CN115287214B - 一种复合微生物、复合微生物菌剂和应用 - Google Patents

一种复合微生物、复合微生物菌剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种复合微生物、复合微生物菌剂和应用，属于生防菌剂技术领域，包括摩加夫芽孢杆菌SYP006、贝莱斯芽孢杆菌SYP033、枯草芽孢杆菌SYP092、嗜盐芽孢杆菌SYP202和枯草芽孢杆菌SYP400。采用本发明提供的复合微生物能够促进辣椒、百合和枸杞的生长，提高产量，还能够降低土壤中的盐碱含量。

Description

一种复合微生物、复合微生物菌剂和应用
技术领域
本发明属于生防菌剂技术领域，尤其涉及一种复合微生物、复合微生物菌剂和应用。
背景技术
世界上最早推出的微生物菌剂为德国的一种具有固氮功能的根瘤菌制剂，之后美国等国家也开始了根瘤菌制剂的研发，迄今为止，根瘤菌肥仍是研究热点。从此之后，以微生物微生菌剂为主的生物防治技术研究领域拓宽，加拿大研制出了根瘤菌+PGPR复合菌肥抑制土传病害病害的发生。我国在60年代亦研发了代号为“5406”的菌剂，其具有促生、抗病等多种功能，在70年代，根瘤菌则为我国的农业生产起到了极大的促进作用，在80年代则相继推广了硅酸盐菌剂、固氮菌、PGPR等。随后，微生物菌剂的品种随着微生物的研究和发展逐渐增多，我国的微生物肥料研究基本已形成规模，菌种类型在不断地丰富中。
微生物菌剂是一种通过人工发酵生产而来的微生物接种剂，其中包含一种或多种优势功能菌株，是一种对土壤和植物既均有益生物肥料或防病制剂。微生物作为土壤环境中重要而活跃的一部分，被称为生态***稳定的“调节器”、土壤养分循环的“转换器”、环境污染物的“净化器”。如果土壤中有益微生物丧失，土壤就丧失生机，从而丧失生产能力。在十九世纪中后期，我国微生物菌剂研究发展迅速，80年代以单一营养菌如根瘤菌、固氮菌等为主，主要利用微生物活性提高土壤营养元素，尤其是土壤氮素含量；90年代以多种营养菌特性研究为主，将单一营养菌复合成“养分互补型”菌剂，提升植物对于土壤养分和肥料的利用效率；21世纪以来，以研究现代生物技术方法和手段为主，实现微生物菌剂在植物营养、生长调理和土壤生物修复等三效合一的作用。
我国西北地区土壤盐碱化问题普遍存在，土壤发生盐渍化现象后理化性质变差，肥力下降，缺少植物生长所必须的氮、磷等元素，导致大多数植物无法正常生长，根腐病等土传病害将进一步加剧和易发。耐盐碱微生物营养需求简单、能在高盐高pH值环境中生长，部分耐盐碱微生物在其生命过程中参与碳酸盐合成与溶解过程，同时可通过代谢活动分泌可促进植物生长的物质。微生物改良盐碱土的方法因其经济高效、节省能源、效果稳定等优点，在改良土壤的同时促进植物生长，提升土壤肥力，增强植物耐盐碱能力。
目前，我国西北地区对于微生物土壤改良剂的研究总体状况是：室内实验室研究较多、大田有效应用较少，引进菌剂较多、拥有自主知识产权的土著菌剂较少的状态。而针对我国西北各地特殊的地理环境及气候条件，引进菌剂作用效果不明显，加之土传病害发生严重，使得能改良盐碱土和防病促生作用的复合微生物菌剂的研发迫在眉睫。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种复合微生物、复合微生物菌剂和应用，本发明提供的复合微生物具有防治植物土传病害、促进作物生长，同时达到改良盐碱土质的作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种复合微生物，包括摩加夫芽孢杆菌SYP006(Bacillusmojavensis)、贝莱斯芽孢杆菌SYP033(Bacillus velezensis)、枯草芽孢杆菌SYP092(Bacillussubtilis)、嗜盐芽孢杆菌SYP202(Bacillus halotolerans)和枯草芽孢杆菌SYP400(Bacillus subtilis)；
所述摩加夫芽孢杆菌SYP006与贝莱斯芽孢杆菌SYP033、枯草芽孢杆菌SYP092、嗜盐芽孢杆菌SYP202和枯草芽孢杆菌SYP400以种子液形式接种于发酵培养基中，所述摩加夫芽孢杆菌SYP006种子液与贝莱斯芽孢杆菌SYP033种子液、枯草芽孢杆菌SYP092种子液、嗜盐芽孢杆菌SYP202种子液和枯草芽孢杆菌SYP400种子液的接种量体积比为4:2:3:1:4；
所述摩加夫芽孢杆菌SYP006种子液、贝莱斯芽孢杆菌SYP033种子液、枯草芽孢杆菌SYP092种子液、嗜盐芽孢杆菌SYP202种子液和枯草芽孢杆菌SYP400种子液的菌含量分别为108CFU/mL；
所述摩加夫芽孢杆菌SYP006保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM 2022354；
所述贝莱斯芽孢杆菌SYP033保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM 2022355；
所述枯草芽孢杆菌SYP092保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2022356；
所述嗜盐芽孢杆菌SYP202保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2022358；
所述枯草芽孢杆菌SYP400保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2022357。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物在防治植物病害中的应用。
