CN115305261B - 一种采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法 - Google Patents

一种采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，所述方法为：将活化后的裂褶菌接种于所述藜麦全植物培养基中，进行发酵培养后，得到裂褶菌发酵产物；其中，所述裂褶菌培养基由藜麦和溶剂组成。所述方法仅采用含有藜麦的发酵培养基，而无需再添加其他营养成分，就能在较短的时间内完成裂褶菌的发酵，获得裂褶菌发酵产物；且该裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量高，最终制备得到的裂褶菌发酵产物具有优异的抗氧化、美白、抗炎和抗皱的能力。

Description

一种采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种含植物组合物的裂褶菌培养基及其制备方法和应用。
背景技术
裂褶菌(学名：Schizophyllum commune Fr.)是裂褶菌科、裂褶菌属真菌。子实体小，覆瓦状散生或丛生，扇形或肾形，无柄或短柄，盖面密生绒毛、白色至浅灰色；盖缘内卷，有条纹、多瓣裂，菌褶狭窄，沿褶缘纵裂向外反卷。
裂褶菌多糖是裂褶菌发酵得到的水溶性多糖，具有抑制肿瘤、抗菌消炎、抗辐射、提高机体免疫力等多种生理活性。目前，裂褶多糖的生产方法多采用单一食用菌液体发酵方式，再将发酵后的产物进行后处理，最终得到裂褶多糖。但发酵得到的裂褶多糖难于重新溶解、不利于生物吸收等特性，极大的限制了其应用。
CN113337545A公开了一种裂褶菌发酵产物及其制备方法、护肤品、裂褶菌培养基。裂褶菌发酵产物的制备方法，包括：在裂褶菌培养基中培养裂褶菌，然后收集发酵产物；其中，所述裂褶菌培养基中含有葛根。在培养基中加入葛根粉末培养裂褶菌，收集发酵产物。
CN108299045A公开了一种用于栽培裂褶菌的培养基，所述培养基由以下质量百分比的各组分组成：黄芪药渣70-90％，石膏粉1％，过磷酸钙1％，麦麸8％-28％，各组分百分比之和为100％。本发明利用黄芪药渣为主要基料，对裂褶菌子实体进行栽培，可以顺利实现出菇，采收得到裂褶菌子实体，裂褶菌子实体是名贵的食药用真菌，具有很高的经济价值。
CN113416687A公开了一种裂褶菌产裂叶多糖的发酵培养方法，该方法包括以下步骤：用基础培养基对裂褶菌进行深层液体培养，然后添加环戊酮脂肪酸继续培养。本发明提供的发酵培养基和环戊酮脂肪酸添加物，能够缩短裂褶菌菌丝发酵周期，大幅度提高单位菌丝体产高附加值产品的含量。
上述专利公开的方法均是在基础发酵培养基中添加功效物质，例如植物成分葛根、黄芪，或是化学成分环戊酮脂肪酸，且均需要添加入酵母浸膏、酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖等碳源和氮源才能够促使裂褶菌进行发酵。目前，仍未发现一种制备裂褶菌发酵产物的单一全植物培养基，能够使裂褶菌发酵高产裂褶多糖。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法。所述方法仅采用含有藜麦的发酵培养基，而无需再添加其他营养成分，就能在较短的时间内完成裂褶菌的发酵，获得裂褶菌发酵产物。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，所述方法为：
将活化后的裂褶菌接种于所述藜麦全植物培养基中，进行发酵培养后，得到裂褶菌发酵产物；其中，所述裂褶菌培养基由藜麦和溶剂组成。
在本发明中，所述方法仅采用含有藜麦的发酵培养基，而无需再添加其他营养成分，就能在较短的时间内完成裂褶菌的发酵，获得裂褶菌发酵产物；且该裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量高，最终制备得到的裂褶菌发酵产物具有优异的抗氧化、美白、抗炎和抗皱的能力。
优选地，所述藜麦全植物培养基中藜麦的浓度为12-30g/L，例如可以是12g/L、14g/L、16g/L、18g/L、20g/L、22g/L、24g/L、26g/L、28g/L、30g/L等。
优选地，所述溶剂为无菌水。
优选地，所述裂褶菌培养基由以下方法配置得到：
将藜麦在烘干后，粉碎过筛，得到藜麦粉，再将藜麦粉和溶剂混合，超声分散，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基进行灭菌。
优选地，所述烘干的温度为40-60℃，例如可以是40℃、45℃、50℃、55℃、60℃等，冻干的时间为10-15h，例如可以是10h、11h、12h、13h、14h、15h等。
优选地，所述藜麦粉的粒径为100-500目，例如可以是100目、200目、300目、400目、500目等。
优选地，所述超声分散的功率为100-500W，例如可以是100W、200W、300W、400W、500W等，超声分散的时间为5-10min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min等。
优选地，所述灭菌的温度为120℃以上，例如可以是120℃、121℃、122℃等，灭菌的时间为20-30min，例如可以是20min、22min、24min、26min、28min、30min等等。
