CN112386534A - 紫花地丁提取物、其提取方法、以及其用途 - Google Patents

紫花地丁提取物、其提取方法、以及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种紫花地丁提取物用于制备促进纤维母细胞生长的组合物的用途、用于制备提升粒线体活性的组合物的用途、以及用于制备提升肌肤光泽的组合物的用途。

Description

紫花地丁提取物、其提取方法、以及其用途
技术领域
本发明提供一种紫花地丁提取物的用途，特别是关于紫花地丁提取物用于制备改善肌肤状态的组合物的用途。
背景技术
皮肤是保护人类个体的最大屏障，其具有对抗水分散失、病原菌以及各种外界环境损害的功能。当皮肤暴露于大量的紫外线(ultraviolet，UV)、游离辐射(ionizingradiation)、药物或异生物质(xenobiotics)会促使皮肤内生成活性氧物质(reactiveoxygen species，ROS)。当所累积的活性氧物质的浓度超过细胞或组织本身的抗氧化能力时，便会形成氧化性压力(oxidative stress)，活性氧物质将会与细胞内的组成物(包括DNA、蛋白质以及脂质等)进行反应。当皮肤细胞受到破坏，将对皮肤产生非所欲的影响，甚至加速老化。
皮肤由外向内依序为表皮层、主要由***构成的真皮层、及皮下组织。表皮层是皮肤的最外层，而表皮层与真皮层间存在持续***的细胞，如纤维母细胞。此类细胞因不断***，对于细胞伤害因素则更为敏感而较易受到影响。若纤维母细胞受到例如紫外线等其他外界环境伤害的影响，降低其增生速度或甚至是使细胞总量减少，则将会导致皮肤表层受损、变薄而无法有效保护内层肌肤，进而加速肌肤整体老化速度。
另一方面，粒线体(mitochondria)亦被称为细胞的发电站，因为它是细胞内合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)(一种传递能量的分子)的主要场所，为细胞的各项活动提供了化学能量。粒线体若损坏，对细胞以及生物个体的影响甚巨。粒线体在合成ATP的过程中会产生很多的自由基，自由基的活性极强，会与体内任何物质发生强烈的氧化反应而破坏其正常功能。自由基日积月累地伤害粒线体内的酵素与DNA，渐渐地使粒线体功能下降进而使各器官组织的功能衰退。因此，如何提升细胞的粒线体活性，进而达到抗老化之效用，亦为重要的议题。
发明内容
有鉴于此，研究或开发一种可促进纤维母细胞生长、提升粒线体活性的组合物以减缓皮肤老化，是有其需求的。
据此，本发明的一目的在于提供一种紫花地丁提取物，由一包含下列步骤的制备方法所制得：将紫花地丁浸泡于萃取溶剂以进行萃取，得到含紫花地丁提取物的紫花地丁汁液；其中萃取溶剂为水，且萃取溶剂与紫花地丁的重量比为25-35：1。
在一些实施例中，将紫花地丁浸泡于萃取溶剂以进行萃取的步骤包括：将紫花地丁浸泡于45℃-50℃的萃取溶剂50-120分钟以进行第一阶段萃取；以及将萃取溶剂升温至75℃-85℃后浸泡20-60分钟以进行第二阶段萃取，得到紫花地丁汁液。
在一些实施例中，将紫花地丁浸泡于萃取溶剂以进行萃取的步骤包括：将紫花地丁浸泡于45℃-50℃的萃取溶剂50-120分钟以进行第一阶段萃取，其中萃取溶剂中添加有萃取溶剂0.05wt％至0.15wt％的果胶酶；以及将萃取溶剂升温至75℃-85℃后浸泡20-60分钟以进行第二阶段萃取，得到紫花地丁汁液。
在一些实施例中，制备方法更包含：在将紫花地丁浸泡于萃取溶剂以进行萃取的步骤后，将浸泡有紫花地丁的萃取溶剂经过滤后得到上清液；以及将上清液浓缩得到紫花地丁汁液。
在一些实施例中，紫花地丁汁液具有下述条件中的至少一者：白利糖度值(Degrees Brix)为8-11°Bx、总黄酮含量为2500-3100ppm、及总多酚含量为2500-3100ppm。
在另一些实施例中，本发明提供一种将紫花地丁提取物用于制备促进纤维母细胞生长的组合物的用途。
在一些实施例中，组合物含有0.060-0.065vol％的紫花地丁汁液，且紫花地丁汁液的糖度为8-11°Bx。
在另一些实施例中，本发明提供一种将紫花地丁提取物用于制备提升细胞的粒线体活性的组合物的用途。
在一些实施例中，细胞的粒线体活性为皮肤纤维母细胞的粒线体活性。
在一些实施例中，组合物含有0.060-0.065vol％的紫花地丁汁液，且紫花地丁汁液的糖度为8-11°Bx。
在另一些实施例中，本发明提供一种将紫花地丁提取物用于制备提升肌肤光泽的组合物的用途。
在一些实施例中，组合物为外用组合物。
在一些实施例中，组合物中含有1wt-5wt％的紫花地丁提取物。
在另一些实施例中，本发明提供一种紫花地丁提取物的制备方法，包括：将紫花地丁浸泡于萃取溶剂以进行萃取，得到含紫花地丁提取物的紫花地丁汁液；其中萃取溶剂为水，且萃取溶剂与紫花地丁的重量比为25-35：1。
