CN107723258B - 防治烟草青枯病的复合菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及复合菌剂制备领域，尤其涉及一种防治烟草青枯病的复合菌剂及其制备方法，包括以下步骤：对原始菌种进行斜面培养、种子培养得到种子液，制备发酵培养基，在发酵培养基中对种子液进行混合培养，得到液体复合菌剂，该防治烟草青枯病的复合菌剂将八种微生物同罐混菌复合培养，各菌株互不拮抗，互生共存，防治烟草青枯病的效果好，对环境无污染，并且对烟苗的生产具有刺激作用，显著地改善了烟苗的农艺性状，有利于提高烟叶产量。
Description
技术领域
本发明涉及复合菌剂制备领域，尤其涉及一种防治烟草青枯病的复合菌剂及其制备方法。
背景技术
烟草青枯病是茄子科雷氏菌引起的一种世界性重大病害。该病又称烟瘟，是典型的维管束病害。近年来在我国南方烟区发生较重，严重时烟株发病率达20%—30%；烟农常用农用链霉素溶液浇灌烟株、可以推延青枯病的发病，但长期使用，会引起病害微生物产生抗药反应，造成二次污染，并且防效不理想。
发明内容
本发明的目的在于克服了当前的治疗烟草青枯病的药剂防效不理想，并且长期使用产生抗药反应，造成二次污染的问题，而提供一种防治烟草青枯病的复合菌剂及其制备方法，该防治烟草青枯病的复合菌剂将八种微生物同罐混菌复合培养，各菌株互不拮抗，互生共存，防治烟草青枯病的效果好，对环境无污染，并且对烟苗的生产具有刺激作用，显著地改善了烟苗的农艺性状，有利于提高烟叶产量。
本发明是这样实现的：一种防治烟草青枯病的复合菌剂，由种子液和同罐发酵的发酵培养基制成，所述种子液由以下重量百分比的菌种组成：枯草芽孢杆菌22-28%、多黏芽孢杆菌2-8%、侧孢短芽胞杆菌12-18%、胶质芽孢杆菌22-28%、哈茨木霉2-8%、绿色木霉2-8%、光合菌12-18%和寡雄腐霉2-8%；所述发酵培养基由以下重量百分比的组分组成：糖蜜1.2-1.4%、葡萄糖0.7-0.9%、玉米淀粉1.5-1.7%、豆粕粉1.4-1.6%、硫酸镁0.02-0.04%、木醋酸1.4-1.6%、尿素0.11-0.13%、磷酸二氢钾0.03-0.05%、蛋白胨0.09-0.11%、酵母粉0.04-0.06%和余量的水。
上述的防治烟草青枯病的复合菌剂，由种子液和同罐发酵的发酵培养基制成，所述种子液由以下重量百分比的菌种组成：枯草芽孢杆菌25%、多黏芽孢杆菌5%、侧孢短芽胞杆菌15%、胶质芽孢杆菌25%、哈茨木霉5%、绿色木霉5%、光合菌15%和寡雄腐霉5%；所述发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：糖蜜1.2%、葡萄糖0.8%、玉米淀粉1.6%、豆粕粉1.5%、硫酸镁0.03%、木醋酸1.5%、尿素0.12%、磷酸二氢钾0.04%、蛋白胨0.1%、酵母粉0.05%和余量的水。
一种上述的防治烟草青枯病的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：对原始菌种进行斜面培养：将枯草芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、侧孢短芽胞杆菌、胶质芽孢杆菌分别接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，在28-32℃下培养2-3天，将哈茨木霉、寡雄腐霉、绿色木霉分别接种到PDA-葡萄糖琼脂培养基上，在28-30℃下培养3-4天，将光合菌接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，在32-35℃下培养3-5天；
步骤2：对步骤1得到的菌种进行种子培养：将步骤1得到的枯草芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、侧孢短芽胞杆菌、胶质芽孢杆菌分别接种到牛肉膏蛋白胨液体三角瓶培养基中，在28-32℃下培养2-4天，将步骤1得到的哈茨木霉、寡雄腐霉、绿色木霉分别接种到PDA-葡萄糖液体三角瓶培养基中，在28-30℃下培养3-4天，将步骤1得到的光合菌接种到光合细菌专用液体三角瓶培养基中，在32-35℃下培养3-7天；