优选的，所述植物病害包括辣椒根腐病、百合枯萎病和枸杞根腐病中的一种或几种。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物在促进植物生长中的应用。
优选的，所述植物包括辣椒、百合和枸杞中一种或几种。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物在作物增产中的应用。
优选的，所述作物包括辣椒、百合和枸杞中的一种或多种。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物在降低土壤中盐碱含量中的应用。
本发明还提供了一种复合微生物菌剂，其特征在于，包括上述技术方案所述的复合微生物、吐温80、尼泊金甲酯和羧甲基纤维素钠。
优选的，所述复合微生物菌剂中复合微生物有效活菌数≥10亿/mL。
本发明的有益效果为：
采用本发明提供的复合微生物能够提高辣椒和枸杞的产量，而且还能够促进辣椒、百合和枸杞的生长，也能够降低土壤中的盐碱含量。
附图说明
图1为复合微生物的***发育树，括号里大写字母加数字的代号为在GenBank中的登录号，上标“T”表示该菌株为模式种；
图2为辣椒根腐病试验采取大区设计的排列图；
图3为百合枯萎病试验采取大区设计的排列图；
图4为枸杞根腐病试验采取大区设计的排列图。
保藏说明
摩加夫芽孢杆菌SYP006，拉丁文为Bacillus mojavensis，于2022年3月31日保存于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2022354；
贝莱斯芽孢杆菌SYP033，拉丁文为Bacillus velezensis，于2022年3月31日保存于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2022355；
枯草芽孢杆菌SYP092，拉丁文为Bacillus subtilis，于2022年3月31日保存于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2022356；
嗜盐芽孢杆菌SYP202，拉丁文为Bacillus halotolerans，于2022年3月31日保存于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2022358；
枯草芽孢杆菌SYP400，拉丁文为Bacillus subtilis，于2022年3月31日保存于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2022357。
具体实施方式
本发明提供了一种复合微生物，包括摩加夫芽孢杆菌SYP006(Bacillusmojavensis)、贝莱斯芽孢杆菌SYP033(Bacillus velezensis)、枯草芽孢杆菌SYP092(Bacillussubtilis)、嗜盐芽孢杆菌SYP202(Bacillus halotolerans)和枯草芽孢杆菌SYP400(Bacillus subtilis)；所述摩加夫芽孢杆菌SYP006与贝莱斯芽孢杆菌SYP033、枯草芽孢杆菌SYP092、嗜盐芽孢杆菌SYP202和枯草芽孢杆菌SYP400以种子液形式接种于发酵培养基中，所述摩加夫芽孢杆菌SYP006种子液与贝莱斯芽孢杆菌SYP033种子液、枯草芽孢杆菌SYP092种子液、嗜盐芽孢杆菌SYP202种子液和枯草芽孢杆菌SYP400种子液的接种量体积比为4:2:3:1:4；所述摩加夫芽孢杆菌SYP006种子液、贝莱斯芽孢杆菌SYP033种子液、枯草芽孢杆菌SYP092种子液、嗜盐芽孢杆菌SYP202种子液和枯草芽孢杆菌SYP400种子液的菌含量分别为108CFU/mL。
在本发明中，所述摩加夫芽孢杆菌SYP006具有溶磷、固氮、解钾、抑菌作用，且以固氮性能最优。在本发明中，所述摩加夫芽孢杆菌SYP006抑制尖镰孢(Fusarium oxysporum)、茄镰孢(Fusarium solani)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和腐霉(Pythium spp.)。本发明将所述摩加夫芽孢杆菌SYP006的基因序列提交至GenBank，登录号为ON241443。
在本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌SYP033具有溶无机磷、固氮、解钾、抑菌作用，且以抑菌能力最优。在本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌SYP033抑制尖镰孢(Fusariumoxysporum)、茄镰孢(Fusarium solani)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和腐霉(Pythium spp.)。本发明将所述贝莱斯芽孢杆菌SYP033的基因序列提交至GenBank，登录号为ON241444。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌SYP092具有溶磷作用，且以溶无机磷功能特性最优。本发明将所述枯草芽孢杆菌SYP092的基因序列提交至GenBank，登录号为ON241445。
