CN115261292A

CN115261292A - 改造的克雷伯氏菌属细菌及其生产1,2-丙二醇的应用和方法

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Publication number: CN115261292A
Application number: CN202110474528.2A
Authority: CN
Inventors: 郝健; 孙少琦
Original assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Current assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Priority date: 2021-04-29
Filing date: 2021-04-29
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2041-04-29
Also published as: CN115261292B

Abstract

本发明公开了改造的克雷伯氏属细菌及其生产1,2‑丙二醇的应用和方法。所述改造的克雷伯氏属细菌为磷酸丙糖异构酶失活的克雷伯氏菌属；所述改造的克雷伯氏属还进一步包括高水平表达甲基乙二醛合酶(mgsA)基因、乙醇脱氢酶(yqhD)基因、乳醛酸还原酶(fucO)基因其中至少其一种基因；将改造的克雷伯氏菌属细菌接种到以甘油、葡萄糖等碳源的培养基中发酵培养，改造后的克雷伯氏属细菌可用于发酵生产1,2‑丙二醇。本发明提供的发酵生产1,2‑丙二醇的方法，可利用甘油、葡萄糖等底物合成1,2‑丙二醇。

Description

改造的克雷伯氏菌属细菌及其生产1,2-丙二醇的应用和方法

技术领域

本发明属于微生物工程菌技术领域，具体涉及改造的克雷伯氏属细菌及其生产1,2-丙二醇的应用。

背景技术

1,2-丙二醇，是一种重要的商业化学品，在感光工业中用作低毒防冻剂、溶剂，在食品工业中用作润湿剂，在化妆品、制药领域中可用作润肤剂和香油的载体等。1,2-丙二醇是一种以中心碳原子为立体中心的三碳二醇，其构型包括(R)-1,2-丙二醇和(S)-1,2-丙二醇。它是一种高沸点的二醇，具有较强的亲水性。1,2-丙二醇的生产方法目前主要包括石油化工生产和微生物转化法生产。石油化工生产的工艺过程为：蒸汽裂解石油产物丙烯转化为环氧丙烷，环氧丙烷进一步水解为1,2-丙二醇。该工艺的主要缺陷是：会产生有毒中间体和副产物。随着新生物工艺、新菌株、代谢和基因工程的发展，生物法生产的1,2-丙二醇可以与石油化工生产的1,2-丙二醇相竞争。此外，生物法生产工艺具有成本效益的潜力，可节约投资成本、能源需求、处理成本和原材料消耗。生物法生产1,2-丙二醇已经有多年的研究和技术开发，包括热解梭菌(Clostridium thermosaccharolyticum)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，大肠杆菌(Escherichia coli)，细长聚球藻(Synechoccuselongates)，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)等。

1,2-丙二醇的生物合成路径可以分为两个步骤。第一个步骤是合成磷酸二羟丙酮，磷酸二羟丙酮在细胞中是一种常见的中间代谢物，在以甘油、葡萄糖等为碳源时都会产生。甘油脱氢形成二羟基丙酮后在二羟基丙酮激酶的催化下合成磷酸二羟丙酮，葡萄糖则是通过糖酵解途径产生磷酸二羟丙酮。第二步是磷酸二羟基丙酮向1，2-丙二醇的转化，甲基乙二醛合酶可催化磷酸二羟丙酮转化为丙酮醛。丙酮醛向1,2-丙二醇转化的反应有两条途径，第一条途径是丙酮醛还原为丙酮醇后，进一步还原为1,2-丙二醇；第二条途径为丙酮酸转化为乳醛后，进而还原为1,2-丙二醇。

克雷伯氏属细菌(genus Klebsiella)是一类在自然界广泛分布的微生物，包括克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)，克雷伯氏产酸杆菌(Klebsiella oxytoca)和克雷伯氏变栖杆菌(Klebsiella variicola)。这个菌属的细菌具有生长旺盛、能利用多种碳源进行生长等特点。目前克雷伯氏属细菌用于生产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、2-酮基葡萄糖酸和乙偶姻等化学产品。

发明内容

本发明的目的是，提供改造的克雷伯氏属细菌及其生产1,2-丙二醇的应用和方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

本发明提供的改造的克雷伯氏属细菌，为磷酸丙糖异构酶失活的克雷伯氏菌属。

作为优选实施方案，所述磷酸丙糖异构酶失活的克雷伯氏菌属通过敲除磷酸丙糖异构酶基因tpiA获得。

作为优选实施方案，所述改造的克雷伯氏属细菌还包括甲基乙二醛合酶基因(mgsA)、乙醇脱氢酶基因(yqhD)、乳醛酸还原酶基因(fucO)其中至少其一种基因的高水平表达。

