CN110507860A - 一种复合工艺制备原位组织工程血管的方法 - Google Patents

一种复合工艺制备原位组织工程血管的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种复合工艺制备原位组织工程血管的方法。结合快速成型、静电纺丝与湿法纺丝工艺制备一种与天然血管结构相似、用于原位组织工程的三层复合血管支架；其内层利用3D打印与静电纺丝技术制备的具有轴向凹槽的管状支架；中间层采用湿法纺丝制备的具有周向排列纤维管状支架；外层是由静电纺丝制备的可包覆内层与中间层的无序纤维组成的管状支架。本发明制备的血管支架的通过肝素化，还加载了血管内皮细胞生长因子，可在宿主体内募集细胞、减少体外培养的感染机会，实现原位组织工程血管的制备，在组织工程血管领域具有广阔的前景。

Description

一种复合工艺制备原位组织工程血管的方法
技术领域
本发明涉及生物医学组织工程技术领域，特别涉及一种复合工艺制备原位组织工程血管的方法。
背景技术
随着人口老龄化的进程加快，许多与人体血管有关的疾病，比如动脉粥样硬化、冠心病等处于高发趋势。当人体自身血管由于疾病、创伤等因素而不能正常对人体供血时，就应该对受损血管采用修补、血管内支架或自体静脉移植术等外科手术进行治疗。通常，隐静脉被认为是小直径血管重建中良好的自体血管替代物，但由于部分患者自身疾病或其他原因无法使用自体静脉，所以用组织工程血管作为替代品用于组织血管修复成为研究的热点。
目前利用高分子材料制备人工血管已取得很大的进步，如聚酯涤纶、膨体聚四氟乙烯等材料制备的血管支架已商品化；这些材料支架在高血流、大直径（大于5～6mm）血管替代物应用中非常广泛。然而这些材料合成的血管支架并不能满足小直径血管支架的要求。因此将自体细胞引入材料，如用内皮细胞覆盖内腔面，从而发挥生物学作用是有希望的方法之一。组织工程的应用分为两种情况，一种是将细胞预接种在支架上，经过培养成熟之后植入体内，称为离体组织工程；另一种是直接植入支架从而诱导自身细胞及组织生长，促进新生组织成形，也称为原位组织工程。
正常血管是由三层同心膜构成的复杂结构。内膜位于血管壁腔面，由单层内皮细胞覆盖；大多数平滑肌细胞位于血管的中膜，其弹性单元的收缩和舒张使动脉收缩或扩张，以此调节血流；血管的外层即外膜，由成纤维细胞构成的疏松纤维网构成。现有的人工血管大多为静电纺丝制成的单层结构，而单层血管易泄漏、静电纺丝纤维的无序排列以及血管支架从旋转收集棒上的拆卸等都是目前存在的问题。专利CN106668944A公开了一种三层复合小口径血管支架及其制备方法；专利CN109259889A公开了一种复合工艺制备仿生血管支架的方法；CN103599568A公开了一种双负载多层小直径血管支架材料的制备方法；专利CN102764171B公开了一种静电纺丝复合血管支架及其制备方法。理想的人工血管移植物应能抗血栓形成、炎症和新生内膜增生，这样的移植血管能维持体内长期通畅。故通过对其他合成血管移植物的表面处理以加强内皮细胞的贴附。当生物材料表面具有特定的平行凹槽结构时，可增强细胞在材料表面的黏附。因此组织工程血管的材料选择与制备工艺还有待发展与改进。
基于上述现有技术，考虑到天然血管的结构功能、细胞生长条件以及生物材料特性，制备一种三层结构的原位组织工程血管支架，在组织工程血管领域具有发展前景。
发明内容
为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，结合3D打印技术提出一种复合工艺制备原位组织工程血管的方法，采用多种工艺复合的方法制备血管支架，使支架内层图案化，不仅可以弥补采用单种工艺所带来的局限，而且能够更好地模拟天然血管的结构，血管支架能够在体内募集细胞、引导细胞排列生长，实现原位组织工程血管支架的制备，使制备的人工血管更接近天然血管的生物性能与机械性能，在血管组织工程领域具有发展前景。
为达到上述发明创造目的，本发明采用下述技术方案：
一种复合工艺制备原位组织工程血管的方法，包括以下步骤：
