CN115322180A - 一种香豆素吡唑酮类荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种香豆素吡唑酮类荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针的化学式为C21H16N4O4，其结构式如下：
该荧光探针采用香豆素基团作为荧光团，采用酰腙结构作为识别受体和猝灭部分，对Cu2+的检测具有较高的选择性和灵敏度，与Cu2+反应时间响应快，具有较大的pH适用范围且可反复使用多次。
Description
技术领域
本发明涉及荧光探针领域，特别涉及一种香豆素吡唑酮类荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
Cu2+是人体必需微量元素之一。但是，过量的Cu2+会对人体带来严重危害，当前由于工业发展，大量含Cu2+废水的排放，造成环境Cu2+污染，给人类的生活生存带来极大的影响。因此，Cu2+的检测是当前研究热点之一。当前，Cu2+的检测手段诸如原子吸收/发射光谱、电感耦合等离子体质谱等存在仪器维护费用高、操作复杂等，导致Cu2+快速检测受限。
香豆素类荧光探针是金属离子荧光探针的一个重要发展方向，该类型探针采用香豆素基团作为荧光团，采用酰腙结构作为识别受体和猝灭部分，具有较好的荧光效率，便于合成，同时该类型的探针具有较高的选择性和灵敏度，因此合成一种能特异性识别Cu2+的香豆素类探针具有重要的使用价值。
发明内容
针对背景技术中的问题，本发明目的在于提供一种对Cu2+能在短时间内反应、反应现象明显、能在高干扰的情况下特异性响应、高灵敏度的香豆素吡唑酮类荧光探针(简称为MPMC荧光探针)及其制备方法与应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种香豆素吡唑酮类荧光探针，其化学式为C21H16N4O4，其结构式如下：
本发明还提供了上述荧光探针的制备方法，包括：将依达拉奉醛基衍生物和香豆素-3-甲酰肼溶解在乙醇中，滴加无水乙酸，加热回流搅拌4h，过滤，得到黄色结晶，用无水乙醇洗涤，用乙醇溶液加热回流得到纯的香豆素吡唑酮类荧光探针。
本发明又提供了上述荧光探针在Cu2+检测中的应用。
优选地，所述应用包括所述香豆素吡唑酮类荧光探针在溶液中特异性识别Cu2+，或者制成试纸后特异性识别Cu2+。
优选地，所述香豆素吡唑酮类荧光探针在可见光和紫外灯下均能够特异性识别Cu2+。
优选地，所述香豆素吡唑酮类荧光探针与Cu2+的配位比为1:1。
优选地，所述香豆素吡唑酮类荧光探针对Cu2+的检测下限为15.16nM。
优选地，所述香豆素吡唑酮类荧光探针对Cu2+检测的pH适用范围4-11。
本发明具有如下优点：
1.该探针采用香豆素基团作为荧光团，采用酰腙结构作为识别受体和猝灭部分对Cu2+的检测具有较高的选择性和灵敏度。
2.该探针对Cu2+在较高的干扰背景下能特异性识别，具有高选择性。
3.在可见光和紫外灯下该探针与Cu2+颜色变化明显，可可视化应用。
4.该探针与Cu2+的配位比为1:1。
5.该探针对Cu2+的检测下限为15.16nM，灵敏度高。
6.该探针与Cu2+反应可逆，可反复使用多次。
7.该探针具有较大的pH适用范围4-11。
8.该探针与Cu2+反应时间响应快。
附图说明
图1为MPMC荧光探针的1HNMR图。
图2为MPMC荧光探针的13CNMR图。
图3为MPMC探针对金属离子敏感性图(a)和离子干扰图(b)。
图4为MPMC探针的比色实验。
图5为MPMC探针的Job’s plot图。
图6为MPMC探针加入不同浓度Cu2+对荧光光谱的影响。
图7为MPMC探针的可逆性图。
图8为不同pH值的环境下MPMC探针对Cu2+的影响。
图9为MPMC探针的响应时间图。
图10为MPMC探针的红外光谱图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例
1.合成依达拉奉的具体步骤：
取乙酰乙酸乙酯(13.0g，0.1mol)和60％乙醇5mL混合，搅拌下，于45℃滴加苯肼(10.8g，0.1mol)和无水乙醇3mL组成的溶液，大约30分钟滴完，滴毕，保温20分钟，冷却至室温，加入浓盐酸1mL，保温45℃反应2小时，滴加10％氢氧化钠调pH 7.0，加水20mL室温搅拌1小时，过滤，得淡黄色结晶，晶体用冷无水乙醇洗涤，用乙酸乙酯/乙醇溶液加热回流得到纯的依达拉奉白色结晶(化合物1，13.2g，yield：76％)，干燥，称重。
2.合成依达拉奉醛基衍生物的具体步骤：
