CN115887347A - 一种中药乳酸菌双向发酵液、发酵工艺及发酵液的应用 - Google Patents
一种中药乳酸菌双向发酵液、发酵工艺及发酵液的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供一种中药乳酸菌双向发酵液、发酵工艺及发酵液的应用，涉及护肤品技术领域。该中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺为将乳酸菌接种在包含中药的发酵培养基中进行发酵培养，以中药作为双向发酵底物，以乳酸菌为菌种，通过二者的组合发酵获得具有多种功效的双向发酵液，提高中药乳酸菌发酵液在化妆品领域的应用，拓宽中药的应用范围。通过将莓茶与乳酸菌进行双向发酵，莓茶打粉处理后可以直接加入发酵培养基中，不需经过酶解、水提或有机试剂提取等方法制得莓茶提取物，方法更简便，能耗低。所得的莓茶乳酸菌双向发酵滤液总抗氧化能力、DPPH和ABTS清除能力优于莓茶‑发酵培养基，酪氨酸酶抑制率明显优于莓茶‑发酵培养基。
Description
技术领域
本申请涉及护肤品技术领域，尤其涉及一种中药乳酸菌双向发酵液、发酵工艺及发酵液的应用。
背景技术
莓茶，是以显齿蛇葡萄嫩茎叶加工制得，又名小叶藤茶，主要分布在我国湖南、湖北、福建、江西等地。该植物富含天然活性成分黄酮，在加工过程中细胞内所含黄酮类成分渗透至表面而形成一层白霜，故名莓茶。莓茶原为土家族常用的民族药物，收录于《土家族医药学》、《全国中草药汇编》、《湖南中药材(2009版)》等中医药专著中。莓茶具有清热解毒、活血通络、利湿消肿及平肝降压等功效，是近年来研究较为热门的药茶两用中药之一。
目前，莓茶中活性成分的提取主要有水提、酶解、碱提酸沉等方法。例如专利文献CN111903812 A中公开了一种速溶莓茶提取物的制备方法及应用，CN109329524 A中公开了一种茅岩莓茶中黄酮的制备方法。现有技术的莓茶活性成分的提取时间长，操作复杂，能耗较高。
发明内容
本申请的目的在于提供一种中药乳酸菌双向发酵液、发酵工艺及发酵液的应用，旨在解决现有莓茶活性成分提取时间长，操作复杂，能耗较高的问题。
为实现以上目的，本申请提供一种中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺，包括：将乳酸菌接种在包含中药的发酵培养基中进行发酵培养，得到所述中药乳酸菌双向发酵液；所述中药在所述发酵培养基中的添加质量体积比为0.1％-2.0％。
优选地，所述中药选自：莓茶、甘草、油茶、奇亚籽和五味子中的任一种。
优选地，所述中药为莓茶，所述莓茶为莓茶粉，所述莓茶粉的目数为20-50目。
优选地，所述乳酸菌的接种体积为所述发酵培养基体积的3％-6％。
优选地，所述发酵培养的发酵温度为34-38℃，发酵时间为1-4天。
优选地，所述发酵培养基还包括：蛋白胨10g/L、牛肉浸膏8g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1g/L，pH调节至5.7。
优选地，所述乳酸菌经活化培养后接种在所述发酵培养基中，所述活化培养的培养基为：蛋白胨12g/L、牛肉浸膏9g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖15g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1g/L，自然pH。
本申请还提供一种中药乳酸菌双向发酵液，由上述的中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺发酵制备得到。
优选地，所述中药乳酸菌双向发酵液为莓茶乳酸菌双向发酵液；
更优选地，所述莓茶乳酸菌双向发酵液的莓茶粉的添加质量体积比为0.5％，其总黄酮含量为400～500μg/mL；总酚含量为800～1000μg/mL；DPPH清除率为95％～97％；ABTS清除率为95％～99.9％；T-AOC为15～20μmol/mL；酪氨酸酶抑制率为98％～99.9％。
本申请还提供上述的中药乳酸菌双向发酵液在制备化妆品中的应用。
本申请还提供一种化妆品，其原料包括上述的中药乳酸菌双向发酵液。
与现有技术相比，本申请的有益效果包括：
