CN115251383B - 一种从青稞米中连续制备两种不同用途青稞米黄酮提取物的方法及应用 - Google Patents
一种从青稞米中连续制备两种不同用途青稞米黄酮提取物的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种从青稞米中连续制备两种不同用途青稞米黄酮提取物的方法及应用，利用等电点沉淀技术、酶解技术对青稞米黄酮提取液进行处理，得到青稞米黄酮提取物A和青稞米黄酮提取物B，并将制备出的青稞米黄酮提取物A应用于固体饮料或固体保健食品中，青稞米黄酮提取物B应用于酒体中，这两种青稞米黄酮提取物均具有较好的抗氧化性。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物提取及应用技术领域，具体涉及一种从青稞米中连续制备两种不同用途青稞米黄酮提取物的方法及应用途径。
背景技术
青稞又称裸大麦，是一种重要的高原谷类作物，广泛分布于我国的西北山地、青海、西藏等地区。青稞是西***民主要的粮食作物，由于西藏海拔高、光照充足，导致青稞产量较高且营养价值丰富。青稞通常被去皮处理加工成青稞米或者青稞饲料供人畜食用。现代研究发现，青稞中的β-葡聚糖、黄酮类化合物等活性物质具有良好的保健功效，其中黄酮类化合物具有较强的抗氧化性，辅助提高人体免疫力。因此，对青稞进行开发利用具有十分重要的意义。
目前，青稞黄酮的提取来源包括青稞幼苗、青稞麸皮以及青稞米等。以青稞幼苗、青稞麸皮作为提取原料制备青稞黄酮提取物较为简单，而以青稞米为原料制备青稞黄酮提取物则较为困难。青稞米中含有较为丰富的蛋白质和淀粉，在使用乙醇进行提取后，提取液经过浓缩随着乙醇含量的降低会析出大量的醇溶性蛋白、多糖和淀粉，这类物质会与黄酮类物质紧紧结合在一起，离心后富含黄酮成分的沉淀会被丢弃，且离心对提取液中悬浮聚合物的分离作用效果甚微，因此当提取液在进行大孔树脂纯化时会堵塞柱子，导致纯化困难，从而使青稞米黄酮提取物的产率较低。
发明专利CN101361932B以青稞幼苗为原料，通过醇提、大孔树脂吸附、浓缩和醇沉等方式制得青稞黄酮提取物，在整个制备过程中并没有使用青稞米，且青稞幼苗中的蛋白质没有去除，促使该产品在常温下应用于酒体中时会产生少量肉眼可见的不溶性沉淀，低温条件下产生大量不溶性沉淀，影响酒类产品销售。另外，以青稞幼苗为原料会使当年的青稞减产，不利于国家粮食安全。发明专利CN101696381A以青稞幼苗为原料，将醇提后的提取液通过陶瓷膜澄清、超滤膜分离和纳滤膜脱盐浓缩制备成青稞黄酮提取物，制备过程需要使用三种膜进行操作，成本较高，不利于工业生产。
近几年，利用青稞米制备酒用青稞黄酮提取物的报道鲜少出现，且关于在低温条件下不产生沉淀的酒用青稞黄酮提取物制备方法未见报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种从青稞米中连续制备两种不同用途青稞米黄酮提取物的方法及应用，并将制备出的青稞米黄酮提取物A应用于固体饮料或固体保健食品中，青稞米黄酮提取物B应用于酒体中，这两种青稞米黄酮提取物均具有较好的抗氧化性。本发明大大提高了青稞米黄酮提取物的得率，既为青稞米的精深加工做出了贡献，又提高了种植收益。
一种从青稞米中连续制备两种不同用途青稞米黄酮提取物的方法，包括以下步骤：
步骤一、将青稞米粗粉碎，然后使用质量分数30-80％的乙醇溶液进行冷凝回流提取，提取1-3次，提取温度70-95℃，提取时间0.5-2.5h，过滤提取液并合并提取液；
