CN113584033B - 一种CRISPR/Cpf1基因编辑***及其构建方法和在赤霉菌中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CRISPR/Cpf1基因编辑***及其构建方法和在赤霉菌中的应用，该***为骨架质粒pCpf1Ff‑DR，包括Fncpf1基因、功能性crRNA基因、启动子pGPD、启动子pTRPC、强RNA聚合酶III型启动子5srRNA、潮霉素筛选标记hph。本发明***效率高、通用性强、易于操作而被迅速应用于丝状真菌赤霉菌中，通过该基因编辑***可用于赤霉菌中实现长达17kb的比卡菌素基因簇的敲除。本发明首次在赤霉菌中实现大片段基因敲除，且首次发现比卡菌素基因簇敲除有利于提高赤霉素产量，该方法有望进一步用于改造赤霉素工业菌，缩短菌株升级的时间，为提高赤霉素产量、增加经济效益提供了强有力保障。

Description

一种CRISPR/Cpf1基因编辑***及其构建方法和在赤霉菌中 的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种CRISPR/Cpf1基因编辑***及其构建方法和在赤霉菌中的应用。
背景技术
在丝状真菌如赤霉素中中进行基因编辑具有重大意义，丝状真菌是一类在蛋白分泌、活性次级代谢物生产、环境污染治理等方面起着重要作用的微生物，关于它们的各项基础和应用研究均高度依赖基因编辑平台。丝状真菌在商业化生产酶、异源蛋白质、广泛的初级和次级代谢产物以及生物燃料等方面具有巨大价值，提高真菌商业应用潜力的方法之一是通过基因工程进行菌株改良。然而，丝状真菌的顶端生长、异核性、同源重组效率低和遗传标记匮乏等生理特点为构建这类微生物成熟的基因编辑平台带来挑战。
现有技术中丝状真菌的代谢途径进行编辑的方法有同源重组技术和CRISPR-Cas9技术，这两种方法都存在一些问题：基于单同源交换或者双同源臂交换的基因敲除、整合技术效率低且费时费力，且面临着筛选标记不够的问题。CRISPR-Cas9基因组编辑在加速这种微生物和其他微生物的代谢工程中发挥了重要作用，虽然有一套合成生物学工具用于赤霉菌的基因工程，但需要多用途的工具加快菌株的产生。近年来，基于CRISPR-Cas***在丝状真菌中得到越来越广泛的应用。由于构成简单、靶向特异，CRISPR-Cas***极大促进了丝状真菌的基因编辑，包括基因***、缺失、碱基转换和转录激活等。编辑的基因包括标记基因、非筛选标记的其他功能基因、功能未知的基因，甚至多个基因。最近，CRISPR/Cas9在丝状真菌中的应用已经显示在几种真菌菌株中，例如烟曲霉、米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、里氏木霉等。
赤霉菌以生产一系列的植物生长激素—赤霉素(Gibberellins，简称GAs)而闻名。赤霉素是一种天然的可以影响植物生长的激素，它的调节能力很强，包括具有解除种子和块茎的睡眠、促进植物生长发育、加快果实成熟等功能，因而在农业上得到了广泛的运用。随着对赤霉素研究的不断加深，已经有超过136种不同结构的赤霉素类(编号GA1-GA136)化合物被发现，其中只有GA1、GA3、GA4、GA7等具有生物活性，目前工业化生产的赤霉素主要为GA3，但是GA3发酵产量低，发酵时间长，导致价格及其昂贵，因此在赤霉菌中建立高效的基因编辑***来提高GA3产量刻不容缓。
比卡菌基因簇中包含有6个蛋白，分别为bik1，bik2，bik3，bik4，bik5，bik6，其中bik1、bik2和bik3酶被预测负责比卡菌素的合成，bik4和bik5被预测为转录调控因子，bik6被推测为是一个渗透酶或转运蛋白。
赤霉菌由于内在遗传操作体系还不成熟，强启动子匮乏，丝状真菌做成感受态(原生质体)破壁效率不高，需要不断优化条件，还没有基因编辑相关报道，而CRISPR/Cpf1***更没有应用在赤霉菌的基因编辑中，也没有通过CRISPR/Cpf1***敲除基因提高赤霉素产量的方法。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种可在丝状真菌如赤霉菌中进行基因编辑的CRISPR/Cpf1***，该CRISPR/Cpf1系可以在赤霉菌中进行基因敲除和整合。解决了现有同源重组技术的基因敲除、整合技术效率低且费时费力，且面临着筛选标记不够的问题，也克服了CRISPR-Cas9基因组编辑需要多用途的工具加快菌株的产生和多基因编辑效率不高等问题。本发明首次构建了一种全新的CRISPR/Cpf1基因编辑***，不同于在植物、酵母中报道的CRISPR/Cpf1基因编辑***，并可以有效用于丝状真菌赤霉菌中。更重要的是，本发明首次将基因编辑***应用于敲除大片段比卡菌素基因簇，不仅克服了大片段删除基因的难度，而且成功尝试了通过删除基因簇有效提高赤霉素产量，该***有望进一步用于改造赤霉素工业菌，缩短菌株升级的时间，为提高赤霉素产量、增加经济效益提供了强有力保障。
本发明还提供所述CRISPR/Cpf1基因编辑***的构建方法和在赤霉菌中的应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种CRISPR/Cpf1基因编辑***，所述***为骨架质粒pCpf1Ff-DR，主要包括Fncpf1基因、功能性crRNA基因、启动子pGPD、启动子pTRPC、强RNA聚合酶III型启动子5srRNA、潮霉素筛选标记hph；所述强启动子pGPD转录Fncpf1基因，强RNA聚合酶III型启动子5srRNA转录crRNA，所述启动子pTRPC表达潮霉素筛选标记hph。
作为优选，所述5srRNA与crRNA序列之间为SpeI酶切位点。
其中，所述强启动子pGPD转录Fncpf1基因，pGPD的序列如SEQ ID NO.1所示，FnCpf1的序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，所述强RNA聚合酶III型启动子5srRNA转录crRNA，5srRNA序列如SEQ IDNO.3所示，crRNA的序列如SEQ ID NO.4所示。
其中，所述所述启动子pTRPC转录潮霉素筛选标记hph，启动子pTRPC的序列如SEQID NO.5所示，潮霉素筛选标记hph的标记如SEQ ID NO.6所示。
本发明所述的CRISPR/Cpf1基因编辑***的构建方法，包括如下步骤：
(1)以质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph为模板设计引物，扩增得到不含fFuCas9基因的骨架线性片段，将此片段骨架与Fncpf1基因经过一步克隆之后得到的重组质粒为pCpf1Ff；
(2)以重组质粒pCpf1Ff为骨架酶切得到线性化的质粒pCpf1Ff片段；
(3)以质粒pUC-FfCas9-HTB-5srRNA-FCC1为模板，设计引物，扩增得到基因DR基因表达盒；
(4)将线性化的质粒pCpf1Ff和构建的DR基因表达盒，克隆得到重组质粒pCpf1Ff-DR即为本发明的CRISPR/Cpf1基因编辑***。
其中，步骤(1)中引物为SEQ ID NO.7-8所示。
其中，步骤(3)中引物为SEQ ID NO.9-10所示。
本发明所述的CRISPR/Cpf1基因编辑***在丝状真菌基因编辑中的应用。
本发明所述的CRISPR/Cpf1基因编辑***在敲除赤霉菌细胞周期蛋白G1基因FCC1中的应用。
其中，所述应用的具体步骤为：pCpf1Ff-DR质粒经过SpeI酶切后，***靶向FCC1基因的N23序列，构建质粒pCpf1Ff-DR-FCC1，将pCpf1Ff-DR-FCC1质粒转化入赤霉菌原生质体中用于基因敲除。
其中，所述***靶向FCC1基因的N23序列为FCC1-N23，其序列如SEQ ID NO.11所示。
利用本发明所述的CRISPR/Cpf1基因编辑***在敲除赤霉菌细胞大片段比卡菌素基因簇提高赤霉素产量中的应用。
其中，所述应用的具体步骤为：
(1)pCpf1Ff-DR质粒经过SpeI酶切后，***靶向BIK3基因的N23序列，构建质粒pCpf1Ff-DR-BIK3；
(2)pCpf1Ff-DR-BIK3质粒经过pmeI酶切后，***比卡菌素基因簇的上游同源臂序列，构建质粒pCpf1Ff-DR-BIKi-UP；
(3)pCpf1Ff-DR-BIK3-UP质粒经过swaI酶切后，***比卡菌素基因簇的下游同源臂序列，构建质粒pCpf1Ff-DR-BIKi-HR；
(4)将pCpf1Ff-DR-BIKi-HR质粒转化入赤霉菌原生质体中用于大片段比卡菌素基因簇的敲除。
其中，所述***质粒pCpf1Ff-DR的靶向BIK3基因的N23序列为BIK3-N23，其序列如SEQ ID NO.14所示。所述***质粒pCpf1Ff-DR-BIK3的比卡菌素基因簇的上游同源臂序列为BIKi-UP，其序列如SEQ ID NO.17所示。所述***质粒pCpf1Ff-DR-BIK3-UP的比卡菌素基因簇的下游同源臂序列为BIKi-Dn，其序列如SEQ ID NO.20所示。
进一步地，步骤(1)中扩增BIK3-N23的引物为SEQ ID NO.15-16所示。
步骤(2)中扩增比卡菌素基因簇的上游同源臂序列的引物为SEQ ID NO.18-19所示。
步骤(3)中扩增比卡菌素基因簇的下游同源臂序列引物为SEQ ID NO.21-22所示。
本发明的CRISPR/Cpf1***是一种新型的基因组编辑技术，分为两个组成部分：Fncpf1基因和crRNA基因。当crRNA识别出基因组中的靶向目标序列时，Fncpf1基因表达的Cpf1蛋白将切割该序列，产生基因组双链断裂。细胞为了存活将通过非同源末端重组在断裂处随机***或者缺失几个碱基用以修复基因组，导致基因失活。该***效率高、通用性强、易于操作而被迅速应用于许多不同的物种，包括各种丝状真菌。本发明在赤霉菌中开发了一套CRISPR/Cpf1基因组编辑***，并选择了赤霉菌细胞周期蛋白(FCC1)验证该套***的有效性，FCC1基因的破坏直接导致赤霉菌积累紫色色素。
本发明首先构建CRISPR/Cpf1骨架质粒pCpf1Ff-DR，该质粒主要包括两大部分:Fncpf1基因和crRNA基因。然后为了验证该套***的有效性，选择FCC1基因作为靶位点进行敲除，即pCpf1Ff-DR质粒骨架上***靶向FCC1的N23序列，质粒命名为pCpf1Ff-DR-FCC1。将该质粒导入赤霉菌原生质体中进行基因编辑，该CRISPR/Cpf1***利用crRNA识别目标DNA(FCC1)，Fncpf1对靶点进行切割，产生双链断裂。然后，细胞将通过非同源末端连接修复基因组，从而可用于基因敲除和整合。
本发明利用CRISPR/Cpf1表达***敲除赤霉素基因FCC1的方法，包括以下步骤：
(1)基于赤霉菌中建立的CRISPR/Cpf1***，首先构建CRISPR/Cpf1骨架质pCpf1Ff-DR，该质粒骨架主要包括两大部分Fncpf1基因和crRNA基因。
(2)为了验证该套***的有效性，选择FCC1作为靶位点进行敲除，即质粒骨架上***FCC1的N23序列。
(3)将该质粒导入赤霉菌感受态中去进行基因编辑，敲除FCC1。
本发明将的CRISPR/Cpf1表达***应用于敲除大片段比卡菌素基因簇同时提高赤霉素的产量的方法，包括以下步骤：
(1)已验证过该套***的有效性，再选择大片段比卡菌素基因簇作为靶位点进行敲除，即构建质粒pCpf1Ff-DR-BIK3，选择基因簇上的BIK3的N23序列，***到CRISPR/Cpf1骨架质粒pCpf1Ff-DR。
(2)利用CRISPR/Cpf1***结合同源重组技术以提高敲除大片段基因的效率，即在质粒pCpf1Ff-DR-BIK3上先后***比卡菌素基因簇的同源臂BIKi-UP和BIKi-Dn，所构得质粒pCpf1Ff-DR-BIKi-HR，敲除基因簇的同时将潮霉素抗性基因整合到赤霉菌基因组上，可作为阳性转化子的筛选标记。
(3)将该质粒pCpf1Ff-DR-BIKi-HR导入赤霉菌感受态中去进行基因编辑，敲除卡菌素基因簇。
本发明所述将重组质粒转化进赤霉菌的感受态中去，首先要将丝状真菌制备成球状的原生质体再进行转化。
其中，制备赤霉菌原生质体：(1)赤霉菌单菌落接种至100mL的再生培养基,培养温度30℃，转速200RPM，培养48h。(2)接种10mL菌液到新的100mL再生培养基扩大培养12h。(3)培养液用无菌擦镜纸过滤，收集菌体。(4)配置10mL酶解液，用质量配比的混合酶Dryalase:Lysing＝3：7的混合酶(45mg：105mg)溶解于氯化钠缓冲液(10mL中有0.41g)，搅拌混匀。0.22um滤头过滤除菌后，每10mL加入1g菌体，30℃，200RPM，酶解3.5-4h。(5)酶解液经过3层擦镜纸过滤除去菌丝残片。(6)下面的为原生质体溶液，3000rcf离心10min，沉淀原生质体。(7)原生质体沉淀用冰浴的STC溶液(1M山梨醇，10mM Tris-cl，50mM CaCl2，PH＝7.5)悬浮离心沉淀原生质体，重复一次。(8)原生质体悬浮于适量的STC溶液，调整原生质体107-108/mL。