优选地，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养培养的速度为180-250rpm，例如可以是180rpm、190rpm、200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm、250rpm等，发酵培养培养的温度为26-32℃，例如可以是26℃、27℃、28℃、29℃等，发酵培养的时间80-120h，例如可以是80h、90h、100h、110h、120h等。
优选地，所述活化后的裂褶菌在所述藜麦全植物培养基中的接种量为1-10vol％，例如可以是1vol％、2vol％、3vol％、4vol％、5vol％、6vol％、7vol％、8vol％、9vol％、10vol％等。
优选地，所述活化后的裂褶菌通过以下步骤活化得到：
将裂褶菌菌种通过斜面培养基活化，在25-30℃(如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等)，条件下培养5-7天(例如可以是5天、6天、7天等)直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基，扩大培养3-4天(例如可以是3天、3.5天、4天等)，得到活化后的裂褶菌种子液。
优选地，所述斜面培养基为PDA斜面培养基。
优选地，所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖1-5％、磷酸二氢钾0.05-0.2％、硫酸镁0.01-0.02％、酵母浸粉0.1-0.2％，余量为水。
以所述液体培养基的总质量为100％计，所述葡萄糖的含量为1-5％，例如可以是1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％等。
以所述液体培养基的总质量为100％计，所述磷酸二氢钾的含量为0.05-0.2％，例如可以是0.05％、0.06％、0.08％、0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等。
以所述液体培养基的总质量为100％计，所述硫酸镁的含量为0.01-0.02％，例如可以是0.01％、0.012％、0.014％、0.016％、0.018％、0.02％等。
以所述液体培养基的总质量为100％计，酵母浸粉的含量为0.1-0.2％，例如可以是0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％等。
第二方面，本发明提供一种裂褶菌发酵产物，所述裂褶菌发酵产物由如第一方面所述的采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法制备得到。
优选地，所述裂褶菌发酵产物中裂褶多糖的含量为3-10mg/mL，例如可以是3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL等。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的裂褶菌发酵产物在制备化妆品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述方法仅采用含有藜麦的发酵培养基，而无需再添加其他营养成分，就能在较短的时间内完成裂褶菌的发酵，获得裂褶菌发酵产物；且该裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量高，最终制备得到的裂褶菌发酵产物抗氧化、美白、抗炎和抗皱的能力；
(2)本发明采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，最终制备得到的裂褶菌发酵产物中裂褶多糖的含量在7.13mg/mL以上，裂褶多糖的分子量在8250kDa以下；
(3)本发明制备得到的裂褶菌发酵产物具有很好的抗氧化和清除DPPH自由基的能力，对于超氧阴离子自由基清除率在44.46％以上，对羟自由基清除率在28.48％以上，对于DPPH自由基抑制率在56.32％以上；本发明采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，最终制备得到的裂褶菌发酵产物对酪氨酸酶的抑制率在53.08％以上，对黑色素合成抑制率在51.21％以上；制备得到的裂褶菌发酵产物对白介素1-α的释放抑制率的抑制率在47.64％以上。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
制备例
本制备例提供裂褶菌菌种，所述裂褶菌菌种通过以下方法活化的得到：
将裂褶菌菌种通过PDA斜面培养基活化，在27℃，160rpm条件下培养6天直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基(所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖3％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.01％、酵母浸膏0.1％，余量为水)，扩大培养3天，得到活化后的裂褶菌种子液。
实施例1