优选地，所述改造的克雷伯氏属细菌还进一步包括含有高表达甲基乙二醛合酶基因的质粒。

优选地，所述改造的克雷伯氏属细菌还进一步包括含有高表达乙醇脱氢酶基因的质粒。

优选地，所述改造的克雷伯氏属细菌还进一步包括含有高表达乳醛酸还原酶基因的质粒。

作为优选的实施方案，所述改造的克雷伯氏属细菌为磷酸丙糖异构酶失活同时高表达甲基乙二醛合酶基因和乙醇脱氢酶基因的克雷伯氏属细菌。

作为优选的实施方案，所述改造的克雷伯氏属细菌为磷酸丙糖异构酶失活同时高表达甲基乙二醛合酶基因和乳醛酸还原酶基因的克雷伯氏属细菌。

作为优选的实施方案，所述改造的克雷伯氏属细菌为磷酸丙糖异构酶失活同时高表达乙醇脱氢酶基因和乳醛酸还原酶基因的克雷伯氏属细菌。

作为优选的实施方案，所述改造的克雷伯氏属细菌为磷酸丙糖异构酶失活同时高表达甲基乙二醛合酶基因、乳醛酸还原酶基因和乙醇脱氢酶基因的克雷伯氏属细菌。

所述磷酸丙糖异构酶是指能够催化磷酸二羟丙酮和甘油醛-3-磷酸之间转换的酶，其编码基因的名称为tpiA。其在克雷伯氏肺炎杆菌342(也称为克雷伯氏变栖杆菌)基因组(GenBank：CP000964.1；NC_011 283)中的基因阅读框如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列Genbank编号为(ACI11956.1)。

所述甲基乙二醛合酶是指能够催化磷酸二羟丙酮向丙酮醛转化的酶，其编码基因的名称为mgsA。其在克雷伯氏肺炎杆菌342基因组中的基因阅读框如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列Genbank编号为(ACI06689.1)。

所述乙醇脱氢酶是指能够将丙酮醛还原为丙酮醇的酶，其编码基因的名称为yqhD。其在克雷伯氏肺炎杆菌342基因组中的基因阅读框如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列Genbank编号为(ACI08934.1)。

所述乳醛酸还原酶是指能够将乳醛还原为1,2-丙二醇的酶，其编码基因的名称为fucO。其在克雷伯氏肺炎杆菌342基因组中的基因阅读框如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列Genbank编号为(ACI11629.1)。

本发明还提供了所述改造的克雷伯氏属细菌在生产1,2-丙二醇的应用。

本发明还提供了所述改造的克雷伯氏属细菌生产1,2-丙二醇的方法，该方法为：将改造的克雷伯氏属细菌接种到含碳源的培养基中，进行发酵培养，菌体会利用碳源合成1,2-丙二醇。

优选地，所述发酵培养基的组成包括：碳源10-50g/L，氮源1-30g/L，无机盐0-10g/L。

所述的碳源为具有转化合成磷酸二羟丙酮能力的碳源，包括丙三醇(甘油)，以及葡萄糖、蔗糖、岩藻糖等糖质碳源。

所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。

所述无机盐选择钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。

优选地，所述发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1，野生型克雷伯氏属细菌利用甘油、葡萄糖进行发酵培养时不生产1,2-丙二醇，其主要代谢产物为1,3-丙二醇及2,3-丁二醇。本发明发现：在磷酸丙糖异构酶缺失的克雷伯氏菌株中，利用甘油代谢时，会将甘油转化为1,2-丙二醇，且没有1,3-丙二醇的产生。利用葡萄糖代谢时，会有少量1,2-丙二醇产生。实验结果表明：甘油培养基与葡萄糖培养基相比更适合1,2-丙二醇的合成，同时过表达甲基乙二醛合酶基因mgsA、乙醇脱氢酶基因yqhD以及乳醛酸还原酶基因的菌株更适合1,2-丙二醇的积累。

2，本发明提供了一种生物法合成1,2-丙二醇的新途径，以甘油为发酵原料时，能够获得较高浓度积累的1,2-丙二醇产物，具有工业化生产前景。为1,2-丙二醇的工业化生产提供了新的选择路径。

具体实施方法

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

实施例1

利用基因重组的方法构建磷酸丙糖异构酶基因失活的克雷伯氏属菌株，来实现磷酸丙糖异构酶活性的失活。

克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366菌株(该菌株也称为TUAC01，AC01)，CGMCC1.6366菌株已经在文献(Journal of Microbiology&Biotechnology.201239:1219-1226)中公开。该菌株是一株用于生产1，3-丙二醇，2，3-丁二醇，乙偶姻和2-酮基葡萄糖酸的菌株。该菌分离来自土壤，分离过程及性状描述见(World Journal of MicrobiologyBiotechnology 2008,24:1731-1740)。

1)扩增tpiA基因上下游两端长同源臂基因序列以及抗性片段基因序列。以tpiA-Q600-s：CCCGGGGATCCTCTAGAGATCCGGCGCGCCGAGCTTTG(SEQ ID No.5所示)、tpiA-Q600-a：GCAGCTCCAGCCTACATTTAATTCTCCACGCTACTTAAGCG(SEQ ID No.6所示)和tpiA-H600-s：ATCCCCGGAATTCCGCTTTTCCCGGCGGC(SEQ ID No.7所示)、tpiA-H600-a：CATGCCTGCAGGTCGACGATTAACGCTGCTGCCGCGGG(SEQ ID No.8所示)为特异性引物，以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366基因组DNA为模板，经PCR扩增分别得到tpiA基因前后各600bp的DNA序列。以tpiA-FRT-s：TAAATGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQ ID No.9所示)、tpiA-FRT-a：AAAAGCGGAATTCCGGGGATCCGTCGA(SEQ ID No.10所示)为特异性引物，以PIJ773质粒(商业产品)为模板进行PCR扩增，得到两端含FRT位点中间带安普霉素抗性的aac(3)IV基因片段。以pMD18-T-s：ATCGTCGACCTGCAGGCA(SEQ ID No.11所示)和pMD18-T-a：ATCTCTAGAGGATCCCCGGGT(SEQ ID No.12所示)为特异性引物，以质粒pMD-18T simple(商业产品)为模板进行PCR扩增，得到线性化的pMD18-T基因片段。