质粒转化：(1)取原生质体，加入50μLSTC溶液，加入10-15μg(不超过20μg)质粒，冰浴20分钟。(2)加入50μL 25％的PEG6000的溶液(1M山梨醇，10mM Tris-Cl，50mM CaCl2，PH＝7.5)混合后冰浴20分钟。(3)加入1mL PEG6000溶液，室温下混合5min，再加入2mLSTC溶液，混匀后取160μL涂布MYG固体再生平板，培养12h后，覆盖10mL浓度为100μg/ml的潮霉素软琼脂再生平板等待5-7天转化子出现。
本发明的利用CRISPR/Cpf1***敲除赤霉素基因的方法，实验证明CRISPR/Cpf1***可以在赤霉菌中进行基因FCC1的敲除，建立了高效稳定的赤霉菌遗传操作方法。
设计原理：本发明在赤霉菌中建立了一种新型基因编辑工具:CRISPR/Cpf1，该***分为两个组成部分：Fncpf1基因和crRNA基因。当crRNA识别出基因组中的靶向目标序列时，Fncpf1基因表达的Cpf1蛋白将切割该序列，产生基因组双链断裂。细胞为了存活将通过非同源末端重组在断裂处随机***或者缺失几个碱基用以修复基因组，导致基因失活。具体来说，如图7所示重组载体pCpf1Ff-DR中使用强启动子pGPD表达Fncpf1蛋白，启动子pTRPC表达潮霉素筛选标记，强RNA聚合酶III型启动子5srRNA转录crRNA。5srRNA与crRNA序列之间为SpeI酶切位点，用以***靶向目标基因的N23序列，***靶基因的N23序列之后，该质粒即为一套可进行基因敲除的完整***。
本发明中先选择了1个易于鉴定的靶位点FCC1验证该套***的有效性，该靶基因的敲除直接导致积累紫色色素。pCpf1Ff-DR质粒经过SpeI酶切后，***FCC1基因的N23序列。利用CRISPR/Cpf1***的基因编辑技术，可以实现在赤霉菌中进行敲除，并简化质粒构建流程。
Cpf1蛋白是一个Cas12a细菌内切酶家族，以与Cas9相似的方式靶向基因组位点，但具有处理自己的CRISPR-RNA阵列的优势。本发明通过对crRNA的设计可以实现同时对多个基因进行编辑，从而简化了基因编辑工具的设计过程。自身的引导RNA(gRNAs)的能力可以用于容易的多路复用，crRNA可以用Array形式排列，DR后面***不同靶基因的N23序列，即可实现多基因编辑，FnCpf1、AsCpf1和Cas9在针对单个基因时具有相似的基因组编辑效率。在Cpf1家族中，只有本发明采用的FnCpf1基因被证明具有多基因靶向的能力，Cpf1家族中有Lbcpf1、Ascpf1其他两种不同来源的内切酶，不具有上述功能。
本发明首次将构建的CRISPR/Cpf1基因编辑***应用到了赤霉菌这种丝状真菌中，现有文献报道还没有在赤霉菌中进行基因编辑，大多都是通过优化发酵条件来提高代谢产物的产量，主要是因为赤霉菌的内在遗传操作体系还不成熟。传统的CRISPR-Cas9编辑效率只有25％，多靶效率更低，而本发明的CRISPR/Cpf1基因编辑***其编辑效率达50％及以上。同时本发明也验证出此***可应用到删除大片段基因簇，一方面克服了删除大片段的难度，另一方面本发明中通过删除比卡菌素基因簇可有效提高赤霉素产量，是通过分子技术应用于赤霉菌的一项重要突破。
本发明中CRISPR/Cpf1成功将赤霉菌中fcc1基因成功敲除，证明本发明的敲除***能在后期应用于敲除赤霉素代谢途径中一些关键基因中，本发明是在赤霉菌中建立了一套高效的基因编辑***，同时也为丝状真菌的基因编辑技术提供了参考依据。
此外，基因敲除随机性较强，很容易引起其它基因功能的丧失，同时***的拷贝数和位置不固定，所以要敲除的片段越长越难控制基因的表达水平和功能研究，导致传统的基因敲除方案敲除片段通常较短，而目前赤霉菌没有大片段比卡菌素基因簇的报道，其基因簇删除后其功能效果也是未知的。
本发明首次在赤霉菌中开发了一套基因组编辑***，并选择了赤霉菌细胞周期蛋白验证该套***的有效性，FCC1基因的破坏直接导致赤霉菌积累紫色色素。随后验证该***删除大片段基因的潜力。以比卡菌素基因簇为例，该CRISPR/Cpf1基因编辑***可用于赤霉菌中并能够实现长达17kb的比卡菌素基因簇的删除。此外，基因簇删除后使得赤霉素产量提高19.7％。本发明首次在赤霉菌中实现大片段基因删除，且首次发现比卡菌素基因簇的删除有利于提高赤霉素产量，该技术有望进一步用于改造赤霉素工业菌，缩短菌株升级的时间，为提高赤霉素产量、增加企业经济效益提供了强有力保障。
相比于CRISPR/Cas9有以下优势:(1)Cpf1蛋白更小，更容易进入赤霉菌中进行编辑。(2)Cpf1切出来的是粘性末端，双键断裂后细胞更容易进行修复。(3)CRISPR-Cpf1***只需要crRNA，相比于CRISPR/Cas9需要tracrRNA和crRNA来说更加简单。(4)Cpf1在构建多敲除质粒时更加简便。
此外，本发明的CRISPR/Cpf1***非常简单，因为它不使用分开的tracrRNA而只需要指定靶DNA序列和指导RNA与Cpf1核酸酶的结合两者的40-45个碱基长的单个短crRNA，是一种即插即用的***，不再需要其他的组分，且crRNA可以用Array形式排列，因此使用一个启动子可以实现多个靶点crRNA的转录，构建多靶点敲除质粒更加方便，具有进行多重基因编辑的天然优势。
本发明先验证***有效之后敲除赤霉菌细胞周期蛋白G1基因FCC1，其它基因只需要替换CRISPR中的间隔序列N23就可以靶定不同基因，如果想实现多个基因的同时编辑，由于FnCpf1的crRNA可以用Array形式排列，因此使用一个启动子可以实现多个靶点crRNA的转录，构建多靶点敲除质粒更加方便。***中的FnCpf1的分子量比Cas9小，有利于质粒转化，可以实现在丝状真菌中的基因编辑。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)***中的FnCpf1的分子量比Cas9小，有利于质粒转化。
(2)***中的FnCpf1剪切DNA所需的crRNA长度仅为42-44nt，只需要替换CRISPR中的间隔序列就可以靶定不同基因，实现多个基因的同时编辑，设计步骤可以显著简化，实验成本也可以显著降低，同时降低了将CRISPR/Cpf1***递送至编辑对象的难度。
(3)FnCpf1的crRNA可以用Array形式排列，因此使用一个启动子可以实现多个靶点crRNA的转录，构建多靶点敲除质粒更加方便。
(4)Cas9和FnCpf1均是单链RNA指导的核酸内切酶，但Cas9只具有DNA内切酶活性，而FnCpf1同时具有DNA和RNA内切酶活性。
(5)在建立CRISPR/Cpf1基因组编辑***前，首先筛选在宿主微生物中的特殊功能基因FCC1。该基因敲除后，可以明显改变转化子表型特征，以便于能够直观地观察到基因编辑事件的发生以及减少筛选阳性克隆的工作量。该策略将有助于赤霉菌中CRISPR/Cpf1***的早期验证和建立。
(6)本发明的CRISPR/Cpf1***非常简单，***效率高、通用性强，因为它不使用分开的tracrRNA而只需要指定靶DNA序列和指导RNA与Cpf1核酸酶的结合两者的40-45个碱基长的单个短crRNA，是一种即插即用的***，不再需要其他的组分，且crRNA可以用Array形式排列，因此使用一个启动子可以实现多个靶点crRNA的转录，构建多靶点敲除质粒更加方便，具有进行多重基因编辑的天然优势。
(7)本发明首次将构建的CRISPR/Cpf1基因编辑***应用到了赤霉菌这种丝状真菌中，现有文献报道还没有在赤霉菌中进行基因编辑，大多都是通过优化发酵条件来提高代谢产物的产量，主要是因为赤霉菌的内在遗传操作体系还不成熟，强启动子匮乏，丝状真菌做成感受态(原生质体)破壁效率不高，需要不断优化条件，而本发明有效的解决了上述问题，其编辑效率达50％及以上。本发明在赤霉菌中开发了一套CRISPR/Cpf1基因组编辑***，并选择了赤霉菌细胞周期蛋白FCC1验证该套***的有效性，FCC1基因的破坏直接导致赤霉菌积累紫色色素，判定fcc1基因被成功敲除。同时本发明验证此CRISPR/Cpf1基因编辑***可行且高效后应用于敲除大片段比卡菌素基因簇，不仅克服了大片段删除基因的难度，而且首次通过删除基因簇提高赤霉素产量，该技术有望进一步用于改造赤霉素工业菌，缩短菌株升级的时间，为提高赤霉素产量，为增加经济效益提供了强有力保障。
附图说明
图1为模板质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph的结构图，其中HPH表示潮霉素筛选基因，pTRPC是表达HPH基因的启动子，AmpR表示氨苄抗性基因，AmpR promoter是表达AmpR基因的启动子，FfuCas9表示藤仓赤霉菌密码子优化的Cas9基因，pGPD是表达FfuCas9的强启动子，HTB表示组蛋白H2B核定位信号。
图2为重组质粒pCpf1Ff的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpR promoter，pGPD，HTB序列与图1所示的一样。Fncpf1表示弗朗西丝菌来源的Fncpf1基因。
图3为模板质粒pUC-FfCas9-HTB-5srRNA-FCC1的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpR promoter，pGPD，HTB，FfuCas9与图1所示的一样。5srRNA为表达sgRNA的启动子。
图4是重组质粒pCpf1Ff-DR的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpR promoter，pGPD，HTB序列与图1所示的一样，Fncpf1序列与图2所示的一样，5srRNA序列与图3所示的一样，crRNA为转录序列。
图5为重组质粒pCpf1Ff-DR的结构简化图。
图6是重组质粒pCpf1Ff-DR-FCC1的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpRpromoter，pGPD，HTB，5srRNA，crRNA序列与图4所示的一样，FCC1表示靶基因的N23序列。
图7是重组质粒pCpf1Ff-DR-BIK3的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpRpromoter，pGPD，HTB，5srRNA，crRNA序列与图4所示的一样，BIK3表示靶基因的N23序列。
图8是重组质粒pCpf1Ff-DR-BIKi-UP的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpRpromoter，pGPD，HTB，5srRNA，crRNA序列与图4所示的一样，BIK3表示靶基因的N23序列，UP表示比卡菌素基因簇的上游同源臂序列。
图9是重组质粒pCpf1Ff-DR-BIKi-HR的结构图，其中HPH，pTRPC，AmpR，AmpRpromoter，pGPD，HTB，5srRNA，crRNA序列与图4所示的一样，BIK3表示靶基因的N23序列，Dn表示比卡菌素基因簇的下游同源臂序列。
图10为未采用基因编辑的对照赤霉菌。
图11为CRISPR/Cas9敲除fcc1基因后的紫色赤霉菌转化子。
图12为CRISPR/Cpf1敲除fcc1基因后的紫色赤霉菌转化子。
图13为比卡菌素基因簇敲除后PCR验证图。
图14为改造菌株发酵液液相检测图，其中上图为对照赤霉菌发酵后的液相检测图，下图为敲除比卡菌素基因簇的赤霉菌(转化子4)发酵后的液相检测图。
图15为原始赤霉菌和敲除比卡菌素基因簇的赤霉菌发酵后GA3产量对比图，图中包括原始赤霉菌与转化子1-8的GA3产量。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
本发明使用的赤霉菌为市面所售普通赤霉菌，购买于中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC AF 200026，或者采用野生型的赤霉菌均可，赤霉菌以生产一系列的植物激素—赤霉素(Gibberellins，简称GAs)而闻名。
质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph、质粒pUC-FfCas9-HTB-5srRNA-FCC1的构建方法可参考文献：(Shi,T.Q.；Gao,J.；Wang,W.J.；Wang,K.F.；Xu,G.Q.；Huang,H.；Ji,X.J.J.A.S.B.,CRISPR/Cas9-based genome-editing in the filamentous fungusFusarium fujikuroi and its application in strain engineering for gibberellicacid production.2019.)