在本发明中，所述嗜盐芽孢杆菌SYP202具有溶无机磷、固氮、解钾、抑菌作用，且以抑菌性能较优。在本发明中，所述嗜盐芽孢杆菌SYP202抑制尖镰孢(Fusarium oxysporum)、茄镰孢(Fusarium solani)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和腐霉(Pythium spp.)。本发明将所述嗜盐芽孢杆菌SYP202的基因序列提交至GenBank，登录号为ON241446。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌SYP400具有溶磷、固氮、解钾、抑菌作用，且以溶有机磷能力最优。在本发明中，所述枯草芽孢杆菌SYP400抑制尖镰孢(Fusarium oxysporum)、茄镰孢(Fusarium solani)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和腐霉(Pythium spp.)。本发明将所述枯草芽孢杆菌SYP400的基因序列提交至GenBank，登录号为ON241447。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物在防治植物病害中的应用。在本发明中，所述植物病害优选包括辣椒根腐病、百合枯萎病和枸杞根腐病中的一种或几种。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物在促进植物生长中的应用。在本发明中，所述植物优选包括辣椒、百合和枸杞中一种或几种。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物在作物增产中的应用。在本发明中，所述作物优选包括辣椒、百合和枸杞中的一种或多种。
本发明还提供了上述技术方案所述的复合微生物在降低土壤中盐碱含量中的应用。
本发明还提供了一种复合微生物菌剂，包括上述技术方案所述的复合微生物、吐温80、尼泊金甲酯和羧甲基纤维素钠。
在本发明中，所述复合微生物发酵液有效活菌数≥10亿/mL。在本发明中，所述吐温80的质量百分含量优选为1％，所述吐温80作为表面活性剂；所述尼泊金甲酯的质量百分含量优选为0.5％，作为防腐剂；所述羧甲基纤维素钠的质量百分含量优选为1％，作为稳定剂。
在本发明中，所述复合微生物菌剂的制备方法优选包括：将上述技术方案所述的复合微生物各菌种按优化比例接种于发酵培养基发酵，得到发酵液，将所述发酵液与吐温80、尼泊金甲酯、羧甲基纤维素钠混合，得到复合微生物菌剂。在本发明中，所述发酵委托发酵公司按照常规发酵方法即可。
在本发明中，当所述微生物菌剂用于辣椒时，所述微生物菌剂的使用量优选为2～12L/亩。本发明优选将所述微生物菌剂对辣椒进行灌根，灌根次数优选为1次。
在本发明中，当所述微生物菌剂用于百合时，将所述微生物菌剂与百合种球进行拌种，所述微生物菌剂的体积与百合种球的质量比优选为2～12L:350kg。本发明优选将所述微生物菌剂经水稀释后再拌种。
在本发明中，当所述微生物菌剂用于枸杞时，在枸杞萌芽前进行灌根，亩用量优选为5～15L，本发明优选将所述微生物菌剂用水稀释后再进行灌根，4～5L/株。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
复合微生物及其功能特性：
该菌剂由SYP006(摩加夫芽孢杆菌Bacillus mojavensis)、SYP033(贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis)、SYP092(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)、SYP202(嗜盐芽孢杆菌Bacillus halotolerans)、SYP400(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)组成。
其中：
SYP006具有溶磷、固氮、解钾、抑菌作用，且以固氮性能最优。在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M 2022354。
SYP033具有溶无机磷、固氮、解钾、抑菌作用，且以抑菌能力最优。在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M 2022355。
SYP092具有溶磷作用，且以溶无机磷功能特性最优。在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M 2022356。
SYP202具有溶无机磷、固氮、解钾、抑菌作用，且以抑菌性能较优。在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M 2022358。
SYP400具有溶磷、固氮、解钾、抑菌作用，且以溶有机磷能力最优。在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M 2022357。
以上各菌株均具有良好的耐盐碱能力。其具体特性值如表1所示：
表1各菌株特性
Figure GDA0003814504700000071
注：表中“/”表示该菌株不具备该项功能；尖镰孢(Fusarium oxysporum)、茄镰孢(Fusarium solani)、腐霉(Pythiumspp.)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)为常见的土传病害病原。
