CN115280147A - 可紫外激发的基于聚芴的缀合物及其在分析物检测方法中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了可紫外激发的基于聚芴的缀合物及其在分析物检测方法中的用途。

Description

可紫外激发的基于聚芴的缀合物及其在分析物检测方法中的 用途
相关申请资料
本申请要求于2020年1月30日提交的美国临时申请第62/967,800号的优先权，所述美国临时申请出于所有目的据此通过引用并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及荧光聚合物缀合物及其分析物检测方法。
背景技术
荧光探针是用于分析和分离分子和细胞以及用于检测和量化其他材料的有价值的试剂。在最佳环境下，可以检测到极少量的荧光分子。Barak和Webb使用SIT相机使少于50种与细胞接收LDL相关的荧光脂质类似物可见，J.CELL BIOL.,90,595-604(1981)。可以使用流式细胞术检测少于10,000个与颗粒或某些细胞相关的荧光素分子(Muirhead,Horan和Poste,BIOTECHNOLOGY,3,337-356(1985))。应用荧光探针的一些具体实例是(1)通过荧光流式细胞术、荧光激活细胞分选和荧光显微镜检查的技术鉴定和分离细胞混合物中的细胞亚群；(2)在荧光免疫测定的技术中确定与第二种物质结合(例如，抗原-抗体反应)的物质的浓度；和(3)通过荧光染色的技术定位凝胶和其他不溶性支持物中的物质。Herzenberg等人，"CELLULAR IMMUNOLOGY"第3版，第22章；Blackwell Scientific Publications(1978)；和Goldman,"FLUORESCENCE ANTIBODY METHODS",Academic Press,New York,(1968)；和Taylor等人，APPLICATIONS OF FLUORESCENCE IN THE BIOMEDICAL SCIENCES,Alan LissInc.,(1986)描述了这些技术。
当将荧光聚合物用于上述目的时，对荧光聚合物的选择有许多限制。一种限制是荧光聚合物的吸收和发射特征，因为测试的样品(例如血液、尿液、脑脊液)中的许多配体、受体和材料会发荧光并干扰对荧光标记的荧光的精确确定。这种现象称为自发荧光或背景荧光。另一考虑因素是将荧光聚合物与配体和受体以及其他生物和非生物材料缀合的能力以及此类缀合对荧光聚合物的影响。在许多情形下，与另一分子的缀合可导致荧光聚合物的荧光特征的大幅变化，并且在一些情况下，大幅破坏或降低荧光聚合物的量子效率。也可能与荧光聚合物的缀合会使被标记的分子的功能失活。第三个考虑因素是荧光聚合物的量子效率，量子效率对于灵敏的检测而言应该是高的。第四个考虑因素是荧光聚合物的光吸收能力或消光系数，光吸收能力或消光系数也应该尽可能大。同样值得关注的是荧光分子在非常靠近时是否会相互作用，从而导致自淬灭。另一个关注的问题是荧光聚合物是否与其他化合物或容器壁非特异性结合，是自身结合，还是连同与荧光聚合物缀合的化合物一起结合。
以上所示方法的适用性和价值与合适的荧光化合物的可用性密切相关。具体而言，需要在紫外线范围内(例如355nm)具有强吸收并发射荧光，具有大的斯托克斯位移的荧光物质，因为这些荧光团的激发产生较少的自发荧光并且如果可以利用光谱的全部可见区和近红外区，则可以同时分析在不同波长发出荧光的多个发色团。近年来，紫色激光器(405nm)越来越多地安装在商业荧光仪器中，因为它比其他激光器(例如，488nm的氩激光器和633nm的He-Ne激光器)给出大得多的发射波长窗口，并且紫外激光器也开始被引入。
藻胆蛋白因其消光系数高和量子产率高而做出了重要贡献。这些含荧光团的蛋白可以共价联接到许多蛋白上，并用于显微镜检查和流式细胞术中的荧光抗体测定中。然而，藻胆蛋白具有一些限制其生物学应用的缺点，例如(1)藻胆蛋白相对复杂并且在高度稀释的溶液中易于解离；(2)它们极不稳定并且在光照下会很快褪色；以及(3)藻胆蛋白对紫外激发的吸收很弱。
明亮的荧光聚合物允许以高灵敏度检测或定位附着的材料。某些聚芴聚合物已展示了作为免疫学应用的标记试剂的效用，例如授予Gaylord等人的美国专利第8,158,444号；美国专利第8,455,613号；美国专利第8,354,239号；美国专利第8,362,193号；和美国专利第8,575,303号；还有授予Chiu等人的WO 2013/101902。聚芴聚合物的其他生物学应用已由Thomas III等人(Chem.Rev.2007,107,1339)；Zhu等人(Chem.Rev.2012,112,4687)和Zhu等人(Chem.Soc.Rev.,2011,40,3509)充分记录。然而，所有现有的水溶性聚芴聚合物都是基于未取代的芴，这是由于所需的关键中间体在商业上不可用。尚未做出努力探索经取代的芴聚合物的生物学应用。已知未取代的聚芴聚合物具有某些缺点，例如(1)现有的聚芴聚合物的发射波长接近可见波长的紫外边缘(400-800nm)；(2)现有的聚芴聚合物也具有非常强的自为聚集(即堆叠)倾向，自为聚集可以显著降低荧光量子产率，如Mishra等人,CHEM.REV.,100,1973(2000)中的广泛综述所述；和(3)现有的聚芴聚合物允许两个苯单元围绕中间单键自由旋转/振动，这会显著降低聚合物的线性度和平面性。这种现象被称为“松散带效应”，在由Nicholas J.Turro著作的“MODERN MOLECULAR PHOTOCHEMISTRY”，第5和6章，University Science Books,Sausalito,CA(1991)有描述。仍然需要可以用紫外光激发的具有改善的荧光特性的荧光聚合物。
发明内容
本发明解决了这一需要并且是基于这样的发现，即所谓的“松散带效应”可以通过两个苯环的交联而消除。已经令人惊讶地发现，基于刚性芴的聚合物出乎意料地产生了期望的生物学特性。这些聚合物缀合物具有(1)高的荧光量子产率；(2)红移发射；(3)高水溶性；(4)高线性度；(5)高平面性；(6)当第二种染料与聚合物偶联时，高的荧光共振能量转移(FRET)效率；和(7)高的光稳定性。
核心芴结构如下所示。
Figure BDA0003809650660000031
刚性桥接芴结构如下所示。
Figure BDA0003809650660000032
刚性桥接芴(A＝N-、P-、O＝P-、O＝P-O-、-C-、-Si-、-S-、O＝S-、O＝S(O)-)
本公开提供了一种聚合物，所述聚合物包含式A的单体单元
Figure BDA0003809650660000033
其中X是所述聚合物中式A的单体单元的数目，其中所述式A的单体单元是连续的或非连续的并且其中X为10至200，
和一个或多个式B的单体单元
Figure BDA0003809650660000041
其中Y是所述聚合物中式B的单体单元的数目，其中所述式B的单体单元是连续的或非连续的并且其中Y为0至100，
以及任选的一个或多个式C的单体单元
Figure BDA0003809650660000042
其中Z是所述聚合物中式C的单体单元的数目，其中所述式C的单体单元是连续的或非连续的并且其中Z为0至100，
其中A是O、S、N或C；
其中SG1、SG2、SG5、SG6、R1和R2独立地是氢、烷基、氨基、磺基、聚乙二醇(PEG)、水溶性基团、受体、接头(L)和/或经由接头缀合的生物底物(L-BS)；
其中SG3、SG4、R3和R4独立地是氢、卤素、氨基、PEG、接头(L)和/或经由接头缀合的生物底物(L-BS)；
其中所述聚合物末端独立地是氢、烷基、卤素、硼羰基、芳基、杂芳基基团或L-BS；
其中X与Y+Z的比率为0.3-1.0，并且
其中X+Y+Z的总和为15至50。
在示例性实施例中，芴并氧杂环庚三烯、芴并氮杂环庚三烯、芴并环庚烷是指在式A的单体单元的环中的“A”取代基位置处的O、N和C取代。
在一个实施例中，当Y以至少40％存在于聚合物中时，聚合物的紫外激发接近350nm。
在一些实施例中，式A、式B和式C的单体单元彼此直接连接。
在其他实施例中，所述受体包括荧光团或荧光染料，并且所述受体与所述聚合物的比率为0.01-0.2。
在还有其他实施例中，所述接头包括烷基、PEG、羧酰胺、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、N-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪基醚、脒、脲、尿烷、硫脲、亚磷酸酯、甲硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-***、哒嗪、噻唑烷、2-二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基团。
在某些实施例中，
(i)SG1、SG2、SG5和SG6独立地表示表PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；和/或
(ii)SG3、SG4、R3和R4独立地表示氢、卤素、PEG或接头(L)，和/或
(iii)L是烷基链或PEG链；和/或
(iv)BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；和/或
(v)氢、烷基、卤素、硼羰基、芳基、杂芳基或L-BS；和/或
(vi)X、Y和Z各自是独立地选自0至200的整数，X/Y+Z的比率>0.4并且X+Y+Z的总和为20至200。
在某些其他实施例中，SG1、SG2、SG5和SG6独立地是PEG3至PEG30。
在还有其他实施例中，SG1-SG6和R1-R4独立地表示氢、羧基芳基或L-BS。
在某些实施例中，式B的单体单元包含
Figure BDA0003809650660000051
其中Y是所述聚合物中式B的单体单元的数目，其中所述式B的单体单元是连续的或非连续的并且其中Y为0至100；并且
其中SG3、SG4、R3和R4独立地是烷基、氟、氢、聚乙二醇(PEG)或受体。
在某些其他实施例中，A是C；并且其中R1和R2各自是聚乙二醇(PEG)。
在还有其他实施例中，A是N；并且其中R1不存在且R2
是
Figure BDA0003809650660000061
在一些实施例中，所述受体还包括荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁。
在某些实施例中，式A、式B和式C包括
Figure BDA0003809650660000062
Figure BDA0003809650660000071
Figure BDA0003809650660000081
其中m和n为5至20。
在一些实施例中，所述受体包括：
Figure BDA0003809650660000082
Figure BDA0003809650660000091
Figure BDA0003809650660000101
Figure BDA0003809650660000111
本公开提供了一种式I的聚合物缀合物：
Figure BDA0003809650660000121
其中所述聚合物缀合物包含上面用x、y和z标注的括号内所示的三种单体单元，其中波浪线表示单体的连接点，其中USU表示不饱和单元、双键、三键、芳基或杂芳基，其中SG表示水溶性基团，其中HG表示头部基团，其中单体单元沿聚合物主链随机分布；其中A＝N-R10、P-R11、O＝P-R11、O＝P-OR11、R11-C-R12、R11-Si-R12、R11-S-R12、O＝S-R11、O＝S(O)-R11；USU是不饱和单元、双键、三键、芳基或杂芳基；R1至R12独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(PEG)、芳基、杂芳基基团或联接的生物底物(L-BS)，其中接头(L)是烷基或PEG；其中SG1至SG4独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基基团或L-BS；并且其中x、y和z是0-100的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，(2)x/(y+z)的比率>1，和(3)x+y+z的总和>10。
在一个实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中R1至R6独立地表示氢、甲基或乙基；其中SG1至SG4独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且其中x、y和z是0-80的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，和(3)x+y+z的总和>20。
在另一个实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中R1至R6是氢；其中SG1和SG2是PEG；其中SG3至SG4独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且其中x、y和z是0-80的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，和(3)x+y+z的总和>20。
在一个实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中SG3至SG4独立地表示PEG、烷基、羧基烷基或L-BS。
在另一个实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中SG3至SG4独立地表示PEG、烷基、氨基烷基或L-BS。
在一个实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中SG1和SG2独立地是PEG6至PEG18。
在另一个实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中x+y+z的总和是30-80。
在一个实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中SG3至SG4独立地表示PEG、甲基、羧基烷基或L-BS。
在另一个实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中SG3至SG4独立地表示PEG、甲基、氨基烷基或L-BS。
在一个实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中R1至R6是氢；其中SG1至SG4独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或L-BS；其中L是烷基链或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；并且其中x、y和z是0-80的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，和(3)x+y+z的总和>20。
在另一个实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中x+y+z的总和是30-80。
在一个实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示氢、羧基芳基或L-BS。
在另一个实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或L-BS。
本公开提供了一种式II的聚合物缀合物：
Figure BDA0003809650660000131
其中所述聚合物缀合物包含上面用w、x、y和z标注的括号内所示的四种单体单元，其中波浪线表示单体的连接点，其中SG表示水溶性基团，其中HG表示头部基团，其中单体单元沿聚合物主链随机分布；其中荧光团(FP)是最大吸收波长大于370nm且最大发射波长大于400nm，荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中A＝N-R10、P-R11、O＝P-R11、O＝P-OR11、R11-C-R12、R11-Si-R12、R11-S-R12、O＝S-R11、O＝S(O)-R11；R1至R12独立地表示氢、烷基、PEG、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中L是烷基、PEG或FP；其中SG1至SG7独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中w、x和z是0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，(2)w/(x+y+z)的比率>1，和(3)w+x+y+z的总和>10。