步骤二、将提取液浓缩至回收液乙醇浓度＜2％，在转速5000-10000r/min 条件下离心10-30min，收集沉淀和离心上清液；
步骤三、将步骤二中的沉淀与乙醇溶液按质量体积比1:5-15g/mL进行混合，并调节混合液pH至4-6.5，然后在70-95℃条件下加热冷凝回流1-3h，离心并收集上清液，调节pH至中性，将上清液浓缩至回收液乙醇浓度＜2％；
步骤四、将步骤二与步骤三中得到的离心上清液合并，调节pH至4.5，等电点沉淀10-20h，离心并收集上清液，调节pH至中性或弱碱性；
步骤五、在上清液中加入α-淀粉酶和糖化酶，复合酶与所用青稞米的质量比为1-10:1000，在30-70℃，酶解pH＝4-7的条件下酶解1-3h，然后过大孔树脂柱，用纯水冲洗柱子至流出液不显浑浊，再用3-10倍20-60％乙醇洗脱柱子得洗脱液；
步骤六、将洗脱液浓缩成干膏粉得青稞米黄酮提取物A；
步骤七、在青稞米黄酮提取物A中加入5-10倍的30-60％乙醇，升温至70-95℃冷凝回流1-3h，然后置于-20℃条件下静置12-24h，离心收集上清液并浓缩，真空冷冻干燥或低温真空干燥得青稞米黄酮提取物B。
优选的是，所述步骤一中，冷凝回流提取使用的乙醇质量分数为60％，提取温度85℃，提取时间1.5h，提取次数3次。
优选的是，所述步骤二中，离心转速为7000r/min，离心时间为15min。
优选的是，所述步骤三中，沉淀与加入的乙醇溶液的质量体积比为1:10g/mL，酸性pH值为5.5，冷凝回流温度为85℃，乙醇溶液质量分数为60％，冷凝回流时间1.5h。
优选的是，所述步骤四中，等电点沉淀时间为15h。
优选的是，所述步骤五中，复合酶与青稞米的质量比为5:1000，酶解时间为3h，酶解温度为55℃，酶解pH为6，乙醇洗脱液的质量分数为60％，洗脱倍数为8。
优选的是，所述步骤七中，乙醇溶液的质量分数为60％，青稞米黄酮提取物A与乙醇溶液的质量体积比为1:8，冷凝回流温度为85℃，冷凝回流时间1.5 h,在-20℃条件下静置24h，上清液干燥方式为真空冷冻干燥。
青稞米黄酮提取物A在固体饮料或固体保健食品中的添加比例为1-5mg/g。
青稞米黄酮提取物B在酒体中的添加量为5mg/L。
本发明产生的有益效果是：
1.本发明将青稞米乙醇提取、浓缩后产生的沉淀废弃物重新利用，显著提高了青稞米黄酮提取物的得率。
2.本发明能同时制备两种不同用途的青稞米黄酮提取物，其中青稞米黄酮提取物A可溶于水和低度乙醇溶液，但会有少许沉淀出现。青稞米黄酮提取物B易溶于30-60％酒体中，添加入酒体后，在环境温度高于-20℃时无肉眼可见的沉淀析出。青稞米黄酮提取物B的色差值明显低于步骤六中的青稞米黄酮提取物A。
3.本发明利用等电点沉淀技术、酶解技术对青稞米黄酮提取液进行处理，避免了青稞米黄酮提取液中的蛋白质、多糖等不溶性成分对树脂柱的堵塞，延长了树脂的使用周期。
4.本发明得到的青稞米黄酮提取物均具有较强的抗氧化活性。
5.本发明使用的原料绿色、无污染，避免了化学药剂对青稞米黄酮提取物的污染，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为大孔树脂对青稞黄酮吸附能力变化趋势图；
图2为不同实施例中青稞米黄酮提取物对DPPH自由基清除能力趋势图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种从青稞米中连续制备两种不同用途青稞米黄酮提取物的方法，其方法步骤具体如下：