步骤3：配制种子液：按照以下重量百分数称取步骤2得到的菌种：枯草芽孢杆菌22-28%、多黏芽孢杆菌2-8%、侧孢短芽胞杆菌12-18%、胶质芽孢杆菌22-28%、哈茨木霉2-8%、绿色木霉2-8%、光合菌12-18%、寡雄腐霉2-8%，混合均匀后得到种子液；
步骤4：对步骤3得到的种子液进行混合培养：包括以下步骤：
A: 制取发酵培养基：将发酵罐在80-100℃下烘干灭菌处理30-50min，然后按照以下重量百分比向发酵罐中置入原料：糖蜜1.2-1.4%、葡萄糖0.7-0.9%、玉米淀粉1.5-1.7%、豆粕粉1.4-1.6%、硫酸镁0.02-0.04%、木醋酸1.4-1.6%、尿素0.11-0.13%、磷酸二氢钾0.03-0.05%、蛋白胨0.09-0.11%、酵母粉0.04-0.06%和余量的水，再向发酵罐中滴入占发酵培养基总体积0.05-0.07%的微量元素营养液，在110-130℃环境下对发酵培养基进行灭菌处理30-90min，最后将发酵培养基冷却至25-35℃，备用；
B：接种种子液：在A步骤所得的发酵培养基中接种步骤3得到的种子液，保持温度25-35℃，转速160-200r/min，同时按照种子液：空气的体积比为1:0.8的比例通入纯净空气，对接种后的发酵培养基进行好氧培养24-36小时，控制光照为1800-2200LX，得到液体复合菌剂；
步骤5：制备固体粉剂：按照以下重量百分数称取原料：向步骤4得到的液体复合菌剂中加入固体基质，按照液体复合菌剂：固体基质为1：0.8的比例搅拌混匀，然后将混合物放入干燥室进行干燥至水分含量低于8%，再粉碎至粒径达1mm以下，得到固体粉状复合菌剂。
上述的防治烟草青枯病的复合菌剂的制备方法，所述固体基质为草炭粉、米糠、高岭土、灭菌有机肥、腐殖酸、白炭黑中的一种或几种。
本发明具有以下的优点：本发明的防治烟草青枯病的复合菌剂及其制备方法，将八种微生物同罐混菌复合培养，各菌株互不拮抗，互生共存，相辅相成，产品含菌量高，该菌剂能诱导烟草作物产生超氧歧化酶，在烟草受到病害、虫害、干旱、衰老等逆境时，产生自由基来提高烟草的抗逆性减轻病害，使其具有很好的防治烟草青枯病的效果，并且该菌剂对烟苗的生产具有刺激作用，显著地改善了烟苗的农艺性状，有利于提高烟叶产量，该菌剂无毒无害，使用后对环境无没有染，保证了环境安全环保，有利于烟草的绿色生产。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：一种防治烟草青枯病的复合菌剂，由种子液和同罐发酵的发酵培养基制成，所述种子液由以下重量百分比的菌种组成：枯草芽孢杆菌24%、多黏芽孢杆菌4%、侧孢短芽胞杆菌14%、胶质芽孢杆菌26%、哈茨木霉6%、绿色木霉6%、光合菌16%和寡雄腐霉4%，所述发酵培养基由以下重量百分比的组分组成：糖蜜1.2%、葡萄糖0.7%、玉米淀粉1.5%、豆粕粉1.4%、硫酸镁0.02%、木醋酸1.4%、尿素0.11%、磷酸二氢钾0.03%、蛋白胨0.09%、酵母粉0.04%和余量的水；
一种上述的防治烟草青枯病的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：对原始菌种进行斜面培养：将枯草芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、侧孢短芽胞杆菌、胶质芽孢杆菌分别接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，在28℃下培养2天，将哈茨木霉、寡雄腐霉、绿色木霉分别接种到PDA-葡萄糖琼脂培养基上，在28℃下培养3天，将光合菌接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，在32℃下培养3天；
步骤2：对步骤1得到的菌种进行种子培养：将步骤1得到的枯草芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、侧孢短芽胞杆菌、胶质芽孢杆菌分别接种到牛肉膏蛋白胨液体三角瓶培养基中，在28℃下培养2天，将步骤1得到的哈茨木霉、寡雄腐霉、绿色木霉分别接种到PDA-葡萄糖液体三角瓶培养基中，在28℃下培养3天，将步骤1得到的光合菌接种到光合细菌专用液体三角瓶培养基中，在32℃下培养3天；