其中，溶磷量的测定采用钼锑抗比色法进行，具体为：将各菌株活化后接入于液体LB培养基中(装液量：50mL/150mL三角瓶)，30℃、150r/min摇床培养36h～48h后，取1mL浓度为108CFU/mL的菌液接入PKO无机磷、蒙金娜有机磷培养液中，每菌株3重复，以不接菌的培养液为对照，30℃、150r/min摇床培养10d后，采用钼锑抗比色法测定磷含量。
固氮量的测定采用凯氏定氮法进行，具体为：将菌株在LB平板上活化后，接种于液体LB培养基中(装液量：50mL/150mL三角瓶)，30℃、150r/min摇床培养36h～48h后，取1mL浓度为108CFU/mL的菌液接入液体NFM培养液中，每菌株3重复，以不接菌的培养液为对照，30℃、160r/min培养7d后，采用凯氏定氮法测定各培养液的氮含量。
解钾量的测定采用火焰原子吸收光谱法，具体为：将菌株在LB平板上活化后，接种于液体LB培养基中(装液量：50mL/150mL三角瓶)，30℃、150r/min摇床培养36h～48h后，取1mL浓度为108CFU/mL的菌液接入液体钾长石培养液中，每菌株3重复，以不接菌的培养液为对照，30℃、160r/min培养7d后，采用火焰原子吸收光谱法测定各培养液中水溶性钾的含量。
抑菌率的测定与许世洋等(2022，微生物学报)方法相同，具体为：将菌株在LB平板上活化后，接入液体LB培养基中(装液量50mL/150mL三角瓶)，30℃、150r/min摇床培养3d后，将发酵液装入10mL离心管中，10000×g离心10min，取上清用0.22μm的微孔滤膜过滤约1mL滤液于PDA平板上，涂布均匀后，接入供试病原，以未涂布发酵液的平板上接种病原菌为对照，每处理3重复，于25℃下恒温培养5d后，测量病原菌直径，计算生长抑制率。生长抑制率(％)＝(对照平板病原菌菌落直径–带毒平板病原菌菌落直径)/(对照平板菌落直径–接入菌饼直径)×100％。
耐盐碱能力的测定则是将菌株再LB平板上活化后，接入不同盐(NaCl)浓度(5％、6％、7％、8％、9％、10％)及不同pH(8、9、10、11、12)液体LB培养基中(装液量50mL/150mL三角瓶)，每菌株3重复，以接入正常液体LB培养基的为对照，30℃、150r/min摇床培养48h后，检测其浓度是否达到108CFU/mL，同时采用酸度计法测定其pH，并取1mL浓度为108CFU/mL的菌液接入PKO无机磷、蒙金娜有机磷、NFM、钾长石培养液中，按上述方法测定其溶磷、固氮及解钾能力是否有变化，同时按照上述方法测定其抑菌能力是否有变化。
表1中所述耐盐能力的盐浓度是指经耐盐能力测定后，其浓度及各项能力均未受到影响的浓度，若某项能力(溶磷、解钾、固氮及抑菌)受到影响(降低)，且差异显著(P<0.05)则本研究判定其不耐受该盐浓度；所述pH为各pH下培养特定时间后浓度达标后测定的实时pH，且在此pH下其各项能力均未受到影响(P<0.05)。
上述方法中所述LB培养基(Luria-Bertani培养基)配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL，pH 7.4。Pikovaskaia’s(PKO)无机磷培养基配方为：葡萄糖10.0g，Ca3(PO4)23.0g，NaCl 0.2g，(NH4)2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1g，KCl0.2g，MnSO4·4H2O 0.03g，FeSO4·7H2O 0.003g，酵母粉0.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH6.8～7.2。蒙金娜有机磷培养基配方为：葡萄糖10.0g，卵磷脂0.2g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，(NH4)2SO40.5 g，MnSO4·4H2O 0.03g，FeSO4·7H2O 0.03g，酵母粉0.4g，CaCO35.0 g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 6.8～7.2。NFM培养基(nitrogen free medium，NFM)配方为：CaCl2·2H2O 0.02g，MgSO4·7H2O0.2g，K2HPO40.5 g，NaMoO4·2H2O 0.002g，NaCl 0.1g，苹果酸5.0g，生物素10μg，0.5％溴百里酚蓝5mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。钾长石培养基配方为：蔗糖5g，葡萄糖5g，(NH4)2SO40.5 g，酵母粉0.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，磷酸氢二钠2g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·7H2O 0.03g，钾长石2g，琼脂粉18g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。PDA培养基(PotatoDextroseAgar)配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH自然。