本申请提供的中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺为将乳酸菌接种在包含中药的发酵培养基中进行发酵培养，以中药作为双向发酵底物，以乳酸菌为菌种，将中药与益生菌组合发酵，通过二者的组合发酵获得具有多种功效的双向发酵液，提高中药乳酸菌发酵液在化妆品领域的应用，拓宽中药的应用范围。通过双向发酵技术，将莓茶与乳酸菌进行双向发酵，莓茶打粉处理后可以直接加入发酵培养基中，不需经过酶解、水提或有机试剂提取等方法制得莓茶提取物，方法更简便，能耗低。所得的莓茶乳酸菌双向发酵滤液总抗氧化能力、DPPH和ABTS清除能力优于莓茶-发酵培养基，酪氨酸酶抑制率明显优于莓茶-发酵培养基。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
本申请提供一种中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺，包括：将乳酸菌接种在包含中药的发酵培养基中进行发酵培养，得到所述中药乳酸菌双向发酵液；所述中药在所述发酵培养基中的添加质量比为0.1％-2.0％。
其中，中药选自：莓茶、甘草、油茶、奇亚籽和五味子中的任一种，经过实验证明，这些中药任一种做为双向发酵底物都可以提高发酵液的抗氧化和/或美白能力。中药在发酵培养基中的添加质量体积比为0.1％-2.0％，例如可以为0.1％～0.5％，0.5％-1.5％，或0.5％-1.0％，更具体的例如可以为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2.0％。
优选地，中药为莓茶，莓茶乳酸菌双向发酵液的抗氧化和美白能力提升最为明显。
其中，乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。乳酸菌例如可以为鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、副干酪乳杆菌、嗜酸酪乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌等任一菌种。
进一步地，乳酸菌在接种到发酵培养基之前还可以经活化培养，其中，乳酸菌活化培养过程用到的培养基组分例如可以为：蛋白胨12g/L、牛肉浸膏9g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖15g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1g/L，自然pH。经过活化培养的乳酸菌发酵效果更好，发酵速度更快。
更进一步地，当需要使用发酵罐进行大批量发酵时，乳酸菌在活化培养之后，还可以经过种子培养得到乳酸菌的发酵种子液，发酵种子液更利于发酵培养罐中发酵。种子培养基的配方例如可以为：蛋白胨10g/L、牛肉浸膏8g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖15g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1g/L，pH自然。
优选地，所述乳酸菌的接种体积为所述发酵培养基体积的3％-6％，例如可以为3％、4％、5％或6％。
其中，本申请经过实验发现，莓茶会对乳酸菌的生长有一定的抑制作用，因此，本申请方案的莓茶乳酸菌双向发酵液的发酵工艺中，莓茶在发酵培养基中的添加质量体积比为0.5％-2.0％，例如可以为0.5％-1.5％，或0.5％-1.0％，更具体的例如可以为0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2.0％。
在一优选实施例中，莓茶在发酵培养基中的添加质量体积比为0.5％。莓茶在该添加量下，可以减少对乳酸菌的抑制作用，同时起到与乳酸菌双向发酵的协同增效作用。
其中，莓茶的添加形式可以为莓茶粉，或莓茶水提物，或莓茶酶解提取物。优选地，添加在发酵培养基中的莓茶为莓茶粉，直接以莓茶粉进行添加，可以起到同样设置更好的发酵效果，却不需要复杂的提取过程，操作方便，能耗低。
优选地，所述莓茶粉的目数为20-50目，例如可以为20-30目，或20-40目，或30-50目，更具体的例如可以为20目、25目、30目、35目、40目、45目或50目。