步骤3：配制种子液：按照以下重量百分数称取步骤2得到的菌种：枯草芽孢杆菌24%、多黏芽孢杆菌4%、侧孢短芽胞杆菌14%、胶质芽孢杆菌26%、哈茨木霉6%、绿色木霉6%、光合菌16%、寡雄腐霉4%，混合均匀后得到种子液；
步骤4：对步骤3得到的种子液进行混合培养：包括以下步骤：
A: 制取发酵培养基：将发酵罐在80℃下烘干灭菌处理30min，然后按照以下重量百分数向发酵罐中置入原料：糖蜜1.2%、葡萄糖0.7%、玉米淀粉1.5%、豆粕粉1.4%、硫酸镁0.02%、木醋酸1.4%、尿素0.11%、磷酸二氢钾0.03%、蛋白胨0.09%、酵母粉0.04%和余量的水，再向发酵罐中滴入占发酵培养基总体积0.05%的微量元素营养液，在110℃环境下对发酵培养基进行灭菌处理30min，最后将发酵培养基冷却至25℃，备用；
B：接种种子液：在A步骤所得的发酵培养基中接种步骤3得到的种子液，保持温度25℃，转速160r/min，同时按照种子液：空气的体积比为1:0.8的比例通入纯净空气，对接种后的发酵培养基进行好氧培养24小时，控制光照为1800LX，得到液体复合菌剂；
步骤5：制备固体粉剂：按照以下重量百分数称取原料：向步骤4得到的液体复合菌剂中加入草炭粉，按照液体复合菌剂：草炭粉为1：0.8的比例搅拌混匀，然后将混合物放入干燥室进行干燥至水分含量低于8%，再粉碎至粒径达1mm以下，得到固体粉状复合菌剂。
实施例2：一种防治烟草青枯病的复合菌剂，由种子液和同罐发酵的发酵培养基制成，所述种子液由以下重量百分比的菌种组成：枯草芽孢杆菌26%、多黏芽孢杆菌6%、侧孢短芽胞杆菌16%、胶质芽孢杆菌24%、哈茨木霉4%、绿色木霉4%、光合菌14%和寡雄腐霉6%，所述发酵培养基由以下重量百分比的组分组成：糖蜜1.4%、葡萄糖0.9%、玉米淀粉1.7%、豆粕粉1.6%、硫酸镁0.04%、木醋酸1.6%、尿素0.13%、磷酸二氢钾0.05%、蛋白胨0.11%、酵母粉0.06%和余量的水；
一种上述的防治烟草青枯病的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：对原始菌种进行斜面培养：将枯草芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、侧孢短芽胞杆菌、胶质芽孢杆菌分别接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，在32℃下培养3天，将哈茨木霉、寡雄腐霉、绿色木霉分别接种到PDA-葡萄糖琼脂培养基上，在30℃下培养4天，将光合菌接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，在35℃下培养5天；
步骤2：对步骤1得到的菌种进行种子培养：将步骤1得到的枯草芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、侧孢短芽胞杆菌、胶质芽孢杆菌分别接种到牛肉膏蛋白胨液体三角瓶培养基中，在32℃下培养4天，将步骤1得到的哈茨木霉、寡雄腐霉、绿色木霉分别接种到PDA-葡萄糖液体三角瓶培养基中，在30℃下培养4天，将步骤1得到的光合菌接种到光合细菌专用液体三角瓶培养基中，在35℃下培养7天；
步骤3：配制种子液：按照以下重量百分数称取步骤2得到的菌种：枯草芽孢杆菌26%、多黏芽孢杆菌6%、侧孢短芽胞杆菌16%、胶质芽孢杆菌24%、哈茨木霉4%、绿色木霉4%、光合菌14%、寡雄腐霉6%，混合均匀后得到种子液；
步骤4：对步骤3得到的种子液进行混合培养：包括以下步骤：
A: 制取发酵培养基：将发酵罐在100℃下烘干灭菌处理50min，然后按照以下重量百分数向发酵罐中置入原料：糖蜜1.4%、葡萄糖0.9%、玉米淀粉1.7%、豆粕粉1.6%、硫酸镁0.04%、木醋酸1.6%、尿素0.13%、磷酸二氢钾0.05%、蛋白胨0.11%、酵母粉0.06%和余量的水，再向发酵罐中滴入占发酵培养基总体积0.07%的微量元素营养液，在130℃环境下对发酵培养基进行灭菌处理90min，最后将发酵培养基冷却至35℃，备用；