再生培养基：每100mL含甘氨酸2g，麦芽糊精2.5g，蔗糖2g，乙酸铵0.45g，磷酸二氢钾0.1g，七水硫酸镁0.1g。
MYG固体再生平板：每400mL溶液含葡萄糖4g，酵母粉：1.2g，琼脂粉8g，蔗糖：68.5g。
Driselase崩溃酶，Lysing裂解酶，购买于sigma；Lysing崩溃酶的酶活≥10units/g；Driselase崩溃酶的酶活≥10％biuret。
实施例1
一、基因元件的扩增与目标质粒的制备
1、目标基因的制备
以构建的质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph(SEQ ID NO.25)(图1)为模板，设计引物HTBnls-R(SEQ ID NO.7)和HTBnls-F(SEQ ID NO.8)，对质粒进行扩增，得到不含fFuCas9基因的骨架线性片段，该片段作为后续重组质粒的骨架。
根据NCB1上提供的Fncpf1序列，委托擎科生物科技有限公司合成Fncpf1，Fncpf1核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，将Fncpf1基因与上述骨架线性片段通过ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，构建得到质粒pCpf1Ff，其上含有启动子pGPD(SEQ ID NO.1)-Fncpf1-终止子trpc-启动子pTRPC(SEQ ID NO.5)-潮霉素筛选标记hph(SEQ ID NO.6)表达框(图2)。再用限制性内切酶EcoRI对质粒pCpf1Ff进行酶切，回收线性质粒。将从质粒pUC-FfCas9-HTB-5srRNA-FCC1(图3)为模板，以5srRNA-F(SEQ ID NO.9)和5srRNA-DR-R(SEQ ID NO.10)为引物，PCR扩增下来的5srRNA(SEQ ID NO.3)与crRNA(SEQID NO.4)基因采用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆(pcr体系如表1所示，pcr程序为：预变性98℃，3min；变性:98℃,10s；退火；56℃,30s；延伸；72℃,30s/kb)，构建得到质粒pCpf1Ff-DR(图4)。再用限制性内切酶SpeI将pCpf1Ff-DR质粒进行酶切，***靶向FCC1基因的N23序列，构建成功的质粒命名为pCpf1Ff-DR-FCC1(图5)。
根据文献中所用质粒pUC-FfCas9-HTB-5srRNA-FCC1(SEQ ID NO.26)(图3)为模板，设计引物5srRNA-F(SEQ ID NO.9)和5srRNA-DR-R(SEQ ID NO.10)，扩增目的基因5srRNA(SEQ ID NO.3)与crRNA(SEQ ID NO.4)。
根据NCB1上提供的赤霉菌的基因组，找到FCC1靶基因序列，其中PAM区的TTTN序列之后紧接着的23个碱基序列即为要***重组质粒的基因片段，FCC1-N23序列如SEQ IDNO.11所示。由此设计引物委托擎科生物科技有限公司合成引物FCC1-N23-F(SEQ IDNO.12)和FCC1-N23-R(SEQ ID NO.13)，将进行引物退火延伸，通过碱基互补配对合成对应的基因片段FCC1-N23序列。
同样地，根据NCB1上提供的赤霉菌的基因组，找到比卡菌基因簇靶基因序列(CP023081.1)，其中PAM区的TTTN序列之后紧接着的23个碱基序列即为要***重组质粒的基因片段，本发明所用N23在比卡菌基因簇中的基因BIK3片段上，BIK3-N23序列如SEQ IDNO.14所示。由此设计引物委托擎科生物科技有限公司合成引物BIK3-N23-F(SEQ IDNO.15)和BIK3-N23-R(SEQ ID NO.16)，将进行引物退火延伸，通过碱基互补配对合成对应的基因片段BIK3-N23序列。
以赤霉菌基因组为模板，设计引物BIKi-UP-F(SEQ ID NO.18)和BIKi-UP-R(SEQID NO.19)，扩增目的基因BIKi-UP(SEQ ID NO.17)；同样以赤霉菌基因组为模板，设计引物BIKi-Dn-F(SEQ ID NO.21)和BIKi-Dn-R(SEQ ID NO.22)，扩增目的基因BIKi-Dn(SEQ IDNO.20)。
二、重组质粒的构建
1、重组质粒pCpf1Ff的构建
据文献中所用的质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph(图1)为模板，设计引物HTBnls-R和HTBnls-F，进行PCR扩增，得到不含fFuCas9基因的骨架线性片段，将此片段与委托擎科生物科技有限公司合成的Fncpf1进行一步克隆最终所得重组质粒为pCpf1Ff(图2)。
上述PCR反应中所用PCR酶为TAKARA的PrimeSTAR MaxDNA聚合酶。上述PCR扩增体系如下表1：
表1 PCR扩增体系
Figure BDA0003222326480000121
上述PCR的程序如下：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸(延伸时间＝目标片段长度/1kb，单位min)，重复35个循环。用AxyPrepTM DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化回收各片段。
一步克隆的体系如下表2：
表2一步克隆体系
Figure BDA0003222326480000122
X＝(0.02×克隆载体碱基对数)ng(0.03pmol)
Y＝(0.02×每个片段碱基对数)ng(0.03pmol)
将环状的重组载体转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，通过氨苄抗性的平板筛选并通过菌落PCR及测序验证，得到阳性重组质粒pCpf1Ff。
2、重组质粒pCpf1Ff-DR的构建
重组质粒pCpf1Ff-DR是以pCpf1Ff为骨架，用内切酶EcoRI在37℃酶切4h，将环状质粒酶切成线性片段。再用AxyPrepTM DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化该酶切体系，得到线性化的质粒pCpf1Ff片段。
根据文献中所用质粒pUC-FfCas9-HTB-5srRNA-FCC1(图3)为模板，设计引物5srRNA-F和5srRNA-DR-R，所用PCR酶为TAKARA的PrimeSTAR MaxDNA聚合酶，PCR扩增体系见上表1，扩增基因DR基因表达盒(包括启动子P5srRNA终止子T8T)。
用AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化PCR原液。
将线性化的质粒pCpf1Ff和构建的DR基因表达盒(包括启动子P5srRNA终止子T8T)利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pCpf1Ff-DR(SEQ ID NO.27)(图4、图5)，具体步骤同重组质粒pCpf1Ff的构建。
EcoRI酶切的体系如下表3：
表3 pCpf1Ff质粒酶切体系
Figure BDA0003222326480000131
3、重组质粒pCpf1Ff-DR-FCC1的构建
重组质粒pCpf1Ff-DR-FCC1是以pCpf1Ff-DR为骨架，用SpeI酶37℃酶切4h，将环状质粒酶切成线性片段。再用AxyPrepTM DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化该酶切体系，得到pCpf1Ff-DR线性片段。
根据NCB1上提供的赤霉菌的基因组，找到FCC1靶基因序列，其中PAM区的TTTN序列之后紧接着的23个碱基即为要***重组质粒的片段，由此设计引物委托擎科生物科技有限公司合成FCC1-N23-F和FCC1-N23-R，将单链引物退火延伸，通过碱基互补配对合成对应的双链片段FCC1-N23。
上述PCR的程序如下：将引物FCC1-N23-F和FCC1-N23-R各加20μL配成体系，从95℃开始到16℃结束，梯度设置温度，5℃为一梯度，每个阶段一分钟。
将线性化的质粒pCpf1Ff-DR和通过退火延伸得到的双链片段fcc1-N23利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pCpf1Ff-DR-FCC1(SEQ ID NO.23)(图6)，具体步骤同重组质粒pCpf1Ff的构建。
SpeI酶切的体系如下表4：
表4 pCpf1Ff-DR质粒酶切体系
Figure BDA0003222326480000132
Figure BDA0003222326480000141
4、重组质粒pCpf1Ff-DR-BIK3的构建
重组质粒pCpf1Ff-DR-BIK3是以pCpf1Ff-DR为骨架，用SpeI酶37℃酶切4h，将环状质粒酶切成线性片段。再用AxyPrepTM DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化该酶切体系，得到pCpf1Ff-DR线性片段。
根据NCB1上提供的赤霉菌的基因组，找到比卡菌基因簇序列，其中PAM区的TTTN序列之后紧接着的23个碱基即为要***重组质粒的片段，由此设计引物委托擎科生物科技有限公司合成BIK3-N23-F和BIK3-N23-R，将单链引物退火延伸，通过碱基互补配对合成对应的双链片段BIK3-N23。
上述PCR的程序如下：将引物BIK3-N23-F和BIK3-N23-R各加20μL配成体系，从95℃开始到16℃结束，梯度设置温度，5℃为一梯度，每个阶段一分钟。
将线性化的质粒pCpf1Ff-DR和通过退火延伸得到的双链片段BIK3-N23利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pCpf1Ff-DR-BIK3(图7)，具体步骤同重组质粒pCpf1Ff-DR-FCC1的构建。
5、重组质粒pCpf1Ff-DR-BIK3-HR的构建
重组质粒pCpf1Ff-DR-BIK3-UP是以pCpf1Ff-DR-BIKi为骨架，先用pmeI酶37℃酶切4h，将环状质粒酶切成线性片段。再用AxyPrepTM DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化该酶切体系，得到pCpf1Ff-DR-BIKi线性片段。
以赤霉菌基因组为模板，设计引物BIKi-UP-F和BIKi-UP-R，所用PCR酶为TAKARA的PrimeSTAR MaxDNA聚合酶，PCR扩增体系见上表1，扩增目的基因BIKi-UP；
用AxyPrepTM DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化PCR原液。
将线性化的质粒pCpf1Ff-DR-BIKi和构建的目的基因BIKi-UP利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pCpf1Ff-DR-BIKi-UP(图8)。
pmeI酶切的体系如下表5：
表5 pCpf1Ff-DR-BIKi质粒酶切体系
Figure BDA0003222326480000151
重组质粒pCpf1Ff-DR-BIK3-HR是以pCpf1Ff-DR-BIKi-UP为骨架，先用swaI酶37℃酶切4h，将环状质粒酶切成线性片段。再用AxyPrepTM DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化该酶切体系，得到pCpf1Ff-DR-BIKi-UP线性片段。
同样以赤霉菌基因组为模板，设计引物BIKi-Dn-F和BIKi-Dn-R，所用PCR酶为TAKARA的PrimeSTAR MaxDNA聚合酶，PCR扩增体系见上表1，扩增目的基因BIKi-Dn；
用AxyPrepTM DNAGel Extraction Kit(购自康宁生命科学有限公司)纯化PCR原液。
将线性化的质粒pCpf1Ff-DR-BIKi-UP和构建的目的基因BIKi-Dn利用南京诺唯赞生物科技有限公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit实现一步克隆，得到重组质粒pCpf1Ff-DR-BIKi-HR(SEQ ID NO.24)(图9)。
swaI酶切的体系如下表6：
表6 pCpf1Ff-DR-BIKi-UP质粒酶切体系
Figure BDA0003222326480000152
本实施例中使用的引物序列如表7所示。
表7所有的引物序列
Figure BDA0003222326480000153
Figure BDA0003222326480000161
实施例2
赤霉菌感受态的制备
(1)赤霉菌单菌落接种至100mL的再生培养基，培养温度30℃，转速200RPM，培养48h。(2)接种10mL菌液到新的100mL再生培养基扩大培养12h。(3)培养液用无菌擦镜纸过滤，收集菌体。(4)配置10mL酶解液：用质量配比Dryalase(崩溃酶)：Lysing(裂解酶)＝3：7的混合酶(45mg，105mg)溶解于氯化钠缓冲液(10mL中含0.41g)，搅拌混匀。0.22μm滤头过滤除菌后，每10mL加入1g菌体，30℃，200RPM，酶解3.5h。(5)酶解液经过3层擦镜纸过滤除去菌丝残片。(6)过滤得到原生质体溶液，3000RPM离心10min，沉淀原生质体。(7)原生质体沉淀用冰浴的STC溶液(1M山梨醇，10mM Tris-cl，50mM CaCl2，pH＝7.5)悬浮离心沉淀原生质体，重复一次。(8)原生质体悬浮于适量的STC溶液，调整原生质体107-108个/mL。
实施例3
重组质粒的转化
(1)取100uL实施例2的原生质体，加入50μL STC溶液，加入10μg实施例1得到的重组质粒pCpf1Ff-DR-FCC1，混合后冰浴20分钟。(2)加入50μL 25％的PEG6000的溶液(1M山梨醇，10mM Tris-Cl，50mM CaCl2，pH＝7.5)混合后冰浴20分钟。(3)加入1mL PEG6000溶液，室温下混合5min，再加入2mLSTC溶液，混匀后取160μL涂布MYG固体再生平板，培养12h后，覆盖10mL浓度为100μg/ml的潮霉素软琼脂再生平板等待5-7天转化子出现。平板上得到了预期的紫菌，(赤霉菌本身是白色的，FCC1被敲除才会有的现象)，同时基因组测序结果说明FCC1基因被成功敲出了。
通过将重组质粒pCpf1Ff-DR-FCC1转化到赤霉菌感受态涂布20个平板，又覆盖潮霉素抗性，结果长出来约30个转化子，其中有17个菌显紫色(图10为空白对照，图12为采用CRISPR/Cpf1技术敲除后FCC1基因后的紫色的赤霉菌)，也就是FCC1基因被成功敲除。
此外，本发明中采用传统的CRISPR-Cas9编辑效率一般只有20％(图11)，多靶效率更低，而本发明的CRISPR/Cpf1基因编辑***其编辑效率达至少50％及以上(详见表1和2)。相对于传统的基因编辑技术CRISPR/Cpf1效率较高。
计算公式：基因编辑效率＝验证敲除成功的转化子个数/板上所有长出来的转化子个数·100％。
其中，传统的CRISPR-Cas9采用同样的骨架，区别在于本发明是Fncpf1基因替换为cas9基因，同时两者的crRNA不同，cas9基因和crRNA可参考文献：(Shi,T.Q.；Gao,J.；Wang,W.J.；Wang,K.F.；Xu,G.Q.；Huang,H.；Ji,X.J.J.A.S.B.,CRISPR/Cas9-based genome-editing in the filamentous fungus Fusarium fujikuroi and its application instrain engineering for gibberellic acid production.2019.)