在一个实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚(rhodol)、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中R1至R6独立地表示氢、甲基或乙基；其中SG1至SG7独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链、FP或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；其中w、x和z是0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)w/(x+y+z)的比率>1，和(3)w+x+y+z的总和>20。
在另一个实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中R1至R6是氢。
在一个实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；其中w+x+y+z的总和为30-80。
在另一个实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、花青、BODIPY、方酸菁、苝二酰亚胺或酞菁。
在一个实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中FP是罗丹明。
在另一个实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中FP是花青。
在一个实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中R1至R6是氢；其中SG1至SG7独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或L-BS；其中L是烷基链、FP或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中w、x和z是0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)w/(x+y+z)的比率>1，和(3)w+x+y+z的总和>20。
在另一个实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中x+y+z的总和是30-80。
在一个实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示氢、羧基芳基或L-BS。
在另一个实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或L-BS。
本公开提供了一种式III的聚合物缀合物：
Figure BDA0003809650660000151
其中所述聚合物缀合物包含上面用w、x和z标注的括号内所示的三种单体单元，其中波浪线表示单体的连接点，其中SG表示水溶性基团，其中HG表示头部基团，
其中单体单元沿聚合物主链随机分布；其中荧光团(FP)是最大吸收波长大于370nm且最大发射波长大于400nm，荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中A＝N-R10、P-R11、O＝P-R11、O＝P-OR11、R11-C-R12、R11-Si-R12、R11-S-R12、O＝S-R11、O＝S(O)-R11；R1至R12独立地表示氢、烷基、PEG、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中L是烷基、PEG或FP；其中SG1至SG6独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中w、x和z是0-100的整数；并且其中z是1至20的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，(2)w/(x+z)的比率>1，和(3)w+x+z的总和>10。
在一个实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中R1至R6独立地表示氢、甲基或乙基；其中SG1至SG6独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链、FP或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；其中w、x和z是0-80的整数；并且其中z是1至10的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)w/(x+z)的比率>1，和(3)w+x+z的总和>20。
在另一个实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中R1至R6是氢。
在一个实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；其中w+x+z的总和为30-80。
在另一个实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、花青、BODIPY、方酸菁、苝二酰亚胺或酞菁。
在一个实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中FP是罗丹明。
在另一个实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中FP是花青。
在一个实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中R1至R6是氢；其中SG1至SG6独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或L-BS；其中L是烷基链、FP或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中w、x和z是0-80的整数；并且其中z是1至10的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)w/(x+z)的比率>1，和(3)w+x+z的总和>20。
在另一个实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中x+z的总和是30-80。
在一个实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示氢、羧基芳基或L-BS。
在另一个实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或L-BS。
本公开提供了一种式IV的聚合物缀合物：
Figure BDA0003809650660000161
其中所述聚合物缀合物包含上面用x、y和z标注的括号内所示的三种单体单元，其中波浪线表示单体的连接点，其中SG表示水溶性基团，其中HG表示头部基团，
其中所述聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的三种单体单元；其中A1、A2或A3＝N-R10、P-R11、O＝P-R11、O＝P-OR11、R11-C-R12、R11-Si-R12、R11-S-R12、O＝S-R11、O＝S(O)-R11；R1至R12独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(PEG)、芳基、杂芳基基团或联接的生物底物(L-BS)；其中接头(L)是烷基或PEG；其中SG1至SG6独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基基团或L-BS；并且其中x、y和z是0-100的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，和(2)x+y+z的总和>10。
在一个实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中R1至R4独立地表示氢、甲基或乙基；其中SG1至SG6独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且其中x、y和z是0-80的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，和(2)x+y+z的总和>20。
在另一个实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中R1至R4是氢；其中SG1和SG2是PEG；其中SG3至SG6独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且其中x、y和z是0-80的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，和(2)x+y+z的总和>20。
在一个实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中SG3至SG6独立地表示PEG、烷基、羧基烷基或L-BS。
在另一个实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中SG3至SG6独立地表示PEG、烷基、氨基烷基或L-BS。
在一个实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中x+y+z的总和是30-80。
在另一个实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中SG3至SG6独立地表示PEG、甲基、羧基烷基或L-BS。
在一个实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中SG3至SG6独立地表示PEG、甲基、氨基烷基或L-BS。
在另一个实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中R1至R4是氢；其中SG1至SG6独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或L-BS；其中L是烷基链或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；并且其中x、y和z是0-80的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，和(3)x+y+z的总和>20。
在一个实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中x+y+z的总和是30-80。
在另一个实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示氢、羧基芳基或L-BS。
在另一个实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或L-BS。
本公开提供了一种式V的聚合物缀合物：
Figure BDA0003809650660000181
其中所述聚合物缀合物包含上面用w、x、y和z标注的括号内所示的四种单体单元，其中波浪线表示单体的连接点，其中SG表示水溶性基团，其中HG表示头部基团，
其中单体单元沿聚合物主链随机分布；其中荧光团(FP)是最大吸收波长大于370nm且最大发射波长大于400nm，荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中A1、A2、A3或A4＝N-R10、P-R11、O＝P-R11、O＝P-OR11、R11-C-R12、R11-Si-R12、R11-S-R12、O＝S-R11、O＝S(O)-R11；R1至R12独立地表示氢、烷基、PEG、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中L是烷基、PEG或FP；其中SG1至SG7独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中w、x和z是0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，和(2)w+x+y+z的总和>10。
在一个实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中R1至R4独立地表示氢、甲基或乙基；其中SG1至SG7独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链、FP或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；其中w、x和z是0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，和(2)w+x+y+z的总和>20。
在另一个实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中R1至R4是氢。
在一个实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中w+x+y+z的总和是30-80。
在另一个实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、花青、BODIPY、方酸菁、苝二酰亚胺或酞菁。
在一个实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中FP是罗丹明。
在另一个实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中FP是花青。
在一个实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中R1至R4是氢；其中SG1至SG7独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或L-BS；其中L是烷基链、FP或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中w、x和z是0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，和(2)w+x+y+z的总和>20。
在另一个实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中w+x+y+z的总和是30-80。
在一个实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示氢、羧基芳基或L-BS。
在另一个实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或L-BS。
本公开还提供了一种检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
a)在包含具有式I的结构的聚合物缀合物的检测试剂将结合所述分析物的条件下，将所述样品与所述检测试剂合并；以及
b)通过荧光检测检测试剂结合的分析物。
其中所述聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的三种单体单元；其中R1至R6独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(PEG)、芳基、杂芳基基团或联接的生物底物(L-BS)；其中接头(L)是烷基或PEG；其中SG1至SG6独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基基团或L-BS；并且其中x、y和z是0-100的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，(2)x/(y+z)的比率>1，和(3)x+y+z的总和>10。
本公开提供了一种检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
a)在包含具有式II的结构的聚合物缀合物的检测试剂将结合所述分析物的条件下，将所述样品与所述检测试剂合并；以及
b)通过荧光检测检测试剂结合的分析物。