B：接种种子液：在A步骤所得的发酵培养基中接种步骤3得到的种子液，保持温度35℃，转速200r/min，同时按照种子液：空气的体积比为1:0.8的比例通入纯净空气，对接种后的发酵培养基进行好氧培养36小时，控制光照为2200LX，得到液体复合菌剂；
步骤5：制备固体粉剂：按照以下重量百分数称取原料：向步骤4得到的液体复合菌剂中加入固体基质，固体基质为米糠、高岭土、灭菌有机肥的混合物，按照液体复合菌剂：固体基质为1：0.8的比例搅拌混匀，然后将混合物放入干燥室进行干燥至水分含量低于8%，再粉碎至粒径达1mm以下，得到固体粉状复合菌剂。
实施例3：一种防治烟草青枯病的复合菌剂，由种子液和同罐发酵的发酵培养基制成，所述种子液由以下重量百分比的菌种组成：枯草芽孢杆菌25%、多黏芽孢杆菌5%、侧孢短芽胞杆菌15%、胶质芽孢杆菌25%、哈茨木霉5%、绿色木霉5%、光合菌15%和寡雄腐霉5%，所述发酵培养基由以下重量百分比的组分组成：糖蜜1.2%、葡萄糖0.8%、玉米淀粉1.6%、豆粕粉1.5%、硫酸镁0.03%、木醋酸1.5%、尿素0.12%、磷酸二氢钾0.04%、蛋白胨0.1%、酵母粉0.05%和余量的水；
一种上述的防治烟草青枯病的复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：对原始菌种进行斜面培养：将枯草芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、侧孢短芽胞杆菌、胶质芽孢杆菌分别接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，在30℃下培养3天，将哈茨木霉、寡雄腐霉、绿色木霉分别接种到PDA-葡萄糖琼脂培养基上，在29℃下培养3天，将光合菌接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，在33℃下培养4天；
步骤2：对步骤1得到的菌种进行种子培养：将步骤1得到的枯草芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、侧孢短芽胞杆菌、胶质芽孢杆菌分别接种到牛肉膏蛋白胨液体三角瓶培养基中，在30℃下培养3天，将步骤1得到的哈茨木霉、寡雄腐霉、绿色木霉分别接种到PDA-葡萄糖液体三角瓶培养基中，在29℃下培养3天，将步骤1得到的光合菌接种到光合细菌专用液体三角瓶培养基中，在33℃下培养4天；
步骤3：配制种子液：按照以下重量百分数称取步骤2得到的菌种：枯草芽孢杆菌25%、多黏芽孢杆菌5%、侧孢短芽胞杆菌15%、胶质芽孢杆菌25%、哈茨木霉5%、绿色木霉5%、光合菌15%和寡雄腐霉5%，混合均匀后得到种子液；
步骤4：对步骤3得到的种子液进行混合培养：包括以下步骤：
A: 制取发酵培养基：将发酵罐在80-100℃下烘干灭菌处理30-50min，然后按照以下重量百分数向发酵罐中置入原料：糖蜜1.2%、葡萄糖0.8%、玉米淀粉1.6%、豆粕粉1.5%、硫酸镁0.03%、木醋酸1.5%、尿素0.12%、磷酸二氢钾0.04%、蛋白胨0.1%、酵母粉0.05%和余量的水，再向发酵罐中滴入占发酵培养基总体积0.06%的微量元素营养液，在121℃环境下对发酵培养基进行灭菌处理30-90min，最后将发酵培养基冷却至32℃，备用；
B：接种种子液：在A步骤所得的发酵培养基中接种步骤3得到的种子液，保持温度32℃，转速180r/min，同时按照种子液：空气的体积比为1:0.8的比例通入纯净空气，对接种后的发酵培养基进行好氧培养30小时，控制光照为2000LX，得到液体复合菌剂；
步骤5：制备固体粉剂：按照以下重量百分数称取原料：向步骤4得到的液体复合菌剂中加入固体基质，固体基质为，按照液体复合菌剂：腐殖酸和白炭黑的混合物为1：0.8的比例搅拌混匀，然后将混合物放入干燥室进行干燥至水分含量低于8%，再粉碎至粒径达1mm以下，得到固体粉状复合菌剂。
关于本发明药剂对烟草青枯病的防治效果的试验
1. 试验对象：选择品种为“中烟100”的烟草。