2)基因片段的重组连接使用的是ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中的操作方法。将步骤1中扩增的基因片段进行重组连接。之后化转入DH5α感受态细胞中。

3)提取步骤2中的阳性克隆DH5α-T-aac(3)IV中的质粒pMD18T-aac(3)IV为模板，以tpiA-Q600-s、tpiA-H600-a为特异性引物扩增出DNA片段A1。DNA片段A1两端具有tpiA基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段A1中间具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段A1用于进行克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366染色体上tpiA基因重组的线性DNA片段。

4)利用转化将制备的DNA片段A1转入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中，DNA片段A1与染色体上的磷酸丙糖异构酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体磷酸丙糖异构酶重组失活的菌株，具体步骤如下：

线性DNA片段A1电击转化CGMCC1.6366-pDK6-red菌株感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为kp-ΔtpiA-pDK6-red，该菌株的磷酸丙糖异构酶基因通过同源重组而失活。

5)利用转化将制备的DNA片段A1转入到克雷伯氏产酸杆菌M5a1中，DNA片段A1与染色体上的磷酸丙糖异构酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体磷酸丙糖异构酶重组失活的菌株，具体步骤如下：

线性DNA片段A1电击转化M5a1-pDK6-red感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为Ko-ΔtpiA-pDK6-red，该菌株的磷酸丙糖异构酶基因通过同源重组而失活。

6)利用转化将制备的DNA片段A1转入到克雷伯氏变栖杆菌S12中，DNA片段A1与染色体上的磷酸丙糖异构酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体磷酸丙糖异构酶重组失活的菌株，具体步骤如下：

线性DNA片段A1电击转化S12-pDK6-red感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性基因，筛选获得的抗性菌株命名为Kv-ΔtpiA-pDK6-red，该菌株的磷酸丙糖异构酶基因通过同源重组而失活。

7)突变株中pDK6-red质粒的消除。将突变株kp-ΔtpiA-pDK6-red、ko-ΔtpiA-pDK6-red和kv-ΔtpiA-pDK6-red分别接种到LB试管培养基，传代培养，在无抗固体LB培养基平板上划线分离，挑选无抗板上可以生长而含卡那霉素抗性平板上不能生长的菌落，即为pDK6-red质粒已消除的突变菌株，获得的菌株命名为kp-ΔtpiA、ko-ΔtpiA和kv-ΔtpiA。

实施例2

构建在克雷伯氏属细菌中失活磷酸丙糖异构酶并高表达甲基乙二醛合酶的菌株。

1)表达质粒的线性化。在pDK6质粒上的HindⅢ以及EcoRⅠ限制性酶切位点上用特异性酶切开，将环状的表达质粒线性化。

2)扩增过表达的目的基因。以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366菌株为模板，以LJ-mgsA-s：TCACACAGGAAACAGAATTCATGGAACTGACAACACGTACCCT(SEQ ID No.13所示)以及LJ-mgsA-a：CCGCCAAAACAGCCAAGCTTTTATTTCAGGCGCTCGGCA(SEQ ID No.14所示)为引物进行PCR扩增，可获得克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366中的甲基乙二醛合酶mgsA片段。

3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段mgsA与双酶切开的质粒片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中。

4)过表达克雷伯氏菌的构建。在构建完成pDK6-mgsA质粒后，按照质粒抽提试剂盒的方法将目标质粒从DH5α中提取并分别电转入实施例1中制备的菌株kp-ΔtpiA、ko-ΔtpiA和kv-ΔtpiA的感受态细胞中，获得的菌株为磷酸丙糖异构酶失活并高表达甲基乙二醛合酶的改造菌株，分别命名为kp-ΔtpiA-(mgsA)、ko-ΔtpiA-(mgsA)和kv-ΔtpiA-(mgsA)。

实施例3

构建在克雷伯氏属细菌中失活磷酸丙糖异构酶并高表达乙醇脱氢酶的菌株。

2)扩增过表达的目的基因。以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366菌株为模板，以LJ-yqhD-s：TCACACAGGAAACAGAATTCATGAATAATTTTGACCTGCATACCC(SEQ ID No.15所示)以及LJ-yqhD-a：CCGCCAAAACAGCCAAGCTTTTAGCGGGCAGCCTCGTA(SEQ ID No.16所示)为引物进行PCR扩增，可获得克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366中的乙醇脱氢酶yqhD片段。

3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段yqhD与双酶切开的质粒片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中。