其中所示聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的四种单体单元；其中荧光团(FP)是最大吸收波长大于370nm且最大发射波长大于400nm，荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中R1至R6独立地表示氢、烷基、PEG、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中L是烷基、PEG或FP；其中SG1至SG7独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中w、x和z是0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，(2)w/(x+y+z)的比率>1，和(3)w+x+y+z的总和>10。
本公开还提供了一种检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
a)在包含具有式III的结构的聚合物缀合物的检测试剂将结合所述分析物的条件下，将所述样品与所述检测试剂合并；以及
b)通过荧光检测检测试剂结合的分析物。
其中所述聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的三种单体单元；其中R1至R4独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(PEG)、芳基、杂芳基基团或联接的生物底物(L-BS)；其中接头(L)是烷基或PEG；其中SG1至SG6独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基基团或L-BS；并且其中x、y和z是0-100的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，和(2)x+y+z的总和>10。
本公开提供了一种检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
a)在包含具有式IV的结构的聚合物缀合物的检测试剂将结合所述分析物的条件下，将所述样品与所述检测试剂合并；以及
b)通过荧光检测检测试剂结合的分析物。
其中所示聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的四种单体单元；其中荧光团(FP)是最大吸收波长大于370nm且最大发射波长大于400nm，荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中R1至R4独立地表示氢、烷基、PEG、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中L是烷基、PEG或FP；其中SG1至SG7独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中x、y和z是0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，和(2)x+y+z的总和>10。
本公开提供了一种检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
a)在包含具有式V的结构的聚合物缀合物的检测试剂将结合所述分析物的条件下，将所述样品与所述检测试剂合并；以及
b)通过荧光检测检测试剂结合的分析物。
其中所示聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的四种单体单元；其中荧光团(FP)是最大吸收波长大于370nm且最大发射波长大于400nm，荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中R1至R4独立地表示氢、烷基、PEG、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中L是烷基、PEG或FP；其中SG1至SG7独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中w、x和z是0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，和(2)w+x+y+z的总和>10。
在一个实施例中，本公开提供了式I、式II、式III、式IV或式V的聚合物缀合物，其中BS是抗体。
在另一个实施例中，本公开提供了式I、式II、式III、式IV或式V的聚合物缀合物，其中BS是抗地高辛抗体。
在又一个实施例中，本公开提供了式I、式II、式III、式IV或式V的聚合物缀合物，其中BS是山羊抗小鼠IgG抗体、山羊抗兔IgG抗体、山羊抗人IgG抗体、驴抗小鼠IgG抗体、驴抗兔IgG抗体、驴抗人IgG抗体、鸡抗小鼠IgG抗体、鸡抗兔IgG抗体或鸡抗人IgG抗体。
在一个实施例中，本公开提供了式I、式II、式III、式IV或式V的聚合物缀合物，其中BS是抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或抗生物素蛋白。
在另一个实施例中，本公开提供了式I、式II、式III、式IV或式V的聚合物缀合物，其中分析物是在细胞表面上表达的靶蛋白。
在另一个实施例中，本发明提供了式I、式II、式III、式IV或式V的聚合物缀合物，其中分析物是靶蛋白，该靶蛋白是在细胞内检测到的细胞内蛋白。
注意，在本公开中且特别是在权利要求和/或段落中，诸如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等术语可以具有《美国专利法》中赋予它的含义；例如，它们可以意指“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等；并且诸如“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consistsessentially of)”的术语具有《美国专利法》中赋予它们的含义，例如，它们允许没有明确列举的要素，但是排除在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新颖特征的要素。这些和其他实施例在下面的具体实施方式中公开或者从中显而易见，并且被下面的具体实施方式所涵盖。
附图说明
专利或申请文件含有用彩色绘制的附图。本专利或专利申请公开与彩色附图的副本将由专利局根据要求在支付必要的费用后提供。通过以下结合附图对示例性实施例的详细描述，将更充分地理解本实施例的上述和其他特征和优点，其中：
图1.芴聚合物生物缀合物的典型合成。BS是一种生物底物(例如，抗体)。w、x、y和z是单体单元的数目。FG是如表2中所列的用于缀合的官能团。FP是如表1中所列的荧光团。L是接头。
图2A至图2C.使用基于芴并氧杂环庚三烯(图2A)、芴并环庚烷(图2B)和芴并氮杂环庚三烯(图2C)的聚合物制备的抗体缀合物的尺寸排阻纯化。将粗缀合反应混合物通过Superdex 200递增树脂纯化并且纯化的缀合物在7-10毫升体积之间洗脱，并单独收集。未缀合的“游离”抗体在11.5毫升体积左右洗脱并将其丢弃。
图3A至图3B.具有基于苯基的接头附接的芴并氧杂环庚三烯基础聚合物的光学特性。图3A).基础聚合物的吸收和发射光谱。图3B).相同的芴并氧杂环庚三烯基础聚合物的串联型式的吸收和发射光谱，能量从聚合物转移到发射约563nm的受体染料。
图4A至图4B.具有基于氮杂环庚三烯单体的接头附接的芴并氧杂环庚三烯基础聚合物的光学特性。图4A).基础聚合物的吸收和发射光谱。图4B).相同的芴并氧杂环庚三烯基础聚合物的串联型式的吸收和发射光谱，能量从聚合物转移到发射约805nm的受体染料。
图5A至图5B.具有基于氮杂环庚三烯单体的接头附接的芴并环庚烷基础聚合物的光学特性。图5A).基础聚合物的吸收和发射光谱。图5B).相同的芴并环庚烷基础聚合物的串联型式的吸收和发射光谱，能量从聚合物转移到发射约563nm的受体染料。
图6A至图6B.具有基于苯基的接头附接的芴并环庚烷基础聚合物的光学特性。图6A).基础聚合物的吸收和发射光谱。图6B).相同的芴并环庚烷基础聚合物的串联型式的吸收和发射光谱，能量从聚合物转移到发射约805nm的受体染料。
图7A至图7B.具有基于氮杂环庚三烯单体的接头附接的芴并氮杂环庚三烯基础聚合物的光学特性。图7A).基础聚合物的吸收和发射光谱。图7B).相同的芴并氮杂环庚三烯基础聚合物的串联型式的吸收和发射光谱，能量从聚合物转移到发射约805nm的受体染料。
图8A至图8B.具有基于苯基的接头附接的芴并氮杂环庚三烯基础聚合物的光学特性。图8A).基础聚合物的吸收和发射光谱。图8B).相同的芴并氮杂环庚三烯基础聚合物的串联型式的吸收和发射光谱，能量从聚合物转移到发射约805nm的受体染料。
图9A至图9D.基于芴并氧杂环庚三烯的聚合物缀合抗体在流式细胞术分析中的性能。图9A).使用接头1的基于氧杂环庚三烯的基础聚合物与抗小鼠CD4(克隆RM4-5)单克隆抗体缀合，并用于对小鼠脾细胞进行染色，通过流式细胞术对小鼠脾细胞进行分析。如右上象限所示，缀合的抗体识别CD3阳性、CD4阳性细胞。图9B).使用接头1的基于芴并氧杂环庚三烯的串联聚合物与抗小鼠CD4(克隆RM4-5)单克隆抗体缀合，并用于对小鼠脾细胞进行染色，通过流式细胞术对小鼠脾细胞进行分析。如右上象限所示，缀合的抗体识别CD3阳性、CD4阳性细胞细胞。图9C).使用接头2的基于芴并氧杂环庚三烯的基础聚合物与抗人CD25(克隆BC96)缀合，并用于对经过刺激的正常人外周血细胞进行染色，通过流式细胞术对经过刺激的正常人外周血细胞进行分析。如上面两个象限所示，缀合的抗体识别CD25阳性细胞。图9D).使用接头2的基于氧杂环庚三烯的串联聚合物与抗人TNFα(克隆MAb11)缀合，并用于对经过刺激的正常人外周血细胞进行细胞内染色，通过流式细胞术对经过刺激的正常人外周血细胞进行分析。如上面两个象限所示，缀合的抗体识别TNFα阳性细胞。
图10A至图10D.基于芴并环庚烷的聚合物缀合抗体在流式细胞术分析中的性能。图10A).使用接头1的基于芴并环庚烷的基础聚合物与抗小鼠CD4(克隆RM4-5)缀合，并用于对小鼠脾细胞进行染色，通过流式细胞术对小鼠脾细胞进行分析。如右上象限所示，缀合的抗体识别CD3阳性、CD4阳性细胞。图10B).使用接头1的基于芴并环庚烷的串联聚合物与抗人CD25(克隆BC96)缀合，并用于对经过刺激的正常人外周血细胞进行染色，通过流式细胞术对经过刺激的正常人外周血细胞进行分析。如上面两个象限所示，缀合的抗体识别CD25阳性细胞。图10C).使用接头2的基于芴并环庚烷的基础聚合物与抗小鼠CD4(克隆RM4-5)缀合，并用于对小鼠脾细胞进行染色，通过流式细胞术对小鼠脾细胞进行分析。如右上象限所示，缀合的抗体识别CD3阳性、CD4阳性细胞。图10D).使用接头2的基于芴并环庚烷的串联聚合物与抗小鼠CD4(克隆RM4-5)缀合，并用于对小鼠脾细胞进行染色，通过流式细胞术对小鼠脾细胞进行分析。如右上象限所示，缀合的抗体识别CD3阳性、CD4阳性细胞。
图11A至图11D.基于芴并氮杂环庚三烯的聚合物缀合抗体在流式细胞术分析中的性能。图11A).使用接头1的基于芴并氮杂环庚三烯的基础聚合物与抗小鼠CD4(克隆RM4-5)缀合，并用于对小鼠脾细胞进行染色，通过流式细胞术对小鼠脾细胞进行分析。如右上象限所示，缀合的抗体识别CD3阳性、CD4阳性细胞。图11B).使用接头1的基于芴并氮杂环庚三烯的串联聚合物与抗人CD20(克隆2H7)缀合，并用于对正常人外周血细胞进行染色，通过流式细胞术对正常人外周血细胞进行分析。缀合的抗体如数据图的左上象限所示，识别CD3阴性、CD20亮细胞，以及如右上象限所示，识别CD3阳性、CD20暗细胞。图11C).使用接头2的基于芴并氮杂环庚三烯的基础聚合物与抗人TNFα(克隆MAb11)缀合，并用于对经过刺激的正常人外周血细胞进行细胞内染色，通过流式细胞术对经过刺激的正常人外周血细胞进行分析。如上面两个象限所示，缀合的抗体识别TNFα阳性细胞。图11D).使用接头2的基于芴并氮杂环庚三烯的串联聚合物与抗人Ki-67(克隆20Raj1)缀合，并用于对经过刺激的正常人外周血细胞进行细胞内染色，通过流式细胞术对经过刺激的正常人外周血细胞进行分析。如左上象限所示，缀合的抗体识别CD19阴性、Ki-67阳性细胞。
具体实施方式
在进一步详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于所描述的特定方法、装置、解决方案或设备，因为此类方法、装置、解决方案或设备当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅仅是为了描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明的范围。
除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”的使用包括复数指示物。因此，例如，提及“一个探针”包括多个探针等。另外，除非上下文另外明确指出，否则关于大量相同主题阅读到特定复数指示物，诸如“两个”、“三个”等的使用。
除非上下文另外明确指出，否则术语诸如“连接”、“附接”、“缀合”和“联接”在本文中可互换使用并且涵盖直接及间接的连接、附接、联接或缀合；在一个实例中，短语“缀合的聚合物”根据其在本领域中的普通含义使用，并且是指含有一系列延伸的不饱和键的聚合物，并且该上下文指出术语“缀合”应当解释为不仅仅是直接或间接连接、附接或联接。
为了公开和描述引用参考文献的特定材料和方法，本文提及的所有出版物特此通过引用并入。本文讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请的提交日期之前的公开而提供的。本文的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于此类公开。
已经尝试芴聚合物的各种化学修饰以探索它们的生物学检测应用。已经注意到，位置1、2、3、6、7和8处的任何取代显著降低了所得聚合物缀合物的荧光强度。另外，这些经取代的芴聚合物缀合物也具有差的水溶性。努力集中在位置4和位置5。对位置4和位置5处的不同取代和不同交联的初始努力未生成期望的聚合物。位置4和位置5的卤化、烷基化、胺化以及5-元环、6-元环和8-元环对位置4和位置5的交联产生了不期望的芴聚合物缀合物。然而，这种当前的刚性桥接芴聚合物缀合物出乎意料地产生了期望的生物特性，其中芴的位置4和位置5通过7元环交联。已经发现这些聚合物缀合物具有以下特性：(1)高的荧光量子产率；(2)红移发射；(3)高水溶性；(4)高线性度；(5)高平面性；(6)当第二荧光团与聚合物偶联时，高的荧光共振能量转移(FRET)效率；和(7)高的光稳定性。已经发现，本文所述的刚性桥接聚芴聚合物出乎意料地减轻了背景技术部分中讨论的问题，并产生了在蛋白质、核酸和其他生物聚合物上荧光性大幅增强的荧光聚合物缀合物。本发明的聚合物-生物分子缀合物增强的荧光强度产生更高的测定灵敏度。
本公开提供了聚合物缀合物，包括基于刚性桥接芴的聚合物缀合物。这些生物缀合物用于定位或检测样品中分析物或配体的相互作用或存在。掺入此类聚合物或聚合物缀合物的试剂盒利于它们在此类方法中的使用。
本公开提供了包含聚合物缀合物，包括基于刚性桥接芴的聚合物缀合物，其包含：1)包含刚性桥接芴单体的聚合物；和2)生物底物(BS)。本发明的聚合物缀合物通常具有式I的结构：
Figure BDA0003809650660000251
其中所述聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的三种单体单元；其中A＝N-R10、P-R11、O＝P-R11、O＝P-OR11、R11-C-R12、R11-Si-R12、R11-S-R12、O＝S-R11、O＝S(O)-R11；USU是不饱和单元、双键、三键、芳基或杂芳基；R1至R12独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(PEG)、芳基、杂芳基基团或联接的生物底物(L-BS)，其中接头(L)是烷基或PEG；其中SG1至SG4独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基基团或L-BS；并且其中x、y和z是0-100的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，(2)x/(y+z)的比率>1，和(3)x+y+z的总和>10。
