1.1
实施例5 0.8
对比例2 33.2
对比例3 99.3
由表2可以看出，实施例1～5的样品在乙酸溶液中的溶解量均低于对比例2～3的样品，其中对比例2的样品的损失率较对比例3低，这是由于对比例2的样品经过了浸泡交联反应，经过化学交联的样品不会溶解到乙酸溶液中，故损失率较低；但是对比例2的样品的损失率远高于实施例1，这是由于实施例1中在浸泡交联前，先进行了蒸汽加湿处理，会让管壁结构更加紧密，并且分子间的交联反应发生的几率增加，降低了浸泡过程中溶解的可能性。因此，通过本发明制备得到的中空胶原蛋白结构体交联程度高，能够提高导管的稳定性。
体外细胞毒检测(MTT法)
实验组：实施例1～5制备的中空胶原蛋白管剪裁为12mm长的小段，称取2g，加入10ml培养基(取45ml DMEM(厂家：gibco，批号：2360346)培养液，5ml新生牛血清(厂家：gibco，批号：2396297P)混匀)在37℃的环境下浸提24小时，取浸提液备用。
按约1×104细胞铺在96孔板内置于37℃、5％CO2(湿度大于90％)培养箱中培养24h以形成半汇合单层，吸去上清，加入100ul实验组样品，空白对照组加入100μl培养基，阴性对照组加入100μl不完全培养基(取50ml DMEM培养液与10ml0.9％氯化钠注射液混合)，继续培养24h。取出96孔板，吸去上清，每孔加入50μl MTT(称取0.50g噻唑蓝(厂家：Aladdin，批号：B1505012)加入100ml灭菌的PBS中溶解过滤除菌备用)溶液，避光置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2h后取出，吸去上清，每孔加入150μl DMSO(厂家：Aladdin，批号：H2120207)，避光将96孔板置于脱色摇床中，60r/min，5min后于酶标仪中检测570nm，630nm的吸光度。按照细胞毒性＝(实验组OD570-OD630)/(空白组OD570-OD630)×100％，试验结果如表3所示。
表3样品的细胞毒性检测结果
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
细胞毒性 98％ 89％ 100％ 95％ 87％
由表2可以看出，根据细胞毒性等级判定，相对增殖率80％～99％区间为1级细胞毒性，相对增殖率≥100为0级细胞毒性，表明本发明制备的中空胶原蛋白管为不大于1级，拥有良好的生物相容性。
体外降解检测
使用来自溶组织梭状芽胞杆菌的细菌胶原酶用于中空胶原蛋白结构体的体外降解。分别称量实施例1～5和对比例2-3中获得的样品，记录初始质量，将其浸入pH7.4的0.05M的Tris缓冲液中，缓冲液中胶原酶的浓度为40U/ml，再将上述缓冲液置于37℃恒温震荡箱中。在确定的时间间隔后，取出样品，用蒸馏水冲洗，干燥并称重。体外降解的程度以胶原酶处理前后干燥凝胶重量的百分比计算。样品的检测结果如图5所示。
从图5中可以看出，实施例1的导管在体外降解实验中，降解曲线比较平缓，经体外降解10h后导管残留质量百分比约为81％，体外降解24h后，导管残留质量百分比仍然能保持78％，且没有明显下降趋势。对比例2的导管由于未经过蒸汽加湿过程，交联程度低，表面存在较大的间隙，增加了胶原蛋白与酶液的接触面积，导管残留量下降明显，说明降解较快，体外降解6h后，导管残留质量百分比低于10％。对比例3的导管没有经过蒸汽加湿和交联处理，体外降解仅2h后，导管残留量极低，稳定性最差。
通过实施例1-5的降解曲线可以看出，通过选择不同的交联剂和交联反应条件制备得到的样品降解时间不同，比如实施例3的样品使用了500mM京尼平浸泡交联24h，在体外降解试验中，降解24h时，残留质量百分比仍达85％，其交联程度较高。因此，通过本发明的方法制备的中空胶原结构体拥有更好的稳定性，并且降解的程度可根据临床使用需求，通过选择不同的交联剂和交联工艺来实现。
综上所述，本发明所公开的通过静电纺丝的方法制备具有特定形状的中空胶原蛋白结构体，操作简单，结构易于控制，制得的中空胶原蛋白结构体强度高，有韧性，稳定性以及生物相容性好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。

Claims (28)

1.一种中空胶原蛋白结构体，包括中空结构和外部结构，其特征在于，所述中空胶原蛋白结构体由胶原蛋白通过静电纺丝、后处理制备得到；所述后处理包括加湿处理；
其中，静电纺丝时胶原纺丝液中胶原蛋白的浓度为10-150mg/ml；
所述加湿处理为水蒸汽加湿，所述加湿处理的温度为25-125℃，时间为5-50min；
所述后处理还包括在加湿处理后进行交联处理。
2.如权利要求1所述的中空胶原蛋白结构体，其特征在于，所述加湿处理的温度为60-90℃；和/或，所述加湿处理时间为10-30min。
3.如权利要求1所述的中空胶原蛋白结构体，其特征在于，所述交联处理为通过交联剂处理。
4.如权利要求3所述的中空胶原蛋白结构体，其特征在于，所述交联剂选自：京尼平、醛类交联剂、碳二亚胺-羟基琥珀酰亚胺、双醛淀粉、壳聚糖、谷氨酰胺转胺酶或环氧化物的一种或多种。