表1.三次对照试验CRISPR-Cas9对FCC1基因的编辑效率
Figure BDA0003222326480000171
Figure BDA0003222326480000181
表2.三次对照试验CRISPR-Cpf1对FCC1基因的编辑效率
Figure BDA0003222326480000182
实施例4
按照实施例3的方法将重组质粒pCpf1Ff-DR-BIKi-HR，转化到赤霉菌感受态涂布20个平板，又覆盖潮霉素抗性，挑出8个阳性转化子，转接到100mL的YPD培养基，30℃,200RPM培养48h后提基因组进行PCR验证，如果扩增出2002bp，说明该基因簇已经敲除。图13显示8个转化子在2000bp左右都可以扩增出对应条带，说明这8个转化子中的比卡菌基因簇均被成功敲除，同时基因测序结果也验证了敲除成功。
将原始赤霉菌和改造后的8个转化子接种到YPD，30℃，200RPM培养16h，按照体积比10％接种量转接到YPD培养基中，30℃，200rpm发酵培养5天后，过滤培养物，然后使用高效液相色谱检测GA3产量。检测方法：甲醇/水/磷酸(68∶32∶0.05)的流动相，以0.7毫升/分钟的流速分离预处理的样品，检测波长为210nm，进样量为10微升。GA3的保留时间分别为21.206分钟。通过液相测定结果表明敲除比卡菌基因簇的赤霉菌在相同的条件下GA3的产量比对照原始赤霉菌提高了19.7％(图14和图15)。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一种CRISPR/Cpf1基因编辑***及其构建方法和在赤霉菌中的应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 882
<212> DNA
<213> 人工序列(pGPD SEQ ID NO.1)
<400> 1
gtacagtgac cggtgactct ttctggcatg cggagagacg gacggacgca gagagaaggg 60
ctgagtaata agcgccactg cgccagacag ctctggcggc tctgaggtgc agtggatgat 120
tattaatccg ggaccggccg cccctccgcc ccgaagtgga aaggctggtg tgcccctcgt 180
tgaccaagaa tctattgcat catcggagaa tatggagctt catcgaatca ccggcagtaa 240
gcgaaggaga atgtgaagcc aggggtgtat agccgtcggc gaaatagcat gccattaacc 300
taggtacaga agtccaattg cttccgatct ggtaaaagat tcacgagata gtaccttctc 360
cgaagtaggt agagcgagta cccggcgcgt aagctcccta attggcccat ccggcatctg 420
tagggcgtcc aaatatcgtg cctctcctgc tttgcccggt gtatgaaacc ggaaaggccg 480
ctcaggagct ggccagcggc gcagaccggg aacacaagct ggcagtcgac ccatccggtg 540
ctctgcactc gacctgctga ggtccctcag tccctggtag gcagctttgc cccgtctgtc 600
cgcccggtgt gtcggcgggg ttgacaaggt cgttgcgtca gtccaacatt tgttgccata 660
ttttcctgct ctccccacca gctgctcttt tcttttctct ttcttttccc atcttcagta 720
tattcatctt cccatccaag aacctttatt tcccctaagt aagtactttg ctacatccat 780
actccatcct tcccatccct tattcctttg aacctttcag ttcgagcttt cccacttcat 840
cgcagcttga ctaacagcta ccccgcttga gcagacatca cc 882
<210> 2
<211> 3900
<212> DNA
<213> 人工序列(FnCpf1 SEQ ID NO.2)
<400> 2
atgagcatct atcaggagtt cgtgaataag tacagcctgt ccaagaccct gcggtttgag 60
ctgatccccc agggcaagac actggagaac atcaaggcca ggggcctgat cctggacgat 120
gagaagcgcg ccaaggacta taagaaggcc aagcagatca tcgataagta ccaccagttc 180
tttatcgagg agatcctgag cagcgtgtgc atctctgagg atctgctgca gaattacagc 240
gacgtgtatt tcaagctgaa gaagtctgac gatgacaacc tgcagaagga cttcaagagc 300
gccaaggaca ccatcaagaa gcagatcagc gagtatatca aggactccga gaagtttaag 360
aatctgttca accagaatct gatcgatgcc aagaagggcc aggagtccga cctgatcctg 420
tggctgaagc agtctaagga caatggcatc gagctgttca aggccaactc tgatatcacc 480
gatatcgacg aggccctgga gatcatcaag agctttaagg gctggaccac atactttaag 540
ggcttccacg agaacaggaa gaacgtgtac agcagcaacg acatccctac aagcatcatc 600
taccgcatcg tggatgacaa tctgccaaag ttcctggaga acaaggccaa gtatgagtcc 660
ctgaaggaca aggcccccga ggccatcaat tacgagcaga tcaagaagga tctggccgag 720
gagctgacct tcgatatcga ctataagaca tccgaggtga accagcgggt gttttctctg 780
gacgaggtgt ttgagatcgc caatttcaac aattacctga accagtccgg catcaccaag 840
ttcaatacaa tcatcggcgg caagtttgtg aacggcgaga ataccaagag aaagggcatc 900
aacgagtaca tcaatctgta tagccagcag atcaacgaca agaccctgaa gaagtacaag 960
atgagcgtgc tgttcaagca gatcctgtcc gatacagagt ctaagagctt tgtgatcgat 1020
aagctggagg atgactctga cgtggtgacc acaatgcaga gcttttatga gcagatcgcc 1080
gccttcaaga ccgtggagga gaagtctatc aaggagacac tgagcctgct gttcgatgac 1140
ctgaaggccc agaagctgga cctgtctaag atctacttca agaacgataa gtccctgacc 1200
gacctgtctc agcaggtgtt tgatgactat agcgtgatcg gcaccgccgt gctggagtac 1260
atcacacagc agatcgcccc aaagaacctg gataatccct ctaagaagga gcaggagctg 1320
atcgccaaga agaccgagaa ggccaagtat ctgagcctgg agacaatcaa gctggccctg 1380
gaggagttca ataagcaccg ggatatcgac aagcagtgca gatttgagga gatcctggcc 1440
aacttcgccg ccatccccat gatctttgat gagatcgccc agaacaagga caatctggcc 1500
cagatctcca tcaagtacca gaaccagggc aagaaggacc tgctgcaggc ctctgccgag 1560
gatgacgtga aggccatcaa ggatctgctg gaccagacca acaatctgct gcacaagctg 1620
aagatcttcc acatctccca gtctgaggat aaggccaata tcctggataa ggacgagcac 1680
ttttatctgg tgttcgagga gtgttacttc gagctggcca acatcgtgcc cctgtacaac 1740
aagatcagaa attatatcac acagaagcct tactccgacg agaagtttaa gctgaacttc 1800
gagaacagca ccctggccaa cggctgggat aagaataagg agcctgacaa cacagccatc 1860
ctgttcatca aggatgacaa gtactatctg ggcgtgatga ataagaagaa caataagatc 1920
ttcgatgaca aggccatcaa ggagaacaag ggcgagggct acaagaagat cgtgtataag 1980
ctgctgcccg gcgccaataa gatgctgcct aaggtgttct tttccgccaa gtctatcaag 2040
ttctacaacc catccgagga catcctgcgg atcagaaatc actccaccca cacaaagaac 2100
ggctctcccc agaagggcta tgagaagttt gagttcaata tcgaggattg ccggaagttt 2160
atcgacttct acaagcagag catctccaag caccctgagt ggaaggattt tggcttcagg 2220
tttagcgaca cccagcggta caactccatc gacgagttct acagagaggt ggagaatcag 2280
ggctataagc tgacatttga gaacatctct gagagctaca tcgacagcgt ggtgaatcag 2340
ggcaagctgt acctgttcca gatctataac aaggacttca gcgcctattc caagggccgg 2400
ccaaacctgc acaccctgta ctggaaggcc ctgttcgatg agagaaatct gcaggacgtg 2460
gtgtataagc tgaacggcga ggccgagctg ttttacagga agcagtccat ccctaagaag 2520
atcacacacc cagccaagga ggccatcgcc aacaagaata aggacaatcc taagaaggag 2580
agcgtgttcg agtacgatct gatcaaggac aagcggttca ccgaggataa gttctttttc 2640
cactgtccaa tcacaatcaa cttcaagtcc tctggcgcca acaagtttaa tgacgagatc 2700
aatctgctgc tgaaggagaa ggccaacgat gtgcacatcc tgagcatcga ccggggcgag 2760
agacacctgg cctactatac cctggtggat ggcaagggca atatcatcaa gcaggatacc 2820
ttcaacatca tcggcaatga caggatgaag acaaactacc acgataagct ggccgccatc 2880
gagaaggata gggactccgc ccgcaaggac tggaagaaga tcaacaatat caaggagatg 2940
aaggagggct atctgtctca ggtggtgcac gagatcgcca agctggtcat cgagtacaat 3000
gccatcgtgg tgttcgagga tctgaacttc ggctttaaga ggggccgctt taaggtggag 3060
aagcaggtgt atcagaagct ggagaagatg ctgatcgaga agctgaatta cctggtgttt 3120
aaggataacg agttcgacaa gaccggaggc gtgctgaggg cataccagct gaccgccccc 3180
tttgagacat tcaagaagat gggcaagcag acaggcatca tctactatgt gccagccggc 3240
ttcacctcca agatctgccc cgtgacaggc tttgtgaacc agctgtaccc taagtatgag 3300
tccgtgtcta agagccagga gtttttcagc aagttcgata agatctgtta taatctggac 3360
aagggctact tcgagttttc cttcgattat aagaactttg gcgacaaggc cgccaagggc 3420
aagtggacca tcgcctcttt cggcagccgg ctgatcaact ttagaaattc cgataagaac 3480
cacaattggg acacccggga ggtgtaccca acaaaggagc tggagaagct gctgaaggac 3540
tacagcatcg agtatggcca cggcgagtgc atcaaggccg ccatctgtgg cgagagcgat 3600
aagaagtttt tcgccaagct gacctccgtg ctgaatacaa tcctgcagat gcggaacagc 3660
aagaccggca cagagctgga ctacctgatc tcccccgtgg ccgatgtgaa cggcaacttc 3720
ttcgacagca gacaggcccc caagaatatg cctcaggatg ccgacgccaa cggcgcctat 3780
cacatcggcc tgaagggcct gatgctgctg ggcaggatca agaacaatca ggagggcaag 3840
aagctgaacc tggtcatcaa gaacgaggag tactttgagt tcgtgcagaa ccgcaacaat 3900
<210> 3
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列(5srRNA SEQ ID NO.3)
<400> 3
cacatacgac caaaggtagt ggaaaatacg ggatcccgtc cgctctccca tagtcaagcc 60
actaaccggc ggattagtag ttgggtcggt gacgaccagc gaatccccgc tgttgtatg 119
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(crRNA SEQ ID NO.4)
<400> 4
taatttctac tgttgtaga 19
<210> 5
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(pTRPC SEQ ID NO.5)
<400> 5
tcccaataca agtgtaatgc tagtggaggt caacacatca atgcctattt tggtttagtc 60
gtccaggcgg tgagcacaaa atttgtgtcg tttgacaaga tggttcattt aggcaactgg 120
tcagatcagc cccacttgta gcagtagcgg cggcgctcga agtgtgactc ttattagcag 180
acaggaacga ggacattatt atcatctgct gcttggtgca cgataacttg gtgcgtttgt 240
caagcaaggt aagtggacga cccggtcata ccttcttaag ttcgcccttc ctccctttat 300
ttcagattca atctgactta cctattctac ccaagcatcc aa 342
<210> 6
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列(hph SEQ ID NO.6)
<400> 6
atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60
agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120
gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180
cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240
ggggagttca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300
caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctccagc cggtcgcgga ggccatggat 360
gcgattgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420
atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480
cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540
ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcatgc ggatttcggc 600
tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660
atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcctct tctggaggcc gtggttggct 720
tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780
cgcctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840
ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900
gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960
tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020
gaatag 1026
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(FCC1-N23 SEQ ID NO.11)
<400> 7
cgcttccgca gcaacgccat ctg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(BIK3-N23 SEQ ID NO.14)
<400> 8
ctatagcttt gaatgaccat tat 23
<210> 9
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(BIKi-UP SEQ ID NO.17)
<400> 9
attggatatc gtctgtaggt ttgggtagcc atacattgca tataacatag cccgctccca 60
aacctggggt actgatcttg acttctcggt catgaccttc atttggaccg gtcagaaatg 120
atacaagctt gcgcagagtc caggtgacgc agttgaggta gattcgatag ggaaagggcc 180
attcttggcc atctgttaca gtaggtatac taacacgact ctgctcagtt gtcatactgt 240
gaggagaatt aaaacagatc cggattgatg agttaccagg tgtgaaagcg cagtaaatgt 300
agtgaaagtg ggctggcgct ggcgctaact tatgtcagtg cgctgacaca gtcaataact 360
aacctatgcg ggtgagatgt gtacccgagg gagaacatga attcaattaa gacggacaag 420
ttcaagatat gagaatagca attataggaa atatgaataa aaatctaagt cagagaaatt 480
ttgctgcttc aacttccttg 500
<210> 10
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列(BIKi- Dn SEQ ID NO.20)
<400> 10
gctgctgagg ttagacaagc agccctgtcg tggctgtttt gatccaacat gcatattcca 60
atcgcggaac cgagcagatg gtgagctgat gtcgggcgtt gtccatttcg tcatttatga 120
gacaccgaca tgcatgaaat ggtcatggat acgggtttaa cagatgtcat caatattgaa 180
cgccactcat tgctggaacg ctcgctcatt tcagtgccct ttttagagat aaacaacatc 240
accagattga gttagaatag aacccttgta atttccactt aataattcac tctacccatc 300
ggcaagcctt ctccctaaca tgatgctacc gtaccatgac gctgactcgc tgccaaacac 360
gtgctccccg atgataacat atcgcattac gtgttctaat cctgaatacg cttgaatacg 420
atataccctg tttatcgtac tttcaaccgc actgaccaac ctgccatctc aagcctagcc 480
gaaaccttaa gcgtatagtt 500
<210> 11
<211> 10627
<212> DNA
<213> 人工序列(pCpf1Ff-DR-FCC1 SEQ ID NO.23)
<400> 11
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accagatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccacatacga ccaaaggtag 420
tggaaaatac gggatcccgt ccgctctccc atagtcaagc cactaaccgg cggattagta 480
gttgggtcgg tgacgaccag cgaatccccg ctgttgtatg taatttctac tgttgtagat 540