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将藜麦在50℃下烘干14h后，粉碎过筛，得到粒径为200目的藜麦粉，再将15g的藜麦粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散5min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以3vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养培养的速度为200rpm，发酵培养培养的温度为27℃，发酵培养的时间120h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例2
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将藜麦在40℃下烘干12h后，粉碎过筛，得到粒径为200目的藜麦粉，再将20g的藜麦粉和1L的无菌水混合，在400W的功率下超声分散5min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌20min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以2vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养培养的速度为200rpm，发酵培养培养的温度为28℃，发酵培养的时间100h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例3
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将藜麦在60℃下烘干10h后，粉碎过筛，得到粒径为300目的藜麦粉，再将25g的藜麦粉和1L的无菌水混合，在300W的功率下超声分散8min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌20min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以2vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养培养的速度为200rpm，发酵培养培养的温度为29℃，发酵培养的时间80h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例4
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将藜麦在50℃下烘干14h后，粉碎过筛，得到粒径为200目的藜麦粉，再将10g的藜麦粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散5min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以3vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养培养的速度为200rpm，发酵培养培养的温度为27℃，发酵培养的时间120h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例5
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将藜麦在50℃下烘干14h后，粉碎过筛，得到粒径为200目的藜麦粉，再将40g的藜麦粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散5min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以3vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养培养的速度为200rpm，发酵培养培养的温度为27℃，发酵培养的时间120h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例6
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将藜麦在50℃下烘干14h后，粉碎过筛，得到粒径为200目的藜麦粉，再将15g的藜麦粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散5min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以3vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养培养的速度为160rpm，发酵培养培养的温度为26℃，发酵培养的时间72h，收集裂褶菌发酵产物。
实施例7
本实施例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将藜麦在50℃下烘干14h后，粉碎过筛，得到粒径为200目的藜麦粉，再将15g的藜麦粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散5min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以3vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养培养的速度为300rpm，发酵培养培养的温度为26℃，发酵培养的时间140h，收集裂褶菌发酵产物。