在另一些实施例中，本发明提供一种紫花地丁汁液，其具有下述条件中的至少一者：白利糖度值(Degrees Brix)为8-11°Bx、总黄酮含量为2500-3100ppm、及总多酚含量为2500-3100ppm。
综合上述，本发明提供一种紫花地丁提取物、得到该紫花地丁提取物的制备方法、以及该紫花地丁提取物用于促进纤维母细胞生长、提升细胞的粒线体活性、与提升肌肤光泽的用途。在一些实施例中，通过使用二段式萃取方式，可提升萃取效率以及保有一定含量的活性成分。在一些实施例中，借由于萃取溶剂中添加果胶酶，可加速紫花地丁中所含的成分进行分解，缩短萃取所需时间或提升提取物中的活性成分含量。在一些实施例中，借由浓缩可使紫花地丁提取物达到特定浓度的糖度、多酚含量、或黄酮含量。而在一些实施例中，由于紫花地丁提取物可用于促进纤维母细胞生长、提升细胞的粒线体活性、或提升肌肤光泽，故紫花地丁提取物可用于改善肌肤整体状态。
附图说明
图1为空白控制组、正对照组及含有紫花地丁提取物的实验组对皮肤纤维母细胞增生率的影响结果比较图。***p值<0.001，相较于空白控制组。
图2为空白控制组以及含有紫花地丁提取物的实验组在提升皮肤纤维母细胞的粒线体活性上的结果比较图。**p值<0.01，相较于空白控制组。
图3为将安慰剂组及实验组的面膜使用于受试者脸部肌肤后，其各组的肌肤光泽状态的变化比较图。**p值<0.01，相较于使用安慰剂面膜后的结果。
具体实施方式
以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下，本案尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。
本案使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，各组之间的差异以学生t检验(student's t-test)进行分析。
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。
紫花地丁(学名：Viola mandshurica)是一种堇菜科堇菜属的多年生草本植物。
在一些实施例中，紫花地丁提取物可促进纤维母细胞生长、提升细胞粒线体活性、及/或提升肌肤光泽。故紫花地丁提取物可用于制备促进皮肤纤维母细胞增生的组合物的用途、制备提升细胞粒线体活性的组合物的用途、或是制备提升肌肤光泽的组合物的用途。
在一些实施例中，前述的各组合物可为医药组合物、保养品组合物、食品组合物、保健食品组合物。
医药组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于经肠道地(enterally)、非经肠道地(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型。例如可为：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)或其他类似物。
医药组合物可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，医药上可接受的载剂可包含下列一种或多种载剂：乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些载剂的选用与数量是本领域技术人员可视情况进行选择的。
在一些实施例中，医药上可接受的载剂可包含下列一种溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)、含有醇的水性溶液(alcohol containing aqueous solution)以及其他任何合适的溶剂。
在一些实施例中，该医药组合物可由下列所述的任一种非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。
在一些实施例中，医药组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于局部施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)。举例而言，其可为下列所述的任一种，但不限于此：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。
在一些实施例中，外部制剂是借由将医药组合物与一为本领域技术人员所详知的基底(base)相混合而制成。
在一些实施例中，该基底可包含下列一种或多种的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸如卡波普
Figure BDA0002634282000000062
974P(