4)过表达克雷伯氏菌的构建。在构建完成pDK6-yqhD质粒后，按照质粒抽提试剂盒的方法将目标质粒从DH5α中提取并分别电转入实施例1中制备的菌株kp-ΔtpiA、ko-ΔtpiA和kv-ΔtpiA的感受态细胞中，获得的菌株为磷酸丙糖异构酶失活并高表达乙醇脱氢酶的改造菌株，分别命名为kp-ΔtpiA-(yqhD)、ko-ΔtpiA-(yqhD)和kv-ΔtpiA-(yqhD)。

实施例4

构建在克雷伯氏属细菌中失活磷酸丙糖异构酶并高表达乳醛酸还原酶的菌株。

2)扩增过表达的目的基因。以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366菌株为模板，以LJ-fucO-s：TCACACAGGAAACAGAATTCATGGCAAACCGAATGATCCTC(SEQ ID No.17所示)以及LJ-fucO-a：CCGCCAAAACAGCCAAGCTTTCACCAGGCCGCCTGATA(SEQ ID No.18所示)为引物进行PCR扩增，可获得克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366中的乳醛酸还原酶fucO片段。

3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段fucO与双酶切开的质粒片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中。

4)过表达克雷伯氏菌的构建。在构建完成pDK6-fucO质粒后，按照质粒抽提试剂盒的方法将目标质粒从DH5α中提取并分别电转入实施例1中制备的菌株kp-ΔtpiA、ko-ΔtpiA和kv-ΔtpiA的感受态细胞中，获得的菌株为磷酸丙糖异构酶失活并高表达乳醛酸还原酶的改造菌株，分别命名为kp-ΔtpiA-(fucO)、ko-ΔtpiA-(fucO)和kv-ΔtpiA-(fucO)。

实施例5

构建在克雷伯氏属细菌中失活磷酸丙糖异构酶并高表达甲基乙二醛合酶和乙醇脱氢酶的菌株。

1)表达质粒的线性化。以实施例3中的质粒pDK6-yqhD为模板，以linear-PDK-s：AAGCTTGGCTGTTTTGGCG(SEQ ID No.19所示)和linear-PDK-a：GAATTCTGTTTCCTGTGTGAAATTG(SEQ ID No.20所示)为引物进行PCR扩增，扩增后的片段即为线性化的pDK6-yqhD。

2)扩增过表达的目的基因。以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366菌株为模板，以LJ-mgsA-s和LJ-mgsA-a(实施例2)为引物进行PCR扩增，可获得克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中的甲基乙二醛合酶mgsA片段。

3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段mgsA与线性化质粒片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中。

4)过表达克雷伯氏菌的构建。在构建完成pDK6-mgsA-yqhD质粒后，按照质粒抽提试剂盒的方法将目标质粒从DH5α中提取并分别电转入实施例1中制备的菌株kp-ΔtpiA、ko-ΔtpiA和kv-ΔtpiA的感受态细胞中，获得的菌株为磷酸丙糖异构酶失活并高表达甲基乙二醛合酶和乙醇脱氢酶的改造菌株，分别命名为kp-ΔtpiA-(mgsA-yqhD)、ko-ΔtpiA-(mgsA-yqhD)和kv-ΔtpiA-(mgsA-yqhD)。

实施例6

构建在克雷伯氏属细菌中失活磷酸丙糖异构酶并高表达甲基乙二醛合酶和乙醛酸还原酶的菌株。

1)表达质粒的线性化。以实施例4中的质粒pDK6-fucO为模板，以linear-PDK-s和linear-PDK-a(实施例5)为引物进行PCR扩增，扩增后的片段即为线性化的pDK6-fucO。

3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段mgsA与线性化质粒片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中，通过Kan^r抗性的平板进行筛选阳性克隆。

4)过表达克雷伯氏菌的构建。在构建完成pDK6-mgsA-fucO质粒后，按照质粒抽提试剂盒的方法将目标质粒从DH5α中提取并分别电转入实施例1中制备的菌株kp-ΔtpiA、ko-ΔtpiA和kv-ΔtpiA的感受态细胞中，获得的菌株为磷酸丙糖异构酶失活并高表达甲基乙二醛合酶和乙醛酸还原酶的改造菌株，分别命名为kp-ΔtpiA-(mgsA-fucO)、ko-ΔtpiA-(mgsA-fucO)和kv-ΔtpiA-(mgsA-fucO)。

实施例7

构建在克雷伯氏属细菌中失活磷酸丙糖异构酶并高表达乙醇脱氢酶和乙醛酸还原酶的菌株。

2)扩增过表达的目的基因。以克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366菌株为模板，以LJ-yqhD-s和LJ-yqhD-a(实施例3)为引物进行PCR扩增，可获得克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366中的乙醇脱氢酶yqhD片段。

3)目的基因与线性化载体相连。根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒中(商业产品)的操作步骤，将扩增出的目的基因片段yqhD与线性化质粒片段连接成环。将重组产物化转入DH5α感受态细胞中。