对比例1
本对比例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将葛根在-20℃下冻干14h后，粉碎过筛，得到粒径为200目的葛根粉，再将15g的葛根粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散5min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以3vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养培养的速度为200rpm，发酵培养培养的温度为27℃，发酵培养的时间120h，收集裂褶菌发酵产物。
对比例2
本对比例提供一种裂褶菌发酵产物的制备方法，所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将甘草在-20℃下冻干14h后，粉碎过筛，得到粒径为200目的甘草粉，再将15g的甘草粉和1L的无菌水混合，在200W的功率下超声分散5min，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基在121℃下高温高压灭菌15min；
(2)将上述制备例活化后的裂褶菌种子液以3vol％的接种量接种于步骤(1)灭菌后的裂褶菌培养基中，进行培养后，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养培养的速度为200rpm，发酵培养培养的温度为27℃，发酵培养的时间120h，收集裂褶菌发酵产物。
试验例1
裂褶多糖含量含量测定
测试样品：实施例1-7提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-2提供的裂褶菌发酵产物；
测试原理：裂褶多糖含量也可作为发酵产物的重要衡量指标，计算方法：裂褶多糖含量＝总糖含量-还原糖含量；
测试方法：
I.采用硫酸-苯酚法测定发酵产物总糖含量，多糖在浓硫酸的作用下，先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚反应生成橙黄色溶液，在490nm处有最大吸收。以葡萄糖标准品，测定发酵产物总糖含量，具体操作步骤如下：
(1)于10.0mL具塞试管中，添加稀释一定倍数待测液1.0mL；
(2)加入5％苯酚溶液1.0mL，再迅速垂直液面加入5.0mL浓硫酸，静置10min。使用旋涡振荡器使反应液充分混合，然后将具塞试管放置于30℃水浴反应20min。
(3)以相应试剂进行空白调零，于490nm处测定吸光度。
计算公式：总糖含量(mg/mL)＝吸光度对应葡萄糖浓度×稀释倍数N；
II.采用DNS法测定发酵产物还原糖含量，还原糖在碱性条件下可被氧化成糖酸及其他产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸则被还原成棕红色的3-氨基-5硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅成正比关系，利用分光光度计在550nm处测定其吸光度。以葡萄糖为标准品，测定发酵产物还原糖含量，具体操作步骤如下：
II.采用DNS法测定发酵产物还原糖含量，还原糖在碱性条件下可被氧化成糖酸及其他产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸则被还原成棕红色的3-氨基-5硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质的颜色深浅成正比关系，利用分光光度计在550nm处测定其吸光度。以葡萄糖为标准品，测定发酵产物还原糖含量，具体操作步骤如下：
(1)于10mL具塞试管中，添加稀释一定倍数待测液1.0mL；
(2)加入DNS溶液3.0mL，沸水浴5min后显色；待冷却后用水定容至25.0mL，充分摇匀；
(3)以相应试剂进行空白调零，于550nm处测定吸光度。
计算公式：还原糖含量(mg/mL)＝吸光度对应葡萄糖浓度×稀释倍数N；
具体测试结果如表1所示：
表1
由表1测试结果可知，本发明采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，最终制备得到的裂褶菌发酵产物中总糖的含量在8.35mg/mL以上，还原糖的含量在0.44mg/mL以上，裂褶多糖的含量在7.13mg/mL以上。由此说明，本发明采用藜麦全植物培养基，无需添加其他成分，就能够满足裂褶菌的生长，实现进一步提高了裂褶菌发酵产物中裂褶多糖含量的目的。
试验例2
裂褶多糖的分子量和粘度测定
测试样品：实施例1-7提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-2提供的裂褶菌发酵产物；
测试方法：将上述发酵液浓缩至原来的体积的至1/4，再加入5倍体积的85vol％乙醇沉淀，以10000rpm的转速离心弃去上清液，收集沉淀用蒸馏水重新溶解，再采用分子量为5kDa的超滤膜过滤除蛋白质及其他小分子产物，得裂褶多糖溶液；将得到裂褶多糖溶液置于-80℃下冷冻干燥24h；配制1mg/mL浓度裂褶多糖溶液，采用高效凝胶渗透色谱对得到的裂褶多糖测分子量；