cgcttccgca gcaacgccat ctgttttttt taattcgagc tcggtacctc gcgaatgcat 600
ctagatatcg gatcccgggc ccgtcgactg cagaggcctg catgcaagct tgtacagtga 660
ccggtgactc tttctggcat gcggagagac ggacggacgc agagagaagg gctgagtaat 720
aagcgccact gcgccagaca gctctggcgg ctctgaggtg cagtggatga ttattaatcc 780
gggaccggcc gcccctccgc cccgaagtgg aaaggctggt gtgcccctcg ttgaccaaga 840
atctattgca tcatcggaga atatggagct tcatcgaatc accggcagta agcgaaggag 900
aatgtgaagc caggggtgta tagccgtcgg cgaaatagca tgccattaac ctaggtacag 960
aagtccaatt gcttccgatc tggtaaaaga ttcacgagat agtaccttct ccgaagtagg 1020
tagagcgagt acccggcgcg taagctccct aattggccca tccggcatct gtagggcgtc 1080
caaatatcgt gcctctcctg ctttgcccgg tgtatgaaac cggaaaggcc gctcaggagc 1140
tggccagcgg cgcagaccgg gaacacaagc tggcagtcga cccatccggt gctctgcact 1200
cgacctgctg aggtccctca gtccctggta ggcagctttg ccccgtctgt ccgcccggtg 1260
tgtcggcggg gttgacaagg tcgttgcgtc agtccaacat ttgttgccat attttcctgc 1320
tctccccacc agctgctctt ttcttttctc tttcttttcc catcttcagt atattcatct 1380
tcccatccaa gaacctttat ttcccctaag taagtacttt gctacatcca tactccatcc 1440
ttcccatccc ttattccttt gaacctttca gttcgagctt tcccacttca tcgcagcttg 1500
actaacagct accccgcttg agcagacatc acctacgtaa tgagcatcta tcaggagttc 1560
gtgaataagt acagcctgtc caagaccctg cggtttgagc tgatccccca gggcaagaca 1620
ctggagaaca tcaaggccag gggcctgatc ctggacgatg agaagcgcgc caaggactat 1680
aagaaggcca agcagatcat cgataagtac caccagttct ttatcgagga gatcctgagc 1740
agcgtgtgca tctctgagga tctgctgcag aattacagcg acgtgtattt caagctgaag 1800
aagtctgacg atgacaacct gcagaaggac ttcaagagcg ccaaggacac catcaagaag 1860
cagatcagcg agtatatcaa ggactccgag aagtttaaga atctgttcaa ccagaatctg 1920
atcgatgcca agaagggcca ggagtccgac ctgatcctgt ggctgaagca gtctaaggac 1980
aatggcatcg agctgttcaa ggccaactct gatatcaccg atatcgacga ggccctggag 2040
atcatcaaga gctttaaggg ctggaccaca tactttaagg gcttccacga gaacaggaag 2100
aacgtgtaca gcagcaacga catccctaca agcatcatct accgcatcgt ggatgacaat 2160
ctgccaaagt tcctggagaa caaggccaag tatgagtccc tgaaggacaa ggcccccgag 2220
gccatcaatt acgagcagat caagaaggat ctggccgagg agctgacctt cgatatcgac 2280
tataagacat ccgaggtgaa ccagcgggtg ttttctctgg acgaggtgtt tgagatcgcc 2340
aatttcaaca attacctgaa ccagtccggc atcaccaagt tcaatacaat catcggcggc 2400
aagtttgtga acggcgagaa taccaagaga aagggcatca acgagtacat caatctgtat 2460
agccagcaga tcaacgacaa gaccctgaag aagtacaaga tgagcgtgct gttcaagcag 2520
atcctgtccg atacagagtc taagagcttt gtgatcgata agctggagga tgactctgac 2580
gtggtgacca caatgcagag cttttatgag cagatcgccg ccttcaagac cgtggaggag 2640
aagtctatca aggagacact gagcctgctg ttcgatgacc tgaaggccca gaagctggac 2700
ctgtctaaga tctacttcaa gaacgataag tccctgaccg acctgtctca gcaggtgttt 2760
gatgactata gcgtgatcgg caccgccgtg ctggagtaca tcacacagca gatcgcccca 2820
aagaacctgg ataatccctc taagaaggag caggagctga tcgccaagaa gaccgagaag 2880
gccaagtatc tgagcctgga gacaatcaag ctggccctgg aggagttcaa taagcaccgg 2940
gatatcgaca agcagtgcag atttgaggag atcctggcca acttcgccgc catccccatg 3000
atctttgatg agatcgccca gaacaaggac aatctggccc agatctccat caagtaccag 3060
aaccagggca agaaggacct gctgcaggcc tctgccgagg atgacgtgaa ggccatcaag 3120
gatctgctgg accagaccaa caatctgctg cacaagctga agatcttcca catctcccag 3180
tctgaggata aggccaatat cctggataag gacgagcact tttatctggt gttcgaggag 3240
tgttacttcg agctggccaa catcgtgccc ctgtacaaca agatcagaaa ttatatcaca 3300
cagaagcctt actccgacga gaagtttaag ctgaacttcg agaacagcac cctggccaac 3360
ggctgggata agaataagga gcctgacaac acagccatcc tgttcatcaa ggatgacaag 3420
tactatctgg gcgtgatgaa taagaagaac aataagatct tcgatgacaa ggccatcaag 3480
gagaacaagg gcgagggcta caagaagatc gtgtataagc tgctgcccgg cgccaataag 3540
atgctgccta aggtgttctt ttccgccaag tctatcaagt tctacaaccc atccgaggac 3600
atcctgcgga tcagaaatca ctccacccac acaaagaacg gctctcccca gaagggctat 3660
gagaagtttg agttcaatat cgaggattgc cggaagttta tcgacttcta caagcagagc 3720
atctccaagc accctgagtg gaaggatttt ggcttcaggt ttagcgacac ccagcggtac 3780
aactccatcg acgagttcta cagagaggtg gagaatcagg gctataagct gacatttgag 3840
aacatctctg agagctacat cgacagcgtg gtgaatcagg gcaagctgta cctgttccag 3900
atctataaca aggacttcag cgcctattcc aagggccggc caaacctgca caccctgtac 3960
tggaaggccc tgttcgatga gagaaatctg caggacgtgg tgtataagct gaacggcgag 4020
gccgagctgt tttacaggaa gcagtccatc cctaagaaga tcacacaccc agccaaggag 4080
gccatcgcca acaagaataa ggacaatcct aagaaggaga gcgtgttcga gtacgatctg 4140
atcaaggaca agcggttcac cgaggataag ttctttttcc actgtccaat cacaatcaac 4200
ttcaagtcct ctggcgccaa caagtttaat gacgagatca atctgctgct gaaggagaag 4260
gccaacgatg tgcacatcct gagcatcgac cggggcgaga gacacctggc ctactatacc 4320
ctggtggatg gcaagggcaa tatcatcaag caggatacct tcaacatcat cggcaatgac 4380
aggatgaaga caaactacca cgataagctg gccgccatcg agaaggatag ggactccgcc 4440
cgcaaggact ggaagaagat caacaatatc aaggagatga aggagggcta tctgtctcag 4500
gtggtgcacg agatcgccaa gctggtcatc gagtacaatg ccatcgtggt gttcgaggat 4560
ctgaacttcg gctttaagag gggccgcttt aaggtggaga agcaggtgta tcagaagctg 4620
gagaagatgc tgatcgagaa gctgaattac ctggtgttta aggataacga gttcgacaag 4680
accggaggcg tgctgagggc ataccagctg accgccccct ttgagacatt caagaagatg 4740
ggcaagcaga caggcatcat ctactatgtg ccagccggct tcacctccaa gatctgcccc 4800
gtgacaggct ttgtgaacca gctgtaccct aagtatgagt ccgtgtctaa gagccaggag 4860
tttttcagca agttcgataa gatctgttat aatctggaca agggctactt cgagttttcc 4920
ttcgattata agaactttgg cgacaaggcc gccaagggca agtggaccat cgcctctttc 4980
ggcagccggc tgatcaactt tagaaattcc gataagaacc acaattggga cacccgggag 5040
gtgtacccaa caaaggagct ggagaagctg ctgaaggact acagcatcga gtatggccac 5100
ggcgagtgca tcaaggccgc catctgtggc gagagcgata agaagttttt cgccaagctg 5160
acctccgtgc tgaatacaat cctgcagatg cggaacagca agaccggcac agagctggac 5220
tacctgatct cccccgtggc cgatgtgaac ggcaacttct tcgacagcag acaggccccc 5280
aagaatatgc ctcaggatgc cgacgccaac ggcgcctatc acatcggcct gaagggcctg 5340
atgctgctgg gcaggatcaa gaacaatcag gagggcaaga agctgaacct ggtcatcaag 5400
aacgaggagt actttgagtt cgtgcagaac cgcaacaatt acgtaatggc tcccaaggct 5460
gctgacaaga agcccgcctc caaggctccc gctactgcct ccaaggctcc tgagaagaag 5520
gatgccggca agaagactgc cgcctctggt gacaagaaga agcgctccaa gacccgcaag 5580
gagacttact cttcttacat ctacaagtaa cacttaacgt tactgaaatc atcaaacagc 5640
ttgacgaatc tggatataag atcgttggtg tcgatgtcag ctccggagtt gagacaaatg 5700
gtgttcagga tctcgataag atacgttcat ttgtccaagc agcaaagagt gccttctagt 5760
gatttaatag ctccatgtca acaagaataa aacgcgtttt cgggtttacc tcttccagat 5820
acagctcatc tgcaatgcat taatgcattg actgcaacct agtaacgcct ttcaggctcc 5880
ggcgaagaga agaatagctt agcagagcta ttttcatttt cgggagacga gatcaagcag 5940
atcaacggtc gtcaagagac ctacgagact gaggaatccg ctcttggctc cacgcgacta 6000
tatatttgtc tctaattgta ctttgacatg ctcctcttct ttactctgat agcttgacta 6060
tgaaaattcc gtcaccagcc cctgggttcg caaagataat tgcatgtttc ttccttgaac 6120
tctcaagcct acaggacaca cattcatcgt aggtataaac ctcgaaatcg tttaaactgt 6180
acacacgtga tattacatga cctggacaga gttctgcgcg aaagtcataa cgtaaatccc 6240
gggcggtagg tgcgtcccgg gcggaaggta gttttctcgt ccaccccaac gcgtttatca 6300
acctcaactt tcaacaacca tcatgccacc aaaagcgcgt aaaacaaagc gagatttgat 6360
tgagcaagag ggcaggatcc aatgcgcgat tcaagacatt aaaaatggaa aatttcaaaa 6420
aattgcgccc gcagcgcgtg catacaaaat tcatcccaat acaagtgtaa tgctagtgga 6480
ggtcaacaca tcaatgccta ttttggttta gtcgtccagg cggtgagcac aaaatttgtg 6540
tcgtttgaca agatggttca tttaggcaac tggtcagatc agccccactt gtagcagtag 6600
cggcggcgct cgaagtgtga ctcttattag cagacaggaa cgaggacatt attatcatct 6660
gctgcttggt gcacgataac ttggtgcgtt tgtcaagcaa ggtaagtgga cgacccggtc 6720
ataccttctt aagttcgccc ttcctccctt tatttcagat tcaatctgac ttacctattc 6780
tacccaagca tccaaatgaa aaagcctgaa ctcaccgcga cgtctgtcga gaagtttctg 6840
atcgaaaagt tcgacagcgt ctccgacctg atgcagctct cggagggcga agaatctcgt 6900
gctttcagct tcgatgtagg agggcgtgga tatgtcctgc gggtaaatag ctgcgccgat 6960
ggtttctaca aagatcgtta tgtttatcgg cactttgcat cggccgcgct cccgattccg 7020
gaagtgcttg acattgggga gttcagcgag agcctgacct attgcatctc ccgccgtgca 7080
cagggtgtca cgttgcaaga cctgcctgaa accgaactgc ccgctgttct ccagccggtc 7140
gcggaggcca tggatgcgat tgctgcggcc gatcttagcc agacgagcgg gttcggccca 7200
ttcggaccgc aaggaatcgg tcaatacact acatggcgtg atttcatatg cgcgattgct 7260
gatccccatg tgtatcactg gcaaactgtg atggacgaca ccgtcagtgc gtccgtcgcg 7320
caggctctcg atgagctgat gctttgggcc gaggactgcc ccgaagtccg gcacctcgtg 7380
catgcggatt tcggctccaa caatgtcctg acggacaatg gccgcataac agcggtcatt 7440
gactggagcg aggcgatgtt cggggattcc caatacgagg tcgccaacat cctcttctgg 7500
aggccgtggt tggcttgtat ggagcagcag acgcgctact tcgagcggag gcatccggag 7560
cttgcaggat cgccgcgcct ccgggcgtat atgctccgca ttggtcttga ccaactctat 7620
cagagcttgg ttgacggcaa tttcgatgat gcagcttggg cgcagggtcg atgcgacgca 7680
atcgtccgat ccggagccgg gactgtcggg cgtacacaaa tcgcccgcag aagcgcggcc 7740
gtctggaccg atggctgtgt agaagtactc gccgatagtg gaaaccgacg ccccagcact 7800
cgtccgaggg caaaggaata gagtagatgc cgaccgatcc ccactaccgc attaagacct 7860
cagcgcggcc gcaaatttaa ataaaatgaa gtgaagttcc tatactttct agagaatagg 7920
aacttctata gtgagtcgaa taagggcgac acaaaattta ttctaaatgc ataataaata 7980
ctgataacat cttatagttt gtattatatt ttgtattatc gttgacatgt ataattttga 8040
tatcaaaaac tgattttccc tttattattt tcgagattta ttttcttaat tctctttaac 8100
aaactagaaa tattgtatat acaaaaaatc ataaataata gatgaatagt ttaattatag 8160
gtgttcatca atcgaaaaag caacgtatct tatttaaagt gcgttgcttt tttctcattt 8220
ataaggttaa ataattctca tatatcaagc aaagtgacag gcgcccttaa atattctgac 8280
aaatgctctt tccctaaact ccccccataa aaaaacccgc cgaagcgggt ttttacgtta 8340
tttgcggatt aacgattact cgttatcaga accgcccagg gggcccgaag cttggcgtaa 8400
tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 8460
cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 8520
attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 8580
tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg 8640
ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 8700
gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 8760
ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 8820
cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 8880
ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 8940
accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 9000
catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 9060
gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 9120
tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 9180
agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 9240
actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 9300
gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 9360
aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 9420
gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 9480
aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 9540
atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 9600
gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 9660
atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgact cccacgctca 9720
ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 9780
cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 9840
agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 9900
cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 9960
tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 10020
agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 10080
gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 10140
gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 10200
ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 10260
tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 10320
tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 10380
gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 10440
caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 10500
atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac 10560
gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc 10620
tttcgtc 10627
<210> 12
<211> 11631
<212> DNA
<213> 人工序列(pCpf1Ff-DR-BIKi-HR SEQ ID NO.24)
<400> 12
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accagatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccacatacga ccaaaggtag 420
tggaaaatac gggatcccgt ccgctctccc atagtcaagc cactaaccgg cggattagta 480
gttgggtcgg tgacgaccag cgaatccccg ctgttgtatg taatttctac tgttgtagat 540
ctatagcttt gaatgaccat tatttttttt taattcgagc tcggtacctc gcgaatgcat 600
ctagatatcg gatcccgggc ccgtcgactg cagaggcctg catgcaagct tgtacagtga 660
ccggtgactc tttctggcat gcggagagac ggacggacgc agagagaagg gctgagtaat 720
aagcgccact gcgccagaca gctctggcgg ctctgaggtg cagtggatga ttattaatcc 780
gggaccggcc gcccctccgc cccgaagtgg aaaggctggt gtgcccctcg ttgaccaaga 840
atctattgca tcatcggaga atatggagct tcatcgaatc accggcagta agcgaaggag 900
aatgtgaagc caggggtgta tagccgtcgg cgaaatagca tgccattaac ctaggtacag 960
aagtccaatt gcttccgatc tggtaaaaga ttcacgagat agtaccttct ccgaagtagg 1020
tagagcgagt acccggcgcg taagctccct aattggccca tccggcatct gtagggcgtc 1080
caaatatcgt gcctctcctg ctttgcccgg tgtatgaaac cggaaaggcc gctcaggagc 1140
tggccagcgg cgcagaccgg gaacacaagc tggcagtcga cccatccggt gctctgcact 1200
cgacctgctg aggtccctca gtccctggta ggcagctttg ccccgtctgt ccgcccggtg 1260
tgtcggcggg gttgacaagg tcgttgcgtc agtccaacat ttgttgccat attttcctgc 1320
tctccccacc agctgctctt ttcttttctc tttcttttcc catcttcagt atattcatct 1380
tcccatccaa gaacctttat ttcccctaag taagtacttt gctacatcca tactccatcc 1440
ttcccatccc ttattccttt gaacctttca gttcgagctt tcccacttca tcgcagcttg 1500
actaacagct accccgcttg agcagacatc acctacgtaa tgagcatcta tcaggagttc 1560
gtgaataagt acagcctgtc caagaccctg cggtttgagc tgatccccca gggcaagaca 1620
ctggagaaca tcaaggccag gggcctgatc ctggacgatg agaagcgcgc caaggactat 1680
aagaaggcca agcagatcat cgataagtac caccagttct ttatcgagga gatcctgagc 1740
agcgtgtgca tctctgagga tctgctgcag aattacagcg acgtgtattt caagctgaag 1800
aagtctgacg atgacaacct gcagaaggac ttcaagagcg ccaaggacac catcaagaag 1860
cagatcagcg agtatatcaa ggactccgag aagtttaaga atctgttcaa ccagaatctg 1920
atcgatgcca agaagggcca ggagtccgac ctgatcctgt ggctgaagca gtctaaggac 1980
aatggcatcg agctgttcaa ggccaactct gatatcaccg atatcgacga ggccctggag 2040
atcatcaaga gctttaaggg ctggaccaca tactttaagg gcttccacga gaacaggaag 2100
aacgtgtaca gcagcaacga catccctaca agcatcatct accgcatcgt ggatgacaat 2160
ctgccaaagt tcctggagaa caaggccaag tatgagtccc tgaaggacaa ggcccccgag 2220
gccatcaatt acgagcagat caagaaggat ctggccgagg agctgacctt cgatatcgac 2280
tataagacat ccgaggtgaa ccagcgggtg ttttctctgg acgaggtgtt tgagatcgcc 2340
aatttcaaca attacctgaa ccagtccggc atcaccaagt tcaatacaat catcggcggc 2400
aagtttgtga acggcgagaa taccaagaga aagggcatca acgagtacat caatctgtat 2460
agccagcaga tcaacgacaa gaccctgaag aagtacaaga tgagcgtgct gttcaagcag 2520
atcctgtccg atacagagtc taagagcttt gtgatcgata agctggagga tgactctgac 2580
gtggtgacca caatgcagag cttttatgag cagatcgccg ccttcaagac cgtggaggag 2640
aagtctatca aggagacact gagcctgctg ttcgatgacc tgaaggccca gaagctggac 2700
ctgtctaaga tctacttcaa gaacgataag tccctgaccg acctgtctca gcaggtgttt 2760
gatgactata gcgtgatcgg caccgccgtg ctggagtaca tcacacagca gatcgcccca 2820
aagaacctgg ataatccctc taagaaggag caggagctga tcgccaagaa gaccgagaag 2880
gccaagtatc tgagcctgga gacaatcaag ctggccctgg aggagttcaa taagcaccgg 2940
gatatcgaca agcagtgcag atttgaggag atcctggcca acttcgccgc catccccatg 3000
atctttgatg agatcgccca gaacaaggac aatctggccc agatctccat caagtaccag 3060
aaccagggca agaaggacct gctgcaggcc tctgccgagg atgacgtgaa ggccatcaag 3120
gatctgctgg accagaccaa caatctgctg cacaagctga agatcttcca catctcccag 3180
tctgaggata aggccaatat cctggataag gacgagcact tttatctggt gttcgaggag 3240
tgttacttcg agctggccaa catcgtgccc ctgtacaaca agatcagaaa ttatatcaca 3300
cagaagcctt actccgacga gaagtttaag ctgaacttcg agaacagcac cctggccaac 3360
ggctgggata agaataagga gcctgacaac acagccatcc tgttcatcaa ggatgacaag 3420
tactatctgg gcgtgatgaa taagaagaac aataagatct tcgatgacaa ggccatcaag 3480
gagaacaagg gcgagggcta caagaagatc gtgtataagc tgctgcccgg cgccaataag 3540
atgctgccta aggtgttctt ttccgccaag tctatcaagt tctacaaccc atccgaggac 3600
atcctgcgga tcagaaatca ctccacccac acaaagaacg gctctcccca gaagggctat 3660
gagaagtttg agttcaatat cgaggattgc cggaagttta tcgacttcta caagcagagc 3720
atctccaagc accctgagtg gaaggatttt ggcttcaggt ttagcgacac ccagcggtac 3780
aactccatcg acgagttcta cagagaggtg gagaatcagg gctataagct gacatttgag 3840
aacatctctg agagctacat cgacagcgtg gtgaatcagg gcaagctgta cctgttccag 3900
atctataaca aggacttcag cgcctattcc aagggccggc caaacctgca caccctgtac 3960
tggaaggccc tgttcgatga gagaaatctg caggacgtgg tgtataagct gaacggcgag 4020
gccgagctgt tttacaggaa gcagtccatc cctaagaaga tcacacaccc agccaaggag 4080
gccatcgcca acaagaataa ggacaatcct aagaaggaga gcgtgttcga gtacgatctg 4140
atcaaggaca agcggttcac cgaggataag ttctttttcc actgtccaat cacaatcaac 4200
ttcaagtcct ctggcgccaa caagtttaat gacgagatca atctgctgct gaaggagaag 4260
gccaacgatg tgcacatcct gagcatcgac cggggcgaga gacacctggc ctactatacc 4320
ctggtggatg gcaagggcaa tatcatcaag caggatacct tcaacatcat cggcaatgac 4380
aggatgaaga caaactacca cgataagctg gccgccatcg agaaggatag ggactccgcc 4440
cgcaaggact ggaagaagat caacaatatc aaggagatga aggagggcta tctgtctcag 4500
gtggtgcacg agatcgccaa gctggtcatc gagtacaatg ccatcgtggt gttcgaggat 4560
ctgaacttcg gctttaagag gggccgcttt aaggtggaga agcaggtgta tcagaagctg 4620
gagaagatgc tgatcgagaa gctgaattac ctggtgttta aggataacga gttcgacaag 4680
accggaggcg tgctgagggc ataccagctg accgccccct ttgagacatt caagaagatg 4740
ggcaagcaga caggcatcat ctactatgtg ccagccggct tcacctccaa gatctgcccc 4800
gtgacaggct ttgtgaacca gctgtaccct aagtatgagt ccgtgtctaa gagccaggag 4860
tttttcagca agttcgataa gatctgttat aatctggaca agggctactt cgagttttcc 4920
ttcgattata agaactttgg cgacaaggcc gccaagggca agtggaccat cgcctctttc 4980
ggcagccggc tgatcaactt tagaaattcc gataagaacc acaattggga cacccgggag 5040
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acctccgtgc tgaatacaat cctgcagatg cggaacagca agaccggcac agagctggac 5220
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gctgacaaga agcccgcctc caaggctccc gctactgcct ccaaggctcc tgagaagaag 5520
gatgccggca agaagactgc cgcctctggt gacaagaaga agcgctccaa gacccgcaag 5580
gagacttact cttcttacat ctacaagtaa cacttaacgt tactgaaatc atcaaacagc 5640
ttgacgaatc tggatataag atcgttggtg tcgatgtcag ctccggagtt gagacaaatg 5700
gtgttcagga tctcgataag atacgttcat ttgtccaagc agcaaagagt gccttctagt 5760
gatttaatag ctccatgtca acaagaataa aacgcgtttt cgggtttacc tcttccagat 5820
acagctcatc tgcaatgcat taatgcattg actgcaacct agtaacgcct ttcaggctcc 5880
ggcgaagaga agaatagctt agcagagcta ttttcatttt cgggagacga gatcaagcag 5940
atcaacggtc gtcaagagac ctacgagact gaggaatccg ctcttggctc cacgcgacta 6000
tatatttgtc tctaattgta ctttgacatg ctcctcttct ttactctgat agcttgacta 6060
tgaaaattcc gtcaccagcc cctgggttcg caaagataat tgcatgtttc ttccttgaac 6120
tctcaagcct acaggacaca cattcatcgt aggtataaac ctcgaaatcg tttgtttatt 6180
ggatatcgtc tgtaggtttg ggtagccata cattgcatat aacatagccc gctcccaaac 6240
ctggggtact gatcttgact tctcggtcat gaccttcatt tggaccggtc agaaatgata 6300
caagcttgcg cagagtccag gtgacgcagt tgaggtagat tcgataggga aagggccatt 6360
cttggccatc tgttacagta ggtatactaa cacgactctg ctcagttgtc atactgtgag 6420
gagaattaaa acagatccgg attgatgagt taccaggtgt gaaagcgcag taaatgtagt 6480
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ctatgcgggt gagatgtgta cccgagggag aacatgaatt caattaagac ggacaagttc 6600
aagatatgag aatagcaatt ataggaaata tgaataaaaa tctaagtcag agaaattttg 6660
ctgcttcaac ttccttgaaa ctgtacacac gtgatattac atgacctgga cagagttctg 6720
cgcgaaagtc ataacgtaaa tcccgggcgg taggtgcgtc ccgggcggaa ggtagttttc 6780
tcgtccaccc caacgcgttt atcaacctca actttcaaca accatcatgc caccaaaagc 6840
gcgtaaaaca aagcgagatt tgattgagca agagggcagg atccaatgcg cgattcaaga 6900
cattaaaaat ggaaaatttc aaaaaattgc gcccgcagcg cgtgcataca aaattcatcc 6960
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gcaaggtaag tggacgaccc ggtcatacct tcttaagttc gcccttcctc cctttatttc 7260
agattcaatc tgacttacct attctaccca agcatccaaa tgaaaaagcc tgaactcacc 7320
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agccagacga gcgggttcgg cccattcgga ccgcaaggaa tcggtcaata cactacatgg 7740
cgtgatttca tatgcgcgat tgctgatccc catgtgtatc actggcaaac tgtgatggac 7800
gacaccgtca gtgcgtccgt cgcgcaggct ctcgatgagc tgatgctttg ggccgaggac 7860
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aatggccgca taacagcggt cattgactgg agcgaggcga tgttcgggga ttcccaatac 7980
gaggtcgcca acatcctctt ctggaggccg tggttggctt gtatggagca gcagacgcgc 8040
tacttcgagc ggaggcatcc ggagcttgca ggatcgccgc gcctccgggc gtatatgctc 8100
cgcattggtc ttgaccaact ctatcagagc ttggttgacg gcaatttcga tgatgcagct 8160
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agtggaaacc gacgccccag cactcgtccg agggcaaagg aatagagtag atgccgaccg 8340
atccccacta ccgcattaag acctcagcgc ggccgcaaat ttgctgctga ggttagacaa 8400
gcagccctgt cgtggctgtt ttgatccaac atgcatattc caatcgcgga accgagcaga 8460
tggtgagctg atgtcgggcg ttgtccattt cgtcatttat gagacaccga catgcatgaa 8520
atggtcatgg atacgggttt aacagatgtc atcaatattg aacgccactc attgctggaa 8580
cgctcgctca tttcagtgcc ctttttagag ataaacaaca tcaccagatt gagttagaat 8640
agaacccttg taatttccac ttaataattc actctaccca tcggcaagcc ttctccctaa 8700
catgatgcta ccgtaccatg acgctgactc gctgccaaac acgtgctccc cgatgataac 8760
atatcgcatt acgtgttcta atcctgaata cgcttgaata cgatataccc tgtttatcgt 8820
actttcaacc gcactgacca acctgccatc tcaagcctag ccgaaacctt aagcgtatag 8880
ttaaataaaa tgaagtgaag ttcctatact ttctagagaa taggaacttc tatagtgagt 8940
cgaataaggg cgacacaaaa tttattctaa atgcataata aatactgata acatcttata 9000
gtttgtatta tattttgtat tatcgttgac atgtataatt ttgatatcaa aaactgattt 9060