a. 3D打印水溶性聚合物材料A制备血管支架收集棒：其结构为圆柱形空心结构，内径2.5～4mm，外径3～4.5mm，且圆柱外表面设计多条等宽度脊，其收集棒采用水溶性聚合物材料A通过FDM打印成形。
b. 采用静电纺丝工艺制备组织工程血管内层：聚L-乳酸（PLLA）与聚己内酯（PCL）分别以19%和5%的浓度通过超声处理溶解在六氟异丙醇（HFIP）中直至完全溶解，然后以1:1比例均匀混合后添加到注射器中。使用注射泵以0.8～1.2ml/h的流速输送聚合物溶液，将a步骤中打印的收集棒安装在旋转轴上作为静电纺丝收集平台，其旋转轴转速设为：800～1000r/min；在注射器针头和收集棒两端施加电压，将电纺的纳米级纤维丝缠绕接收于收集棒上，作为血管支架的内层。
c. 采用湿法纺丝工艺制备纤维周向排列的中间层：将配制好的PCL/PLLA溶液装入注射器中，所述注射针浸入乙醇的凝固浴中，用注射器泵驱动溶液的滴流以1～2ml/h的流速挤出到凝固浴中。将纤维以800～1000r/min收集到旋转的不锈钢杆上6min。然后用乙醇洗涤纤维包裹的不锈钢杆3次，然后在真空干燥器中干燥两天以除去残留溶剂。再将湿法纺丝的纤维在步骤b制备完成的血管支架的内层外表面上缠绕呈周向排列结构，形成具有纤维周向排列结构的血管支架中间层。
d. 电纺血管支架外层：将聚合物材料B以10～12% w/v完全溶解到溶剂A中，装入10ml注射器，再在步骤c制备完成的血管支架中间层外部电纺一层聚合物材料B，其电纺条件为：电压为10～12kv，注射速度为1～3mL/h，收集棒的转速控制在800-1000r/min，针头到收集棒之间的距离为10～15cm，电纺时间为2～3h，最终获得完全包覆内层与中间层的聚合物材料B层。
e. 去除血管支架收集棒，对血管支架进行真空干燥：将上述制备完成的结构拆卸下来放入培养皿中，在培养皿中加入去离子水浸没血管支架，30min后内层的血管支架收集棒由于其材料的水溶特性逐渐***易去除，收集棒的空心结构可防止聚合物材料A在遇水膨胀后影响血管支架的尺寸，在对血管支架不产生损坏的情况下去除收集棒，将血管支架收集棒完全去除后，将支架放入真空干燥箱2天，去除残余水分和溶剂。最终得到内层具有轴向凹槽，中间层周向排列的组织工程血管支架。
f. 血管支架肝素化：以1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳化二亚胺氢氯化物（EDC）和N-羟基磺基琥珀酰亚胺（SULFO NHS）为交联剂，以二氨基聚乙二醇（DI-NH2-PEG）为间隔物，对血管支架进行肝素共价连接。通过在氢氧化钠（NaOH，0.01N）中短暂水解10分钟,提高表面碳氧基的密度。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中彻底冲洗支架，然后用去离子水冲洗。然后使支架在室温下含有20mg/ml的EDC、10mg/mL的磺基-NHS、和20mg/ml 的di-NH2-PEG的2-（N-***酮）乙磺酸（MES）缓冲液（pH5.5）中反应3小时，在PBS中冲洗支架，然后在含有20mg/ml的EDC、10mg/mL的磺基-NHS、和20mg/ml的未分级肝素钠盐的MES缓冲液（pH5.5）中反应3小时。在肝素修饰之后，在PBS中使用10mg/ml甘氨酸彻底洗涤支架30分钟，淬灭剩余的反应位点。
g. 血管内皮细胞生长因子（VEGF）的固定：将VEGF固定到血管支架上，在含0、1、2和44μg/ml的重组人VEGF-165的PBS溶液中在4℃条件下在振荡器上放置16小时培养支架。在VEGF固定后，在PBS中重复冲洗支架30分钟。最终获得接枝肝素与血管内皮细胞生长因子的原位组织工程血管支架。
本发明制备的原位组织工程血管支架包括内层、中间层和外层，所述的内层由3D打印支架收集棒在静电纺丝膜上形成的轴向凹槽图案；所述的中间层纤维呈周向排列；所述的外层纤维呈无序排列。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的优点：
1. 本发明制备的血管支架采用3D打印水溶性聚合物材料收集棒进行收丝，在支架去除步骤简便可行，不会对血管支架内层造成损害，并且使血管内层图案化，有利于内皮细胞的黏附与生长，轴向凹槽与血液流动方向一致，可减少血液流动的阻力。