所述平板为配方中加有琼脂的固体培养基，所述培养液为未加琼脂的液体培养基。
对各菌株利用gyrA基因进行进行分子鉴定，如图1所示，构建***发育树发现，SYP006与Bacillus mojavensis的遗传距离为0，1000次重复自展支持率98，鉴定为摩加夫芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)，其序列提交至GenBank的登录号为ON241443；SYP033与Bacillus velezensis的遗传距离为0，1000次重复自展支持率99，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，其序列提交至GenBank的登录号为ON2414434；SYP092和SYP400与Bacillus subtilis模式种NRRL B-23978(AY663697.1)的遗传距离为小于0.01，1000次重复自展支持率为100，鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，其序列提交至GenBank的登录号分别为ON2414435和ON2414437；SYP202与Bacillus halotolerans的遗传距离为0，1000次重复自展支持率为99，鉴定为嗜盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans)，其序列提交至GenBank的登录号为ON2414436。
上述菌株分子鉴定采用DNA提取试剂盒(OMEGA)，按照其说明书步骤，提取各菌株的DNA，采用引物gyrA：
SEQ ID No.1：42F(5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′)
SEQ ID No.2：1066R(5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′)对其进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为(20μL):10μL扩增mix，PCR引物各1.0μL，模板DNA2.0μL，无菌双蒸水6μL。PCR反应程序为：95℃5min，94℃30s，55℃45s，72℃1min，35个循环，72℃7min。1％琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。最后所获得的序列在GenBank基因库进行BLAST同源性比对，并用MEGA7.0中的UPGMA方法构建***发育树，Bootstrap 1000重复检验其可信度。
实施例2
复合微生物最佳接种比例优化：
由于菌株间存在协同或拮抗作用，在复合发酵前通过简单的平板十字划线法确定其之间无拮抗作用后，设置不同的接种量(2％、4％、6％、8％)将各菌株进行混合发酵，但其协同效果未知，因此本发明通过测定混合发酵液的其各项能力(溶磷、固氮、解钾及抑菌)来确定最优组合处理。具体通过正交设计确定各处理配比，如表2所示，设置L16(45)正交试验，将各菌株在LB平板活化后接种于液体LB培养基中(装液量：50mL/150mL三角瓶)，30℃、150r/min摇床培养36h～48h后，测定各菌株培养液浓度达到108CFU/mL后，按表2中各处理比例再次接入LB培养液中，混合发酵培养36h～48h后，测定发酵培养液浓度达到108CFU/mL后，接入PKO无机磷、蒙金娜有机磷、NFM、钾长石培养液，按照前述方法测定各处理的溶磷、固氮、解钾能力；同时按照前述方法测定各处理的抑菌率。结果如表3所示，最后采用Topsis综合分析各处理综合能力大小并进行排名。
表2各菌株最佳配比量实验设计
Figure GDA0003814504700000101
Figure GDA0003814504700000111
表3各处理特性
Figure GDA0003814504700000112
Figure GDA0003814504700000121
根据表3排名知，处理14的综合性能最优，Topsis综合分析的统计量为0.8631，则菌株SYP006:SYP033:SYP092:SYP202:SYP400最佳接种比例为4:2:3:1:4时其功效发挥最大。
实施例3
复合微生物菌剂及其制作方法：
将发酵形成的复合微生物(浓度≥10亿/mL)，按菌液体积比加入0.5％紫外保护剂山梨醇，1％表面活性剂吐温-80，0.5％防腐剂尼泊金甲酯及1％稳定剂羧甲基纤维素钠即制成液体菌剂，其中，山梨醇、吐温-80，尼泊金甲酯、羧甲基纤维素钠的纯度均需在工业纯及以上。
具体制备方法为：将菌株SYP006、SYP033、SYP092、SYP202、SYP400在LB平板上活化后接入LB培养液中，进行液体发酵，测定其浓度达到108CFU/mL后，按实施例2中得到的优化比例SYP006:SYP033:SYP092:SYP202:SYP400＝4:2:3:1:4混合形成种子液，委托发酵公司进行大规模发酵，发酵结束后将已灭菌的山梨醇、吐温-80，尼泊金甲酯、羧甲基纤维素钠溶解灭菌后按上述比例加入到发酵液中，混合稳定48h后，测定其浓度达到国家标准GB20287-2006中农用微生物菌剂产品的技术指标，形成液体菌剂，暂定名为“土微微4号”。
实施例4
于2021年，将实施例3制备的“土微微4号”应用于辣椒根腐病防治方面，其效果如下：
用于防治辣椒根腐病田间试验报告
1试验目的