Figure BDA0002634282000000061
974P)、微结晶纤维素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、螯合剂(chelating agents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。
在一些实施例中，保养品中可包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含下列一种或多种佐剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。可根据实际需求对这些试剂的选用与数量进行合适的调整。
在一些实施例中，保养品可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，其可为下列中的任一种，但不限于此：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oilysolution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansing products)等。
在一些实施例中，保养品亦可与下列中的已知活性的外用剂(external useagents)的一种或多种一起合并使用：美白剂(whitening agents)[诸如维生素A酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素C]、保湿剂、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultraviolet absorbers)、植物提取物(plant extracts)[诸如芦荟提取物(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂(antipsoriatic agents)、抗老化剂(antiaging agents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。
在一些实施例中，医药组合物可被当作食品添加物(food additive)，通过现有技术方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。
在一些实施例中，食品的种类可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。
本案中所述的「紫花地丁」，在一些实施例中指含有根、茎、以及叶的全株的植物体。在另一些实施例中，亦可以是除含有根、茎、以及叶外，亦包含其花、及/或果实的植物体。在一些实施例中，紫花地丁可以是将全株植物体经切碎及/或磨制而成的紫花地丁粉末，以方便进行运输或萃取程序。
在一些实施例中，紫花地丁提取物以水为萃取溶剂，并以萃取溶剂与紫花地丁的重量比为25-35：1的方式来萃取紫花地丁而得。在一些实施例中，紫花地丁提取物可借由将紫花地丁全株浸泡于水中，在室温(25±5℃)下萃取3-4小时而得。
在一些实施例中，紫花地丁提取物是以经过不同温度的二段式萃取方式而得。举例而言，可将萃取溶剂(例如水)与紫花地丁粉末以重量比25-35：1的方式混合后，先于45℃-50℃下浸泡约50-120分钟(例如50-80分钟)进行第一阶段萃取，然后将溶液温度升温至75℃-85℃再浸泡约20-60分钟(例如20-40分钟)以进行第二阶段萃取，得到含有紫花地丁提取物的紫花地丁汁液。借由此二段式萃取方式，可提升活性物质的萃取效率以及加速整体萃取过程，亦不致破坏过多的活性成分。
在一些实施例中，可于萃取溶剂中添加果胶酶，可加速紫花地丁进行分解，缩短萃取所需时间或提升提取汁液中的活性成分含量。在一些实施例中，可于萃取溶剂中添加萃取溶剂的0.05wt％至0.15wt％的果胶酶。在一些实施例中，若采二段式萃取方式进行萃取，则果胶酶可于较低温的第一阶段中加入，使果胶酶可具有较高的活性，以促进第一阶段的萃取效率；而后在较高温的第二阶段萃取可使果胶酶失去活性，避免果胶酶持续进行非所欲的分解反应。
在一些实施例中，萃取步骤可进一步包含其他调整浓度的步骤，以得到含有所欲浓度的指标物的紫花地丁汁液。例如，萃取步骤可进一步包含有过滤浓缩的步骤。举例而言，可将萃取完后的紫花地丁汁液经适当孔径大小的滤网(例如200-400目数的滤网)过滤，以去除大部分的固体杂质后，再将所得到的上清液于45℃-70℃下进行减压浓缩，使最终得到的紫花地丁汁液符合下述条件中的至少其中一者：白利糖度值(Degrees Brix)为8-11°Bx、总黄酮含量为2500-3100ppm、及总多酚含量为2500-3100ppm。在一些实施例中，浓缩后的紫花地丁汁液的白利糖度值(Degrees Brix)为8-11°Bx、总黄酮含量为2500-3100ppm、且总多酚含量为2500-3100ppm。