2. 本发明制备的血管支架模仿天然血管中间层平滑肌细胞周向排列的结构，采用湿法纺丝技术制备出具有周向排列纤维的血管支架中间层，引导平滑肌细胞周向生长。
3. 本发明制备的血管支架最外层采用静电纺丝将中间层和内层包裹，可防止血管破裂，保证血管支架足够的机械性能。
4. 本发明制备的血管支架模仿天然血管的结构与功能，结合3D打印、静电纺丝与湿法纺丝技术制备的一种三层血管支架结构。
5. 本发明制备的血管支架内层与中间层材料为通过在PLLA中添加低分子量的PCL来增加肝素分子结合位点。
6. 本发明制备的血管支架的采用肝素化涂层，增加了细胞浸润到电纺移植物中，从而增加了移植物壁内胶原和弹性蛋白的产生。
7. 本发明制备的血管支架加载了血管内皮细胞生长因子（VEGF），可在植入体内募集细胞、减少体外培养的感染机会，实现原位组织工程血管支架的制备。
附图说明
图1是本发明在制备血管支架收集棒的模型示意图。
图2是本发明在收集电纺丝时收集平台装备示意图。
图3是本发明在制备血管支架中间层湿法纺丝的装备示意图。
图4是本发明制备血管支架的三层结构示意图。
图5是本发明制备血管支架的工艺流程图。
在图1至图5中：
1—收集棒， 2—旋转轴， 3—电机，
4—不锈钢棒， 5—丝纤维， 6—凝固浴，
7—外层， 8—中间层， 9—内层。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对上述方案做出进一步说明，本发明得优选实施例详述如下：
实施例1：
如图5所示，一种复合工艺制备原位组织工程血管的方法，包括以下步骤：
a. 3D打印水溶性材料制备血管支架收集棒：其结构为圆柱形空心结构，如图1所示：内径3.5mm，外径4.5mm，且圆柱外表面设计8条脊，凸起结构的尺寸为长50mm，宽0.4mm，高0.2mm，其收集棒采用水溶性聚合物材料聚乙烯醇通过FDM打印成形。打印机的喷嘴温度160℃、床温60℃、喷嘴移动速度20mm/s，并将分层厚度设置为0.15mm。
b. 采用静电纺丝工艺制备组织工程血管内层，如图2所示：为增加可用于生物分子连接的端基的数量，将聚L-乳酸（PLLA）与聚己内酯（PCL）分别以19%和5%的浓度通过超声处理溶解在1、1、1、3、3-六氟-2-丙醇（HFIP）中直至完全溶解，然后以1:1比例均匀混合后添加到注射器中。使用注射泵以1.2ml/h的流速输送聚合物溶液，将a步骤中打印的收集棒1安装在旋转轴2上作为静电纺丝收集平台，其电机3的旋转轴2转速设为：1000r/min；在注射器针头和收集棒1两端施加电压，将电纺的纳米级纤维丝缠绕接收于收集棒1上，作为血管支架的内层。
c. 采用湿法纺丝工艺制备具有周向取向纤维的血管中间层，如图3所示：将配好的PCL/PLLA溶液装入注射器中，所述注射针浸入乙醇的凝固浴6中，用注射器泵驱动溶液的滴流以2ml/h的流速挤出到凝固浴6中。将丝纤维5以1000r/min收集到旋转的不锈钢杆4上6min。然后用乙醇洗涤纤维包裹的不锈钢杆4三次，然后在真空干燥器中干燥两天以除去残留溶剂。再将湿法纺丝的纤维5在人工血管支架内层膜的外表面上缠绕呈周向排列结构，形成具有纤维周向排列结构的血管支架中间层。
d. 电纺血管支架外层：将聚（L-乳酸-ε-己内酯）PLCL材料以10% w/v完全溶解到六氟异丙醇HFIP中，装入10ml注射器，再在步骤c制备完成的中间层外部电纺一层聚（L-乳酸-ε-己内酯），其电纺条件为：电压为10kv，注射速度为2mL/h, 收集棒的转速控制在800r/min，针头到收集棒之间的距离为10～15cm，电纺时间为4h，最终获得完全包覆内层与中间层的聚合物材料B层。
e. 水溶去除聚乙烯醇PVA收集棒，然后对血管支架进行真空干燥：在超净工作台上，将上述制备完成的结构拆卸下来放入培养皿中，在培养皿中加入去离子水浸没血管支架，30min后内层的血管支架收集棒由于其材料的水溶特性逐渐***易去除，收集棒的空心特性可防止聚合物材料A在遇水膨胀后影响血管支架的尺寸，在对血管支架不产生损坏的情况下去除收集棒将血管支架收集棒血管支架中完全去除后，将支架放入真空干燥箱2天，去除残余水分和溶剂。得到内层具有轴向凹槽，中间层周向排列的血管支架。