通过试验，评价“土微微4号”对辣椒根腐病的防治效果、生长影响及最佳使用剂量和施用次数；为产品推广应用提供依据。
2试验条件
2.1试验对象、作物和品种的选择
试验对象：辣椒根腐病。
试验作物：辣椒，品种螺丝椒。
2.2环境条件
试验设在甘肃省兰州市安宁区农科院植保所试验地，势平坦，肥力中等，前茬为辣椒。试验田辣椒为垄作栽培，5月19日移栽，株行距为30厘米×30厘米，品字形定植。试验期间于5月19日、6月22日、7月28日、8月20日和9月7日浇水5次，其它田间管理按常规进行。
3试验设计和安排
3.1药(菌)剂
3.1.1试验药(菌)剂
土微微4号；
30％噁霉灵水剂(山东恒利达生物科技有限公司，市购)；
2亿/克枯草芽孢杆菌粉剂(寿光市绿士达生物工程有限公司，市购)。
3.1.2药(菌)剂用量与处理编号
表4供试药(菌)剂试验设计
Figure GDA0003814504700000131
Figure GDA0003814504700000141
3.2试验安排
3.2.1小区排列
该试验采取小区排列，排列图为图2：
3.2.2小区面积和重复
小区面积：宽1.0m，长10.0m，面积10m2；重复4次。
3.3施药(菌)方法
3.3.1使用方法
辣椒定植后于6月23日进行一次土微微4号灌根；7月28日进行第1次人工接菌(根腐病菌，浓度是8×106)4mL/株；9月6日进行了第2次人工接菌5mL/株。
3.3.2施药(菌)器械
水桶(25kg、20kg)、量杯(2000ml)、量筒(500ml)、烧杯(200ml)、电子天平。
3.3.3施药(菌)时间和次数
6月22日进行土微微4号灌根，共施药(菌)1次。
3.3.4使用容量
辣椒定植后，根据表4试验设计用量进行，第1次人工接菌(根腐病菌)按4mL/株；第2次人工接菌(根腐病菌)按5mL/株；用水200mL/株。
3.3.5防治其它病虫害的药剂资料
试验期间，于6月19日和6月28日各喷施86.2％氧化亚铜(铜大师)800倍液1次，再未用任何农药。
4调查、记录和测量方法
4.1调查时间和次数
辣椒定植并根施土微微4号后至收获末期，根据对照区发病情况，不定期调查并记录辣椒根腐病发病株数。
4.2调查方法
调查小区全部植株，并记录发病株数。具体调查方法参考GB/T17980.32-2000进行。
4.3防效计算方法
用下式计算发病率和防效。
发病株率(％)＝发病株数/调查总株数×100
防治效果(％)＝(1-CK0×PT1/CK1×PT0)×100
式中：CK0—空白对照区施药前发病株率；PT0—药剂处理区施药前发病株率；
CK1—空白对照区施药后发病株率；PT1—药剂处理区施药后发病株率；
4.3对作物的直接影响
据田间不定期观察，试验药剂各处理区植株生长正常，无任何不良影响，说明供试药剂在试验剂量范围内对辣椒安全。
4.4对作物产量的影响
结果期对试验田进行两次测产，合并计算。
5结果与分析
表5土微微4号防治辣椒根腐病试验结果
Figure GDA0003814504700000151
试验结果：土微微4号对辣椒安全，灌施1次后对根腐病具有一定的防治效果，除4.0L/亩处理外，其余防效在20.38-47.94％之间；之后田间辣椒根腐病再未观察到。测产结果表明灌施土微微4号对辣椒有增产作用，增产率在2.34-7.65％之间。土微微4号对根腐病的防效和增产率都有随施用量增加而提升的趋势。
实施例5
于2021年，将实施例1制备的“土微微4号”应用百合枯萎病防治方面，其效果如下：
用于防治百合枯萎病田间试验报告
1试验目的
通过试验，评价土微微4号对百合枯萎病的防治效果、生长影响及最佳使用剂量和施药(菌)次数；为产品推广应用提供依据。
2试验条件
2.1试验对象、作物和品种的选择
试验对象：百合枯萎病。
试验作物：兰州百合。
2.2环境条件
试验设在甘肃省兰州市榆中县马坡乡旧庄村，慢坡地，肥力中等，前茬为柴胡。试验田百合为露地直播，4月30日播种种球，株行距为20厘米×35厘米。其它田间管理按常规进行。
3试验设计和安排
3.1药(菌)剂
3.1.1试验药(菌)剂
土微微4号；
30％噁霉灵水剂(山东恒利达生物科技有限公司，市购)；
2亿/克枯草芽孢杆菌粉剂(寿光市绿士达生物工程有限公司，市购)。
3.1.2药剂用量与处理编号
表6供试药剂试验设计
Figure GDA0003814504700000161
Figure GDA0003814504700000171
3.2试验安排
该试验采取大区设计，长32m，宽6.5m，排列图如图3：
3.3施药(菌)方法
3.3.1使用方法
播种前，按种球常规用量350kg/亩、药(菌)剂按试验设计用量，药(菌)液量按2.5L/100kg稀释均匀后进行拌种。
3.3.2施药(菌)器械
量杯、量筒、电子天平、洒水壶。
3.3.3施药(菌)时间和次数
于播种前一天，4月29日进行拌种，施药(菌)一次。
3.3.4防治其它病虫害的药剂资料
试验期间未用任何农药。
4调查、记录和测量方法
4.1调查时间和次数
百合出苗后5月下旬到6月中上旬不定期调查，确定各处理出苗期；齐苗后调查各处理的出苗率1次；枯萎病显症后调查发病率2次，间隔30天；9月中下旬调查株高1次。
4.2调查方法
出苗率和发病率调查时，全区5点取样，每点100株样方，记缺苗数、发病株数。株高调查时3点取样，每点10株左右，测量记录株高。
4.3防效效计算方法
用下式计算发病率和防效：
发病株率(％)＝发病株数/调查总株数×100
防治效果(％)＝CK-PT/CK×100
式中：CK—空白对照区发病株率；PT—药剂处理区发病株率。