在一些实施例中，「紫花地丁提取物」指紫花地丁汁液中所含有的成分，其可为液态或是由紫花地丁汁液经其他合适的处理步骤所获得的其他型态的提取物。举例而言，由紫花地丁汁液经干燥而得的粉末中亦含有「紫花地丁提取物」。
在一些实施例中，紫花地丁提取物可促进纤维母细胞生长、提升细胞粒线体活性、及/或提升肌肤光泽。在一些实施例中，以浓度0.060-0.065vol％、含有紫花地丁提取物的紫花地丁溶液处理细胞24小时，可使细胞增生率提高约1.25至1.35倍。在一些实施例中，以浓度0.060-0.065vol％、含有紫花地丁提取物的紫花地丁溶液处理细胞24小时，可提升细胞粒线体活性25至35％。在一些实施例中，紫花地丁提取物可提升肌肤5-7％的光泽度。
下列范例中的实验步骤若无特别叙明，即在室温(25±5℃)、常压(1atm)下进行。
[例1]紫花地丁汁液的制备
于水(萃取溶剂)中添加其总重0.1wt％的果胶酶(购自Novozymes，型号Novozymes
Figure BDA0002634282000000091
L)，再于该含有果胶酶的水中加入由紫花地丁全株(产地：中国)所研磨成的粉末(其中水：紫花地丁粉末的重量比为30：1)，使其混合后再将此液升温至并维持在55±5℃，并持续浸泡约60分钟，以进行第一阶段萃取。而后，再将此液的温度升温至并维持在85±5℃约30分钟，进行第二阶段萃取。
停止加热后，将萃取溶剂以400目数的筛网进行过滤以去除固态物，得到上清液。再将此上清液以浓缩机(购自BUCHI，型号Rotavapor R-100)在60±5℃下进行减压浓缩，至溶液的白利糖度值(Degrees Brix)为10±0.5°Bx时停止浓缩，得到含紫花地丁提取物的紫花地丁汁液。
[例2]总黄酮含量测试
将例1中所得到的紫花地丁汁液以水，依其体积做10倍稀释后，取200μL到试管中。于此试管内加入200μL 5wt％亚硝酸钠(购自Sigma，商品编号31443)水溶液，混合均匀后静置反应6分钟。接着加入200μL 10wt％硝酸铝(购自Alfa Aesar，商品编号12360)水溶液，混合均匀后静置反应6分钟，再加入2mL 4wt％氢氧化钠水溶液(氢氧化钠购自Macron，产品编号7708-10)，使其混合均匀。最后再加入1.4mL的水于试管中并混合均匀得到反应液，取试管中200μL反应液至96孔反应盘中，以分光亮度计(Jasco，型号V-730)于500nm的波长下检测吸光值。
接着配制标准品以制作检量线。本案以芸香素(rutin，购自ChromaDex，商品编号ASB-00018440)当量作为总黄酮相对含量的表示。先配制200μg/mL的芸香素甲醇溶液，作为芸香素标准液。取该芸香素标准液0μL、200μL、400μL、600μL、800μL及1000μL分别加入至不同试管中，再于该些试管中加入水，使其各试管内的总体积为1200μL。接着，针对每一试管，从试管中分别取200μL的芸香素标准溶液至另一新试管，再于此试管内加入200μL 5wt％亚硝酸钠水溶液，混合均匀后静置反应6分钟。接着加入200μL 10wt％硝酸铝水溶液，混合均匀后静置反应6分钟，再加入2mL 4wt％氢氧化钠水溶液，使其混合均匀。最后再加入1.4mL的水于此试管中并混合均匀得到反应液，取试管中200μL反应液至96孔反应盘中，以分光亮度计于500nm的波长下检测吸光值。将六种不同浓度的芸香素溶液依相同方式所测得的吸光值，绘制成检量线。
接着，利用检量线将稀释后的紫花地丁汁液的吸光值换算成总黄酮含量。于此，可推算出稀释前的紫花地丁汁液(即例1中所得到的紫花地丁汁液)的总黄酮含量为3000ppm。
已知黄酮并非为本案所述促进纤维母细胞生长、提升细胞的粒线体活性、或提升肌肤光泽用途的活性成分，但由于已知黄酮可具有其他例如预防心血管疾病等的用途，而从前方实验可知，相较于其他提取方式，由本案提取方式所得的紫花地丁汁液可具有较高的总黄酮含量，故本案的紫花地丁汁液可具有多种复合用途。此外，在一些实施例中，此总黄酮含量亦可作为浓缩终点的判断基准。
[例3]总多酚含量测试
将例1中所得到的紫花地丁汁液以水，依其体积做10倍稀释后，取100μL到试管中。而后，于此试管内添加500μL的佛萧酚试剂(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent，购自Merck，货号1.09001.0100)，混合均匀并静置3分钟，接着添加400μL的7.5wt％碳酸钠(购自Sigma，商品编号31432)水溶液于试管中，使其混合均匀并反应30分钟。再经由振荡(vortex)确保溶液中无气泡后，取其中的200μL溶液于750nm的波长下测量吸光值。