4)过表达克雷伯氏菌的构建。在构建完成pDK6-yqhD-fucO质粒后，按照质粒抽提试剂盒的方法将目标质粒从DH5α中提取并电转入实施例1中制备的菌株kp-ΔtpiA、ko-ΔtpiA和kv-ΔtpiA的感受态细胞中，获得的菌株为磷酸丙糖异构酶失活并高表达乙醇脱氢酶和乙醛酸还原酶的改造菌株，分别命名为kp-ΔtpiA-(yqhD-fucO)、ko-ΔtpiA-(yqhD-fucO)和kv-ΔtpiA-(yqhD-fucO)。

实施例8

构建在克雷伯氏属细菌中失活磷酸丙糖异构酶并高表达甲基乙二醛合酶、乙醇脱氢酶和乙醛酸还原酶的菌株。

1)表达质粒的线性化。以实施例7中的质粒pDK6-yqhD-fucO为模板，以linear2-PDK-s：TCGTGTCGCTCAAGGCGC(SEQ ID No.21)和linear2-PDK-a：ATTATGCAGTGATTTACGACCTGC(SEQ ID No.22)为引物进行PCR扩增，扩增后的片段即为线性化的pDK6-yqhD-fucO。

2)扩增过表达的目的基因。以实施例2中构建的pDK6-mgsA为模板，以LJ2-mgsA-s：GTCGTAAATCACTGCATAATTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGC(SEQ ID No.23)和LJ2-mgsA-a：GTGCGCCTTGAGCGACACGATTATTTCAGGCGCTCGGCA(SEQ ID No.24)为引物进行PCR扩增，可获得pDK6-mgsA质粒上的含有tac启动子的甲基乙二醛合酶片段。

4)过表达克雷伯氏菌的构建。在构建完成pDK6-mgsA-yqhD-fucO质粒后，按照质粒抽提试剂盒的方法将目标质粒从DH5α中提取并电转入实施例1中制备的菌株kp-ΔtpiA、ko-ΔtpiA和kv-ΔtpiA的感受态细胞中，获得的菌株为磷酸丙糖异构酶失活并高表达甲基乙二醛合酶、乙醇脱氢酶和乙醛酸还原酶的改造菌株，分别命名为kp-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)、ko-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)和kv-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)。

实施例9

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、克雷伯氏产酸杆菌M5a1、克雷伯氏变栖杆菌S12和实施例1-8中获得的改造菌株分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml发酵培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温37℃进行发酵培养。

培养基组分为：甘油30g/L，硫酸铵4g/L，酵母提取物1.5g/L,磷酸氢二钾0.69g/L，磷酸二氢钾0.25g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.01g/L。配好的培养基需在121℃下灭菌15min后使用。

在培养120小时后，对发酵液中组分的测定采用液相色谱和气相色谱法测定。液相色谱法测定，利用HPX-87H色谱柱对发酵液组分进行分离，利用视差和紫外检测器检测。流动相0.025mol/L硫酸水溶液，流速0.8ml/min，柱温箱65℃。对于1,2-丙二醇的定量分析，本次研究使用的是气相色谱法。内标为乙二醇，溶剂为乙醇。气相色谱分析使用岛津GC-2010Plus***，色谱柱为Agilent Technolngies公司的型号为HP-FFAP的气相色谱柱。氮气作为载气，进样器温度250℃，检测器温度280℃。气相运行程序为：在120℃条件下平衡1min，以20℃/min的速度升温到230℃，在230℃条件下保持1.3min，该程序的总时间为7.80min。相关物质的出峰时间为乙偶姻(1.4min)，2，3-丁二醇(2.1min和2.3min)，1,2-丙二醇(2.4)，乙二醇(2.6min)，1，3-丙二醇(3.4min)，甘油(6.0min)。各菌株发酵结果如表1-表3所示。

表1，克雷伯氏肺炎杆菌及其改造菌株摇瓶发酵实验结果

菌株	1,2-丙二醇(g/L)	1,3-丙二醇(g/L)
			克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366	0	9.9
kp-ΔtpiA	3.3	0
			kp-ΔtpiA-(mgsA)	4.2	0
kp-ΔtpiA-(yqhD)	4.7	0
			kp-ΔtpiA-(fucO)	4.1	0
kp-ΔtpiA-(mgsA-yqhD)	5.7	0
			kp-ΔtpiA-(mgsA-fucO)	5.1	0
kp-ΔtpiA-(yqhD-fucO)	4.6	0
			kp-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)	6.2	0

表2，克雷伯氏产酸杆菌及其改造菌株摇瓶发酵实验结果

菌株	1,2-丙二醇(g/L)	1,3-丙二醇(g/L)
			克雷伯氏产酸杆菌M5a1	0	8.1
ko-ΔtpiA	2.9	0
			ko-ΔtpiA-(mgsA)	2.9	0
ko-ΔtpiA-(yqhD)	4.3	0
			ko-ΔtpiA-(fucO)	4.0	0
ko-ΔtpiA-(mgsA-yqhD)	4.4	0
			ko-ΔtpiA-(mgsA-fucO)	4.6	0
ko-ΔtpiA-(yqhD-fucO)	4.2	0
			ko-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)	5.9	0