5.如权利要求4所述的中空胶原蛋白结构体，其特征在于，所述醛类交联剂为甲醛或戊二醛，所述碳二亚胺-羟基琥珀酰亚胺为EDC-NHS，所述环氧化物选自：环氧乙烷、环氧丙烷、1,2-环氧丁烷、1,4-环氧丁烷、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,2,3,4,二环氧丁烷、甘油三(1,2-环氧)丙醚。
6.如权利要求1所述的中空胶原蛋白结构体，其特征在于，所述中空结构全部或部分为圆柱形结构、圆锥形结构、多棱柱形结构或多角锥形结构；和/或，
所述外部结构全部或部分为圆柱形结构、环纹结构、圆锥形结构、多棱柱形结构、多角锥形结构或球形结构。
7.如权利要求1所述的中空胶原蛋白结构体，其特征在于，所述中空结构为圆柱形结构，所述圆柱形的直径为40-4000μm。
8.如权利要求1所述的中空胶原蛋白结构体，其特征在于，所述外部结构为圆柱形结构，所述圆柱形的直径为50-8000μm。
9.如权利要求1-8任一项所述的中空胶原蛋白结构体，其特征在于，所述胶原蛋白为I型或III型胶原蛋白；
所述胶原蛋白为天然胶原蛋白、重组活性胶原蛋白或胶原蛋白衍生物；
所述胶原蛋白衍生物为酰基化胶原蛋白或酯化胶原蛋白。
10.如权利要求9所述的中空胶原蛋白结构体，其特征在于，所述酰基化胶原蛋白为琥珀酰化胶原蛋白、邻苯二甲酰化胶原蛋白或马来酰化胶原蛋白。
11.一种如权利要求1-10任一项所述的中空胶原蛋白结构体的制备方法，其包括胶原纺丝液的制备、静电纺丝以及后处理的步骤，所述后处理包括加湿处理；
其中，所述胶原纺丝液中胶原蛋白的浓度为10-150mg/ml；所述加湿处理为水蒸汽加湿，所述加湿处理的温度为25-125℃，时间为5-50min；
所述后处理还包括在加湿处理后进行交联处理。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述加湿处理的温度为60-90℃；和/或，
所述加湿处理时间为10-30min。
13.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述交联处理为待交联材料浸泡于交联剂溶液中。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂选自：京尼平、醛类交联剂、碳二亚胺-羟基琥珀酰亚胺、双醛淀粉、壳聚糖、谷氨酰胺转胺酶或环氧化物的一种或多种。
15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述醛类交联剂为甲醛或戊二醛，所述碳二亚胺-羟基琥珀酰亚胺为EDC-NHS，所述环氧化物选自：环氧乙烷、环氧丙烷、1,2-环氧丁烷、1,4-环氧丁烷、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,2,3,4,二环氧丁烷、甘油三(1,2-环氧)丙醚。
16.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂的用量为胶原蛋白原料质量的0.01-2.5倍；和/或，所述浸泡时间为2-48h。
17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂的用量为胶原蛋白原料质量的0.2-2.25倍。
18.如权利要求11-17任一项所述的制备方法，其特征在于，所述胶原纺丝液中胶原蛋白的浓度为20-100mg/ml。
19.如权利要求11-17任一项所述的制备方法，其特征在于，所述胶原纺丝液中溶剂选自：六氟异丙醇、三氟乙醇、有机酸水溶液、离子液体中的一种或多种。
20.如权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述有机酸为乙酸或柠檬酸。
21.如权利要求19所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为20-60wt％的有机酸水溶液。
22.如权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为20-60wt％的乙酸溶液。
23.如权利要求11-17任一项所述的制备方法，其特征在于，所述后处理还包括：洗涤、脱模、干燥、灭菌中的一个或多个步骤。
24.一种植入物或细胞培养材料，其包含权利要求1-10任一项所述的中空胶原蛋白结构体或经权利要求11-23任一项所述制备方法制备得到的中空胶原蛋白结构体。
25.权利要求1-10任一项所述的中空胶原蛋白结构体或经权利要求11-23任一项所述制备方法制备得到的中空胶原蛋白结构体在制备治疗疾病的产品、细胞培养材料或美容产品的应用。
26.如权利要求25所述的应用，其特征在于，所述美容产品选自鼻腔植入物、眼部植入物、隐形眼镜、皮下植入物。
27.如权利要求25所述的应用，其特征在于，所述治疗疾病的产品选自眼部植入物、口腔防护物、假牙垫料、组织替代物、输尿管修补物、筋和韧带代用物、绷带、缝线。
28.如权利要求27所述的应用，其特征在于，所述组织替代物为心脏植入物或血管植入物。
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