接着，配制标准品以制作检量线。本案以没食子酸(Gallic acid)当量作为总多酚相对含量的表示。于此，配置0μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL、及100μL/mL的没食子酸(没食子酸购自Sigma，产品编号G7384)的标准溶液，并分别取100μL的各浓度的标准溶液至不同试管中。针对各试管，于其中添加500μL的佛萧酚试剂，混合均匀并静置3分钟，接着添加400μL的7.5wt％碳酸钠水溶液于试管中，使其混合均匀并反应30分钟。再经由振荡(vortex)确保溶液中无气泡后，取其中的200μL溶液于750nm的波长下测量吸光值。将六种不同浓度的没食子酸标准溶液依相同方式所测得的吸光值，绘制成检量线。
接着，利用检量线将稀释后的紫花地丁汁液的吸光值换算成总多酚含量。于此，可推算出稀释前的紫花地丁汁液(即例1中所得到的紫花地丁汁液)的总多酚含量为3000ppm。
已知多酚并非为本案所述促进纤维母细胞生长、提升细胞的粒线体活性、或提升肌肤光泽用途的活性成分，但由于已知多酚可具有其他例如预防心血管疾病等的用途，而从前方实验可知，相较于其他提取方式，由本案提取方式所得的紫花地丁汁液可具有较高的总多酚含量，故本案的紫花地丁汁液可具有多种复合用途。此外，在一些实施例中，此总多酚含量亦可作为浓缩终点的判断基准。
[例4]细胞实验-紫花地丁汁液促进皮肤纤维母细胞增生的效用评估
借由Click-iTTM EdU试验(利用EdU试剂处理细胞、固定并透化细胞、使用与EdU结合的荧光染剂)来检测细胞数目，由此检验紫花地丁汁液对于纤维母细胞是否具有促进增生作用。
材料与仪器
1.细胞株：人类纤维母细胞(Human skin fibroblast)CCD-966SK，购自美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。
2.培养基：于Eagle’s最低限度基本培养基(minimum essential medium，MEM，购自Gibco，商品编号61100-061)中添加额外成分使其含有10vol％胎牛血清(fetal bovineSerum，FBS，购自Gibco，商品编号10437-028)、90vol％1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate，购自Gibco，商品编号11360-070)、1.5g/L碳酸氢钠(购自Sigma，商品编号S5761)、0.1mM非必需氨基酸(non-essential amino acid solution，购自Gibco，购自11140-050)。
3.20vol％FBS溶液：于Eagle’s最低限度基本培养基中添加额外成分使其含有20vol％FBS、90vol％1mM丙酮酸钠、1.5g/L碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸。
4.细胞增殖检测试剂盒(Cell proliferation assay kits，Click-iTTM Plus EdUAlexa FluorTM 488Flow Cytometry Assay Kit)，购自Invitrogen，型号C10632，50tests)
试剂盒中所含的药品：
(a)5-乙炔-2’-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU)10mg(成分A)
(b)Alexa FluorTM 488picolyl azide的DMSO溶液130μL(成分B)
(c)Dimethylsulfoxide(DMSO)4.5mL(成分C)
(d)Click-iTTM固定剂(fixative)(4％paraformaldehyde in PBS)5mL(成分D)
(e)Click-iTTM渗透及清洗试剂(fixative saponin-based permeabilizationand wash reagent)，10X 50mL(成分E)
(f)浓度为100mM的铜保护剂(Copper protectant)水溶液0.5mL(成分F)
(g)Click-iTTM EdU缓冲添加剂(EdU buffer additive)400mg(成分G)
5.含有1vol％BSA(Bovine serum albumin，牛血清白蛋白，购自Sigma；商品编号A9647)的PBS溶液，后方将略称为1％BSA/PBS溶液。
6.10mM的EdU溶液：将试剂盒中的成分C取4mL，加入至成分A中，并保存于-20℃。
7.1X Click-iTTM渗透及清洗试剂：将试剂盒中的成分E以1％BSA/PBS溶液稀释10倍，并保存于4℃。