取依达拉奉标准品(8.70g，0.05mol)并加入1mL DMF溶解，冰浴搅拌，缓慢加入10.1mL三氯氧磷后在100℃的条件下加热回流1.5h，待冷却后加入200mL冰水，振抖后静置，过滤后得到依达拉奉醛基衍生物粗品，用无水乙醇洗涤，78～80℃用乙醇溶液加热回流得到纯的依达拉奉醛基衍生物(化合物2，5.98g，yield：59.2％)，干燥，称重。
3.合成香豆素-3-羧酸乙酯的具体步骤：
取水杨醛(4.90g，0.04mol)、丙二酸二乙酯(7.25g，0.045mol)和20mL无水乙醇混合，再使用胶头滴管滴入0.5mL六氢吡啶和两滴乙酸，78～80℃加热回流搅拌2h，放冷析出结晶，过滤并用乙醇洗涤数次，干燥获得白色结晶香豆素-3-羧酸乙酯粗品，78～80℃用乙醇溶液加热回流得到纯的香豆素-3-羧酸乙酯结晶(化合物3，5.54g，yield：73％)，干燥，称重。
4.合成香豆素-3-甲酰肼的具体步骤：
取香豆素-3-羧酸乙酯(2.00g，0.01mol)溶于50mL无水乙醇中并加入5滴水合肼(0.01mol)，78～80℃加热回流搅拌10h，放冷析出结晶，过滤，得到黄色晶体粉末，用无水乙醇进行洗涤，78～80℃用乙醇溶液加热回流得到纯的香豆素-3-甲酰肼亮黄色结晶(化合物4，1.39g，yield：68.1％)，干燥，称重。
5.合成MPMC荧光探针的具体步骤：
取依达拉奉醛基衍生物(1.00g，4.95mmol)和香豆素-3-甲酰肼(1.00g，4.95mmol)溶解在40mL乙醇中，滴加两滴无水乙酸，78～80℃加热回流搅拌4h，过滤，得到黄色结晶，用无水乙醇洗涤，78～80℃用乙醇溶液加热回流得到纯的MPMC荧光探针(化合物5，0.902g，yield：46.96％)，MPMC荧光探针的1H NMR如图1所示。MPMC荧光探针的13CNMR如图2所示。
测试例
1.MPMC探针对Cu2+的响应检测：
分别测定Cu2+、Pb2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ni2+、Cd2+、Mn2+、Ca2+、Ba2+、Na+、K+、Ag+与MPMC探针在乙醇/水溶液(V/V＝1:1)中的荧光发射光谱。由图3a和图3b可见，当加入Cu2+后，在548nm处MPMC探针发生了较为完全的荧光猝灭。MPMC探针溶液和MPMC探针与其他金属离子溶液的荧光强度没有明确改变，说明MPMC对Cu2+具有响应。
2.MPMC探针对Cu2+识别的选择性检测：
测定K+，Na+，Mg2+，Fe3+，Ca2+，Mn2+，Pb2+，Cd2+，Ni2+，Ag+，Ba2+，Co2+，Fe2+与MPMC探针(10:1)在乙醇/水(V/V＝1：1)中的荧光发射光谱，然后按上述方法再加入Cu2+溶液配制成干扰离子/Cu2+/探针(1：1：10)的乙醇/水(V/V＝1：1)溶液，测试荧光发射发射光谱。结果表明，在干扰离子存在时Cu2+仍然对MPMC探针发生猝灭现象，说明MPMC探针对Cu2+具有很好的选择性、专一性和抗干扰性。
3.MPMC探针与Cu2+在可见光与紫外光下的比色实验：
在可见光下通过目视比色法可见，由图4a可知，可见光下，MPMC探针溶液与其他金属离子的乙醇/水(1:1)溶液几乎无色，而Cu2+却能使MPMC探针溶液变成亮黄色。此外由图4b可知，在365nm的紫外灯下，MPMC探针溶液无色，而Cu2+离子使MPMC探针溶液产生黄色荧光，说明MPMC探针对Cu2+能特异性的进行识别，说明MPMC探针具有可视化检测Cu2+的潜力。
4.MPMC探针与Cu2+的配位比的测定：
配制总浓度为20μM的MPMC探针与Cu2+溶液，配制浓度比为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的MPMC-Cu2+溶液，绘制出Job’s plot曲线，如图5所示，当Cu2+与MPMC探针比例在5：5的时候出现了拐点，比例从1：9到5：5荧光强度变化显著，从5：5到9:1的区间荧光强度几乎不变，可以确定MPMC探针和金属离子的配位比为1:1。
5.MPMC探针荧光光谱与不同浓度Cu2+的荧光实验：
由MPMC探针与Cu2+的配位比测试可以看出Cu2+浓度越大对MPMC探针的荧光猝灭效果越好，表明了荧光强度的变化与Cu2+浓度有关。由图6a-c所示，随着Cu2+的加入，荧光强度越来越弱直至完全猝灭，前后的荧光强度缩小了48倍。Cu2+浓度在0.1-1.5μM范围内荧光强度呈线性变化，回归方程为Y＝-708.21x+1388.2，相关系数为R2＝0.9612，依据最低检测限的公式LOD＝3σ/k测试计算得Cu2+的检测限度为15.16nM。
6.MPMC探针对Cu2+的竞争性实验：