在一个优选实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中R1至R6独立地表示氢、甲基或乙基；其中SG1至SG4独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且其中x、y和z是0-80的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，和(3)x+y+z的总和>20。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中R1至R6是氢；其中SG1和SG2是PEG；其中SG3至SG4独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且其中x、y和z是0-80的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，和(3)x+y+z的总和>20。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中SG3至SG4独立地表示PEG、烷基、羧基烷基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中SG3至SG4独立地表示PEG、烷基、氨基烷基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中SG1和SG2独立地是PEG6至PEG18。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中x+y+z的总和是30-80。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中SG3至SG4独立地表示PEG、甲基、羧基烷基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中SG3至SG4独立地表示PEG、甲基、氨基烷基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中R1至R6是氢；其中SG1至SG4独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或L-BS；其中L是烷基链或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；并且其中x、y和z是0-80的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，和(3)x+y+z的总和>20。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中x+y+z的总和是30-80。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示氢、羧基芳基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或L-BS。
一个优选的实施例是式II的聚合物缀合物：
Figure BDA0003809650660000271
其中所述聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的四种单体单元；其中荧光团(FP)是最大吸收波长大于370nm且最大发射波长大于400nm，荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中A＝N-R10、P-R11、O＝P-R11、O＝P-OR11、R11-C-R12、R11-Si-R12、R11-S-R12、O＝S-R11、O＝S(O)-R11；R1至R12独立地表示氢、烷基、PEG、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中L是烷基、PEG或FP；其中SG1至SG7独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中w、x和z是0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，(2)w/(x+y+z)的比率>1，和(3)w+x+y+z的总和>10。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中R1至R6独立地表示氢、甲基或乙基；其中SG1至SG7独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链、FP或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；其中w、x和z是0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)w/(x+y+z)的比率>1，和(3)w+x+Y+z的总和>20。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中R1至R6是氢。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；其中w+x+y+z的总和为30-80。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、花青、BODIPY、方酸菁、苝二酰亚胺或酞菁。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中FP是罗丹明。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中FP是花青。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中R1至R6是氢；其中SG1至SG7独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或L-BS；其中L是烷基链、FP或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中w、x和z是0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)w/(x+y+z)的比率>1，和(3)w+x+y+z的总和>20。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中x+y+z的总和是30-80。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示氢、羧基芳基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式II的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或L-BS。
一个优选的实施例是式III的聚合物缀合物：
Figure BDA0003809650660000281
其中所述聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的四种单体单元；其中荧光团(FP)是最大吸收波长大于370nm且最大发射波长大于400nm，荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中A＝N-R10、P-R11、O＝P-R11、O＝P-OR11、R11-C-R12、R11-Si-R12、R11-S-R12、O＝S-R11、O＝S(O)-R11；R1至R12独立地表示氢、烷基、PEG、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中L是烷基、PEG或FP；其中SG1至SG6独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中w、x和z是0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，(2)w/(x+z)的比率>1，和(3)w+x+z的总和>10。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中R1至R6独立地表示氢、甲基或乙基；其中SG1至SG6独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链、FP或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；其中w、x和z是0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)w/(x+z)的比率>1，和(3)w+x+z的总和>20。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中R1至R6是氢。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；其中w+x+z的总和为30-80。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、花青、BODIPY、方酸菁、苝二酰亚胺或酞菁。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中FP是罗丹明。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中FP是花青。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中R1至R6是氢；其中SG1至SG6独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或L-BS；其中L是烷基链、FP或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中w、x和z是0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)w/(x+z)的比率>1，和(3)w+x+z的总和>20。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中x+z的总和是30-80。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示氢、羧基芳基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式III的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或L-BS。
一个优选的实施例是式IV的聚合物缀合物：
Figure BDA0003809650660000301
其中所述聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的三种单体单元；其中A1、A2或A3＝N-R10、P-R11、O＝P-R11、O＝P-OR11、R11-C-R12、R11-Si-R12、R11-S-R12、O＝S-R11、O＝S(O)-R11；R1至R12独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(PEG)、芳基、杂芳基基团或联接的生物底物(L-BS)；其中接头(L)是烷基或PEG；其中SG1至SG6独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基基团或L-BS；并且其中x、y和z是0-100的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，和(2)x+y+z的总和>10。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中R1至R4独立地表示氢、甲基或乙基；其中SG1至SG6独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且其中x、y和z是0-80的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，和(2)x+y+z的总和>20。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中R1至R4是氢；其中SG1和SG2是PEG；其中SG3至SG6独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；并且其中x、y和z是0-80的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，和(2)x+y+z的总和>20。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中SG3至SG6独立地表示PEG、烷基、羧基烷基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中SG3至SG6独立地表示PEG、烷基、氨基烷基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中x+y+z的总和是30-80。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中SG3至SG6独立地表示PEG、甲基、羧基烷基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中SG3至SG6独立地表示PEG、甲基、氨基烷基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中R1至R4是氢；其中SG1至SG6独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或L-BS；其中L是烷基链或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；并且其中x、y和z是0-80的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，(2)x/(y+z)的比率>1，和(3)x+y+z的总和>20。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中x+y+z的总和是30-80。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示氢、羧基芳基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式IV的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或L-BS。
一个优选的实施例是式V的聚合物缀合物：
Figure BDA0003809650660000311
其中所述聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的四种单体单元；其中荧光团(FP)是最大吸收波长大于370nm且最大发射波长大于400nm，荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中A1、A2、A3或A4＝N-R10、P-R11、O＝P-R11、O＝P-OR11、R11-C-R12、R11-Si-R12、R11-S-R12、O＝S-R11、O＝S(O)-R11；R1至R12独立地表示氢、烷基、PEG、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中L是烷基、PEG或FP；其中SG1至SG7独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中w、x和z是0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，和(2)w+x+y+z的总和>10。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中R1至R4独立地表示氢、甲基或乙基；其中SG1至SG7独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；其中L是烷基链、FP或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基；其中w、x和z是0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，和(2)w+x+y+z的总和>20。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中R1至R4是氢。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中w+x+y+z的总和是30-80。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、花青、BODIPY、方酸菁、苝二酰亚胺或酞菁。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中FP是罗丹明。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中FP是花青。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中FP是荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁；其中R1至R4是氢；其中SG1至SG7独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或L-BS；其中L是烷基链、FP或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中w、x和z是0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1-2，和(2)w+x+y+z的总和>20。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中BS/聚合物的比率为1；并且其中x+y+z的总和是30-80。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示氢、羧基芳基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式V的聚合物缀合物，其中HG1和HG2独立地表示卤素、硼羰基、羧基芳基或L-BS。