首先，将2kg青稞米粗粉碎，然后使用质量分数50％的乙醇溶液进行冷凝回流提取，提取2次，提取温度80℃，提取时间2.5h，过滤提取液并合并提取液。再将提取液浓缩至回收液乙醇浓度＜2％，在转速10000r/min条件下离心 10min，收集沉淀和离心上清液。将沉淀与60％乙醇溶液按质量体积比1:15g/mL 进行混合，并调节混合液pH至5.5，然后在85℃条件下加热冷凝回流1h，离心并收集上清液，调节pH至中性，将上清液浓缩至回收液乙醇浓度＜2％。将两次得到的离心上清液合并，调节pH至4.5，等电点沉淀15h，离心并收集上清液，调节pH至中性。在上清液中加入α-淀粉酶和糖化酶，复合酶与所用青稞米的质量比为3:1000，在50℃，酶解pH＝6的条件下酶解1h，然后过大孔树脂柱，用纯水冲洗柱子至流出液不显浑浊，再用6倍50％乙醇洗脱柱子得洗脱液。再将洗脱液浓缩成干膏粉得青稞米黄酮提取物A。在青稞米黄酮提取物A中加入10倍的30％乙醇，升温至85℃冷凝回流3h，然后置于-20℃条件下静置24h，离心收集上清液并浓缩，真空冷冻干燥得青稞米黄酮提取物B。
实施例2
本实施例提供了一种从青稞米中连续制备两种不同用途青稞米黄酮提取物的方法，其方法步骤具体如下：
首先，将2kg青稞米粗粉碎，然后使用质量分数60％的乙醇溶液进行冷凝回流提取，提取3次，提取温度85℃，提取时间1.5h，过滤提取液并合并提取液。再将提取液浓缩至回收液乙醇浓度＜2％，在转速7000r/min条件下离心15 min，收集沉淀和离心上清液。将沉淀与60％乙醇溶液按质量体积比1:10g/mL 进行混合，并调节混合液pH至5.5，然后在85℃条件下加热冷凝回流1.5h，离心并收集上清液，调节pH至中性，将上清液浓缩至回收液乙醇浓度＜2％。将两次得到的离心上清液合并，调节pH至4.5，等电点沉淀15h，离心并收集上清液，调节pH至中性。在上清液中加入α-淀粉酶和糖化酶，复合酶与所用青稞米的质量比为5:1000，在55℃，酶解pH＝6的条件下酶解3h，然后过大孔树脂柱，用纯水冲洗柱子至流出液不显浑浊，再用8倍60％乙醇洗脱柱子得洗脱液。再将洗脱液浓缩成干膏粉得青稞米黄酮提取物A。在青稞米黄酮提取物A 中加入8倍的60％乙醇，升温至85℃冷凝回流1.5h，然后置于-20℃条件下静置24h，离心收集上清液并浓缩，真空冷冻干燥得青稞米黄酮提取物B。
对比例1
本对比例与实施例2相比，区别在于未进行以下操作：将沉淀与60％乙醇溶液按质量体积比1:10g/mL进行混合，并调节混合液pH至5.5，然后在85℃条件下加热冷凝回流1.5h，离心并收集上清液，调节pH至中性，将上清液浓缩至回收液乙醇浓度＜2％。仅仅将提取液浓缩至回收液乙醇浓度＜2％，在转速 7000r/min条件下离心15min，收集到的离心上清液进行等电点沉淀、酶解等后续操作。
对比例2
本对比例与实施例2相比，区别在于将两次得到的离心上清液合并后未进行等电点沉淀和酶解操作，直接过大孔树脂柱进行后续操作。
对比例3
参照发明专利CN101361932B中的方法制备青稞米黄酮提取物，步骤如下：取青稞米2kg粗粉碎，加入原料40倍量，浓度50％乙醇溶液，在温度80℃下提取2次，每次2h，得提取液；然后浓缩至回收提取液中的乙醇浓度＜10％后静置1h，用400目滤布过滤得滤液，将滤液流经装有AB-8填充的直径10厘米、高120厘米的玻璃吸附柱，先用体积为填充材料10倍量的纯水洗至无色；再用体积为填充体积20倍量、浓度50％的乙醇洗脱后浓缩至浸膏；最后用95％乙醇先热溶再冷却至常温，析出沉淀物，以5000转/分的转速离心过滤，然后干燥(干燥温度80℃)即得青稞米黄酮提取物。
对比例4
与实施例2相比，本对比例的区别在于将2kg青稞米替换成2kg青稞幼苗。