测试条件为：色谱柱：7.8×300mm(Ultrahydrogel TM 120，250，1000，由WatersCorporation提供)；柱温：35℃；流动相：高纯水；流速0.6mL/min；进样量：50μL；
具体测试结果如表2所示：
表2
由表2测试数据可知，本发明采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，最终制备得到的裂褶菌发酵产物中，裂褶多糖的分子量在8250kDa以下。说明在本发明中，采用藜麦全植物培养不仅使得从菌丝体中大量制备裂褶多糖，而且还能获得分子量相对较低，水溶性更好的裂褶多糖，更加利于生物吸收入体内发挥生物活性，极大的扩展了裂褶多糖的应用。
试验例3
抗氧化能力测试
测试样品：实施例1-7提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-2提供的裂褶菌发酵产物；
测试方法：
1、对超氧阴离子自由基清除能力评价
取0.05mol/L pH＝8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL，于25℃水浴锅中预热20min。再加入1mL试样和0.4mL 25mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后，于25℃水浴中反应5min，加入8mol/L的HCl 1.0mL终止反应。以Tris-HCl缓冲液作参比，在299nm处测吸光度值。空白对照用1mL试样的溶剂来替代样品。
超氧阴离子自由基清除率(％)＝[1-(A2/A1)]×100％；式中A1为空白对照的吸光度值；A2为样品的吸光度值。
2、对羟自由基的清除能力评价
在25mL比色管中依次加入2mmol/L FeSO43 mL，1mmol/L H2O23 mL，摇匀，接着加入6mmol/L水杨酸3mL，摇匀，于37℃水浴加热15min后取出，测其吸光度；分别加入一定浓度的待测液，摇匀，继续水浴加热15min，取出测其吸光度。下式为待测液对羟自由基(·OH)的清除率：
羟自由基清除率(％)＝[A1-A2-(A1-A3)]/A1×100％；式中A1为未加药品前反应体系的吸光度值；A2为样品清除·OH后体系的吸光度值；A3为空白对照清除·OH后体系的吸光度值；
3、对DPPH自由基的清除能力评价
试验参照Larrauri JA中规定的方法，配制20mmol/L的DPPH溶液；受试样品溶液：采用超纯水稀释实施例1-10提供的裂褶多糖组合物和对比例1-5提供的组合物，得到质量浓度为0.1％的溶液。取受试样品溶液2.0mL及20mmol/L的DPPH溶液2.0mL于试管之中，混匀后反应30min，于517nm下测定吸光度值，无水乙醇为空白对照，根据吸光度值计算DPPH抑制率。
DPPH自由基抑制率(％)＝[1-(A1-A2)/A3]×100％；其中，A1为2.0mL的DPPH溶液与2.0mL受试样品溶液的吸光度，A2为2.0mL受试样品溶液与2.0mL无水乙醇的吸光度，A3为2.0mL的DPPH溶液与2.0mL无水乙醇的吸光度，平行测试三次取平均值；
具体测试结果如表3所示：
表3
由表3测试数据可知，本发明采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，最终制备得到的裂褶菌发酵产物具有很好的抗氧化和清除DPPH自由基的能力，对于超氧阴离子自由基清除率在44.46％以上，对羟自由基清除率在28.48％以上，对于DPPH自由基抑制率在56.32％以上。说明采用藜麦全植物培养基能够促进裂褶菌发酵，得到的裂褶菌发酵产物能进一步对于DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用，可增强皮肤组织的抗氧化能力，降低皮肤组织自由基含量。
试验例4
美白能力测试
测试样品：实施例1-7提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-2提供的裂褶菌发酵产物；
测试方法：
(1)酪氨酸酶活性抑制试验
检测前，对裂褶菌发酵产物过0.45μm微孔滤膜；
向96孔板中依次加入磷酸盐缓冲液、不同供试液(磷酸缓冲液充当样品空白)、500U/mL酶液，最后加入底物1.5mmol/L L-酪氨酸，立即开始计时，测定反应20min时475nm波长下的吸光值。
式中：A1：添加样品，添加L-酪氨酸；A2：添加样品，没有添加L-酪氨酸；B1:没有添加样品，添加L-酪氨酸；B2：没有添加样品，没有添加L-酪氨酸，R'为对应样品对酪氨酸酶抑制率(％)。
(2)黑色素合成抑制实验
将B16黑色素瘤细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，每孔90μL，CO2孵箱中孵育24小时后，每孔加入样品溶液。同时设立培养基和细胞的空白对照组。
将培养板置于孵箱中孵育72小时后，弃去上清液，PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗涤两遍，然后每孔加入0.5mL胰酶消化细胞3min，每孔加入2mL维持液终止消化。混匀后，每种浓度取出0.5mL做细胞计数。其余细胞悬液以2500r/min离心分离5min，弃去上清液，于沉淀中加入NaOH溶液，加热使黑色素溶解，选择490nm波长在酶联免疫检测仪下测定吸光度值。
计算样品对黑色素合成抑制率(％)公式如下所示：