f. 血管支架肝素化：以1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳化二亚胺氢氯化物（EDC）和N-羟基磺基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）为交联剂，以二氨基聚乙二醇（di-NH2-PEG）为间隔物，对血管支架进行肝素共价连接。通过在氢氧化钠(NaOH,0.01N)中短暂水解10分钟,提高表面碳氧基的密度。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中彻底冲洗支架，然后用去离子水冲洗。然后使支架在室温下含有20mg/ml的EDC、10mg/mL的磺基-NHS、和20mg/ml 的di-NH2-PEG的2-（N-***酮）乙磺酸（MES）缓冲液（pH5.5）中反应3小时，在PBS中冲洗支架，然后在含有20mg/ml的EDC、10mg/mL的磺基-NHS、和20mg/ml的未分级肝素钠盐的MES缓冲液（pH5.5）中反应3小时。在肝素修饰之后，在PBS中使用10mg/ml甘氨酸彻底洗涤支架30分钟，淬灭剩余的反应位点。
g. 血管内皮细胞生长因子（VEGF）的固定：将VEGF固定到血管支架上，在含0、1、2和4μg/ml的重组人VEGF-165的PBS溶液中在4℃条件下在振荡器上放置16小时培养支架。在VEGF固定后，在PBS中重复冲洗支架30分钟。最终获得接枝肝素与血管内皮细胞生长因子的原位组织工程血管支架（PLLA/PCL内层9，PLLA/PCL周向排列的中间层8，PLCL外层7），如图4所示。
实施例2：
本实施例与实施例1基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种复合工艺制备原位组织工程血管的方法，通过血管支架收集棒外部制备不同宽度与数量的脊导致支架内层图案化，包括如下步骤：
a. 3D打印水溶性材料制备血管支架收集棒：设计血管支架收集棒：其结构为圆柱形空心结构，内径4mm，外径5mm，且圆柱外表面设计6条脊，凸起结构的尺寸为长50mm，宽0.5mm，高0.3mm，其收集棒采用水溶性聚合物材料聚乙烯醇通过FDM打印成形。打印机的喷嘴温度160℃、床温60℃、喷嘴移动速度20mm/s，并将分层厚度设置为0.15mm；
其余步骤于实施例1相同。
实施例2：
本实施例与实施例1基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种复合工艺制备原位组织工程血管的方法，制备多种材料用于电纺外层的复合血管，包括如下步骤：
a. 本步骤与实施例1相同；
b. 本步骤与实施例1相同；
c. 本步骤与实施例1相同；
d. 电纺血管支架外层：将聚己内酯PCL材料以10% w/v完全溶解二氯甲烷和DMF中，装入10ml注射器，再在步骤c制备完成的中间层外部电纺一层聚己内酯，其电纺条件为：电压为10kv，注射速度为2mL/h, 收集棒的转速控制在800r/min，针头到收集棒之间的距离为10～15cm，电纺时间为4h，最终获得完全包覆内层与中间层的PCL层；
e. 本步骤与实施例1相同；
f. 本步骤与实施例1相同；
g. 本步骤与实施例1相同。

Claims (4)

1.一种复合工艺制备原位组织工程血管的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a. 3D打印水溶性聚合物材料A制备血管支架收集棒：其结构为圆柱形空心结构，内径2.5～4mm，外径3～4.5mm，且圆柱外表面设计多条等宽度脊，所述收集棒采用水溶性聚合物材料A通过FDM打印成形；