试验例1
各实施例和对比例样品中总黄酮含量的测定A和得率计算。
供试品溶液的制备：取样品25mg左右，精密称定，置50mL容量瓶中，加入60％乙醇适量，摇匀，超声处理10分钟，使其完全溶解，冷却后定容，作为供试品溶液。
对照品溶液制备：取芦丁对照品20mg，精密称定，置50mL容量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取25mL，置50mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、 6mL，分别置25mL量瓶中，各加水至6.0mL，加5％亚硝酸钠溶液1mL，混匀，放置6分钟。再加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6分钟。加4％氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟。以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在500nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，标准曲线为Abs＝0.02179C-0.00372，R2＝0.9971。
测定与计算：取供试品溶液，滤纸过滤，精密量取续滤液2mL，置25mL 量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至6mL”起，依法测定吸光度。
试样中的总黄酮含量按下式(1.1)计算：
式中：
w—试样中总黄酮的含量(％)；
C—由标准曲线求得供试品溶液中总黄酮的浓度(mg/L)：
V—试样稀释体积倍数(mL)；
m—试样质量(mg)。
样品得率计算：样品得率按下式(1.2)计算：
式中：
H—样品得率(％)；
m—得到的样品质量(g)：
M—所用的原料质量(g)。
表1各实施例和对比例中样品的总黄酮含量和得率
从表1中可以看出实施例2中青稞米黄酮提取物A和青稞米黄酮提取物B 的黄酮含量与对比例1无显著性差异，但产品得率明显高于对比例1，这说明将青稞米乙醇提取、浓缩后产生的沉淀废弃物重新利用能显著提高青稞米黄酮提取物的得率。实施例2中青稞米黄酮提取物A和青稞米黄酮提取物B的黄酮含量和产品得率均明显高于对比例2，说明等电点沉淀和酶解操作能提高产品中的黄酮含量和收率。实施例2中青稞米黄酮提取物A和青稞米黄酮提取物B的黄酮含量和产品得率均明显高于对比例3中的青稞黄酮提取物，说明本专利青稞米黄酮提取物的制备方法优于发明专利CN101361932B中的青稞黄酮提取物的方法，且本发明专利能同时得到两种用途的产品。实施例2中青稞米黄酮提取物A和青稞米黄酮提取物B的黄酮含量和产品得率均明显高于对比例4，说明青稞米原料制备青稞米黄酮提取物的效果高于青稞幼苗。
试验例2
低温稳定性实验
为了进一步说明本发明中得到的青稞米黄酮提取物具有较好的低温稳定性，选取各实施例和对比例中的样品添加到酒体中(添加量2mg/L)进行以下低温稳定性实验。在环境温度-15℃的条件下，分别静置30d、180d和365d观察酒体中是否有肉眼可见的沉淀出现。
表2各实施例和对比例中样品的低温稳定性情况
从表2中可以看出，实施例1、实施例2、对比例1、对比例2和对比例4，在低温条件下均未产生肉眼可见的沉淀，而对比例3有沉淀出现，说明利用本发明制备出的青稞米黄酮提取物B具有较高的低温稳定性，等电点沉淀和酶解操作并不是造成沉淀不出现的原因。另外，利用发明专利CN101361932B中方法制备的青稞黄酮提取物并不具有低温稳定性，说明本发明比发明专利 CN101361932B更具有低温稳定性的优势。