表3，克雷伯氏变栖杆菌及其改造菌株摇瓶发酵实验结果

菌株	1,2-丙二醇(g/L)	1,3-丙二醇(g/L)
			克雷伯氏变栖杆菌S12	0	7.6
kv-ΔtpiA	3.0	0
			kv-ΔtpiA-(mgsA)	3.8	0
kv-ΔtpiA-(yqhD)	3.7	0
			kv-ΔtpiA-(fucO)	4.1	0
kv-ΔtpiA-(mgsA-yqhD)	5.5	0
			kv-ΔtpiA-(mgsA-fucO)	5.4	0
kv-ΔtpiA-(yqhD-fucO)	4.9	0
			kv-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)	5.8	0

野生型克雷伯氏属细菌利用甘油发酵不生产1,2-丙二醇，其主要代谢物为1,3-丙二醇。而在磷酸丙糖异构酶缺失的菌株中，则会将甘油代谢转化为1,2-丙二醇，且没有1,3-丙二醇的产生。在磷酸丙糖异构酶基因缺失的基础上，过表达1,2-丙二醇合成通路上的关键基因可以明显提高发酵液中1,2-丙二醇的浓度。其中关键基因包括编码甲基乙二醛合酶基因mgsA、乙醇脱氢酶基因yqhD以及乳醛酸还原酶基因fucO。相比于单个过表达基因的实验结果，过表达两个基因的菌株中的1,2-丙二醇的浓度更高，而同时过表达以上三个基因的菌株则更适合1,2-丙二醇的积累。相比于其它菌株，kp-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)、ko-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)和kv-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)则更适合作为1,2-丙二醇的生产菌株。

实施例10

将出发菌株克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1.6366、克雷伯氏产酸杆菌M5a1、克雷伯氏变栖杆菌S12和实施例1-8中获得的改造的菌株分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml发酵培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温37℃进行发酵培养。

培养基组分为：葡萄糖25g/L，硫酸铵4g/L，酵母提取物1.5g/L,磷酸氢二钾0.69g/L,磷酸二氢钾0.25g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.01g/L。配好的培养基需在115℃下灭菌15min后使用。

在培养30小时后，对发酵液中组分的测定采用液相色谱和气相色谱法测定。检测方法如实施例9所示。各菌株发酵结果如表4-表6所示。

表4，克雷伯氏肺炎杆菌及其改造菌株摇瓶发酵实验结果

菌株	1,2-丙二醇(g/L)	2,3-丁二醇(g/L)
			克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1.6366	0	3.6
kp-ΔtpiA	0.1	2.0
			kp-ΔtpiA-(mgsA)	0.3	1.8
kp-ΔtpiA-(yqhD)	0.3	1.8
			kp-ΔtpiA-(fucO)	0.2	1.9
kp-ΔtpiA-(mgsA-yqhD)	0.4	1.7
			kp-ΔtpiA-(mgsA-fucO)	0.4	1.9
kp-ΔtpiA-(yqhD-fucO)	0.4	1.6
			kp-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)	0.4	1.9

表5，克雷伯氏产酸杆菌及其改造菌株摇瓶发酵实验结果

表6，克雷伯氏变栖杆菌及其改造菌株摇瓶发酵实验结果

菌株	1,2-丙二醇(g/L)	2,3-丁二醇(g/L)
			克雷伯氏变栖杆菌S12	0	3.3
kv-ΔtpiA	0.2	1.5
			kv-ΔtpiA-(mgsA)	0.3	1.5
kv-ΔtpiA-(yqhD)	0.4	1.4
			kv-ΔtpiA-(fucO)	0.2	1.3
kv-ΔtpiA-(mgsA-yqhD)	0.4	1.5
			kv-ΔtpiA-(mgsA-fucO)	0.3	1.1
kv-ΔtpiA-(yqhD-fucO)	0.2	1.0
			kv-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)	0.4	1.3

野生型克雷伯氏属细菌利用葡萄糖发酵不产生1,2-丙二醇，其主要代谢物为2,3-丁二醇。磷酸丙糖异构酶是催化磷酸二羟丙酮和甘油醛-3-磷酸之间相互转化的关键酶。磷酸丙糖异构酶的失活会阻断两种代谢物之间的转化，因此磷酸二羟丙酮会在细胞内积累。在1，2-丙二醇合成途径中，磷酸二羟丙酮是重要的前体物质。为了研究磷酸二羟丙酮向1，2-丙二醇转化途径中关键基因的影响，对关键基因包括编码甲基乙二醛合酶基因mgsA、乙醇脱氢酶基因yqhD以及乳醛酸还原酶基因fucO分别进行了单独表达和组合表达。结果表明，相比于单个过表达基因的实验结果，过表达两个基因的菌株中的1,2-丙二醇的浓度更高，而同时过表达以上三个基因的菌株则更适合1,2-丙二醇的积累。结合实施例9中的实验结果，甘油培养基与葡萄糖培养基相比更适合1,2-丙二醇的合成。kp-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)、ko-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)和kv-ΔtpiA-(mgsA-yqhD-fucO)更适合作为1,2-丙二醇的生产菌株。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 改造的克雷伯氏属细菌及其生产1,2-丙二醇的应用和方法

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 768

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎杆菌342(Klebsiella pneumoniae342)