4.4对作物的直接影响
据田间不定期观察，试验药剂各处理区植株生长正常，无任何不良影响，说明供试药剂在试验剂量范围内对百合安全。
5结果与分析
表7土微微4号对百合枯萎病试验结果
Figure GDA0003814504700000181
试验结果：土微微4号对拌种对百合安全，出苗时间较为一致；出苗率2.0L/亩处理的的最低，为91.2％；4.0-12.0L/亩处理的在93.6％-96.8％之间，差异不显著。
枯萎病防效调查，第一次2.0、4.0和6.0L/亩处理的防效分别为79.10％、89.55％和98.51％，8.0-12.0L/亩处理的防效都达100.0％；两对照处理也达100.0％；6.0-12.0L/亩处理与两对照处理间防效差异不显著，但都优于其2.0和4.0L/亩处理。第二次调查的防效在54.48％-63.43％之间，各处理间防效差异不显著。
百合叶枯萎后株高调查结果表明，土微微4号10.0L/亩处理的株高最高为32.54cm，显著优于其余处理；其次为12.0L/亩处理的29.57cm，与两对照处理的28.63cm和27.80cm间的差异不显著，但都优于土微微4号2.0-8.0L/亩处理；最低为2.0L/亩处理的22.76cm。
实施例6
于2021年，将实施例1制备的“土微微4号”应用于枸杞根腐病防治方面，其效果如下：
用于防治枸杞根腐病田间试验示范报告
1试验目的
通过试验，评价土微微4号对枸杞根病的防治效果、生长影响及最佳使用剂量和对枸杞根围土壤盐碱含量影响情况；为产品推广应用提供依据。
2试验条件
2.1试验对象、作物和品种的选择
试验对象：枸杞根腐病。
试验作物：枸杞，品种为宁杞1号。
2.2环境条件
试验设在甘肃省白银市靖远县五合镇白茨林村，势平坦，肥力中等，枸杞树林10年，株行距为1.5米×2.0米。试验期间于5月6日、6月8日和7月11日浇水3次，其它田间管理按常规进行。
3试验设计和安排
3.1菌剂
3.1.1试验菌剂
土微微4号；
2亿/克枯草芽孢杆菌水分散粒剂(寿光市绿士达生物工程有限公司，市购)；
200亿/克枯草芽孢杆菌粉剂(江西盾牌化工有限责任公司，市购)。
3.1.2菌剂用量与处理编号
表8供试菌剂试验设计
Figure GDA0003814504700000201
3.2试验安排
该试验采取大区设计，面积1.0-1.5亩，排列图为图4：
3.3施菌方法
3.3.1使用方法
春季枸杞萌芽前于4月22日进行灌根，每株树周围离茎基部50cm左右选3点，用追肥枪***土壤中，每点停顿3-4秒，将药液灌入枸杞根部。
3.3.2施菌器械
拖拉机、水桶(1500kg)、追肥枪。
3.3.3施菌时间和次数
4月22日进行灌根，共施菌1次。
3.1.4使用容量
根据试验设计，枸杞萌芽前将试验菌剂按设计用量配制成菌液，按500kg/亩(每株4-5L/株)进行灌根。
3.3.5防治其它病虫害的药剂资料
试验期间，于5月12日、6月5日、6月30日和7月23日分别喷施杀虫剂啶虫脒、阿维菌素、吡虫啉和螺虫乙酯，再未喷施其它药剂。
4调查、记录和测量方法
4.1调查时间和次数
灌根时调查枸杞树的树冠、茎粗；枸杞采摘时分次(6-7次)测量记录产量；枸杞发病后7-8月调查记录根腐病1-2次；同时采集枸杞根围土壤样品，低温运输至实验室进行土壤盐碱含量测定；枸杞落叶后再次调查树冠、茎粗。
4.2调查方法
4.2.1树冠、茎粗和产量调查
根据地块性状避开边行，选择中间行，每处理根据行长调查1-3行，间隔1-2行。
4.2.2根腐病调查
每处理查全部植株的发病程度，并记录发病株数。根据树冠叶片黄化程度、数量，及落叶状况共分5级，具体调查方法如下：
0级：叶绿无黄叶；
1级：1-3个枝条叶片黄化或脱落；
2级：4-6个枝条叶片黄化或脱落；
3级：树冠6个以上枝条至1/2总枝条叶片黄化或脱落；
4级：1/2以上总枝条叶黄或脱落。
4.3防效计算方法
用下式计算发病率和防效：
发病指数(％)＝Σ(各级病株数×相对级数值)/调查总株数×4×100
防治效果(％)＝CK-PT/CK×100
式中：CK—空白对照区发病指数；PT—药剂处理区发病指数。
4.3对作物的直接影响
据田间不定期观察，试验菌剂各处理区植株生长正常，无任何不良影响，说明供试菌剂在试验剂量范围内对枸杞安全。
4.4对作物产量的影响
枸杞成熟后每处理选择1行(地块短的选两行)记录植株数，根据枸杞收获茬数对试验田枸杞进行了5茬收获，每茬记录鲜重产量，合并计算总产，再平均计算单株产量。
4.5对枸杞根围土壤盐碱含量的影响
分别于施菌前4月21日及施菌后8月26日采集枸杞根围土壤(0～20cm)，低温运输至实验室，采用重量法测定土壤中全盐量，pH计(PDS-3C)测定土壤pH。
5结果与分析
表9土微微4号对枸杞根腐病试验结果
Figure GDA0003814504700000221
试验结果：土微微4号对枸杞安全，灌施1次后对根腐病具有一定的防治效果，5.0kg/亩处理防效为37.39％，处理防效为56.11％，15.0kg/亩处理防效为36.71％；对照2亿CFU枯草芽孢杆菌水分散粒剂2.0kg/亩处理防效为38.01％；对照200亿解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂1.2kg/亩防效为40.93％.方差分析结果表明处理2(土微微4号10.0kg/亩)的防效显著优于其它处理；其余处理间防效差异不显著。
表10土微微4号对枸杞生长量的影响
Figure GDA0003814504700000222