在另一个优选实施例中，本公开还提供了一种检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
a)在包含具有式I的结构的聚合物缀合物的检测试剂将结合所述分析物的条件下，将所述样品与所述检测试剂合并；以及
b)通过荧光检测检测试剂结合的分析物。
其中所述聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的三种单体单元；其中R1至R6独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(PEG)、芳基、杂芳基基团或联接的生物底物(L-BS)；其中接头(L)是烷基或PEG；其中SG1至SG6独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基基团或L-BS；并且其中x、y和z是0-100的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，(2)x/(y+z)的比率>1，和(3)x+y+z的总和>10。
在另一个优选实施例中，本公开提供了一种检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
a)在包含具有式II的结构的聚合物缀合物的检测试剂将结合所述分析物的条件下，将所述样品与所述检测试剂合并；以及
b)通过荧光检测检测试剂结合的分析物。
其中所示聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的四种单体单元；其中荧光团(FP)是最大吸收波长大于370nm且最大发射波长大于400nm，荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中R1至R6独立地表示氢、烷基、PEG、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中L是烷基、PEG或FP；其中SG1至SG7独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中w、x和z是0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，(2)w/(x+y+z)的比率>1，和(3)w+x+y+z的总和>10。
在另一个优选实施例中，本公开还提供了一种检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
a)在包含具有式III的结构的聚合物缀合物的检测试剂将结合所述分析物的条件下，将所述样品与所述检测试剂合并；以及
b)通过荧光检测检测试剂结合的分析物。
其中所述聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的三种单体单元；其中R1至R4独立地表示氢、烷基、聚乙二醇(PEG)、芳基、杂芳基基团或联接的生物底物(L-BS)；其中接头(L)是烷基或PEG；其中SG1至SG6独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素或硼羰基、芳基、杂芳基基团或L-BS；并且其中x、y和z是0-100的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，和(2)x+y+z的总和>10。
在另一个优选实施例中，本公开提供了一种检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
a)在包含具有式IV的结构的聚合物缀合物的检测试剂将结合所述分析物的条件下，将所述样品与所述检测试剂合并；以及
b)通过荧光检测检测试剂结合的分析物。
其中所示聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的四种单体单元；其中荧光团(FP)是最大吸收波长大于370nm且最大发射波长大于400nm，荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中R1至R4独立地表示氢、烷基、PEG、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中L是烷基、PEG或FP；其中SG1至SG7独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中x、y和z是0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，和(2)x+y+z的总和>10。
在另一个优选实施例中，本公开提供了一种检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
a)在包含具有式V的结构的聚合物缀合物的检测试剂将结合所述分析物的条件下，将所述样品与所述检测试剂合并；以及
b)通过荧光检测检测试剂结合的分析物。
其中所示聚合物缀合物包含沿聚合物主链随机分布的四种单体单元；其中荧光团(FP)是最大吸收波长大于370nm且最大发射波长大于400nm，荧光量子产率大于5％的荧光染料；其中R1至R4独立地表示氢、烷基、PEG、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中L是烷基、PEG或FP；其中SG1至SG7独立地表示烷基、水溶性基团或L-BS；其中HG1和HG2独立地表示氢、卤素、硼羰基、烷基、芳基、杂芳基基团或L-BS；其中w、x和z是0-100的整数；并且其中y是1至20的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为0.2-3，和(2)w+x+y+z的总和>10。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I、式II、式III、式IV或式V的聚合物缀合物，其中BS是抗体。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I、式II、式III、式IV或式V的聚合物缀合物，其中BS是抗地高辛抗体。
在又一个优选实施例中，本发明公开了式I、式II、式III、式IV或式V的聚合物缀合物，其中BS是山羊抗小鼠IgG抗体、山羊抗兔IgG抗体、山羊抗人IgG抗体、驴抗小鼠IgG抗体、驴抗兔IgG抗体、驴抗人IgG抗体、鸡抗小鼠IgG抗体、鸡抗兔IgG抗体或鸡抗人IgG抗体。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I、式II、式III、式IV或式V的聚合物缀合物，其中BS是抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或抗生物素蛋白。
在另一个优选实施例中，本公开提供了式I、式II、式III、式IV或式V的聚合物缀合物，其中分析物是在细胞表面上表达的靶蛋白。
在另一个优选实施例中，其中FP是选自表1的荧光染料；其中R1至R4是氢；其中SG1至SG7独立地表示PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基或氨基烷基；其中HG1和HG2独立地表示氢、芳基、卤素、硼羰基或L-BS；其中L是烷基链、FP或PEG链；其中BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；其中w、x和z是0-80的整数；并且其中y是1至10的整数，条件是(1)BS/聚合物的比率为1，和(2)w+x+y+z的总和为30-80。
联接到本发明的聚合物上的荧光团(FP)通常是最大吸收波长大于370nm且最大发射波长大于400nm，荧光量子产率大于10％的荧光染料。它们通常选自香豆素、荧光素、罗丹明、花青、BODIPY或其他多环芳族化合物。它们中的许多是可商购的，如表1中选择性列出的一些实例。
表1.可以联接到芴聚合物的典型荧光团
Figure BDA0003809650660000351
Figure BDA0003809650660000361
Figure BDA0003809650660000371
Figure BDA0003809650660000381
Figure BDA0003809650660000391
Figure BDA0003809650660000401
本发明的化合物的许多实施例具有总电子电荷。应当理解，当显示存在此类电子电荷时，它们因存在适当的抗衡离子得以平衡，抗衡离子可以或可以不明确标识。一些应用中优选的生物相容性抗衡离子在生物学应用中是无毒的，并且对生物分子没有实质性有害影响。当本发明的化合物带正电荷时，抗衡离子通常选自但不限于氯离子、溴离子、碘离子、硫酸根、链烷磺酸根、芳基磺酸根、磷酸根、高氯酸根、四氟硼酸根、四芳基硼离子、硝酸根和芳香族或脂肪族羧酸的阴离子。当本发明的化合物带负电荷时，抗衡离子通常选自但不限于碱金属离子、碱土金属离子、过渡金属离子、铵离子或经取代的铵离子或吡啶离子。优选地，任何必需的抗衡离子都是生物相容行的，使用时无毒，并且对生物分子没有实质性有害影响。通过本领域众所周知的方法，诸如离子交换色谱法或选择性沉淀，可以容易地改变抗衡离子。
应理解，本发明的聚合物缀合物已经绘制成一种或另一种特定的电子共振结构。本发明的每个方面同样适用于以其他容许的共振结构绘制的聚合物缀合物，因为主题聚合物缀合物上的电子电荷在整个聚合物缀合物本身中是离域的。
在本发明的另一个优选实施例中，聚合物缀合物含有至少一种L-BS或L-FP-BS，其中BS通过如表2中作为实例列出的公知反应附接到聚合物上。在某些实施例中，将聚合物附接到BS的共价联接含有多个充当接头(L)的***原子。聚合物可用于标记多种生物、有机或无机物质，这些物质含有或经改性为含有具有合适反应性的官能团，引起缀合物质的化学附接。
表2.用于制备L-BS或FP-BS的共价联接的官能团的实例
Figure BDA0003809650660000411
Figure BDA0003809650660000421
Figure BDA0003809650660000431
用于将聚合物附接到待缀合的生物底物上的联接的选择通常取决于待缀合的生物底物上的官能团和期望的共价联接的类型或长度。有机或无机生物底物上通常存在的官能团的类型包括但不限于胺、酰胺、硫醇、醇、酚、醛、酮、膦酸酯、咪唑、肼、羟胺、二取代的胺、卤基、环氧基团、羧酸酯、磺酸酯、嘌呤、嘧啶、羧酸、烯键、叠氮基团、炔烃、四嗪或这些基团的组合。生物底物上可能有单一类型的反应位点可用(对于多糖来说是典型的)，或者可能出现多个位点(例如胺、硫醇、醇、酚)，正如对于蛋白质来说是典型的。缀合的生物底物可以缀合至一种以上可能相同或不同的聚合物缀合物，或者缀合至另外受半抗原诸如生物素修饰的生物底物。可替代地，多种底物可以缀合至单一聚合物。尽管通过小心控制反应条件可以获得一定选择性，但是标记的选择性最好是通过选择适当的反应性聚合物缀合物来获得。
通常，聚合物将与胺、硫醇、醇、醛或酮反应。优选地，聚合物与胺、硫醇官能团或点击反应性基团反应。在某些实施例中，聚合物与丙烯酰胺、反应性胺(包括尸胺或乙二胺)、羧酸的活化酯(通常为羧酸的琥珀酰亚胺酯)、酰基叠氮、酰基腈、醛、烷基卤、酸酐、苯胺、芳基卤、叠氮化物、氮杂环丙烷、硼酸盐、羧酸、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼(包括酰肼)、亚氨基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、亚磷酰胺、反应性铂络合物、磺酰卤、四嗪、叠氮基、炔烃或硫醇基团反应。“反应性铂络合物”特别意指化学反应性铂络合物，诸如在美国专利第5,580,990号、第5,714,327号和美国专利第5,985,566号中所述。
在聚合物是可光活化的，诸如叠氮化物、二氮杂环丙烯基(diazirinyl)、叠氮芳基或补骨脂素衍生物的情况下，聚合物只有在用适当波长的光照射后才变得有化学活性。在聚合物是羧酸的活化酯的情况下，反应性聚合物特别适用于制备蛋白质、核苷酸、寡核苷酸或半抗原的聚合物缀合物。在聚合物是马来酰亚胺或卤代乙酰胺的情况下，反应性聚合物特别适用于缀合到含硫醇的生物底物上。在聚合物是酰肼的情况下，反应性聚合物特别适用于缀合到高碘酸盐氧化的碳水化合物和糖蛋白上，并且另外还是细胞显微注射的醛可固定的极性示踪剂。在聚合物有点击反应性的情况下，该反应性聚合物特别适用于缀合到互补的点击反应性底物上。优选地，聚合物是羧酸、羧酸的琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、肼、异硫氰酸酯、马来酰亚胺基团、脂肪胺、全氟苯甲酰胺基、叠氮全氟苯甲酰胺基团或补骨脂素。更优选地，聚合物是羧酸的琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、碘乙酰胺或反应性铂络合物。
基于上述属性，选择本发明的适当反应性聚合物用于制备期望的聚合物缀合物，其有利的特性使它们可用于各种各样的应用。其中特别有用的聚合物缀合物包括其中底物是肽、核苷酸、抗原、类固醇、维生素、药物、半抗原、代谢物、毒素、环境污染物、氨基酸、蛋白质、核酸、核酸聚合物、碳水化合物、脂质、离子络合部分、玻璃或非生物聚合物的缀合物。可替代地，底物是细胞、细胞***、细胞片段或亚细胞颗粒(例如，除了别的以外)、病毒颗粒、细菌颗粒、病毒组分、生物细胞(诸如动物细胞、植物细胞、细菌、酵母或原生生物)或细胞组分。反应性聚合物通常标记细胞表面处、细胞膜、细胞器或细胞质中的官能团。
典型的底物是氨基酸、肽、蛋白质、酪胺、多糖、离子络合部分、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、脂质、脂质组合体、聚合物、聚合物微粒、生物细胞或病毒。更典型地，底物是肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸或核酸。当将本发明的聚合物缀合物缀合至此类生物聚合物时，可以每个分子掺入更多的聚合物以增强荧光信号。对于聚合物-抗体缀合物，优选一种聚合物缀合至抗体。
在一个实施例中，底物是氨基酸(包括被膦酸酯、碳水化合物或C1至C25羧酸保护或取代的氨基酸)，或者是氨基酸的聚合物，诸如肽或蛋白质。优选的肽缀合物含有至少五个氨基酸，更优选5至36个氨基酸。优选的肽包括但不限于神经肽、细胞因子、毒素、蛋白酶底物和蛋白激酶底物。优选的蛋白质缀合物包括酶、抗体、凝集素、糖蛋白、组蛋白、白蛋白、脂蛋白、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、其他抗生物素蛋白、蛋白A、蛋白G、藻胆蛋白和其他荧光蛋白、激素、毒素、趋化因子和生长因子。在一个优选方面，缀合的蛋白质是聚合物抗体缀合物。