在MPMC-Cu2+中加入相同浓度EDTA(1×10-3mol/L)，由图7所示，加入EDTA的溶液，荧光强度恢复到了接近MPMC探针荧光强度的水平，这种现象说明了EDTA对Cu2+的络合能力强于MPMC探针，EDTA夺取了与MPMC探针结合的Cu2+导致了荧光恢复，MPMC探针的荧光识别可逆性较好，继续加入Cu2+后，仍然发生了荧光猝灭现象，加入EDTA后荧光强度继续恢复，说明该MPMC探针可以反复多次使用。
7.MPMC探针对Cu2+的pH荧光实验：
不同pH值的环境下MPMC探针对Cu2+的影响：在pH从1.0到14.0的EtOH-PBS测试探针对Cu2+的识别能力。如图8所示，MPMC探针的荧光强度在pH值为4.0-11.0的范围内几乎保持不变，在不同pH的MPMC探针溶液中加入Cu2+，在pH为5.0-8.0的范围内荧光快速猝灭。当溶液的pH值较低时，荧光强度几乎没有变化，这可以归因于在酸性条件下铜的水解反应，抑制MPMC-Cu2+的形成。因此，MPMC探针可作为pH荧光探针，可以在较大pH范围检测Cu2+(pH:4-11)。
8.MPMC探针对Cu2+的响应时间实验：
通过测定MPMC在548nm处的荧光强度，来判断响应时间的变化，如图9所示。加入Cu2+离子后，MPMC探针的荧光强度在1min内急剧下降，荧光强度在1min内达到平衡。
9.MPMC探针对Cu2+的红外光谱检测：
将MPMC探针与MPMC-Cu2+(MPMC:Cu2+＝1:1)通过压片法进行红外光谱扫描如图10所示，从红外图谱中我们可以发现，MPMC的红外峰为：1699.38，1624.28，1571，1526.30，1277.52，1205.43，751.66cm-1。对红外数据进行分析，在1699.38cm-1处出现的尖锐峰为醛基(C＝O)的红外吸收峰；而在1624.28，1571.49cm-1处的尖峰是含氮五元环和桥的碳氮双键(-C＝N-)的红外吸收峰；在1526.30cm-1处出现的峰以及泛频区弱的吸收峰可以证明苯环骨架上碳碳键的红外吸收峰，此化合物属于芳香化合物，在1277.52cm-1出现的峰为桥上的碳氮(-C-N-)，在1205.43cm-1为香豆素结构上的(-O-)，在751cm-1可以提示芳香性化合物发生了单取代。通过红外数据和MPMC的化学结构进行对比，主要的官能团都可以在红外光谱图上找到一一对应的红外吸收峰。与Cu2+离子络合后的化合物的红外图谱上一张红外图进行对比可以发现红外图谱基本相似，红外吸收峰为3199.98，1684.52，1612.97，1569.79，1558.78，1533.14，1200.93，766.29cm-1。在3199.98cm-1处可以证明有(-OH)生成，1684.52cm-1处为的羰基(-C＝O)的吸收峰，在1612.97，1569.79，1558.78cm-1处为碳氮双键(-C＝N-)的红外吸收峰，相比MPMC的可以发现与Cu2+离子络合后(-C＝N-)的数量增多，在1533.14cm-1处的红外吸收峰和泛频区的弱吸收峰证明该化合物为芳香化合物，相比MPMC的红外图谱在1277cm-1的碳氮键(-C-N-)吸收峰消失，在1200.93cm-1为香豆素结构上的(-O-)，在766.29cm-1可以提示芳香性化合物发生了单取代。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (8)
1.一种香豆素吡唑酮类荧光探针，其化学式为C21H16N4O4，其结构式如下：
2.权利要求1所述的一种香豆素吡唑酮类荧光探针的制备方法，包括：将依达拉奉醛基衍生物和香豆素-3-甲酰肼溶解在乙醇中，滴加无水乙酸，加热回流搅拌4h，过滤，得到黄色结晶，用无水乙醇洗涤，用乙醇溶液加热回流得到纯的香豆素吡唑酮类荧光探针。
3.权利要求1所述的一种香豆素吡唑酮类荧光探针在Cu2+检测中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括所述香豆素吡唑酮类荧光探针在溶液中特异性识别Cu2+，或者制成试纸后特异性识别Cu2+。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述香豆素吡唑酮类荧光探针在可见光和紫外灯下均能够特异性识别Cu2+。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述香豆素吡唑酮类荧光探针与Cu2+的配位比为1:1。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述香豆素吡唑酮类荧光探针对Cu2+的检测下限为15.16nM。
8.根据权利要求3-7任意一项所述的应用，其特征在于，所述香豆素吡唑酮类荧光探针对Cu2+检测的pH适用范围4-11。
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