<400> 1

atgcgacatc ctttagtgat gggtaactgg aaactgaacg gcagccgcca catggtaaac 60

gaactggttg cgaacctgcg taccgaactg gctggcgtaa gcggctgtgc agttgccatc 120

gccccgccgg aaatgtatct ggacctggct aaacgtgcgg cagaaggcag ccacattcac 180

ctgggcgcgc agaacgttga cgtgaacctg tccggcgcat tcaccggtga aacctccgcc 240

gaaatgctga aagatatcgg cgcacagtac atcatcatcg gccactccga gcgtcgtacc 300

taccacaaag aatccgacga gctgatcgcg aagaaattcg ctgtgctgaa agagcagggt 360

ctgaccccgg tactgtgcat cggtgaaacc gaagccgaaa acgaagcggg caaaaccgaa 420

gaagtttgcg cacgtcagat cgacgccgtg ctgaaaacgc agggcgctgc cgctttcgaa 480

ggcgtggtta tcgcttacga accggtatgg gctatcggta ccggcaaatc cgcgaccccg 540

gctcaggctc aggcggtgca caaattcatc cgtgaccaca ttgctaaagc tgacgcgaaa 600

atcgctgagc aagtgatcat ccagtacggt ggttccgtta acgctggcaa cgcagcagag 660

ctgttcaccc agccggacat cgacggcgcg ctggttggcg gcgcctccct gaaagctgac 720

gctttcgcgg tgatcgttaa agcagcagaa gcagcgaaaa aagcgtaa 768

<210> 2

<211> 459

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎杆菌342(Klebsiella pneumoniae342)

<400> 2

atggaactga caactcgtac cctgtccgcg caaaaacata tcgcgctggt ggctcacgat 60

cactgtaaag atatgctgat gaaatgggtc gctcgccatc aggcgttgct ggcgcaacac 120

gttttgtatg ccaccggcac caccggtaac ctggtctcgc gggctaccgg actggaggtc 180

aatgccatgc tgagcggccc gatgggcggt gaccagcagg ttggcgcgct tatttcagaa 240

ggcaaaatcg acgtgctgat cttcttctgg gatccgctga acgccgtgcc tcacgacccg 300

gacgtcaaag cgttgctgcg cctggccacc gtctggaaca ttccggtcgc cactaacgtc 360

tccaccgctg actttatcat ccagtcaccg cactttaatc agccgctcga tattctgatc 420

ccggattatc cgcgttatct tgccgagcgc ctgaaataa 459

<210> 3

<211> 1164

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎杆菌342(Klebsiella pneumoniae342)

<400> 3

atgaataatt ttgacctgca taccccaacc cgcattctgt ttggcaaagg cgcgattgaa 60

aagctgcgtg aacagctccc ggcggaggct cgcgtactga tcacctacgg cggcggcagc 120

gtgaaaaaaa cgggcgtcct ggatcaggta ctcaccgccc tgaatggcct ggatgtcctt 180

gaatttggcg gcatcgagcc gaacccgtct tacgaaactc tgatgaacgc cgtgaagctc 240

gcccgtgaag agaaggtcac cttcctgctg gcggtcggcg gcggttcagt actggatggc 300

accaagttca tcgccgcggc ggcccattac gacgccgcta tcgatccatg ggaaattctg 360

gaaacttacg gcagtaagat cgccagcgcc attccaatgg gttcggttct gactctgcca 420

gcgaccggtt ctgaatcaaa caaaggggcg gtgatttcgc ggaaaaccac cggcgacaaa 480

cgcgcgttta tgtcttcgca cgtccagcca cagttcgcga tcctcgaccc ggtttacacc 540

tacactctgc caccacgcca ggtcgccaac ggcgtggttg acgccttcgt ccataccgtt 600

gaacagtacg tcacctaccc ggttgacggc aaaattcagg accgtttcgc cgaaggcatt 660

ctgctgacgc tggtggaaga tggctcgaaa gcgctgcagg agccagagaa ctacgacgtg 720

cgcgctaata ttatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtcttatcgg cgctggcgta 780

ccgcaggact gggcgaccca tatgctcggc cacgaactga cggcgatgca tggtctggat 840

cacgcccaga cgctggctat cgtgctgccg gcgctgtgga atgagaaacg cgataccaag 900

cgcgcgaaac tgctgcagta tgccgagcgc gtatggaata tcaccgaggg ctccgaagaa 960

cagcgtatcg atgccgctat tgccgcaacc cgtagtttct tcgagcagat gggggtgccg 1020

acccgcctct ccgattacgg tctcgacggt agctccatcc cggcgctgct ggcgaaactg 1080

gaagagcacg gcatgaccaa actgggcgaa catcaggata tcaccctgga cgtcagccgc 1140

cgtatttacg aggctgctcg ctaa 1164

<210> 4

<211> 1149

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎杆菌342(Klebsiella pneumoniae342)