在本发明的一个方面，底物是缀合的生物底物，其是抗体(包括完整抗体、抗体片段和抗体血清等)、氨基酸、血管抑素或内皮抑素、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白、生物素(例如氨基生物素、生物胞素、脱硫生物素等)、血液组分蛋白(例如白蛋白、纤维蛋白原、纤溶酶原等)、葡聚糖、酶、酶抑制剂、IgG结合蛋白(例如蛋白A、蛋白G、蛋白A/G等)、荧光蛋白(例如藻胆蛋白、水母发光蛋白、绿色荧光蛋白等)、生长因子、激素、凝集素(例如，麦胚凝集素、刀豆蛋白A等)、脂多糖、金属结合蛋白(例如钙调蛋白等)、微生物或其部分(例如细菌、病毒、酵母等)、神经肽和其他生物活性因子(例如皮啡肽、deltropin、内***肽、内啡肽、肿瘤坏死因子等)、非生物微粒(例如铁磁流体、金、聚苯乙烯等的非生物微粒)、核苷酸、寡核苷酸、肽毒素(例如蜂毒明肽(apamin)、银环蛇毒素(bungarotoxin)、鬼笔环肽(phalloidin)等)、磷脂结合蛋白(例如膜联蛋白(annexin)等)、小分子药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)等)、结构蛋白(例如肌动蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、微管相关蛋白、微管蛋白等)或者酪胺。
在另一个优选实施例中，生物底物是核酸碱基、核苷、核苷酸或核酸聚合物，包括经修饰成具有用于附接本发明的聚合物缀合物的附加接头或间隔区的那些，附加接头或间隔区诸如炔基联接(美国专利第5,047,519号)，氨基烯丙基联接(美国专利第4,711,955号)，或杂原子取代的接头(美国专利第5,684,142号)或其他联接。在另一个优选实施例中，缀合的生物底物是核苷或核苷酸类似物，其通过非环状间隔区将嘌呤碱基或嘧啶碱基联接到磷酸部分或多磷酸部分。在另一个优选实施例中，聚合物缀合物缀合至核苷酸或核苷的碳水化合物部分，通常是通过羟基缀合，但另外通过硫醇或氨基基团缀合(美国专利第5,659,025、5,668,268、5,679,785号)。通常，缀合的核苷酸是核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸或双脱氧核苷三磷酸。将亚甲基部分或氮或硫杂原子掺入磷酸部分或多磷酸部分也是有用的。非嘌呤和非嘧啶碱基，诸如7-去氮嘌呤(美国专利第6,150,510号)和含有此类碱基的核酸也可以偶联到本发明的聚合物缀合物上。通过脱嘌呤化核酸与胺、酰肼或羟胺衍生物的反应制备的核酸加合物提供了标记和检测核酸的附加手段，例如"A method fordetecting abasic sites in living cells:age-dependent changes in base excisionrepair."Atamna H,Cheung I,Ames BN.PROC.NATL.ACAD.SCI.U.S.A.97,686-691(2000)。
优选的核酸聚合物缀合物是标记的、单链或多链、天然或合成的DNA或RNA、DNA或RNA寡核苷酸、或DNA/RNA杂交体，或者掺入罕见接头(诸如吗啉衍生的磷酸酯)或肽核酸(诸如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元)。当核酸是合成寡核苷酸时，它通常含有少于50个核苷酸，更通常少于25个核苷酸。肽核酸(PNA)的缀合物(Nielsen等人，美国专利第5,539,082号)因为它们通常具有更快的杂交速率可优选用于某些应用。
在一个实施例中，本发明的缀合的寡核苷酸是特定靶分子的适体，该特定靶分子诸如代谢物、聚合物缀合物、半抗原或蛋白质。也就是说，已经选择寡核苷酸以优先与靶分子结合。制备和筛选给定靶分子的适体的方法先前已有描述并且是本领域已知的[例如，授予Gold的美国专利第5,567,588号(1996)]。
在另一个优选实施例中，底物是碳水化合物，其通常是多糖，诸如葡聚糖、肝素、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、菊粉、淀粉、琼脂糖和纤维素。可替代地，碳水化合物是多糖，其是脂多糖。优选的多糖结合物是葡聚糖或脂多糖结合物。
具有离子络合部分的缀合物用作钙、钠、镁、锌、钾或其他生物学上重要的金属离子的指示剂。优选的离子络合部分是冠醚(美国专利第5,405,975)；1,2-双-(2-氨基苯氧乙烷)-N,N,N',N'-四乙酸的衍生物(BAPTA螯合剂；美国专利第5,453,517、5,516,911和5,049,673号)；2-羧基甲氧基苯胺-N,N-二乙酸的衍生物(APTRA螯合剂；AM.J.PHYSIOL.,256,C540(1989))；或基于吡啶和菲咯啉的金属离子螯合剂(美国专利第5,648,270号)；或次氮基三乙酸的衍生物，参见例如"Single-step synthesis and characterization ofbiotinylated nitrilotriacetic acid,a unique reagent for the detection ofhistidine-tagged proteins immobilized on nitrocellulose",McMahan SA和BurgessRR,ANAL.BIOCHEM.,236,101-106(1996)。优选地，离子络合部分是冠醚螯合剂、BAPTA螯合剂、APTRA螯合剂或次氮基三乙酸的衍生物。
非生物材料的其他缀合物包括以下的聚合物缀合物：有机或无机聚合物、聚合物膜、聚合物晶片、聚合物膜、聚合物颗粒或聚合物微粒(磁性和非磁性微球)；铁、金或银颗粒；导电和非导电金属和非金属；及玻璃和塑料表面和颗粒。缀合物任选地通过以下方式制备：在制备聚合物的同时含有适当官能团的聚合物缀合物的共聚，或者通过含有具有合适化学反应性的官能团的聚合物的化学改性。可用于制备聚合物缀合物的其他类型的反应包括烯烃的催化聚合或共聚以及二烯与亲二烯体的反应、酯交换或氨基交换。在另一个优选实施例中，缀合的生物底物是玻璃或二氧化硅，其可以形成为光纤或其他结构。
在一个实施例中，生物聚合物诸如肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸聚合物的缀合物也至少用第二荧光染料缀合物标记(第二荧光染料缀合物任选地是本发明的附加聚合物缀合物)，以形成能量转移对。在本发明的一些方面，标记的缀合物起到酶底物的作用，并且酶水解破坏能量转移。在本发明的另一个优选实施例中，掺入本发明的聚合物缀合物的能量转移对缀合至在其发夹构象中展示出有效荧光淬灭的寡核苷酸，例如，Tyagi等人，NATUREBIOTECHNOLOGY,16,49(1998)的所谓“分子信标”。
使用反应性聚合物缀合物制备聚合物缀合物有充分记录，例如授予Gaylord等人的美国专利第8,158,444号；美国专利第8,455,613号；美国专利第8,354,239号；美国专利第8,362,193号；和美国专利第8,575,303号；还有授予Chiu等人的WO 2013/101902。聚芴聚合物的其他生物学应用已由Thomas III等人(Chem.Rev.2007,107,1339)；Zhu等人(Chem.Rev.2012,112,4687)和Zhu等人(Chem.Soc.Rev.,2011,40,3509)充分记录。缀合物通常是由将适当的反应性聚合物和待缀合的生物底物在两者均可溶的合适溶剂中混合而产生的。本发明的聚合物缀合物易溶于水溶液，利于与大多数生物材料的缀合反应。对于那些光活化的反应性聚合物缀合物，缀合需要照射反应混合物以活化反应性聚合物缀合物。
反应性聚合物的合成
本发明的反应性聚合物的合成取决于某些关键中间体的初始制备，如图1所示。为简单起见，除了少数可能的取代基外，其余都示为氢。在合成期间或之后，这些基本结构任选被进一步取代，得到如上定义的相应聚合物缀合物取代基。认识到有许多可以产生等效结果的可能变化。
合成含有多种反应性官能团(诸如表2中描述的那些)的聚合物的方法在本领域中有充分记录。特别有用的是胺反应性聚合物缀合物，诸如羧酸的“活化酯”，其通常通过将羧酸与相对酸性的“离去基团”偶联而合成。其他优选的胺反应性基团包括：磺酰卤，其使用卤化剂诸如PCl5或POCl3由磺酸制备；卤代三嗪，其通过三聚卤化氰与胺的反应制备；和异氰酸酯或异硫氰酸酯，它们分别由胺和光气或硫光气制备。含有叠氮化物、炔烃和四嗪的聚合物特别适用于缀合到点击反应性基团修饰的底物，诸如由含有点击反应性基团的活化酯修饰的抗体。
含有胺和酰肼的聚合物特别适用于缀合到羧酸、醛和酮。最常见的是这些通过羧酸或磺酰卤的活化酯与二胺(诸如尸胺)或与肼的反应来合成。可替代地，芳香胺通常通过硝基芳香化合物的化学还原来合成。胺和肼是特别适用于通过标准方法合成硫醇反应性卤代乙酰胺或马来酰亚胺的前体。
应用和使用方法
在本发明的一个方面，本发明的聚合物缀合物用于直接染色或标记样品，以便可以鉴定或定量样品。例如，可以添加此类聚合物缀合物作为生物目标分析物测定的一部分，作为生物或非生物流体中可检测的示踪元素；或者用于诸如肿瘤的光动力疗法的目的，其中聚合物缀合的样品经辐照以选择性破坏肿瘤细胞和组织；或者通常通过光敏化产生单线态氧来光消融动脉斑块或细胞。在一个优选实施例中，使用聚合物缀合物对包含配体的样品染色，对于该配体，缀合的生物底物是特异性结合对的互补成员(例如表3)。
通常，样品直接从液体来源获得，或者作为来自固体材料(有机或无机)或生长培养基(其中已经引入细胞进行培养)的洗液获得，或者作为其中已经放置细胞用于评价的缓冲溶液获得。在样品包含细胞的情况下，细胞任选地是单细胞(包括微生物)，或与二维层或三维层中的其他细胞相关的多细胞，包括多细胞生物、胚胎、组织、活检组织、细丝、生物膜等。
可替代地，样品是固体，任选地是涂片或刮除物或通过过滤从液体或蒸汽中去除的滞留物。在本发明的一个方面，样品从生物流体中获得，包括分离的或未过滤的生物流体，诸如尿液、脑脊液、血液、淋巴液、组织匀浆、间质液、细胞萃取物、粘液、唾液、痰、粪便、生理分泌物或其他类似流体。可替代地，样品从环境来源获得，诸如土壤、水或空气；或从工业来源获得，诸如取自废弃物流、水源、供给管线或生产批次。
表3.代表性的特异性结合对
Figure BDA0003809650660000481
*IgG是免疫球蛋白；**aDNA和aRNA是用于杂交的反义(互补)链
在又一个实施例中，样品存在于固体或半固体基质之上或之中。在本发明的一个方面，基质是膜。在另一方面，基质是电泳凝胶，诸如用于分离和表征核酸或蛋白质，或者是通过从电泳凝胶转移到膜上而制备的印迹。在另一方面，基质是硅片或载玻片，并且感兴趣的分析物已经固定在阵列中的芯片或载玻片上(例如样品包括微阵列中的蛋白质或核酸聚合物)。在另一方面，基质是微孔板或微流体芯片，并且样品通过自动化方法分析，典型地通过各种高通量筛选方法，诸如药物筛选方法来分析。
通常通过在经过选择以产生可检测的光学响应的条件下将如上所述的本发明的聚合物缀合物与感兴趣的样品合并来利用本发明的聚合物缀合物。术语“聚合物缀合物”在本文中用于指要求保护的聚合物缀合物的所有方面。聚合物缀合物通常与样品的元素形成共价缔合或复合物，或者简单地存在于样品或样品的一部分的边界内。然后，以经过选择以引发光学响应的波长照射样品。通常，对样品进行染色用于通过进一步将光学响应与标准或预期响应进行比较来确定样品的特定特征。
可检测的光学响应意指可通过观察或用仪器检测的光学信号的变化或出现。通常，可检测的响应是荧光的变化，诸如荧光的强度、激发或发射波长分布、荧光寿命、荧光偏振或它们的组合的变化。与标准或预期响应相比，染色的程度和/或位置指示样品是否具有给定特征以及具有给定特征的程度。
对于生物学应用，本发明的聚合物缀合物通常以根据本领域众所周知的方法制备的水溶液(主要是水溶液或水可混溶的溶液)的形式使用。聚合物缀合物的确切浓度取决于实验条件和期望的结果。通过***变化确定最佳浓度，直到获得背景荧光最小的满意结果。
聚合物缀合物最有利地用于对具有生物组分的样品染色。样品可包含组分的不均匀混合物(包括完整细胞、细胞提取物、细菌、病毒、细胞器及它们的混合物)，或单一组分或一组均匀组分(例如天然或合成的氨基酸、核酸或碳水化合物聚合物，或脂质膜复合物)。这些聚合物缀合物在使用浓度范围内通常对活细胞和其他生物组分无毒。
将聚合物缀合物以利于聚合物缀合物和感兴趣的样品组分之间接触的任何方式与样品合并。通常，仅仅将聚合物缀合物或含有聚合物缀合物的溶液添加到样品中。可以采用用聚合物缀合物进行细胞染色的各种方案，例如用于流式细胞术的抗体聚合物缀合物染色。此类方案包括用聚合物缀合物对样品的细胞内感兴趣的靶抗原进行细胞内染色的方案。透化质膜的处理，诸如电穿孔、休克处理或高细胞外ATP可用于将选择的聚合物缀合物引入细胞中。可替代地，可将选择的聚合物缀合物物理***细胞中，例如通过压力显微注射、划痕负载、膜片钳方法或吞噬作用。
可以将掺入脂肪胺或肼残基的聚合物缀合物显微注射到细胞中，在细胞中它们可以通过醛类固定剂诸如甲醛或戊二醛固定到位。这种可固定性使得此类聚合物缀合物可用于细胞内应用，诸如神经元示踪。
具有亲脂性取代基的聚合物缀合物，诸如磷脂，将非共价掺入到脂质组合体中，例如用作膜结构的探针；或者掺入脂质体、脂蛋白、膜、塑料、亲脂性微球或类似材料中；或者用于示踪。亲脂性聚合物缀合物可用作膜结构的荧光探针。
使用聚合物缀合物标记细胞表面上、细胞膜中或细胞内区室(诸如细胞器)中或细胞的细胞质中的活性位点，可以容许确定它们在样品中的存在或数量、可及性或它们的空间和时间分布。光反应性聚合物缀合物可以类似地用于对生物细胞外膜的组分进行光标记，或者用作细胞的光可固定的极性示踪剂。
任选地，染色后洗涤样品以去除残留、过量或未结合的聚合物缀合物。在染色过程中，任选地将样品与一种或多种其他溶液合并，包括洗涤溶液、渗透和/或固定溶液以及含有附加检测试剂的溶液。根据本领域众所周知的方法，由于特定细胞组分、细胞内生物底物或细胞条件的存在，附加检测试剂通常产生可检测的响应。在附加检测试剂具有或产生具有不同于主题聚合物缀合物的光谱特性的产物时，多色应用是可能的。这在附加检测试剂是本发明的聚合物缀合物或聚合物缀合物-缀合物的情况下特别有用，本发明的聚合物缀合物或聚合物缀合物-缀合物具有可检测地区别于染色聚合物缀合物的光谱特性。
本发明的聚合物缀合物缀合物根据本领域广泛已知的方法使用；例如在显微镜检查和免疫荧光测定中使用抗体缀合物；以及核苷酸或寡核苷酸缀合物用于核酸杂交测定和核酸测序(例如，授予Prober等人的美国专利第5,332,666号(1994)；授予Smith等人的美国专利第5,171,534号(1992)；授予Hobbs等人的美国专利第4,997,928号(1991)；和授予Menchen等人的WO Appl.94/05688)。本发明的多种独立聚合物缀合物的聚合物缀合物-缀合物具有多色应用的效用。
在染色后或染色期间的任何时间，以经过选择以给出可检测的光学响应的光波长照射样品，并用检测光学响应的工具观察。可用于照射本发明的聚合物缀合物的设备包括但不限于手持紫外灯、汞弧灯、氙灯、激光器和激光二极管。这些照射源任选地集成到激光扫描仪、荧光酶标仪、标准或微型荧光计或色谱检测器中。本发明的优选实施例是在波长405nm或附近可激发的聚合物缀合物。
任选地通过目视检查，或通过使用以下任何装置来检测光学响应：CCD相机、摄像机、摄影胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪，或通过用于放大信号的工具诸如光电倍增管来检测光学响应。在使用流式细胞仪检查样品的情况下，样品的检查任选地包括根据它们的荧光响应对样品的部分进行分选。
本发明的一个方面是试剂盒的配制，所述试剂盒利于使用如上所述的本发明的任何聚合物缀合物实践各种测定。本发明的试剂盒通常包含本发明的荧光聚合物缀合物，其中缀合的生物底物是特异性结合对成员，或核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、肽或蛋白质。该试剂盒任选地还包含一种或多种缓冲剂，通常以水溶液的形式存在。本发明的试剂盒任选地还包含附加检测试剂、用于纯化所得标记的生物底物的纯化介质、发光标准品、酶、酶抑制剂、有机溶剂或用于进行本发明的测定的说明书。
实例
在下面的实例中提供了本发明的选定聚合物缀合物的一些合成策略的实例，以及它们的表征、合成前体、缀合物和使用方法。对于本领域的技术人员来说，进一步的修改和变更将是显而易见的给出以下实例是为了说明本发明的实践。它们并非旨在限制或限定本发明的整个范围。应理解本发明不限于所描述的特定方面，因为这些方面可以变化。还应理解，本文所用的术语仅仅是为了描述特定方面的目的，而非旨在为限制性，因为本发明的范围将仅受所附权利要求限定。在提供值的范围时，应当理解，除非上下文另外明确指出，否则介于该范围上限与下限之间的每个居间值(至下限单位的十分之一)以及该规定范围内的任何其它规定值或居间值均涵盖在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内并且也涵盖在本发明内，以规定范围内任何明确排除的限值为条件。当规定范围包括一个或两个限值时，排除了那些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或试验，但现在描述代表性的说明性方法和材料。
实例1.化合物2的制备