其中，发酵培养基除了莓茶以外的组分还包括：蛋白胨10g/L、牛肉浸膏8g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1g/L，pH调节至5.7。
优选地，所述发酵培养的发酵温度为34-38℃，例如可以为34℃、35℃36℃、37℃或38℃，发酵时间为1-4天，例如可以为1天、2天、3天或4天。
本申请还提供一种中药乳酸菌双向发酵液，由上述的中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺发酵制备得到。
优选地，该中药乳酸菌双向发酵液为莓茶乳酸菌双向发酵液；更优选地，所述莓茶乳酸菌双向发酵液的莓茶粉的添加质量体积比为0.5％，其总黄酮含量为400～500μg/mL；总酚含量为800～1000μg/mL；DPPH清除率为95％～97％；ABTS清除率为95％～99.9％；T-AOC为15～20μmol/mL；酪氨酸酶抑制率为98％～99.9％。
本申请还提供上述的中药乳酸菌双向发酵液在制备化妆品中的应用。
本申请还提供一种化妆品，其原料包括上述的中药乳酸菌双向发酵液。
本申请提供的中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺为将乳酸菌接种在包含中药的发酵培养基中进行发酵培养，以中药作为双向发酵底物，以乳酸菌为菌种，通过二者的组合发酵获得具有多种功效的双向发酵液，提高中药乳酸菌发酵液在化妆品领域的应用，拓宽中药的应用范围。通过双向发酵技术，将莓茶与乳酸菌进行双向发酵，莓茶打粉处理后可以直接加入发酵培养基中，不需经过酶解、水提或有机试剂提取等方法制得莓茶提取物，方法更简便，能耗低。所得的莓茶乳酸菌双向发酵滤液总抗氧化能力、DPPH和ABTS清除能力优于莓茶-发酵培养基，酪氨酸酶抑制率明显优于莓茶-发酵培养基。
下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
实施例1的莓茶乳酸菌双向发酵液的发酵工艺如下：
1、菌种活化
取一支副干酪乳杆菌菌种接种入菌种活化培养基中，34-37℃密闭静置培养1-2天，获得活化菌种。
菌种活化培养基配方为：蛋白胨12g/L、牛肉浸膏9g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖15g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温801g/L，pH自然，配制体积为40ml，118℃灭菌15min。
2、发酵培养
将步骤1中的活化菌种按照3％-6％比例接入500mL摇瓶发酵培养基中，发酵温度为34-37℃，静置密闭发酵1-2天，获得实施例1的莓茶乳酸菌双向发酵液。
发酵培养基配方为：取莓茶适量，粉碎后过20-50目筛，过筛后的莓茶粉按质量体积比0.5％比例加入300ml配好的培养基中，培养基配方为：蛋白胨10g/L、牛肉浸膏8g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1g/L，pH调节至5.7，118℃灭菌15min。
3、制备滤液
步骤2中得到的发酵液8500rpm离心15min，取上清，过0.22微米滤膜除菌后得发酵滤液。
实施例2
与实施例1的区别在于：实施例2的发酵工艺中，步骤2中的添加的莓茶粉替换为甘草粉，其他步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例3
与实施例1的区别在于：实施例3的发酵工艺中，步骤2中的添加的莓茶粉替换为油茶籽粉，其他步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例4
与实施例1的区别在于：实施例4的发酵工艺中，步骤2中的添加的莓茶粉替换为奇亚籽粉，其他步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
实施例5
与实施例1的区别在于：实施例5的发酵工艺中，步骤2中的添加的莓茶粉替换为五味子粉，其他步骤与实施例1相同，在此不再赘述。
对实施例1-5得到的不同中药底物双向发酵液进行功效测试，体外功效评价检测方法如下：
1、DPPH自由基清除率测定
DPPH的中文名称为1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一个稳定的自由基。