8.10X Click-iTTM EdU缓冲添加剂溶液：将2mL的二次蒸馏水加入至试剂盒中的成分G，并保存于-20℃。
9.Dulbecco's磷酸缓冲盐溶液(Dulbecco's phosphate-buffered saline，DPBS溶液)：购自Gibco，产品编号14200-075。
10.流式细胞仪(Flow cytometry)，Beckman，Catalog No.660519。
11.紫花地丁样品溶液：将[例1]中得到的紫花地丁汁液，使用培养基作为溶剂，以体积比1：1600的方式稀释而得(紫花地丁样品溶液浓度：0.0625vol％)。
实验步骤
将CCD-966SK细胞以每孔1×105个的方式，接种于每孔含2ml培养基的培养盘中，并于5％CO2、37℃环境下，培养24小时。而后将细胞分为3组，分别为空白控制组、正控制组、以及实验组。针对实验组的细胞，于每孔添加紫花地丁样品溶液2000μL；针对正控制组的细胞，于每孔添加20vol％FBS溶液2000μL；针对空白控制组，则仅添加培养基2000μL于每孔中。将各组细胞于5％CO2、37℃环境下，培养24小时。
接着，将前述10mM的EdU溶液以培养基稀释为10μM后，于每孔中加入2mL 10μM的EdU溶液并培养2小时，然后收取细胞。以1％BSA/PBS溶液清洗收取的细胞一次，并移除上清液。再将试剂盒中的Click-iTTM固定剂(成分D)100μL添加至每孔中与细胞混合，在暗处中于室温培养15分钟。而后，以1％BSA/PBS溶液清洗细胞一次，并移除上清液。再将试剂盒中的1X Click-iTTM渗透及清洗试剂(成分E)100μL添加至每孔中，并于暗处、室温下静置15分钟。接着，收集各孔中的悬浮细胞与培养基至对应的15ml离心试管内，将各离心试管以400xg离心5分钟使细胞沉淀，并移除上清液。然后于各试管进行Click-iTTM反应。
Click-iTTM反应流程如下：首先，制备1X Click-iTTM EdU缓冲添加剂溶液(将10XClick-iTTM EdU缓冲添加剂溶液，以二次蒸馏水稀释为1X Click-iTTM EdU缓冲添加剂溶液)。接着制备Click-iTTM Plus reaction混合试剂(每一试管使用500μL的Click-iTTMPlus reaction混合试剂，该500μL的混合试剂以10μL的铜保护剂(成分F)、2.5μL picolylazide的DMSO溶液(成分B)、50μL 1X Click-iTTM EdU缓冲添加剂溶液、以及438μL的DPBS溶液配制而成)，其需于配制后15分钟内进行使用。
接着，于每一试管中添加500μL配制的Click-iTTM Plus reaction混合试剂，并使其于暗处室温下，静置30分钟。而后，以1X Click-iTTM渗透及清洗试剂清洗细胞一次，并移除上清液。再以500μL 1X Click-iTTM渗透及清洗试剂，重新悬浮细胞，并将各试管的细胞以流式细胞仪对细胞进行分析。
由于染料(成分B)将会与细胞中的核酸异性结合并产生绿色荧光，而荧光的强度将与细胞的数量成正比，故可透过测量荧光来量化细胞数目(激发波长：488nm；发射波长：530/30(515-545nm))。
将空白控制组的细胞增生率作为基准值(即设为1.0)，并将空白控制组的细胞增生率、正控制组的相对细胞增生率、以及实验组的相对细胞增生率，绘示于图1。由图1中可知，经过紫花地丁提取物处理过的纤维母细胞，其细胞增生量可显著提升，且紫花地丁提取物具有如同FBS的促进细胞增生的功效。
[例5]细胞实验-紫花地丁汁液提升细胞的粒线体活性的效用评估
此处以人类皮肤纤维母细胞进行皮肤细胞粒线体活性分析，再利用流式细胞仪粒线体膜电位检测试剂盒(Flow cytometry Mitochrondrial membrane potentialdetection kit，购自BD bioscience，型号551302)进行实验。
材料与仪器
1.细胞株：人类纤维母细胞(Human skin fibroblast)CCD-966SK，购自中国台湾生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC，产品编号：60153)。
2.培养基：于Eagle’s最低限度基本培养基(minimum essential medium，MEM，购自Gibco，商品编号61100-061)中添加额外成分使其含有10vol％FBS、90vol％1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate，购自Gibco，商品编号11360-070)、1.5g/L碳酸氢钠(购自Sigma)、0.1mM非必需氨基酸(non-essential amino acid solution，购自Gibco，11140-050)。