试验结果(表10)：表中数据表明10年树龄的枸杞树的茎粗在年初和年末的变化几乎没有(1mm之内)，是否施用3号菌对10年树龄的枸杞树也没有影响。而冠幅的变化较大，施用土微微4号对枸杞树冠幅的增加在4.35％-8.58％；施用2亿/克枯草芽孢杆菌水分散粒剂2.0kg/亩处理较对照冠幅增加少了2.57％；200亿/克枯草芽孢杆菌粉剂1.2kg/亩处理较对照冠幅增加了19.84％。
表11土微微4号对枸杞产量的影响
Figure GDA0003814504700000231
试验结果(表11)：施用土微微4号能增加枸杞产量，施用土微微4号5kg/亩、10kg/亩和15kg/亩的株产量分别为4.41kg、5.18kg和3.90kg，较对照增产在65.54％-119.99％。2亿/克枯草芽孢杆菌水分散粒剂2.0kg/亩处理与200亿/克枯草芽孢杆菌粉剂1.2kg/亩处理增产率分别为67.55％和38.30％。
表12土微微4号对枸杞根围土壤盐碱含量的影响
Figure GDA0003814504700000232
Figure GDA0003814504700000241
试验结果(表12)：施用土微微4号后，土壤的全盐含量下降显著，尤其以土微微4号施用量为10kg/亩和15kg/亩时，全盐含量下降至3.94g/kg和3.87g/kg，pH下降至8.60和8.56。其中，全盐含量降幅最高达56.71％，较对照降幅高出45％左右，较对照菌剂降幅高出35％左右。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 甘肃省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种复合微生物、复合微生物菌剂和应用
<141> 2022-05-13
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cagtcaggaa atgcgtacgt cctt 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
caaggtaatg ctccaggcat tgct 24

Claims (10)

1.一种复合微生物，其特征在于，包括摩加夫芽孢杆菌SYP006(Bacillusmojavensis)、贝莱斯芽孢杆菌SYP033(Bacillus velezensis)、枯草芽孢杆菌SYP092(Bacillussubtilis)、嗜盐芽孢杆菌SYP202(Bacillus halotolerans)和枯草芽孢杆菌SYP400(Bacillus subtilis)；
所述摩加夫芽孢杆菌SYP006与贝莱斯芽孢杆菌SYP033、枯草芽孢杆菌SYP092、嗜盐芽孢杆菌SYP202和枯草芽孢杆菌SYP400以种子液形式接种于发酵培养基中，所述摩加夫芽孢杆菌SYP006种子液与贝莱斯芽孢杆菌SYP033种子液、枯草芽孢杆菌SYP092种子液、嗜盐芽孢杆菌SYP202种子液和枯草芽孢杆菌SYP400种子液的接种量体积比为4:2:3:1:4；
所述摩加夫芽孢杆菌SYP006种子液、贝莱斯芽孢杆菌SYP033种子液、枯草芽孢杆菌SYP092种子液、嗜盐芽孢杆菌SYP202种子液和枯草芽孢杆菌SYP400种子液的菌含量分别为108CFU/mL；
所述摩加夫芽孢杆菌SYP006保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2022354；
所述贝莱斯芽孢杆菌SYP033保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2022355；
所述枯草芽孢杆菌SYP092保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2022356；
所述嗜盐芽孢杆菌SYP202保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2022358；
所述枯草芽孢杆菌SYP400保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2022357。
2.权利要求1所述的复合微生物在防治植物病害中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物病害包括辣椒根腐病、百合枯萎病和枸杞根腐病中的一种或几种。
4.权利要求1所述的复合微生物在促进植物生长中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物包括辣椒、百合和枸杞中一种或几种。
6.权利要求1所述的复合微生物在作物增产中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述作物包括辣椒、百合和枸杞中的一种或多种。
8.权利要求1所述的复合微生物在降低土壤中盐碱含量中的应用。
9.一种复合微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的复合微生物、吐温80、尼泊金甲酯和羧甲基纤维素钠。
10.根据权利要求9所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中复合微生物的有效活菌数≥10亿/mL。
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