(1)溶液配制
DPPH溶液：每次取0.002g DPPH溶于50ml乙醇，避光保存。使用前用乙醇稀释至吸光度为0.7左右，现配现用。
样品处理：取2ml发酵液或培养基，8500rpm离心5min，取上清液，用水稀释至5％、10％、20％、100％。
(2)实验过程
在避光条件下，取100μl DPPH醇溶液和100μl测试样品加入96孔板中，室温下避光孵育30min，测定517nm处的吸光值。每次测定都需要样品、空白和对照三组，每组设3个平行，具体如下：
Sample：100μl样品溶液+100μl DPPH醇溶液
Blank：100μl样品溶液+100μl无水乙醇
Control：100μl DPPH醇溶液+100μl水
结果计算：DPPH清除率＝(1-(Sample-Blank)/Control)*100％。
2、ABTS自由基清除率测定
ABTS的中文名称为2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，是一种化学自由基。
(1)溶液配制
PBS缓冲液：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.63g，用蒸馏水定容至1000ml，用盐酸或氢氧化钠调节pH至7.4。
ABTS储备液(7mmol/L):称ABTS 0.0384g，用蒸馏水定容至10ml。
K2S2O8储备液(2.45mmol/L):称K2S2O8 0.0066g，用蒸馏水定容至10ml。
ABTS工作液：将ABTS储备液和K2S2O8储备液1：1混匀，静置12-16h，配制成ABTS工作液。
样品处理：取2ml发酵液或培养基，8500rpm离心5min，取上清液，用缓冲液稀释至5％、10％、20％、100％。
(2)实验过程
取适量ABTS工作液，用PBS溶液稀释至该溶液在734nm处吸光度为0.7左右。在避光条件下，取200μl稀释后的ABTS工作液和10μl测试样品加入96孔板中，室温下避光孵育6min，测定734nm处的吸光值。每次测定都需要样品、空白和对照三组，每组设3个平行，具体如下：
Sample：10μl样品溶液+200μl ABTS工作液
Blank：10μl样品溶液+200μl PBS缓冲液
Control：10μl蒸馏水+200μl ABTS工作液
结果计算：ABTS清除率＝(1-(Sample-Blank)/Control)*100％。
3、酪氨酸酶抑制率检测
(1)溶液配制
磷酸盐缓冲液：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250mL，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118mL，用去离子水定容至1000mL。
L-酪氨酸溶液：称取27.17mg L-酪氨酸，用磷酸缓冲液溶解后定容至100mL容量瓶，配制成1.5mmol/L的L-酪氨酸溶液，现配现用。
酪氨酸酶溶液：称量18.5mg酪氨酸酶(25KU，索莱宝)，加入12.5mL磷酸缓冲液稀释至2KU/mL，分装后冻存。使用前用磷酸缓冲液稀释至200U/mL。
(2)实验过程
样品离心处理后备用，在避光条件下分别加入磷酸缓冲液、样品、酪氨酸和酪氨酸酶，在酶标仪中37℃恒温孵育10分钟，于475nm处测定吸光值。每次测定都需要样品、空白、A0和A1四组，每组设2个平行，具体如下：
A0：50μl酪氨酸溶液+100μl缓冲液+50μl酪氨酸酶；
A1：50μl酪氨酸溶液+150μl缓冲液；
Sample：50μl酪氨酸溶液+50μl样品+50μl缓冲液+50μl酪氨酸酶；
Blank：50μl酪氨酸溶液+50μl样品+100μl缓冲液
结果计算：酪氨酸酶抑制率＝(1-(Sample-Blank)/(A0-A1))*100％
对实施例1-5所得的发酵液进行体外抗氧化、美白活性检测，结果如表1所示。发酵液的抗氧化能力用DPPH和ABTS自由基清除率进行评价，美白能力用酪氨酸酶抑制率表示。在所研究的几种中药中，莓茶发酵液的抗氧化和美白能力都显著优于其他中药发酵液，此外油茶籽发酵液的抗氧化能力也较优秀，五味子和甘草发酵液的美白能力几乎与莓茶不相上下。因此，综合抗氧化和美白能力考虑，选择莓茶作为后续研究对象。