b. 采用静电纺丝工艺制备组织工程血管内层：聚L-乳酸与聚己内酯分别以19%和5%的浓度通过超声处理溶解在六氟异丙醇中直至完全溶解，然后以1:1比例均匀混合后添加到注射器中；使用注射泵以0.8～1.2ml/h的流速输送聚合物溶液，将a步骤中打印的收集棒安装在旋转轴上作为静电纺丝收集平台，其旋转轴转速设为：800～1000r/min；在注射器针头和收集棒两端施加电压，将电纺的纳米级纤维丝缠绕接收于收集棒上，作为血管支架的内层；
c. 采用湿法纺丝工艺制备具有周向取向纤维的中间层：将配制好的聚L-乳酸与聚己内酯混合溶液装入注射器中，所述注射针浸入乙醇的凝固浴中，用注射器泵驱动溶液的滴流以1～2ml/h的流速挤出到凝固浴中；将纤维以800～1000r/min收集到旋转的不锈钢杆上6min；然后用乙醇洗涤纤维包裹的不锈钢杆3次，然后在真空干燥器中干燥两天以除去残留溶剂；再将湿法纺丝的纤维在步骤b制备完成的血管支架的内层外表面上缠绕呈周向排列结构，形成具有纤维周向排列结构的血管支架中间层；
d. 电纺血管支架外层：将聚合物材料B以10～12%w/v完全溶解到溶剂A中，装入10ml注射器，再在步骤c制备完成的血管支架中间层外部电纺一层聚合物材料B，其电纺条件为：电压为10～12kv，注射速度为1～3mL/h，收集棒的转速控制在800-1000r/min，针头到收集棒之间的距离为10～15cm，电纺时间为3～5h，最终获得完全包覆内层与中间层的聚合物材料B层；
e. 去除血管支架收集棒，对血管支架进行真空干燥：将上述制备完成的结构拆卸下来放入培养皿中，在培养皿中加入去离子水浸没血管支架，30min后内层的血管支架收集棒由于其材料的水溶特性逐渐***易去除，收集棒的空心结构能够防止聚合物材料A在遇水膨胀后影响血管支架的尺寸，在对血管支架不产生损坏的情况下去除收集棒，将血管支架收集棒完全去除后，将支架放入真空干燥箱2天，去除残余水分和溶剂；最终得到内层具有轴向凹槽，中间层周向排列的组织工程血管支架；
f. 血管支架肝素化：以1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳化二亚胺氢氯化物和N-羟基磺基琥珀酰亚胺为交联剂，以二氨基聚乙二醇为间隔物，对血管支架进行肝素共价连接；通过在氢氧化钠中短暂水解10分钟，提高表面碳氧基的密度；在磷酸盐缓冲盐水中彻底冲洗支架，然后用去离子水冲洗；然后使支架在室温下含有20mg/ml的EDC、10mg/mL的磺基-NHS、和20mg/ml的di-NH2-PEG的2-（N-***酮）乙磺酸缓冲液，pH5.5，中反应3小时，在PBS中冲洗支架，然后在含有20mg/ml的EDC、10mg/mL的磺基-NHS、和20mg/ml的未分级肝素钠盐的MES缓冲液，pH5.5，中反应3小时；在肝素修饰之后，在PBS中使用10mg/ml甘氨酸彻底洗涤支架30分钟，淬灭剩余的反应位点；
g. 血管内皮细胞生长因子的固定：将VEGF固定到血管支架上，在含0、1、2和4μg/ml的重组人VEGF-165的PBS溶液中在4℃条件下在振荡器上放置16小时培养支架；在VEGF固定后，在PBS中重复冲洗支架30分钟；最终获得接枝肝素与血管内皮细胞生长因子的原位组织工程血管支架。
2.根据权利要求1所述复合工艺制备原位组织工程血管的方法，其特征在于，所述步骤a中，制作血管支架收集棒的聚合物材料A为可溶于水的聚乙烯醇PVA。
3.根据权利要求1所述复合工艺制备原位组织工程血管的方法，其特征在于，所述步骤a中，血管支架收集棒的外部设计为多条等宽度脊，脊的数量为4～8条，每条脊的长度与收集棒等长，宽0.3～0.9mm，高0.2～0.5mm，通过FDM技术成形，收集棒外部形状导致静电纺丝的内层图案化，轴向凹槽结构引导内皮细胞黏附生长、减小血液流动阻力的作用。
4.根据权利要求1所述复合工艺制备原位组织工程血管的方法，其特征在于，所述步骤d中，聚合物材料B为聚（L-乳酸-ε-己内酯）PLCL、热塑性聚氨酯TPU、聚己内酯PCL高分子聚合物中的一种；溶剂A为二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺DMF、四氢呋喃THF、六氟异丙醇HFIP中的一种或两种。
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