Figure BDA0003809650660000511
将化合物1(36.6g，Tianjin Biolite)悬浮在400mL MeCN中。快速添加烯丙基胺(30mL，4当量)。将混合物在室温下搅拌40分钟，并浓缩。向残留物中添加10g NaHCO3和盐水，并将混合物用DCM萃取三次。收集有机层，用Na2SO4干燥，浓缩并通过硅胶快速色谱法纯化，得到呈黄色固体的产物2(21.75g)。
实例2.化合物3的制备
Figure BDA0003809650660000521
将化合物2(4.7g)添加到KOH(3g)在二乙二醇(60mL)中的溶液中。将混合物在180℃加热1小时，然后冷却至室温并用水稀释。通过过滤收集沉淀的固体并通过硅胶快速色谱法纯化，得到呈淡黄色固体的产物3(3.75g)。
实例3化合物4的制备
Figure BDA0003809650660000522
在冰浴中，向化合物3(4.94g)和TBAB(0.644g，0.1当量)的混合物中添加甲苯(50mL)和50％NaOH(28mL)。将混合物在氩气下在室温下搅拌16小时，然后用冰水稀释。将混合物用DCM萃取两次。合并有机相并用水洗涤。用Na2SO4干燥收集的溶液，浓缩并通过硅胶快速色谱法纯化，得到呈黄橙色固体的产物4(9.36g)。
实例4.化合物5的制备
Figure BDA0003809650660000523
将化合物4(9.2g)与Pd(OAc)2(0.205g，0.05当量)、PPh3(1.10g，0.23当量)和1,3-二甲基巴比妥酸(8.56g，3当量)混合在250mL DCM中。将反应在35℃下搅拌2小时。将反应混合物用NaHCO3溶液和盐水洗涤，用Na2SO4干燥，浓缩并通过硅胶快速色谱法纯化，得到呈黄色固体的产物5(9.44g)。
实例5.化合物6的制备
Figure BDA0003809650660000531
将化合物5(9.44g)溶解在400mL DCM中，并添加iPr2NEt(14mL，4当量)。将混合物在冰浴中冷却并添加琥珀酸单乙酯酰氯(5.05g，1.5当量)。将反应在室温下搅拌20分钟，然后用盐水淬灭。分离有机相，用Na2SO4干燥，浓缩并通过硅胶快速色谱法纯化，得到呈黄褐色固体的产物6(9.83g)。
实例6.化合物7的制备
Figure BDA0003809650660000532
向在30mL DCM中的化合物6(9.8g)中添加15mL TFA。将反应在室温下搅拌1.5小时。将混合物浓缩，与DCM、甲苯以及最后己烷和DCM共沸，得到呈黄色固体的产物7(7.32g)。
实例7.化合物8的制备
Figure BDA0003809650660000541
将化合物7(2.93g)溶解在20mL AcOH中。添加碘(0.6g，0.4当量)、KIO3(0.32g，0.24当量)和2.5mL 33％H2SO4。将反应在50℃下搅拌4.5小时，然后用水稀释。添加25mLNaHCO3(饱和)得到溶液，将溶液通过反相HPLC C18柱纯化并冻干得到产物8(1.95g)。
实例8.化合物9的制备
Figure BDA0003809650660000542
将化合物8(1.95g)溶解在20mL DMF中，并添加0.15mL溴(2当量)。将混合物在室温下搅拌30小时。用Na2SO3溶液淬灭反应。添加NaHCO3(饱和，25mL)得到溶液，将溶液通过反相HPLC C18柱纯化并冻干得到产物9(1.8g)。
实例9.化合物10的制备
Figure BDA0003809650660000551
在0℃下，向化合物9(1.8g)在THF(20mL)中的混合物中添加Et3N(1.4mL，6当量)，接着滴加氯甲酸乙酯(0.63mL，4当量)。将混合物在室温下搅拌30分钟。过滤白色沉淀，并浓缩滤液。在0℃高真空下干燥1小时后，添加THF(20mL)，接着滴加在水(2mL)中的硼氢化钠(0.37g，6当量)。将混合物在0℃下搅拌30分钟。用NH4Cl溶液淬灭反应。添加更多的H2O来溶解所有的沉淀。将混合物浓缩以去除THF并用EtOAc(3X50 mL)萃取，直到水层中没有产物。用Na2SO4干燥有机相，浓缩并通过硅胶快速色谱法纯化，得到呈白色固体的产物10(1g)。
实例10.化合物11的制备
Figure BDA0003809650660000552
将化合物10(1.0g)溶解在10mL DMF中并添加双(频哪醇)二硼(0.413g,1.4当量)，然后添加Pd(dppf)Cl2(0.04g，0.05当量)和乙酸钾(0.47g，4当量)。将混合物用氩气脱气10分钟。将反应在80℃下搅拌2小时。在室温下，添加EtOAc(100mL)并用盐水淬灭。分离有机相，用Na2SO4干燥，浓缩并通过硅胶快速色谱法纯化，得到呈浅褐色固体的产物11(0.9g)。
实例11.化合物12的制备
Figure BDA0003809650660000561
将化合物11(0.9g)溶解在THF(10mL)中，添加Et3N(1.22mL，6当量)，接着添加TsCl(1.12g，4当量)。将反应在室温下搅拌18小时。浓缩混合物并通过硅胶快速色谱法纯化，得到呈浅褐色固体的产物12(1.5g)。
实例12.化合物13的制备
Figure BDA0003809650660000562
在0℃下，向NaH(0.33g，6当量)在无水THF(40mL)中的混合物中添加PEG11-OH(4.34g，6当量)。在0℃下10分钟后，滴加化合物12(1.5g)在无水THF(20mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌18小时。浓缩混合物并添加氯仿(100mL)。将有机相用H2O(100ml)洗涤，分离，用Na2SO4干燥，浓缩并通过硅胶快速色谱法纯化，得到呈无色液体的产物13(3g)。
实例13.化合物14的制备
Figure BDA0003809650660000563
Figure BDA0003809650660000571
在氩气下，向Schlenk烧瓶中化合物13(0.8g)和化合物TJ4003(0.029g，TianjinBiolite)在DMF(6mL)中的溶液中添加K2CO3的水溶液(2M，4mL)，接着添加四(三苯基膦)钯(0.015g，0.03当量)。将混合物经由三次冷冻-泵送-解冻循环脱气，并加热至80℃保持4小时。在室温下，在氩气下向反应混合物中添加苯基硼酸频哪醇酯(0.043g，0.1当量)，并加热至80℃保持2小时。在室温下，向反应混合物中添加在20％EtOH/H2O(20mL)中的EDTA(0.1g)并在室温下搅拌2小时。将所得混合物通过0.45μm的杯状过滤器过滤。使用20％EtOH/H2O将经过过滤的溶液稀释到2mg/mL的浓度。使用具有30kD和750kD分子量截留膜的切向流过滤***，将所得稀释液透析到20％EtOH/H2O中，直到洗脱液中的聚合物少于0.1mg/mL。将溶液浓缩并冻干，得到呈黄色半固体的化合物14(0.5g)。
实例14.化合物15的制备
Figure BDA0003809650660000572
在室温下，向化合物14(500mg)在二氯甲(13ml)中的溶液中添加三氟乙酸(7mL)，接着添加苯甲醚(0.08mL)。将反应混合物在室温下搅拌2-3小时。去除溶剂并在高真空下干燥过夜，得到呈淡浅黄色油状物的化合物15(400mg)。
实例15.化合物16的制备
Figure BDA0003809650660000573
在室温下，向化合物15(120mg)在DMF(3mL)中的溶液中添加三乙胺(0.033mL)，接着添加TJ4100(2.1mg，Tianjin Biolite)。将混合物在室温下搅拌1-2小时。添加冰水(3-6g)以淬灭反应。将混合物通过P6DG柱色谱法纯化(水作为溶剂)，得到黄色溶液。根据消光系数将终产物16等分。
实例16.芴聚合物琥珀酰亚胺酯(化合物17)的制备
Figure BDA0003809650660000581
向化合物15(100mg)在DMF(10ml)中的溶液中添加0.1ml戊二酸二(N-琥珀酰亚胺)酯(1mg，AAT Bioquest)的DMF溶液和10μl三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2小时，并在高真空下浓缩以去除DMF。将残余物用***洗涤多次，直到去除大部分未反应的戊二酸二(N-琥珀酰亚胺基)酯。将残余物快速溶解在冷的酸性水(pH＝5)中，并用醚萃取三次。将水溶液冷冻并干燥，得到作为化合物17的期望芴聚合物琥珀酰亚胺酯。
实例17.芴聚合物马来酰亚胺(化合物18)的制备
向化合物15(100mg)在DMF(10ml)中的溶液中添加0.1ml3-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(1mg，AAT Bioquest)的DMF溶液和10μl三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2小时，并在高真空下浓缩以去除DMF。将残余物溶解在酸性水(pH＝5)中，并用乙酸乙酯萃取三次。将水溶液冷冻并干燥，得到作为化合物18的期望芴聚合物马来酰亚胺。
本发明的选定聚合物的一些合成策略的以上实例，以及它们的表征、合成前体、缀合物和使用方法在实例中提供用于说明。对于本领域的技术人员来说，它们的进一步修改和变更显而易见。例如，与本发明的聚合物缀合的第二荧光团(诸如以上实例中的Cy3.5、Cy5、TAMRA和德克萨斯红)可以容易地用表1中列出的商用染料代替，以使聚合物具有不同的期望光谱特性。另外，本发明的聚合物可以进一步用如表2中列出的不同反应性官能团对进行官能化。公知的点击反应基团也可以添加到本发明的聚合物中进行基于双正交化学的缀合(参见P.Agarwal和R.Bertozzi,Bioconjugate Chem.,2015,26,176-192；K.Lang和J.Chin,Chem.Reviews,2014,114,4764-4806；M.D.Best,Biochemistry,2009,48,6571-6584)。一些其他替代的聚合物官能化方法在文献中有很好的描述(参见授予Gaylord等人的美国专利第8,158,444号；美国专利第8,455,613号；美国专利第8,354,239号；美国专利第8,362,193号；和美国专利第8,575,303号；还有授予Chiu等人的WO2013/101902)。
实例18.山羊抗小鼠IgG-芴聚合物染料缀合物的制备
将山羊抗小鼠IgG(GAM)溶解在10mM NaHCO3(pH 8.2)缓冲液中，制成5mg/mL溶液。向GAM蛋白质水溶液中添加化合物17(20当量)的DMF溶液。将溶液在室温下旋转3小时，并将反应混合物转移到Amicon超滤器(MWCO＝10kDa)中以去除DMF。用PBS缓冲液将蛋白质恢复到初始体积。
使用阳离子交换色谱法去除游离聚合物。将缀合混合物上样到低盐缓冲液[50mMMES缓冲液(pH＝5.0)]中的UNOsphereTMS树脂(Bio-Rad)上，并在室温下温育10分钟，将样品重复上样3次以获得最大结合。上样后，用低盐缓冲液洗涤培养基至基线(直到414nm下的吸光度低于0.01)，以去除所有游离聚合物。通过用高盐磷酸盐缓冲液[10mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)+1.0M NaCl缓冲液/甲醇，90/10]提高pH和离子强度，释放保留在阳离子交换树脂上的芴聚合物染料-GAM缀合物。也可以使用蛋白A和蛋白G亲和树脂去除游离聚合物，结果相当。HiTrap Protein G HP 1mL柱(GE Lifesciences)用10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)预先平衡，将SEC纯化产物以<1mg/mL缓慢注射，并允许温育30分钟以结合。用>10倍柱体积的10mM磷酸盐缓冲液洗涤该柱，以洗去未结合的聚合物材料，同时监测280nm和414nm下洗脱液的吸收，以确保去除所有过量的材料。通过用4倍柱体积的0.1M甘氨酸(pH 2.3)洗涤该柱来洗脱缀合物。合并洗脱级分并使用1M Tris pH 8将pH值调回到中性。去除游离聚合物后，用Amicon超滤器(MWCO＝30kD)浓缩缀合物溶液并上样到尺寸排阻柱(Superdex 200,GE lifesciences)上，以分离缀合和未缀合的抗体。用PBS缓冲液平衡该柱，并且芴聚合物-抗体缀合物在游离抗体之前洗脱。
为了有效标记，对于大多数抗体，取代程度应该在1-3摩尔芴聚合物染料:1摩尔抗体之间。如本领域公知的，聚合物染料/蛋白质的最佳比率取决于待标记抗体的特性。聚合物染料/蛋白质的最佳标记比率是通过在聚合物染料/蛋白质的比率范围内制备一系列染料缀合物并比较期望的信号/背景而凭经验确定的。在一些情况下，较高比率的聚合物染料/蛋白质可以提供明亮的信号，而在其他情况下，较高比率的聚合物染料/蛋白质可以降低待标记抗体的亲和力。
实例19.用于流式细胞术的芴聚合物缀合物
与本发明的芴聚合物染料缀合的分析物特异性抗体(即标记抗体)可用于通过流式细胞术分析血细胞(例如，在全血样品中)。标记抗体用于对细胞蛋白染色并且标记的细胞用流式细胞仪检测。芴聚合物生物缀合物通过流式细胞仪上如BD Biosciences定义的染色指数来评价。参见，例如，H.Maeker和J.Trotter,BD Biosciences Application Note:"Selecting Reagents for Multicolour Flow Cytometry"，2009年9月。染色指数报告了聚合物亮度(非特异性结合)的量度。流式细胞术提供了一种测量特定微球上特定表型的细胞或感兴趣的分析物的方法。这可以通过直接标记第一抗体来实现，或者如果期望信号放大，则可以通过二抗或亲和素-生物素与亲和素-聚合物缀合物的复合来实现。取足够量的感兴趣的细胞，离心，在DPBS+0.2％BSA和0.05％NaN3中洗涤，然后重悬于芴聚合物缀合物的染色缓冲液中。
对于一次温育，将细胞与对感兴趣的抗原有特异性的一次缀合物一起温育，阴性细胞用作阴性非特异性结合参照。对照群体或建立的商用缀合物用作阳性对照。一抗-聚合物缀合物在10-500nM体积稀释的浓度下温育30分钟。
对于二抗标记，将针对感兴趣的抗原的未标记的一抗以1-50μg/ml或其他滴定量温育。一次温育后，用5倍体积的染色缓冲液冲洗细胞并离心3-5分钟。物种反应性二次芴聚合物缀合物在10-500nM的体积稀释浓度下温育30-60分钟。二次温育后，用3-5倍体积的染色缓冲液冲洗细胞并离心3-5分钟。将细胞重悬于DPBS+0.2％BSA、0.05％叠氮化钠中进行测试。
对于链霉抗生物素蛋白-聚合物缀合物标记，将细胞与针对感兴趣的标志物的生物素化的一抗一起温育，如上文对于二抗标记所详述的，而不是未标记的一抗。一次洗涤后，将细胞重悬并与1-100nM体积稀释的链霉抗生物素蛋白-聚合物缀合物一起温育30分钟。二次温育后，用5倍体积的染色缓冲液冲洗细胞，离心3-5分钟。将细胞重悬用于测试。如果需要进一步的信号放大，可以将细胞与未标记的一抗一起温育，虽然再与物种反应性生物素化的二抗一起温育，之后与链霉抗生物素蛋白缀合物一起温育。
应当理解，使用的特定抗体缀合物以及使用的具体反应组分和特定反应条件可对所得结果产生影响。应进行常规实验，以确定优选的反应组分，诸如缓冲液或裂解液，以及反应条件，包括染色时间和温度。此类测定条件的常规优化是基于免疫染色的测定领域中的标准实践。
实例20.MTA修饰(胺)
将抗体以10mg/mL溶解在0.1M碳酸氢钠(pH 8.5)中，并将溶液形式的1mg抗体转移到微量离心小瓶中。将四嗪琥珀酰亚胺以10mg/mL溶解在无水DMSO中并在室温下将1.08uL添加到抗体溶液中。将反应混合物短暂涡旋混合，然后置于低速涡旋振荡器上反应1小时。在1小时结束时，通过在PD-10柱上脱盐到3mM磷酸盐缓冲液、35mM NaCl pH7.4中，从游离的四嗪琥珀酰亚胺中纯化经修饰的抗体，并收集到Amicon Ultra-4 30k分子量浓缩器中并浓缩至>5mg/mL。经修饰的抗体储存在4℃直至缀合。
实例21.MTA修饰(巯基)
将抗体以10mg/mL溶解在10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，并将溶液形式的1mg抗体转移到微量离心小瓶中。通过添加1mL的1M二硫苏糖醇(DTT)溶液，短暂涡旋并允许在室温下静置30分钟来还原抗体。然后将该溶液在PD-10柱(GE Lifesciences)上脱盐，以将DTT去除到3mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中。然后在30kDa浓缩器(Millipore Amicon Ultra)上将脱盐的还原抗体浓缩至10mg/mL。向还原抗体溶液中添加2.3mL的10mg/mL马来酰亚胺-MTA在DMSO中的溶液。将溶液短暂涡旋，并置于涡旋振荡器上，在室温(RT)下反应90分钟。在90分钟时，通过在PD-10柱上脱盐到3mM磷酸盐缓冲液、35mM NaCl pH 7.4中，从游离马来酰亚胺-MTA中纯化经修饰的抗体，并收集到Amicon Ultra-4 30k分子量浓缩器中并浓缩至>5mg/mL。经修饰的抗体储存在4℃直至缀合。