表1实施例1-5不同中药底物发酵液功效评价
为了探究莓茶最适添加量，设计了如下对比实验。
对比例1
步骤1、3同实施例1，步骤2中发酵培养基配制步骤不添加莓茶粉。
对比例2
步骤1、3同实施例1，步骤2中发酵培养基配制步骤中莓茶粉添加量为1.0％。
对比例3
步骤1、3同实施例1，步骤2中发酵培养基配制步骤中莓茶粉添加量为1.5％。
对比例4
步骤1、3同实施例1，步骤2中发酵培养基配制步骤中莓茶粉添加量为2.0％。
对实施例1和对比例1-4的菌体生长和pH进行测试，结果统计如表2所示，根据表2可知，添加莓茶粉对乳酸菌的生长有一定的抑制作用，且随莓茶用量增加，抑菌效果越来越明显。当莓茶粉添加量达到0.5％以上时，菌体生长缓慢，发酵终止pH较高，表明莓茶有一定的抑菌效果。为了保证发酵液功效，同时不影响乳酸菌生长，莓茶粉用量优选为0.5％。
表2不同莓茶添加量下发酵菌体生长及终止pH
| 实验条件 | pH | 生长情况 | |
| 实施例1 | 0.5％莓茶粉发酵 | 3.71 | 正常生长 |
| 对比例1 | 0莓茶粉发酵 | 3.63 | 正常生长 |
| 对比例2 | 1.0％莓茶粉发酵 | 4.22 | 菌体量较少 |
| 对比例3 | 1.5％莓茶粉发酵 | 4.56 | 菌体量极少 |
| 对比例4 | 2.0％莓茶粉发酵 | 4.79 | 菌体量极少 |
为了探究莓茶和乳酸菌发酵过程中的相互作用，进行了如下探究。
对比例5
实施例1中步骤2中的发酵培养基不加莓茶粉直接灭菌得到的培养基，不进行接种，作为空白对照。
对比例6
步骤1、3同实施例1，步骤2中发酵培养基配制步骤不添加莓茶粉。
对比例7
按实施例1的步骤2中发酵培养基配方配制，但不接种菌。
对实施例1和对比例5-7得到的发酵液进行功效测试，功效测试包括：DPPH清除率、ABTS清除率、T-AOC、酪氨酸酶抑制率、总黄酮和总酚，结果如表3所示。DPPH清除率、ABTS清除率和酪氨酸酶抑制率的测试方法如前述实施例所述，T-AOC、总黄酮和总酚的体外功效评价检测方法如下：
1、总抗氧化能力T-AOC测定
T-AOC检测使用BIOSS的试剂盒检测，其原理是在酸性环境下，还原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ的能力，反映了总抗氧化能力。按试剂盒说明制备反应体系，反应10分钟后，在酶标仪中593nm处测定吸光度。测定计算标准曲线，经计算，标准曲线为y＝10.641x+0.0006，R2＝1。x为Fe2+浓度，y为样品与对照吸光度差值。
样品管为：180μl检测试剂+6μl样品+18μl蒸馏水；
对照管为：180μl检测试剂+24μl蒸馏水。
根据吸光度差值计算出x(μmol/mL)，则总抗氧化能力T-AOC＝x*34。
2、总酚含量检测
(1)标准曲线的测定
以焦性没食子酸为标准品，称取4.4mg焦性没食子酸，用蒸馏水定容至10ml。分别取0μl，10μl，20μl，40μl，60μl，80μl，100μl，120μl到比色管中，用水补齐至2ml，加入0.5ml2倍稀释的福林酚试剂，再加入1.5ml26.7％碳酸钠溶液，加水定容至10ml，混匀后室温下反应2小时，于760nm处测定吸光度。以吸光度对标准品含量拟合标准曲线。所得标曲为y＝0.0132x+0.0353，R2＝0.9986。
(2)样品测定
取适量样品，按上述步骤加入试剂，反应2小时后测定吸光度，计算总酚含量。
3.总黄酮含量检测
(1)标准曲线的测定
以芦丁为标准品，用60％乙醇配制成1000μg/ml，800μg/ml，600μg/ml，400μg/ml，200μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，0μg/ml的标准液。分别取300μl标准液到EP管中，加入100μl5％亚硝酸钠溶液，混匀后静置反应6min，再加入100μl 10％硝酸铝溶液，混匀后静置反应6min，再加入500μl 4％氢氧化钠溶液，混匀后静置反应15min，吸取反应液200μl，于510nm处测定吸光度。以吸光度对标准品含量拟合标准曲线。所得标曲为y＝0.0061x+0.0409，R2＝0.9994。
(2)样品测定
取适量样品，按上述步骤加入试剂，反应后测定吸光度，计算总黄酮含量。
表3不同发酵条件所得发酵液功效及活性物含量检测