3.Dulbecco's磷酸缓冲盐溶液(DPBS溶液)：购自Gibco，产品编号14200-075。
4.流式细胞仪粒线体膜电位检测试剂盒(Flow cytometry Mitochrondrialmembrane potential detection kit，购自BD bioscience，型号551302)。
5.流式细胞仪(Flow cytometry)，购自BD，型号AccuriTM C6 Plus，660517。
6.紫花地丁样品溶液：将[例1]中得到的紫花地丁汁液，使用培养基作为溶剂，以体积比1：1600的方式稀释而得(紫花地丁样品溶液浓度：0.0625vol％)。
实验步骤
将CCD-966SK细胞以每孔1×105个的方式，接种于每孔含2ml培养基的培养盘中，并于5％CO2、37℃环境下，培养24小时，再将每孔的培养基更换为新鲜培养基。而后，将细胞分为空白控制组以及实验组2组。针对实验组的细胞，于每孔添加紫花地丁样品溶液2000μL；针对空白控制组，则仅添加培养基2000μL于每孔中。将各组细胞于37℃环境下，培养24小时。
于37℃下预热10X分析缓冲液(由试剂盒提供)，以无菌的DPBS溶液将其稀释，以制备1X分析缓冲液，并将之保存于37℃下。另将130μL的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO，购自Sigma，商品编号D2650-100ML)添加至冻干的JC-1粒线体染剂(由试剂盒提供)以制备JC-1储备溶液(若保存于-20℃可维持6个月)。接着，将JC-1储备溶液与1X分析缓冲液以1：200的体积比例配制工作溶液。
将前述培养后的空白控制组以及实验组细胞移除其培养基，再以DPBS溶液润洗两次。之后，加入200μl胰蛋白酶(Trypsin-EDTA，购自Gibco；产品编号15400-054)处理3分钟后，吸取悬浮的细胞至1.5mL的微离心管，以400xg转速离心5分钟。移除上清液，再以1mlDPBS溶液于1.5mL的微离心管中再次悬浮细胞。再以400xg离心5分钟。移除上清液，并于微离心管中加入100μL先前所配制的工作溶液。将其振荡(vortex)混合后，于暗室静置30分钟。之后，以400xg转速离心5分钟，去除上清液，再以1mL的1X清洗缓冲液(1X DPBS，购自Gibco，商品编号14200-075)润洗并以400xg转速离心5分钟。而后，去除上清液，再以1mL的1X清洗缓冲液润洗并以400xg转速离心5分钟。去除上清液后，以含有2vol％FBS的500μLDPBS溶液再次悬浮细胞，然后利用流式细胞仪，于激发波长450-490nm、发射波长510-550nm的条件下，进行粒线体染色信号值的分析，以观察细胞凋亡时粒线体膜电位的改变。
粒线体在呼吸氧化过程中，将所产生的能量以电化学位能储存于粒线体内膜，称之为粒线体膜电位，并以此位能来进行电子传递链，最终产生ATP以供细胞使用。而此一电位差形成于粒线体内膜，为外正内负的形式。而JC-1为带正电的染剂分子，当其进入细胞中，会被粒线体膜上的负电位吸引并形成二聚体。此二聚体在荧光显微镜下可发出橘色荧光。而若粒线体上的膜电位消失(例如当细胞凋亡时)，则JC-1染剂将会散布于细胞中呈现单体状态，此时将呈现绿色荧光。
JC-1聚合体的相对比例如图2所示，由图2可见，与空白控制组相较之下，实验组的皮肤纤维母细胞的粒线体活性(即相对的JC-1聚合体比例)有显著提升。显示紫花地丁提取物确实可提升细胞粒线体活性，有利维持细胞活力及其正常代谢。
[例6]人体实验-紫花地丁汁液提升肌肤光泽效用的评估
使用样品：含紫花地丁汁液的面膜(以面膜布浸泡于含有紫花地丁汁液的精华液中，使其充分吸收后制得)以及安慰剂面膜(以相同型号的面膜布浸泡于前述精华液中，但其中的紫花地丁汁液替换成等重的水)，再使其充分吸收后制得。于此实施例中，各面膜含20mL的对应精华液。
含有紫花地丁汁液的精华液成分：三仙胶0.2wt％、馨鲜酮0.6wt％、卡波姆0.1wt％、1,3-丁二醇5wt％、三乙醇胺0.1wt％、己二醇0.6wt％、紫花地丁汁液1.0wt％，其余为水。其中，此处的紫花地丁汁液系指[例1]中得到的紫花地丁汁液。
在另一些实施例中，精华液中的紫花地丁汁液所占比例可达5.0wt％。
受试者人数：8位30-55岁的受试者。
实验方式：受试者将全脸清洁后，使用德国Courage+Khazaka electronic公司的多功能皮肤测试仪(C+K Multi Probe Adapter System)并装配有肌肤光泽度检测探头Glossymeter GL200，纪录左右半脸于使用面膜前的数值(借由标准白光照射，测量肌肤的反射光和散射光，从而精确地测试皮肤的光泽度)。而后，分别将紫花地丁汁液面膜以及安慰剂面膜贴敷于受试者的右半脸及左半脸上，经15分钟后取下，再以指腹稍加按摩左半脸与右半脸。待面膜移除约5分钟后，再以相同的仪器及测量方式进行测量，再与自身原左半脸或右半脸的数值进行对照(使用前与使用后欲进行检测时，受试者所在的测试区域的温度与湿度为一致，以减少外界的温湿度等因素会对皮肤所造成的影响)，其结果记录于图3。