2. 试验地点：选择在云南省文山州麻栗坡烟站进行试验，该地连年种植烟草，土壤为红壤土，中等肥力。
3. 供试药剂：
表1 供试药剂实验设计
| 药剂代码 | 试验药剂 | 稀释倍数 |
| A | 100亿CUF/g本发明的防治烟草青枯病复合菌剂的可湿性粉剂 | 500倍 |
| B | 72%农用链霉素可溶性粉剂 | 500倍 |
| C | 20%叶枯唑可湿性粉剂 | 400倍 |
| CK | 清水 | - |
4. 试验过程：
5月6日开始移栽烟苗，随机选择30个小区，每小区栽植烟草100株，5月20日第一次施药；团棵期6月8日第二次施药；6月28日第三次施药；施药方法采用灌根方法，每株200ml。
5. 调查内容及方法：
5.1药效调查：
烟株发病情况调查采用小区普查方式，以株为单位，在发病高峰期（7月25日）进行第一次调查，烟叶采收后期（8月19日）进行第二次调查，采用五点取样方法，每小区调查30株，按CB/232222008《烟草病虫害分级及调查方法》调查处理发病情况，并计算各处理病情指数与防效效果。试验数据采用DPS软件进行差分析处理。
烟草青枯病病情分级标准（以株为单位）：0级-全株无病；1级-颈部偶有褪绿斑，或病侧1/2以下叶片凋萎；3级-颈部有黑色条斑，但不超过1/2，或病侧1/2-2/3叶片凋萎；5级-颈部黑色条斑超过1/2，但未到达茎顶部，或病侧2/3以上叶片凋萎；7级-颈部黑色条斑达到茎顶部，或病株叶片全部凋萎；9级-病株基本枯死。
按下列公式计算防效：
5.2生理性状调查：
打顶后(7月18日)以株为单位，采用5点取样法，每小区调查10株，测量烟株的株高、茎围、节距、有效叶片数及叶片的长、宽值。
6. 试验结果与分析：
6.1药效结果与分析：
表2 不同药剂处理下对烟草青枯病的防治效果
药效试验结果如上表所示，第1次调查(7月25日)中，防治烟草青枯病效果最好的是100亿CUF/g本发明的防治烟草青枯病复合菌剂的可湿性粉剂，防治效果达到69.21%，其次为72%农用硫酸链霉素可溶性粉剂和20%叶枯唑粉剂，防效分别为45.14%、44.21%。第2次调查（8月19日)中，72%农用硫酸链霉素可溶性粉剂和20%叶枯唑粉剂防效分别达到67．94%、66．41%，两者差异不显著，而100亿CUF/g本发明的防治烟草青枯病复合菌剂的可湿性粉剂的防治效果升至8O．12%，显著高于72%农用硫酸链霉素可溶性粉剂和20%叶枯唑粉剂的防效。
6.2烟草农艺性状结果与分析：
表3 不同药剂处理下烟草农艺性状
烟草农艺性状的试验结果如上表所示，从农艺性状调查可知，100亿CUF/g本发明的防治烟草青枯病复合菌剂的可湿性粉剂处理区烟草的农艺性状，与其他处理及空白对照相比，在株高、茎围、叶的长、宽等都具有明显的优势；表明经100亿CUF/g本发明的防治烟草青枯病复合菌剂的可湿性粉剂处理后，能够显著促进烟草农艺性状的改善。
7. 试验结论：
3种药剂通过灌根法均对烟草青枯病有控制作用。其中100亿CUF/g本发明的防治烟草青枯病复合菌剂的可湿性粉剂对烟草青枯病的防治效果最好，第2次调查防效高达80.02%，并且对烟苗具有刺激生长的作用，显著地改善了烟苗的农艺性状，大大提高了烟叶产量。由于烟草青枯病初次侵染源以作物根际土壤为主，且病原菌直接进入寄主维管束为害，故药剂防治必须在烟草移栽后及时进行，并且灌根容量为100-300ml/株，连续3次以上，方可达到有效控制其为害的目标。同时，100亿CUF/g本发明的防治烟草青枯病复合菌剂的可湿性粉剂为生物制剂，其在使用后对环境安全，确保了烟草的绿色生产。
Claims (4)
1.一种防治烟草青枯病的复合菌剂，其特征在于：由种子液和同罐发酵的发酵培养基制成，所述种子液由以下重量百分比的菌种组成：枯草芽孢杆菌22-28%、多黏芽孢杆菌2-8%、侧孢短芽孢 杆菌12-18%、胶质芽孢杆菌22-28%、哈茨木霉2-8%、绿色木霉2-8%、光合菌12-18%和寡雄腐霉2-8%；所述发酵培养基由以下重量百分比的组分组成：糖蜜1.2-1.4%、葡萄糖0.7-0.9%、玉米淀粉1.5-1.7%、豆粕粉1.4-1.6%、硫酸镁0.02-0.04%、木醋酸1.4-1.6%、尿素0.11-0.13%、磷酸二氢钾0.03-0.05%、蛋白胨0.09-0.11%、酵母粉0.04-0.06%和余量的水。