由表3可以看出，不含莓茶的基础培养基中，乳酸菌发酵可产生一定的抗氧化和较强的酪氨酸酶抑制能力，其中T-AOC发酵后增加了1.71倍，酪氨酸酶抑制率提升了5.93倍，基础培养基经发酵后总黄酮和总酚含量分别提高了29.29μg/mL和35.15μg/mL。表明乳酸菌发酵本身可产生较好的抗氧化和美白功效。
添加莓茶粉后培养基的DPPH和ABTS清除率都可达到90％左右，T-AOC达到14.36μmol/mL，总酚和总黄酮较对比例5分别提高了418.49μg/mL和271.47μg/mL，但酪氨酸酶抑制能力只有49.25％。莓茶培养基经乳酸菌发酵后，自由基清除能力和T-AOC总还原力分别提高了6.5％-9.4％和1.14μmol/mL，酪氨酸酶抑制率提高101％，总酚和总黄酮分别提高162.12μg/mL和86.45μg/mL。可见，莓茶具有优秀的抗氧化和一定的美白能力，经乳酸菌发酵后功效能够得到进一步提升，二者表现出协同作用。
为探究莓茶不同处理方式对功效的影响，选取了常见的水提法和酶解法对莓茶进行处理，研究其对发酵液功效指标的影响。
对比例8
步骤1、3同实施例1，步骤2中莓茶处理方式改为水提，具体如下：称量所需用量的莓茶粉，按1：10-20的比例加入80～90℃的纯化水，至于80～90℃水浴锅中提取30分钟，趁热将提取液滤出，滤渣中加入等量的热水，重复该提取步骤2～3次，合并所有的滤液，加入到发酵培养基中后，用水定容至3L，118℃灭菌15min。
对比例9
步骤1、3同实施例1，步骤2中莓茶处理方式改为酶解后水提，具体如下：称量所需用量的莓茶粉，按1：10-20的比例加入纯化水，按1％～2％比例加入纤维素酶，至于40～50℃水浴锅中酶解2小时，将酶解液加入到发酵培养基中后，用水定容至3L，118℃灭菌15min。
对实施例1和对比例8-9得到的发酵液进行功效和活性物含量检测，结果如表4所示，由表4可看出，莓茶经水提和酶解处理后，抗氧化和美白功效差异不明显，总酚和总黄酮等活性物含量略有降低，可见莓茶粉直接添加进培养基中即可很好的发挥其功效，水提和酶解处理后发酵液的功效反而略有下降。
表4不同莓茶处理方式发酵后功效及活性物含量检测
为进一步验证以上的实验结论，探究在工业生产领域的可行性，又在发酵罐中进行了发酵条件优化。
实施例2
实施例2的莓茶乳酸菌双向发酵液的发酵工艺如下：
1、菌种活化
取一支副干酪乳杆菌菌种接种入菌种活化培养基中，34-37℃密闭静置培养1-2天，获得活化菌种。
菌种活化培养基配方为：蛋白胨12g/L、牛肉浸膏9g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖15g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温801g/L，pH自然，配制体积为40ml，118℃灭菌15min。
2、种子培养
将活化菌种按3％-6％体积比接种到种子培养基，34-37℃密闭静置培养1天，获得发酵种子液。
种子培养基配方为：蛋白胨10g/L、牛肉浸膏8g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖15g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1g/L，pH自然，配制体积为150ml，118℃灭菌15min。
3、发酵培养
将步骤2中的种子液按照3％-6％比例接入发酵罐内的发酵培养基中，发酵温度为34-38℃，罐压0.02-0.05MPa，搅拌50-80rpm，pH自然，密闭发酵2天，得到实施例2的莓茶乳酸菌双向发酵液。
发酵培养基配方为：取莓茶适量，粉碎后过20-50目筛，过筛后的莓茶粉按质量体积比0.5％比例加入3L配好的发酵培养基中，配方为蛋白胨10g/L、牛肉浸膏9g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.25g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1g/L，pH调节至5.7，118℃灭菌15min。
4、制备滤液
步骤3中得到的发酵液8500rpm离心15min，取上清，过0.22微米滤膜除菌后得发酵滤液。
对实施例2所得发酵滤液进行功效检测，结果如表5所示，所述发酵罐培养工艺与实施例1摇瓶培养工艺相比，功效及活性物含量略有提升，表明该工艺具有较高的工业放大潜力。