试验例3
大孔树脂吸附样品溶液的使用寿命测试
以青稞总黄酮比吸附量为指标，观察大孔树脂在多次吸附洗脱后的比吸附量变化，设定比吸附量下降至65％以下时为大孔树脂使用寿命结束。
试验方法：使用95％乙醇浸泡D101型大孔树脂3h，然后用95％乙醇洗至大孔树脂流出液不浑浊，再用大量纯水洗至无醇味。取6份已处理过的湿树脂(干重约100g)，分别装入6根玻璃树脂柱中。按照各实施例和对比例中的方法取适量提取液上柱，静态预吸附1.5h后以流速为10mL/min从树脂柱下方流出提取液进行动态吸附过程，收集流出液作总黄酮含量测定。吸附完后树脂分别用1L 纯化水和60％乙醇以进行洗脱，最后用适量纯净水冲洗树脂至流出液不含乙醇，即为完成1次使用。重复以上操作，得出每次的比吸附量。
按照公式1.3计算比吸附量：
以吸附次数为横坐标，比吸附量为纵坐标，作出吸附能力变化趋势图，见图1。
从图1可以看出第一次生产的树脂比吸附量约98％，随着树脂吸附量的累计增加，树脂吸附能力出现衰退现象，实施例1、实施例2、对比例1和对比例 4在生产60次后，比吸附量低于65％，而对比例2和对比例2在生产约30次后，比吸附量低于65％，这说明等电点沉淀和酶解步骤能显著提高树脂的使用寿命，并且使用本发明的制备方法制备青稞米黄酮提取物比使用发明专利 CN101361932B能延长2倍的树脂使用寿命，大大降低树脂再生成本。
试验例4
不同实施例中青稞米黄酮提取物A和青稞米黄酮提取物B对DPPH自由基清除率能力测定
实验步骤：
(1)DPPH溶液(0.25mM)的配制：精确称取4.929mg DPPH溶于50mL 容量瓶中，加入无水乙醇定容至50mL，冷藏避光保存；
(2)阳性对照品溶液的制备：将维生素C配制成母液(0.24mg/mL)，经过梯度稀释成0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02mg/mL；
(3)样品溶液的制备：分别将各实施例中制备出的青稞米黄酮提取物配制成母液(10mg/mL)，经过梯度稀释成8、6、4、2mg/mL；
(4)显色反应：将1mL DPPH乙醇溶液(0.25mM)与1mL无水乙醇混合均匀，25℃避光反应30min，在517nm处测定其吸光值，以无水乙醇做空白，吸光值记为A；将1mL DPPH乙醇溶液(0.25mM)与1mL样品溶液混合均匀， 25℃避光反应30min，在517nm处测定其吸光值，以无水乙醇做空白，吸光值记为B；将1mL无水乙醇与1mL样品溶液混合均匀，25℃避光反应30min，在517nm处测定其吸光值，以无水乙醇做空白，吸光值记为C；并以Vc为对照组。
(5)DPPH自由基清除率(％)计算按公式1.4：
DPPH自由基清除率(％)＝[A-(B-C)]/A×100％(1.4)
不同实施例中青稞米黄酮提取物对DPPH自由基清除能力如图2所示。
从图2可以看出实施例1和实施例2中的青稞米黄酮提取物A和青稞米黄酮提取物B均具有较强的抗氧化性。
试验例5
不同实施例和对比例中青稞黄酮提取物在酒体中的色差情况
以纯净水作为对照组，将不同实施例和对比例中的青稞黄酮提取物添加入酒体中，按照添加量5mg/L使用色差仪进行色差测定。
表3各实施例和对比例中样品的色差情况