tccctttatt attttcgaga tttattttct taattctctt taacaaacta gaaatattgt 9120
atatacaaaa aatcataaat aatagatgaa tagtttaatt ataggtgttc atcaatcgaa 9180
aaagcaacgt atcttattta aagtgcgttg cttttttctc atttataagg ttaaataatt 9240
ctcatatatc aagcaaagtg acaggcgccc ttaaatattc tgacaaatgc tctttcccta 9300
aactcccccc ataaaaaaac ccgccgaagc gggtttttac gttatttgcg gattaacgat 9360
tactcgttat cagaaccgcc cagggggccc gaagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 9420
ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 9480
agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 9540
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cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 9660
gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 9720
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atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 9900
aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 9960
gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 10020
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agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt 10560
ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 10620
gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 10680
catctggccc cagtgctgca atgataccgc gactcccacg ctcaccggct ccagatttat 10740
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gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 11220
taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 11280
tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 11340
ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 11400
taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 11460
tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 11520
aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta 11580
ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt c 11631
<210> 13
<211> 10647
<212> DNA
<213> 人工序列(pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph SEQ ID NO.25)
<400> 13
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accagatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tgcatctaga tatcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcctgcatgc aagcttgtac 480
agtgaccggt gactctttct ggcatgcgga gagacggacg gacgcagaga gaagggctga 540
gtaataagcg ccactgcgcc agacagctct ggcggctctg aggtgcagtg gatgattatt 600
aatccgggac cggccgcccc tccgccccga agtggaaagg ctggtgtgcc cctcgttgac 660
caagaatcta ttgcatcatc ggagaatatg gagcttcatc gaatcaccgg cagtaagcga 720
aggagaatgt gaagccaggg gtgtatagcc gtcggcgaaa tagcatgcca ttaacctagg 780
tacagaagtc caattgcttc cgatctggta aaagattcac gagatagtac cttctccgaa 840
gtaggtagag cgagtacccg gcgcgtaagc tccctaattg gcccatccgg catctgtagg 900
gcgtccaaat atcgtgcctc tcctgctttg cccggtgtat gaaaccggaa aggccgctca 960
ggagctggcc agcggcgcag accgggaaca caagctggca gtcgacccat ccggtgctct 1020
gcactcgacc tgctgaggtc cctcagtccc tggtaggcag ctttgccccg tctgtccgcc 1080
cggtgtgtcg gcggggttga caaggtcgtt gcgtcagtcc aacatttgtt gccatatttt 1140
cctgctctcc ccaccagctg ctcttttctt ttctctttct tttcccatct tcagtatatt 1200
catcttccca tccaagaacc tttatttccc ctaagtaagt actttgctac atccatactc 1260
catccttccc atcccttatt cctttgaacc tttcagttcg agctttccca cttcatcgca 1320
gcttgactaa cagctacccc gcttgagcag acatcaccat ggacaagaag tactctatcg 1380
gcctcgacat cggtactaac tcagttggtt gggccgttat cacagacgag tacaaggttc 1440
ccagcaagaa gttcaaggtc cttggtaaca ccgaccgaca ctctatcaag aagaacctca 1500
tcggcgctct gcttttcgat tcaggagaga cagccgaggc tactcgactt aaacgaacag 1560
ctcgacgacg atacactcga cgaaagaacc gcatttgcta cctccaggag atcttcagca 1620
acgagatggc taaggtcgac gatagcttct tccatcgact tgaggagagc ttcctcgttg 1680
aggaggataa gaagcacgag cgacatccta tcttcggtaa catcgtcgac gaggttgctt 1740
accacgagaa gtaccctacc atctaccacc ttcgcaagaa gctcgtcgat tctaccgata 1800
aggccgatct tcgactcatc tacctcgctc ttgctcatat gatcaagttc cgcggtcact 1860
tcctcatcga gggcgatctt aacccagata actcagacgt cgacaagctc ttcatccagc 1920
tcgttcaaac ctacaaccag ctcttcgagg agaaccctat caacgcttca ggagttgacg 1980
ctaaggctat cctctcagct cgactctcta agtctcgacg acttgagaac ctcatcgctc 2040
aacttcctgg cgagaaaaag aacggtctct tcggtaacct tatcgctctc tctctcggtc 2100
ttactcctaa cttcaagagc aacttcgacc ttgccgagga cgctaagctc cagctctcta 2160
aggataccta cgacgacgat ctcgataacc tccttgctca gatcggagac caatacgccg 2220
atcttttcct tgccgctaag aacctttcag acgctatcct cctcagcgat atccttcgag 2280
tcaacactga gatcactaag gctcctctct cagcttctat gatcaagcgc tacgacgagc 2340
atcatcagga tctcactctc ctcaaggctc ttgttcgaca acagcttccc gagaagtaca 2400
aggagatctt cttcgaccag tctaagaacg gttacgccgg ttatattgac ggaggagcta 2460
gccaagagga gttctacaag ttcatcaagc ccatcctcga gaagatggac ggtacagagg 2520
agcttctcgt taagctcaac cgagaggatc tccttcgtaa gcagcgaact ttcgacaacg 2580
gtagcatccc tcatcagatc catcttggag agcttcacgc tatccttcga cgacaggagg 2640
acttctatcc tttcctcaag gacaaccgcg agaagatcga gaagatcctc actttccgca 2700
tcccttacta cgttggtcct cttgctcgag gtaactctcg atttgcttgg atgacccgaa 2760
agtcagagga gactatcacc ccttggaact tcgaggaggt tgttgacaag ggagcttcag 2820
ctcagtcttt catcgagcgc atgaccaact tcgacaagaa cctccctaac gagaaggtcc 2880
tccctaagca ttctctcctc tacgagtact tcaccgtcta caacgagctc accaaggtca 2940
agtacgtcac agagggtatg cgaaagccag ctttcctttc aggcgagcag aagaaggcta 3000
tcgttgatct cctcttcaag accaaccgaa aggttaccgt caagcagctc aaggaggact 3060
acttcaagaa gatcgagtgc ttcgacagcg ttgagatcag cggagttgag gatcgattca 3120
acgcttctct cggtacttac cacgatctcc tcaagatcat caaggacaag gacttcctgg 3180
acaacgagga gaacgaggat atccttgagg acatcgtcct cactctcact cttttcgagg 3240
atcgagagat gatcgaggag cgacttaaga cctacgctca tctcttcgac gacaaggtca 3300
tgaagcagct taagcgacga cgatatacag gttggggtcg actttctcgc aagctcatca 3360
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ttgctaaccg caacttcatg cagctcatcc acgacgatag cctcactttc aaggaggaca 3480
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agactactca gaagggtcag aagaactctc gagagcgaat gaagcgaatc gaggagggta 3720
tcaaggagct tggttctcag atcctcaagg agcatcctgt tgagaacact cagctccaga 3780
acgagaagct ctacctttac tacctccaga acggtcgaga catgtacgtt gatcaggagc 3840
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aggacgactc tatcgacaac aaggtcctca ctcgaagcga caagaaccga ggtaagagcg 3960
ataacgtccc ttcagaggag gtcgtcaaga agatgaagaa ctattggcgc cagctcctta 4020
acgctaagct catcacccag cgcaagttcg acaaccttac taaagccgag cgaggaggtc 4080
tttcagagct tgataaggcc ggtttcatca agcgacagct tgtcgagact cgacagatca 4140
ctaagcacgt tgctcagatc ctcgactctc gaatgaacac caagtacgac gagaacgaca 4200
agctcatccg agaggttaag gtcatcaccc tcaagtctaa gctcgttagc gacttccgca 4260
aggatttcca gttctacaag gtccgcgaga tcaacaacta ccatcacgct cacgacgctt 4320
accttaacgc tgttgttggt accgctctca tcaagaagta ccctaagctc gagagcgagt 4380
tcgtttacgg cgattacaag gtctacgacg ttcgaaagat gatcgccaag tcagagcagg 4440
agattggtaa ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa catcatgaac ttcttcaaga 4500
ccgagatcac ccttgctaac ggagagattc gaaagcgacc tcttatcgag actaacggag 4560
agacaggaga gatcgtttgg gataagggtc gagacttcgc tacagttcga aaggtcctct 4620
ctatgcctca ggtcaacatc gtcaagaaga ccgaggttca gacaggcggt ttctctaagg 4680
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ctaagaagta cggaggtttc gattctccta ccgttgctta ctctgtcctc gttgttgcta 4800
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aggaggtcaa gaaggacctc atcatcaagc tccccaagta ctctctcttc gagcttgaga 4980
acggtcgaaa gcgaatgctt gcttcagccg gagagcttca aaagggtaac gagctcgctc 5040
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acatcatcca cctcttcact cttactaacc tcggagctcc agctgctttc aagtacttcg 5340
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agtaacgcct ttcaggctcc ggcgaagaga agaatagctt agcagagcta ttttcatttt 5940
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tgcatgtttc ttccttgaac tctcaagcct acaggacaca cattcatcgt aggtataaac 6180
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ccaccccaac gcgtttatca acctcaactt tcaacaacca tcatgccacc aaaagcgcgt 6360
aaaacaaagc gagatttgat tgagcaagag ggcaggatcc aatgcgcgat tcaagacatt 6420
aaaaatggaa aatttcaaaa aattgcgccc gcagcgcgtg catacaaaat tcatcccaat 6480
acaagtgtaa tgctagtgga ggtcaacaca tcaatgccta ttttggttta gtcgtccagg 6540
cggtgagcac aaaatttgtg tcgtttgaca agatggttca tttaggcaac tggtcagatc 6600
agccccactt gtagcagtag cggcggcgct cgaagtgtga ctcttattag cagacaggaa 6660
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ggtaagtgga cgacccggtc ataccttctt aagttcgccc ttcctccctt tatttcagat 6780
tcaatctgac ttacctattc tacccaagca tccaaatgaa aaagcctgaa ctcaccgcga 6840
cgtctgtcga gaagtttctg atcgaaaagt tcgacagcgt ctccgacctg atgcagctct 6900
cggagggcga agaatctcgt gctttcagct tcgatgtagg agggcgtgga tatgtcctgc 6960
gggtaaatag ctgcgccgat ggtttctaca aagatcgtta tgtttatcgg cactttgcat 7020
cggccgcgct cccgattccg gaagtgcttg acattgggga gttcagcgag agcctgacct 7080
attgcatctc ccgccgtgca cagggtgtca cgttgcaaga cctgcctgaa accgaactgc 7140
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tatactttct agagaatagg aacttctata gtgagtcgaa taagggcgac acaaaattta 7980
ttctaaatgc ataataaata ctgataacat cttatagttt gtattatatt ttgtattatc 8040
gttgacatgt ataattttga tatcaaaaac tgattttccc tttattattt tcgagattta 8100
ttttcttaat tctctttaac aaactagaaa tattgtatat acaaaaaatc ataaataata 8160
gatgaatagt ttaattatag gtgttcatca atcgaaaaag caacgtatct tatttaaagt 8220
gcgttgcttt tttctcattt ataaggttaa ataattctca tatatcaagc aaagtgacag 8280
gcgcccttaa atattctgac aaatgctctt tccctaaact ccccccataa aaaaacccgc 8340
cgaagcgggt ttttacgtta tttgcggatt aacgattact cgttatcaga accgcccagg 8400
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tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 8520
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cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 8760
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ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 9120
ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 9180
ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 9240
ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 9300
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gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 10080
cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 10140
actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 10200
caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 10260
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caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 10440
tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 10500
gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 10560
cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 10620
ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 10647
<210> 14