其中，A1为药物孔吸光度值，P1为药物孔细胞密度，A2为对照孔吸光度值；P2为对照孔细胞密度，I'为对应样品对黑色素合成抑制率(％)；
具体测试结果如表4所示：
表4
测试样品 酪氨酸酶的抑制率/％ 黑色素合成抑制率/％
实施例1 77.94±1.35 76.20±0.18
实施例2 71.60±1.68 66.92±1.70
实施例3 65.39±3.37 68.46±0.78
实施例4 63.37±0.81 62.31±3.80
实施例5 55.30±1.32 57.59±2.19
实施例6 56.34±0.12 51.85±1.04
实施例7 53.08±1.25 51.21±0.44
对比例1 47.55±1.23 48.95±0.89
对比例2 46.51±0.59 45.34±1.06
由表4测试结果可知，本发明采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，最终制备得到的裂褶菌发酵产物对酪氨酸酶的抑制率在53.08％以上，对黑色素合成抑制率在51.21％以上，说明说明本发明所述藜麦全植物培养基能够促进裂褶菌发酵，得到的裂褶菌发酵产物，能够有效抑制黑色素转移至角质细胞，抑制黑色素沉着，促进肌肤的新陈代谢，进而减轻色素沉积，能够从多个方面实现美白效果，令皮肤健康白皙。
试验例5
抗炎能力测试
测试样品：实施例1-7提供的裂褶菌发酵产物和对比例1-2提供的裂褶菌发酵产物；
试验方法：
(1)分别采用0.1g 0.3％月桂醇硫酸钠(SLS)、0.1g 0.3％月桂醇硫酸钠+0.1g待测样品处理3D人造皮肤(由I型胶原蛋白和人体细胞组成，广东博溪生物科技有限公司)，每组设置3个平行(具体操作见“Test No.439:In Vitro Skin Irritation:ReconstructedHuman Epidermis Test Method[S].OECD Guidelines for the Testingof Chemicals,2010,1(4:)1-18”)；
(2)然后酶联免疫吸附法(ELISA)(使用人白介素1(IL-1)定量ELISA检测试剂盒)测定促发炎症的白介素1-α的释放量。抗炎效果通过促发炎症的白介素1-α的释放抑制率来表示。其计算公式如下：
其中，B'为白介素1-α的释放抑制率，S为添加SLS和待测样品的白介素1-α的释放量，B0为只添加SLS的白介素1-α的释放量；
具体测试结果如表5所示：
表5
/>
由表5测试结果可知，本发明采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，最终制备得到的裂褶菌发酵产物对白介素1-α的释放抑制率的抑制率在47.64％以上，说明说明本发明所述藜麦全植物培养基能够促进裂褶菌发酵，得到的裂褶菌发酵产物，还能使化妆品兼具即时紧致、长效抗衰和抗炎的功效。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述方法为：
将活化后的裂褶菌接种于裂褶菌培养基中，进行发酵培养后，得到裂褶菌发酵产物；其中，所述裂褶菌培养基由藜麦粉和无菌水组成；
所述裂褶菌培养基中藜麦粉的浓度为12-30 g/L；
所述裂褶菌培养基由以下方法配置得到：
将藜麦烘干后，粉碎过筛，得到藜麦粉，再将藜麦粉和无菌水混合，超声分散，得到裂褶菌培养基，最后再将裂褶菌培养基进行灭菌；
所述藜麦粉的粒径为100-300目；
所述活化后的裂褶菌在所述裂褶菌培养基中的接种量为1-3 vol%。
2.根据权利要求1所述的采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述烘干的温度为40-60℃，烘干的时间为10-15 h。
3.根据权利要求1所述的采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述超声分散的功率为100-500 W，超声分散的时间为5-10 min。
4.根据权利要求1所述的采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述灭菌的温度为121℃，灭菌的时间为10-20 min。
5.根据权利要求1所述的采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述发酵培养在摇床震荡的条件下进行，发酵培养的速度为180-250 rpm，发酵培养的温度为26-32℃，发酵培养的时间80-120 h。
6.根据权利要求1所述的采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述活化后的裂褶菌通过以下步骤活化得到：
将裂褶菌菌种通过斜面培养基活化，在25-30℃条件下培养5-7天直至菌丝长满斜面；将斜面菌种转接至液体培养基，扩大培养3-4天，得到活化后的裂褶菌种子液。
7.根据权利要求6所述的采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在于，所述斜面培养基为PDA斜面培养基。
8.根据权利要求6所述的采用藜麦全植物培养基制备裂褶菌发酵产物的方法，其特征在，所述液体培养基按质量百分含量计由如下组分组成：葡萄糖1-5%、磷酸二氢钾0.05-0.2%、硫酸镁0.01-0.02%、酵母浸粉0.1-0.2%，余量为水。
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