由图3可知，相较于安慰剂面膜，紫花地丁汁液面膜显著提升肌肤光泽度(在一些实施例中，相较于使用前，肌肤光泽度提升5-7％。于此实施例中，相较于使用前，肌肤光泽度提升约6％)。显示以外用方式使用紫花地丁汁液，确实可改善肌肤的暗沈，提升肌肤的光泽度。
综合前述，本案提供一种紫花地丁提取物以及得到该紫花地丁提取物的制备方法。并证实紫花地丁提取物可用于促进纤维母细胞生长、提升细胞的粒线体活性、以及提升肌肤光泽的用途。据此可知使用紫花地丁提取物，可有效改善肌肤整体状态。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (16)

1.一种紫花地丁提取物，其特征在于，由一包含下列步骤的制备方法所制得：将紫花地丁浸泡于一萃取溶剂以进行萃取，得到一含该紫花地丁提取物的紫花地丁汁液；其中该萃取溶剂为水，且该萃取溶剂与该紫花地丁的重量比为25-35：1。
2.如权利要求1所述的紫花地丁提取物，其中该将紫花地丁浸泡于该萃取溶剂以进行萃取的步骤包括：将该紫花地丁浸泡于45℃-50℃的该萃取溶剂50-120分钟以进行第一阶段萃取；以及将该萃取溶剂升温至75℃-85℃后浸泡20-60分钟以进行第二阶段萃取，得到该紫花地丁汁液。
3.如权利要求1所述的紫花地丁提取物，其中该将紫花地丁浸泡于该萃取溶剂以进行萃取的步骤包括：
将该紫花地丁浸泡于45℃-50℃的该萃取溶剂50-120分钟以进行第一阶段萃取，其中该萃取溶剂中添加有该萃取溶剂的0.05wt％至0.15wt％的果胶酶；以及
再将该萃取溶剂升温至75℃-85℃后浸泡20-60分钟以进行第二阶段萃取，得到该紫花地丁汁液。
4.如权利要求1所述的紫花地丁提取物，其中该紫花地丁汁液具有下述条件中的至少一者：白利糖度值(Degrees Brix)为8-11°Bx、总黄酮含量为2500-3100ppm、及总多酚含量为2500-3100ppm。
5.一种将权利要求1-4中任一项所述的紫花地丁提取物用于制备一促进纤维母细胞生长的组合物的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其中该组合物含有0.060-0.065vol％的该紫花地丁汁液，且该紫花地丁汁液的糖度为8-11°Bx。
7.一种将权利要求1-4中任一项所述的紫花地丁提取物用于制备一提升细胞的粒线体活性的组合物的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其中该细胞的粒线体活性为皮肤纤维母细胞的粒线体活性。
9.如权利要求7所述的用途，其中该组合物含有0.060-0.065vol％的紫花地丁汁液，且该紫花地丁汁液的糖度为8-11°Bx。
10.一种将权利要求1-4中任一项所述的紫花地丁提取物用于制备一提升肌肤光泽的组合物的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其中该组合物中含有1wt-5wt％的紫花地丁汁液。
12.一种紫花地丁提取物的制备方法，包括：将紫花地丁浸泡于一萃取溶剂以进行萃取，得到一含该紫花地丁提取物的紫花地丁汁液；其中该萃取溶剂为水，且该萃取溶剂与该紫花地丁的重量比为25-35：1。
13.如权利要求12所述的制备方法，其中该将紫花地丁浸泡于该萃取溶剂以进行萃取的步骤包括：将该紫花地丁浸泡于45℃-50℃的该萃取溶剂50-120分钟以进行第一阶段萃取；以及将该萃取溶剂升温至75℃-85℃后浸泡20-60分钟以进行第二阶段萃取，得到该紫花地丁汁液。
14.如权利要求12所述的制备方法，其中该将紫花地丁浸泡于该萃取溶剂以进行萃取的步骤包括：
将该紫花地丁浸泡于45℃-50℃的该萃取溶剂50-120分钟以进行第一阶段萃取，其中该萃取溶剂中添加有该萃取溶剂的0.05wt％至0.15wt％的果胶酶；以及
再将该萃取溶剂升温至75℃-85℃后浸泡20-60分钟以进行第二阶段萃取，得到该紫花地丁汁液。
15.如权利要求12所述的制备方法，其中该紫花地丁汁液具有下述条件中的至少其中一者：白利糖度值(Degrees Brix)为8-11°Bx、总黄酮含量为2500-3100ppm、及总多酚含量为2500-3100ppm。
16.一种紫花地丁汁液，其具有下述条件中的至少一者：白利糖度值(Degrees Brix)为8-11°Bx、总黄酮含量为2500-3100ppm、及总多酚含量为2500-3100ppm。
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