<211> 10904
<212> DNA
<213> 人工序列(pUC-FfCas9-HTB-5srRNA-FCC1 SEQ ID NO.26)
<400> 14
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tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420
tgcatctaga tatcggatcc cgggcccgtc gactgcagag gcacatacga ccaaaggtag 480
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gttgggtcgg tgacgaccag cgaatccccg ctgttgtatg aaaggacgaa acaccggcca 600
tcgacacgtc caagcgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta 660
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catccggcat ctgtagggcg tccaaatatc gtgcctctcc tgctttgccc ggtgtatgaa 1200
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ggacaaggac ttcctggaca acgaggagaa cgaggatatc cttgaggaca tcgtcctcac 3480
tctcactctt ttcgaggatc gagagatgat cgaggagcga cttaagacct acgctcatct 3540
cttcgacgac aaggtcatga agcagcttaa gcgacgacga tatacaggtt ggggtcgact 3600
ttctcgcaag ctcatcaacg gtatccgaga taagcagagc ggtaagacta tcctcgactt 3660
cctcaagagc gacggttttg ctaaccgcaa cttcatgcag ctcatccacg acgatagcct 3720
cactttcaag gaggacatcc agaaggctca ggtttcaggt caaggcgatt ctcttcacga 3780
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gatggctcga gagaaccaga ctactcagaa gggtcagaag aactctcgag agcgaatgaa 3960
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gaacactcag ctccagaacg agaagctcta cctttactac ctccagaacg gtcgagacat 4080
gtacgttgat caggagctcg acatcaaccg acttagcgat tacgacgtcg atcacatcgt 4140
tcctcagtct ttcctcaagg acgactctat cgacaacaag gtcctcactc gaagcgacaa 4200
gaaccgaggt aagagcgata acgtcccttc agaggaggtc gtcaagaaga tgaagaacta 4260
ttggcgccag ctccttaacg ctaagctcat cacccagcgc aagttcgaca accttactaa 4320
agccgagcga ggaggtcttt cagagcttga taaggccggt ttcatcaagc gacagcttgt 4380
cgagactcga cagatcacta agcacgttgc tcagatcctc gactctcgaa tgaacaccaa 4440
gtacgacgag aacgacaagc tcatccgaga ggttaaggtc atcaccctca agtctaagct 4500
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cgccaagtca gagcaggaga ttggtaaggc taccgccaag tacttcttct acagcaacat 4740
catgaacttc ttcaagaccg agatcaccct tgctaacgga gagattcgaa agcgacctct 4800
tatcgagact aacggagaga caggagagat cgtttgggat aagggtcgag acttcgctac 4860
agttcgaaag gtcctctcta tgcctcaggt caacatcgtc aagaagaccg aggttcagac 4920
aggcggtttc tctaaggagt ctatcctccc taagcgcaac tcagataagc tcatcgctcg 4980
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tgtcctcgtt gttgctaagg tcgagaaggg taagagcaag aagctcaaga gcgtcaagga 5100
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cgagaagctc aagggttctc cagaggataa cgagcagaag cagctcttcg ttgagcagca 5400
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tgctttcaag tacttcgaca ccactatcga tcgcaagcga tacacctcta ccaaggaggt 5640
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ttctcaactt ggcggagatc ctatggctcc caaggctgct gacaagaagc ccgcctccaa 5760
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ctctggtgac aagaagaagc gctccaagac ccgcaaggag acttactctt cttacatcta 5880
caagtaacac ttaacgttac tgaaatcatc aaacagcttg acgaatctgg atataagatc 5940
gttggtgtcg atgtcagctc cggagttgag acaaatggtg ttcaggatct cgataagata 6000
cgttcatttg tccaagcagc aaagagtgcc ttctagtgat ttaatagctc catgtcaaca 6060
agaataaaac gcgttttcgg gtttacctct tccagataca gctcatctgc aatgcattaa 6120
tgcattgact gcaacctagt aacgcctttc aggctccggc gaagagaaga atagcttagc 6180
agagctattt tcattttcgg gagacgagat caagcagatc aacggtcgtc aagagaccta 6240
cgagactgag gaatccgctc ttggctccac gcgactatat atttgtctct aattgtactt 6300
tgacatgctc ctcttcttta ctctgatagc ttgactatga aaattccgtc accagcccct 6360
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gaaggtagtt ttctcgtcca ccccaacgcg tttatcaacc tcaactttca acaaccatca 6600
tgccaccaaa agcgcgtaaa acaaagcgag atttgattga gcaagagggc aggatccaat 6660
gcgcgattca agacattaaa aatggaaaat ttcaaaaaat tgcgcccgca gcgcgtgcat 6720
acaaaattca tcccaataca agtgtaatgc tagtggaggt caacacatca atgcctattt 6780
tggtttagtc gtccaggcgg tgagcacaaa atttgtgtcg tttgacaaga tggttcattt 6840
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<211> 10607
<212> DNA
<213> 人工序列(pCpf1Ff-DR SEQ ID NO.27)
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ctccacccac acaaagaacg gctctcccca gaagggctat gagaagtttg agttcaatat 3660
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ttttggttta gtcgtccagg cggtgagcac aaaatttgtg tcgtttgaca agatggttca 6540
tttaggcaac tggtcagatc agccccactt gtagcagtag cggcggcgct cgaagtgtga 6600
ctcttattag cagacaggaa cgaggacatt attatcatct gctgcttggt gcacgataac 6660
ttggtgcgtt tgtcaagcaa ggtaagtgga cgacccggtc ataccttctt aagttcgccc 6720
ttcctccctt tatttcagat tcaatctgac ttacctattc tacccaagca tccaaatgaa 6780
aaagcctgaa ctcaccgcga cgtctgtcga gaagtttctg atcgaaaagt tcgacagcgt 6840
ctccgacctg atgcagctct cggagggcga agaatctcgt gctttcagct tcgatgtagg 6900
agggcgtgga tatgtcctgc gggtaaatag ctgcgccgat ggtttctaca aagatcgtta 6960
tgtttatcgg cactttgcat cggccgcgct cccgattccg gaagtgcttg acattgggga 7020
gttcagcgag agcctgacct attgcatctc ccgccgtgca cagggtgtca cgttgcaaga 7080
cctgcctgaa accgaactgc ccgctgttct ccagccggtc gcggaggcca tggatgcgat 7140
tgctgcggcc gatcttagcc agacgagcgg gttcggccca ttcggaccgc aaggaatcgg 7200
tcaatacact acatggcgtg atttcatatg cgcgattgct gatccccatg tgtatcactg 7260
gcaaactgtg atggacgaca ccgtcagtgc gtccgtcgcg caggctctcg atgagctgat 7320
gctttgggcc gaggactgcc ccgaagtccg gcacctcgtg catgcggatt tcggctccaa 7380
caatgtcctg acggacaatg gccgcataac agcggtcatt gactggagcg aggcgatgtt 7440
cggggattcc caatacgagg tcgccaacat cctcttctgg aggccgtggt tggcttgtat 7500
ggagcagcag acgcgctact tcgagcggag gcatccggag cttgcaggat cgccgcgcct 7560
ccgggcgtat atgctccgca ttggtcttga ccaactctat cagagcttgg ttgacggcaa 7620
tttcgatgat gcagcttggg cgcagggtcg atgcgacgca atcgtccgat ccggagccgg 7680
gactgtcggg cgtacacaaa tcgcccgcag aagcgcggcc gtctggaccg atggctgtgt 7740
agaagtactc gccgatagtg gaaaccgacg ccccagcact cgtccgaggg caaaggaata 7800
gagtagatgc cgaccgatcc ccactaccgc attaagacct cagcgcggcc gcaaatttaa 7860
ataaaatgaa gtgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttctata gtgagtcgaa 7920
taagggcgac acaaaattta ttctaaatgc ataataaata ctgataacat cttatagttt 7980
gtattatatt ttgtattatc gttgacatgt ataattttga tatcaaaaac tgattttccc 8040
tttattattt tcgagattta ttttcttaat tctctttaac aaactagaaa tattgtatat 8100
acaaaaaatc ataaataata gatgaatagt ttaattatag gtgttcatca atcgaaaaag 8160
caacgtatct tatttaaagt gcgttgcttt tttctcattt ataaggttaa ataattctca 8220
tatatcaagc aaagtgacag gcgcccttaa atattctgac aaatgctctt tccctaaact 8280
ccccccataa aaaaacccgc cgaagcgggt ttttacgtta tttgcggatt aacgattact 8340
cgttatcaga accgcccagg gggcccgaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 8400
tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg 8460
taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 8520
cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 8580
gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 8640
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 8700
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 8760
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 8820
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 8880
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 8940
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 9000
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 9060
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 9120
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 9180
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg 9240
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 9300
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 9360
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 9420
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 9480
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 9540
tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 9600
atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 9660
tggccccagt gctgcaatga taccgcgact cccacgctca ccggctccag atttatcagc 9720
aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 9780
catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 9840
gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 9900
ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 9960
aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 10020
atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 10080
cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 10140
gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 10200
agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 10260
gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 10320
caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 10380
ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 10440
tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 10500
aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat 10560
catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 10607

Claims (4)

1.一种CRISPR/Cpf1基因编辑***在敲除赤霉菌细胞大片段比卡菌素基因簇提高赤霉素产量中的应用，所述CRISPR/Cpf1基因编辑***为骨架质粒pCpf1Ff-DR，其序列如序列表中15所示，包括Fncpf1基因、功能性crRNA基因、启动子pGPD、启动子pTRPC、强RNA聚合酶III型启动子5srRNA、潮霉素筛选标记hph；所述启动子pGPD转录Fncpf1基因，强RNA聚合酶III型启动子5srRNA转录crRNA，所述启动子pTRPC表达潮霉素筛选标记hph；
所述应用的具体步骤为：
（1）pCpf1Ff-DR质粒经过SpeI酶切后，***靶向BIK3基因的N23序列，其序列如序列表中8所示，构建质粒pCpf1Ff-DR-BIK3；
（2）pCpf1Ff-DR-BIK3质粒经过pmeI酶切后，***比卡菌素基因簇的上游同源臂序列，其序列如序列表中9所示，构建质粒pCpf1Ff-DR-BIKi-UP；
（3）pCpf1Ff-DR-BIK3-UP质粒经过swaI酶切后，***比卡菌素基因簇的下游同源臂序列，其序列如序列表中10所示，构建质粒pCpf1Ff-DR-BIKi-HR；
（4）将pCpf1Ff-DR-BIKi-HR质粒转化入赤霉菌原生质体中用于大片段比卡菌素基因簇的敲除。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述启动子pGPD转录Fncpf1基因，pGPD的序列如SEQ ID NO.1所示，FnCpf1的序列如SEQ ID NO.2所示；所述强RNA聚合酶III型启动子5srRNA转录crRNA，5srRNA序列如SEQ ID NO.3所示，crRNA的序列如SEQ ID NO.4所示；所述启动子pTRPC转录潮霉素筛选标记hph，启动子pTRPC的序列如SEQ ID NO.5所示，潮霉素筛选标记hph的标记如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cpf1基因编辑***的构建方法，包括如下步骤：
（1）以质粒pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph为模板设计引物，扩增得到不含fFuCas9基因的骨架线性片段，将此片段骨架与Fncpf1基因经过一步克隆之后得到的重组质粒为pCpf1Ff；
（2）以重组质粒pCpf1Ff为骨架酶切得到线性化的质粒pCpf1Ff片段；
（3）以质粒pUC-FfCas9-HTB-5srRNA-FCC1为模板，设计引物，扩增得到DR基因表达盒，所述引物为5srRNA-F和5srRNA-DR-R，其序列分别为GCCAGTGAATTCCACATACG和AATTAAAAAAAACTAGTCTA；
（4）将线性化的质粒pCpf1Ff和构建的DR基因表达盒克隆得到重组质粒pCpf1Ff-DR。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中引物为HTBnls-R和HTBnls-F，其序列分别为TCCATGGTGATGTCTGCTCA和GAGATCCTATGGCTCCCAAG。
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Assignee: JIANGXI NEW REYPHON BIOCHEMICAL CO.,LTD.

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Contract record no.: X2023980038076

Denomination of invention: A CRISPR/Cpf1 Gene Editing System and Its Construction Method and Application in Gibberella

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License type: Common License

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