L﹡代表酒体的明暗度，符号为+表示酒体颜色偏白，符号为-表示酒体颜色偏暗；a﹡代表酒体的红绿度，符号为+表示酒体颜色偏红，符号为-表示酒体颜色偏绿；b﹡代表酒体的黄蓝度，符号为+表示酒体颜色偏黄，符号为-表示酒体颜色偏蓝。从表3中可以看出实施例2中的青稞米黄酮提取物A添加入酒体后酒体颜色亮度低于青稞米黄酮提取物B，且添加了青稞米黄酮提取物B的酒体颜色偏黄红色。对比例4中添加了青稞黄酮提取物A和青稞黄酮提取物B的酒体呈现蓝绿色，这可能是因为采用发明专利CN101361932B以青稞幼苗为原料制备青稞黄酮提取物时有较多的叶绿素进行了提取液中，导致酒体在应用青稞黄酮提取物时呈蓝绿色。一般来说，黄酮类物质呈现偏黄红的颜色，酒体呈现偏黄红的颜色容易被消费者接受。因此，本发明专利制备的青稞米黄酮提取物在颜色方面优于发明专利CN101361932B。
综上所述，上述实施例仅是对本发明的优选方式进行举例说明，并不包括所有的发明实施范围。本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与润饰，因此本发明的保护范围以权利要求界定的范围为准。
Claims (4)
1.一种从青稞米中连续制备两种不同用途青稞米黄酮提取物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将青稞米粗粉碎，然后使用乙醇溶液进行冷凝回流提取，过滤并收集提取液；冷凝回流提取使用的乙醇质量分数为30-80％，提取温度70-95℃，提取时间0.5-2.5h，提取次数1-3次；
步骤二、将提取液浓缩至回收液乙醇浓度＜2％，离心，收集沉淀和离心上清液；
步骤三、在步骤二得到的沉淀中加入乙醇溶液并调节pH成酸性,然后加热冷凝回流，离心并收集上清液，调节pH至中性，将上清液浓缩至回收液乙醇浓度＜2％；沉淀与加入的乙醇溶液的质量体积比为1:5-15g/mL，酸性pH值为4-6.5，冷凝回流温度为70-95℃，乙醇溶液质量分数为30-80％，冷凝回流时间1-3h；
步骤四、将步骤二与步骤三中得到的离心上清液合并，调节pH至4.5，等电点沉淀10-20h，离心并收集上清液，调节pH至中性或弱碱性；
步骤五、在上清液中加入复合酶进行酶解，然后过大孔树脂柱，用纯水冲洗柱子至流出液不显浑浊，再用乙醇洗脱柱子得洗脱液；复合酶的类型为α-淀粉酶和糖化酶，复合酶与青稞米的质量比为1-10:1000，酶解时间为1-3h，酶解温度为30-70℃，酶解pH为4-7，乙醇洗脱液的质量分数为20-60％，洗脱倍数为3-10；
步骤六、将洗脱液浓缩成干膏粉得青稞米黄酮提取物A；
步骤七、在青稞米黄酮提取物A中加入乙醇冷凝回流，然后置于-20℃条件下静置一段时间，离心收集上清液并浓缩、干燥得青稞米黄酮提取物B；乙醇溶液的质量分数为30-60％，青稞米黄酮提取物A与乙醇溶液的质量体积比为1:5-10，冷凝回流温度为70-95℃，冷凝回流时间1-3h,在-20℃条件下静置12-24h，上清液干燥方式为真空冷冻干燥或低温真空干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，离心转速为5000-10000r/min，离心时间为10-30min。
3.一种权利要求1或2所述的方法制备得到的青稞米黄酮提取物A的应用，其特征在于，将其应用于固体饮料或固体保健食品中，添加比例为1-5mg/g。
4.一种权利要求1或2所述的方法制备得到的青稞米黄酮提取物B的应用，其特征在于，将其应用于酒体中，添加量为1-5mg/L，且在-20℃的低温条件下不会析出沉淀。
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