实例22.生物正交聚合物-抗体缀合
将环辛烯反应性聚合物以5mg/mL储存在-20℃的DI H2O中，并在使用前立即解冻。将MTA修饰的抗体(1mg,0.167mL)转移到含有0.104mL的3mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)的微量离心小瓶中。添加聚合物溶液(0.133mL,0.67mg聚合物)，接着添加乙醇(0.1mL)。用移液管快速混合溶液。将反应混合物置于涡旋振荡器上，在室温下避光反应2小时。2小时后，通过添加6.7mL的10mM环辛烯淬灭剂淬灭反应混合物，并允许在纯化前再振荡10分钟。
实例23.尺寸排阻(SEC)纯化
使用Bio-Rad NGC FPLC色谱***，在Superdex 200Increase尺寸排阻色谱柱(24mL)上从游离抗体中纯化抗体-聚合物缀合物。首先将缀合物以20,238rcf离心5分钟，以使任何沉淀的或交联的缀合物团块化。然后将上清液以<1.5％v/v注射到24mL Superdex200Increase 10/300GL柱(GE Lifesciences)上，并用10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)以1.0mL/min洗脱。收集280nm处的第一洗脱峰，该第一洗脱峰含有抗体-聚合物缀合物，并且丢弃任何游离聚合物和任何后续峰。(参见图2)
接头附接的聚合物的光学特性如图3-图8所示。
实例24.细胞刺激
一些抗原的检测需要刺激细胞以上调表达。对于CD25，在含有10％胎牛血清、1:100青霉素/链霉素、1:100丙酮酸钠和1:1000 2-巯基乙醇(cRPMI)的RPMI-1640中培养正常的人外周血细胞，并以1:500的稀释度添加植物凝集素保持3天。对于TNFα，将正常的人外周血细胞在具有含佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯、离子霉素、布雷菲德菌素A和莫能菌素的混合物的1:500稀释液的cRPMI中培养4-6小时。对于Ki-67，将正常的人外周血细胞在具有板结合的抗人CD3和可溶性抗人CD28单克隆抗体的cRPMI中培养3天。在指定的刺激持续时间后，收获细胞并在流式细胞术染色缓冲液中洗涤，然后进行抗体染色。
实例25.小鼠CD4(克隆RM4-5)、人CD20(克隆2H7)和人CD25(克隆BC96)的表面染色
为了对细胞表面上发现的抗原进行染色，将小鼠脾细胞或正常的人外周血细胞的单细胞悬液以107个细胞/mL重悬于含有3％胎牛血清和0.09％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水(流式细胞术染色缓冲液)中。将一百微升的细胞悬浮液等分到12x75 mm的试管中，并按照制造商推荐的最佳浓度添加别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗体。向细胞中添加终浓度为0.0006-0.01mg/mL的聚合物缀合抗体。将细胞和抗体的混合物在4℃下温育30分钟，然后向细胞中添加3mL流式细胞术染色缓冲液。将细胞以600xg离心5分钟并弃去上清液。将细胞团块重悬于至多0.4mL的流式细胞术染色缓冲液中，然后在
Figure BDA0003809650660000622
SORP流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company)上分析细胞，该流式细胞仪配备有紫外(355nm)和红色(640nm)激光线和适于检测APC(670/14)以及基础和串联聚合物染料(分别为379/28，和585/15和820/60)的带通滤光片。收集最少10,000个淋巴细胞。使用FlowJo软件(Becton,Dickinson andCompany)分析数据。
实例26.人TNF α(克隆MAb11)的细胞内染色
对于TNFα的细胞内染色和检测，将经过刺激的正常的人外周血细胞的单细胞悬浮液以107个细胞/mL重悬于流式细胞术染色缓冲液中。将一百微升的细胞悬浮液等分到12x75 mm的试管中，并添加0.1mL基于甲醛的固定缓冲液。将细胞在室温下温育20-30分钟，然后添加3mL基于洗涤剂的透化缓冲液，将细胞以600xg离心5分钟并弃去上清液。用3mL透化缓冲液进行附加洗涤。将细胞重悬于0.1mL透化缓冲液中，然后以制造商推荐的最佳浓度添加APC或异硫氰酸荧光素(FITC)缀合抗体，将聚合物缀合抗体以0.0006-0.01mg/mL的终浓度添加到细胞中，然后将样品在室温下温育30分钟。用3mL透化缓冲液洗涤样品两次。最后一次洗涤后，将细胞团块重悬于至多0.4mL的流式细胞术染色缓冲液中，然后在
Figure BDA0003809650660000621
SORP流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company)上分析样品，该流式细胞仪配备有紫外(355nm)、红色(640nm)和蓝色(488nm)激光线和适于检测APC(670/14)、FITC(530/30)以及基础和串联聚合物染料(分别为379/28和820/60)的带通滤光片。收集最少10,000个淋巴细胞。使用FlowJo软件(Becton,Dickinson and Company)分析数据。
实例27.人Ki-67(克隆20Raj1)的细胞内染色
对于Ki-67的细胞内染色和检测，将经过刺激的正常的人外周血细胞的单细胞悬浮液以107个细胞/mL重悬于流式细胞术染色缓冲液中。将一百微升的细胞悬浮液等分到12x75 mm的试管中，并添加1mL基于甲醛和基于洗涤剂的固定/透化缓冲液。将细胞在室温下温育20-30分钟，然后添加3mL基于洗涤剂的透化缓冲液，将细胞以600xg离心5分钟并弃去上清液。用3mL透化缓冲液进行附加洗涤。将细胞重悬于0.1mL透化缓冲液中，然后以制造商推荐的最佳浓度添加APC缀合抗体，将聚合物缀合抗体以0.0006-0.01mg/mL的终浓度添加到细胞中，然后将样品在室温下温育30分钟。用3mL透化缓冲液洗涤样品两次。最后一次洗涤后，将细胞团块重悬于至多0.4mL的流式细胞术染色缓冲液中，然后在
Figure BDA0003809650660000632
SORP流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company)上分析样品，该流式细胞仪配备有紫外(355nm)和红色(640nm)激光线和适于检测APC(670/14)以及串联聚合物染料(820/60)的带通滤光片。收集最少10,000个淋巴细胞。使用FlowJo软件(Becton,Dickinson andCompany)分析数据。
图9-图11示出了基于芴并氧杂环庚三烯、芴并氮杂环庚三烯和芴并环庚烷的聚合物缀合抗体在流式细胞分析中的性能。
表4.代表性的基于芴的聚合物
Figure BDA0003809650660000631
Figure BDA0003809650660000641
*接头1是亚甲基，接头2是PEG4。
**上表中聚合物的结构如下：
Figure BDA0003809650660000642
Figure BDA0003809650660000651

Claims (41)

1.一种聚合物，所述聚合物包含式A的单体单元
Figure FDA0003809650650000011
其中X是所述聚合物中式A的单体单元的数目，其中所述式A的单体单元是连续的或非连续的并且其中X为10至200，
和一个或多个式B的单体单元
Figure FDA0003809650650000012
其中Y是所述聚合物中式B的单体单元的数目，其中所述式B的单体单元是连续的或非连续的并且其中Y为0至100，
以及任选的一个或多个式C的单体单元
Figure FDA0003809650650000021
其中Z是所述聚合物中式C的单体单元的数目，其中所述式C的单体单元是连续的或非连续的并且其中Z为0至100，
其中A是O、S、N或C；
其中SG1、SG2、SG5、SG6各自独立地是氢、烷基、氨基、磺基、聚乙二醇(PEG)、水溶性基团、受体、接头(L)和/或经由接头缀合的生物底物(L-BS)；
其中R1不存在或是氢、烷基、氨基、磺基、聚乙二醇(PEG)、水溶性基团、受体、接头(L)和/或经由接头缀合的生物底物(L-BS)；
其中R2是氢、烷基、氨基、磺基、聚乙二醇(PEG)、水溶性基团、受体、接头(L)和/或经由接头缀合的生物底物(L-BS)；
其中SG3、SG4、R3和R4独立地是氢、卤素、氨基、PEG、接头(L)和/或经由接头缀合的生物底物(L-BS)；
其中所述聚合物末端独立地是氢、烷基、卤素、硼羰基、芳基、杂芳基基团或L-BS；
其中X与Y+Z的比率为0.3-1.0，并且
其中X+Y+Z的总和为15至50。
2.如权利要求1所述的聚合物，其中Y以至少40％存在于所述聚合物中。
3.如权利要求1所述的聚合物，其中所述聚合物的激发峰接近350nm。
4.如权利要求1所述的聚合物，其中式A、式B和式C的所述单体单元彼此直接连接。
5.如权利要求1所述的聚合物，其中所述受体包括荧光团或荧光染料，并且所述受体与所述聚合物的比率为0.01-0.2。
6.如权利要求1所述的聚合物，其中所述接头包括烷基、PEG、羧酰胺、硫醚、酯、亚胺、肼、肟、烷基胺、醚、芳基胺、硼酸酯、N-酰基脲或酸酐、铂络合物、氨基三嗪、三嗪基醚、脒、脲、尿烷、硫脲、亚磷酸酯、甲硅烷基醚、磺酰胺、磺酸酯、1,2,3-***、哒嗪、噻唑烷、2-二苯基膦酰基-苯甲酰胺、异噁唑或琥珀酰亚胺基团。
7.如权利要求1所述的聚合物，其中：
(i)SG1、SG2、SG5和SG6独立地表示表PEG、烷基、羧基烷基、磺酰基烷基、膦酰基烷基、氨基烷基或L-BS；和/或
(ii)SG3、SG4、R3和R4独立地表示氢、卤素、PEG或接头(L)，和/或
(iii)L是烷基链或PEG链；和/或
(iv)BS是抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、核酸或碳水化合物；和/或
(v)氢、烷基、卤素、硼羰基、芳基、杂芳基或L-BS；和/或
(vi)X、Y和Z各自是独立地选自0至200的整数，X/Y+Z的比率>0.4并且X+Y+Z的总和为20至200。
8.如权利要求1所述的聚合物，其中SG1、SG2、SG5和SG6独立地是PEG3至PEG30。
9.如权利要求1所述的聚合物，其中：SG1-SG6和R1-R4独立地表示氢、羧基芳基或L-BS。
10.如权利要求1所述的聚合物，其中所述式B的单体单元包含
Figure FDA0003809650650000031
其中Y是所述聚合物中式B的单体单元的数目，其中所述式B的单体单元是连续的或非连续的并且其中Y为0至100；并且
其中SG3、SG4、R3和R4独立地是烷基、氟、氢、聚乙二醇(PEG)或受体。
11.如权利要求1所述的聚合物，其中A是C；并且其中R1和R2各自是聚乙二醇(PEG)。
12.如权利要求1所述的聚合物，其中A是N；并且其中R1不存在且R2是
Figure FDA0003809650650000032
13.如权利要求1所述的聚合物，其中所述受体还包括荧光素、罗丹明、对甲氨基酚、花青、BODIPY、方酸菁、香豆素、苝二酰亚胺、二酮吡咯并吡咯、卟啉或酞菁。
14.如权利要求1所述的聚合物，其中式A包括
Figure FDA0003809650650000041
Figure FDA0003809650650000051
其中m和n为5至20。
15.如权利要求1所述的聚合物，其中式B包括
Figure FDA0003809650650000052
其中m为5至20。
16.如权利要求1所述的聚合物，其中所述受体包括：
Figure FDA0003809650650000061
Figure FDA0003809650650000071
Figure FDA0003809650650000081
17.一种聚合物-抗体缀合物，所述聚合物-抗体缀合物包含
如权利要求1所述的一种或多种聚合物和抗体，其中所述一种或多种聚合物与所述抗体缀合。
18.如权利要求17所述的聚合物-抗体缀合物，其中所述抗体是山羊抗小鼠IgG抗体、山羊抗兔IgG抗体、山羊抗人IgG抗体、驴抗小鼠IgG抗体、驴抗兔IgG抗体、驴抗人IgG抗体、鸡抗小鼠IgG抗体、鸡抗兔IgG抗体或鸡抗人IgG抗体。
19.如权利要求17所述的聚合物-抗体缀合物，其中所述聚合物的单体A包括芴并氧杂环庚三烯、芴并氮杂环庚三烯或芴并环庚烷。
20.一种检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：
a)在包含如权利要求1所述的聚合物的检测试剂将结合所述分析物的条件下，将所述样品与所述检测试剂合并；以及
b)通过荧光检测所述检测试剂结合的分析物。
21.如权利要求20所述的方法，其中BS是抗体。
22.如权利要求20所述的方法，其中BS是抗地高辛抗体。
23.如权利要求20所述的方法，其中BS是山羊抗小鼠IgG抗体、山羊抗兔IgG抗体、山羊抗人IgG抗体、驴抗小鼠IgG抗体、驴抗兔IgG抗体、驴抗人IgG抗体、鸡抗小鼠IgG抗体、鸡抗兔IgG抗体或鸡抗人IgG抗体。
24.如权利要求20所述的方法，其中BS是抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、抗生物素蛋白DN或抗生物素蛋白D部分。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述分析物是在细胞表面上表达的靶蛋白。
26.如权利要求20所述的方法，其中所述分析物是细胞内表达的靶蛋白。
27.一种检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：
a)在包含如权利要求17所述的聚合物-抗体缀合物的检测试剂将结合所述分析物的条件下，将所述样品与所述检测试剂合并；以及
b)通过荧光检测所述检测试剂结合的分析物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述抗体是山羊抗小鼠IgG抗体、山羊抗兔IgG抗体、山羊抗人IgG抗体、驴抗小鼠IgG抗体、驴抗兔IgG抗体、驴抗人IgG抗体、鸡抗小鼠IgG抗体、鸡抗兔IgG抗体或鸡抗人IgG抗体。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述分析物是在细胞表面上表达的靶蛋白。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述分析物是细胞内表达的靶蛋白。
31.如权利要求27所述的方法，其中所述聚合物的单体A包括芴并氧杂环庚三烯、芴并氮杂环庚三烯或芴并环庚烷。
32.一种用于检测样品中的分析物的***，所述***包括：
包含如权利要求17所述的聚合物-抗体缀合物的检测试剂，
一个或多个细胞，和光学响应装置。
33.如权利要求32所述的***，其中所述抗体是山羊抗小鼠IgG抗体、山羊抗兔IgG抗体、山羊抗人IgG抗体、驴抗小鼠IgG抗体、驴抗兔IgG抗体、驴抗人IgG抗体、鸡抗小鼠IgG抗体、鸡抗兔IgG抗体或鸡抗人IgG抗体。
34.如权利要求32所述的***，其中所述聚合物的单体A包括芴并氧杂环庚三烯、芴并氮杂环庚三烯或芴并环庚烷。
35.如权利要求32所述的***，其中所述分析物是在细胞表面上表达的靶蛋白。
36.如权利要求32所述的***，其中所述分析物是细胞内表达的靶蛋白。
37.如权利要求32所述的***，其中光学响应检测器是CCD相机、摄像机、摄影胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪。
38.一种试剂盒，所述试剂盒包含
如权利要求1的聚合物，所述聚合物包含选自选自由特异性结合对成员、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸聚合物、肽和蛋白质组成的组的缀合生物底物，以产生标记的生物底物，和
一种或多种缓冲剂。
39.如权利要求38所述的试剂盒，所述试剂盒还包含以下的一种或多种：检测试剂、用于纯化所得标记的生物底物的纯化介质、发光标准品、酶、酶抑制剂、有机溶剂或用于进行测定的说明书。
40.一种试剂盒，所述试剂盒包含
如权利要求17所述的聚合物抗体缀合物，和
一种或多种缓冲剂。
41.如权利要求40所述的试剂盒，所述试剂盒还包含以下的一种或多种：检测试剂、用于纯化所得标记的生物底物的纯化介质、发光标准品、酶、酶抑制剂、有机溶剂或用于进行测定的说明书。
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