表5发酵罐培养所得发酵滤液功效检测
| 检测项 | 检测结果 |
| DPPH清除率(稀释20倍) | 96.24％ |
| ABTS清除率(稀释20倍) | 99.35％ |
| T-AOC(μmol/mL) | 15.83 |
| 酪氨酸酶抑制率 | 99.75％ |
| 总黄酮(μg/mL) | 437.53 |
| 总酚(μg/mL) | 912.35 |
综上所述，莓茶具有优秀的抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力，利用乳酸菌进行双向发酵后，能够赋予双向发酵液十分优异的抗氧化和酪氨酸酶抑制能力，可以作为功效成分加入到化妆品配方中，具有十分巨大的应用潜力。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本申请的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本申请的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
Claims (10)
1.一种中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺，其特征在于，包括：将乳酸菌接种在包含中药的发酵培养基中进行发酵培养，得到所述中药乳酸菌双向发酵液；所述中药在所述发酵培养基中的添加质量体积比为0.1％-2.0％。
2.根据权利要求1所述的中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺，其特征在于，所述中药选自：莓茶、甘草、油茶、奇亚籽和五味子中的任一种。
3.根据权利要求2所述的中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺，其特征在于，所述中药为莓茶，所述莓茶为莓茶粉，所述莓茶粉的目数为20-50目。
4.根据权利要求1所述的中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺，其特征在于，所述乳酸菌的接种体积为所述发酵培养基体积的3％-6％。
5.根据权利要求1所述的中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺，其特征在于，所述发酵培养的发酵温度为34-38℃，发酵时间为1-4天。
6.根据权利要求1所述的中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺，其特征在于，所述发酵培养基还包括：蛋白胨10g/L、牛肉浸膏8g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1g/L，pH调节至5.7。
7.根据权利要求1所述的中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺，其特征在于，所述乳酸菌经活化培养后接种在所述发酵培养基中，所述活化培养的培养基为：蛋白胨12g/L、牛肉浸膏9g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖15g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1g/L，自然pH。
8.一种中药乳酸菌双向发酵液，其特征在于，由权利要求1至7任一项所述的中药乳酸菌双向发酵液的发酵工艺发酵制备得到；
优选地，所述中药乳酸菌双向发酵液为莓茶乳酸菌双向发酵液；
更优选地，所述莓茶乳酸菌双向发酵液的莓茶粉的添加质量体积比为0.5％，其总黄酮含量为400～500μg/mL；总酚含量为800～1000μg/mL；DPPH清除率为95％～97％；ABTS清除率为95％～99.9％；T-AOC为15～20μmol/mL；酪氨酸酶抑制率为98％～99.9％。
9.权利要求8所述的中药乳酸菌双向发酵液在制备化妆品中的应用。
10.一种化妆品，其特征在于，其原料包括权利要求8所述的中药乳酸菌双向发酵液。
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