2.根据权利要求1所述的防治烟草青枯病的复合菌剂，其特征在于：由种子液和同罐发酵的发酵培养基制成，所述种子液由以下重量百分比的菌种组成：枯草芽孢杆菌25%、多黏芽孢杆菌5%、侧孢短芽孢 杆菌15%、胶质芽孢杆菌25%、哈茨木霉5%、绿色木霉5%、光合菌15%和寡雄腐霉5%；所述发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：糖蜜1.2%、葡萄糖0.8%、玉米淀粉1.6%、豆粕粉1.5%、硫酸镁0.03%、木醋酸1.5%、尿素0.12%、磷酸二氢钾0.04%、蛋白胨0.1%、酵母粉0.05%和余量的水。
3.一种制备根据权利要求1所述的防治烟草青枯病的复合菌剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：对原始菌种进行斜面培养：将枯草芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、侧孢短芽孢 杆菌、胶质芽孢杆菌分别接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，在28-32℃下培养2-3天，将哈茨木霉、寡雄腐霉、绿色木霉分别接种到PDA-葡萄糖琼脂培养基上，在28-30℃下培养3-4天，将光合菌接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，在32-35℃下培养3-5天；
步骤2：对步骤1得到的菌种进行种子培养：将步骤1得到的枯草芽孢杆菌、多黏芽孢杆菌、侧孢短芽孢 杆菌、胶质芽孢杆菌分别接种到牛肉膏蛋白胨液体三角瓶培养基中，在28-32℃下培养2-4天，将步骤1得到的哈茨木霉、寡雄腐霉、绿色木霉分别接种到PDA-葡萄糖液体三角瓶培养基中，在28-30℃下培养3-4天，将步骤1得到的光合菌接种到光合细菌专用液体三角瓶培养基中，在32-35℃下培养3-7天；
步骤3：配制种子液：按照以下重量百分数称取步骤2得到的菌种：枯草芽孢杆菌22-28%、多黏芽孢杆菌2-8%、侧孢短芽孢 杆菌12-18%、胶质芽孢杆菌22-28%、哈茨木霉2-8%、绿色木霉2-8%、光合菌12-18%、寡雄腐霉2-8%，混合均匀后得到种子液；
步骤4：对步骤3得到的种子液进行混合培养：包括以下步骤：
A: 制取发酵培养基：将发酵罐在80-100℃下烘干灭菌处理30-50min，然后按照以下重量百分比向发酵罐中置入原料：糖蜜1.2-1.4%、葡萄糖0.7-0.9%、玉米淀粉1.5-1.7%、豆粕粉1.4-1.6%、硫酸镁0.02-0.04%、木醋酸1.4-1.6%、尿素0.11-0.13%、磷酸二氢钾0.03-0.05%、蛋白胨0.09-0.11%、酵母粉0.04-0.06%和余量的水，再向发酵罐中滴入占发酵培养基总体积0.05-0.07%的微量元素营养液，在110-130℃环境下对发酵培养基进行灭菌处理30-90min，最后将发酵培养基冷却至25-35℃，备用；
B：接种种子液：在A步骤所得的发酵培养基中接种步骤3得到的种子液，保持温度25-35℃，转速160-200r/min，同时按照种子液：空气的体积比为1:0.8的比例通入纯净空气，对接种后的发酵培养基进行好氧培养24-36小时，控制光照为1800-2200LX，得到液体复合菌剂；
步骤5：制备固体粉剂：按照以下重量百分数称取原料：向步骤4得到的液体复合菌剂中加入固体基质，按照液体复合菌剂：固体基质为1：0.8的比例搅拌混匀，然后将混合物放入干燥室进行干燥至水分含量低于8%，再粉碎至粒径达1mm以下，得到固体粉状复合菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备防治烟草青枯病的复合菌剂的方法，其特征在于：所述固体基质为草炭粉、米糠、高岭土、灭菌有机肥、腐殖酸、白炭黑中的一种或几种。
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