<400> 4

atggcaaacc gaatgatcct caacgaaacg gcgtggtttg gccggggggc gataaacgca 60

ttaaccgatg aagtagcgcg gcgcggctat cgtaaagcat tgatcgtcac cgacagcacc 120

ctcgcccgct gcggcgtggc ggcgaaagtc accgacaaac tggatgccgc cgggctggca 180

tgggatatgt tcagcgacgt gatccctaac ccgaccattg ccgtggtcca gcaggggctg 240

caggcctttc agcgcagcgg ggcggattac ctgatcgcca ttggcggcgg ttcgccgcag 300

gatacctgta aggcgatcgg tattattcag cgtaacccgg aattcgccga tgtccgcagt 360

ctggaggggc tgtcgcccac ccgtcagccc agcgtgccga tcttcgcggt gccgactacc 420

gcgggtaccg cggcggaggt gacgattaac tatgtcatca ccgatgaaga acagcggcgc 480

aagttcgtct gcgtcgaccc gcatgatatt ccgcaggtgg cctttatcga tgccgatatg 540

atggacgcca tgccgccggc gctgaaggcg gccaccggcg tggacgccct gacgcacgct 600

atcgaaggat atctcacccg cggcgcctgg gctttgaccg atgcgctgca cctcaaggcc 660

atcgagatca ttgccggggc gctgcgcggc tcggttgccg gggatgccgg cgcgggcgaa 720

gccatggcgc tgggccagta cgtcgcgggg atgggatttt ccaacgtcgg gctcgggctg 780

gtgcacggca tggcgcatcc gctcggcgct ttttacaaca cgccgcacgg cgtggcgaat 840

gccatccttt tgccgcacgt gatgcgcttt aatgctgagg cgacggggga aaaatatcgc 900

gatatcgccc ggtcgatggg cgtcagggtg gaagcgttaa gcctgactgc cgcgcgccag 960

gcggcagtgg aggcggtctg ccagctaaac cgcgatgtcg gtattcccgg ccatctgcgc 1020

gaggtgggcg tcaggaaaga ggatattccg gcgctggcgc aggcggcgct ggaggatgtg 1080

tgtaccggcg gtaacccgcg tgaggcgagc ctggccgata tcgtcgggtt atatcaggcg 1140

gcctggtga 1149

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccggggatc ctctagagat ccggcgcgcc gagctttg 38

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcagctccag cctacattta attctccacg ctacttaagc g 41

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atccccggaa ttccgctttt cccggcggc 29

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

catgcctgca ggtcgacgat taacgctgct gccgcggg 38

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taaatgtagg ctggagctgc ttcg 24

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaagcggaa ttccggggat ccgtcga 27

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atcgtcgacc tgcaggca 18

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atctctagag gatccccggg t 21

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcacacagga aacagaattc atggaactga caacacgtac cct 43

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccgccaaaac agccaagctt ttatttcagg cgctcggca 39

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcacacagga aacagaattc atgaataatt ttgacctgca taccc 45

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ccgccaaaac agccaagctt ttagcgggca gcctcgta 38

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcacacagga aacagaattc atggcaaacc gaatgatcct c 41

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccgccaaaac agccaagctt tcaccaggcc gcctgata 38

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aagcttggct gttttggcg 19

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gaattctgtt tcctgtgtga aattg 25

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tcgtgtcgct caaggcgc 18

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

attatgcagt gatttacgac ctgc 24

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtcgtaaatc actgcataat ttctggcaaa tattctgaaa tgagc 45

<210> 24

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gtgcgccttg agcgacacga ttatttcagg cgctcggca 39

Claims

1.改造的克雷伯氏属细菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏属细菌为磷酸丙糖异构酶失活的克雷伯氏菌属。

2.如权利要求1所述的改造的克雷伯氏属细菌，其特征在于：所述磷酸丙糖异构酶失活的克雷伯氏菌属通过敲除磷酸丙糖异构酶基因tpiA获得。

3.如权利要求1所述的改造的克雷伯氏属细菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏属细菌还包括甲基乙二醛合酶基因(mgsA)、乙醇脱氢酶基因(yqhD)、乳醛酸还原酶基因(fucO)其中至少其一种基因的高水平表达。

4.如权利要求1所述的改造的克雷伯氏属细菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏属细菌还包括甲基乙二醛合酶基因(mgsA)、乙醇脱氢酶基因(yqhD)、乳醛酸还原酶基因(fucO)三种基因的高水平表达。

5.权利要求1-4任一项所述的改造的克雷伯氏属细菌在生产1，2-丙二醇中的应用。

6.权利要求1-4任一项所述的改造的克雷伯氏属细菌生产1,2-丙二醇的方法，该方法为：将改造的克雷伯氏属细菌接种到含碳源的培养基中进行发酵培养，菌体会利用碳源合成1,2-丙二醇。

7.权利要求6所述的改造的克雷伯氏属细菌生产1,2-丙二醇的方法，其特征在于：所述碳源为甘油和/或葡萄糖。

8.如权利要求6所述的改造的克雷伯氏属细菌生产1,2-丙二醇的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：发酵温度30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。

9.如权利要求6所述的改造的克雷伯氏属细菌生产1，2-丙二醇的方法，其特征在于，所述菌体发酵培养的培养基组成包括：碳源10-50g/L，氮源1-30g/L，无机盐0-10g/L。

10.如权利要求9所述的改造的克雷伯氏属细菌生产1,2-丙二醇的方法，其特征在于，所述的碳源为甘油和/或葡萄糖；所述的氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐；所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。