TWI784229B - 金銀花發酵物的製備方法及其改善皮膚外觀與抗老化的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種金銀花發酵物的製備方法及其改善皮膚外觀與抗老化的用途，本發明之製程能提升金銀花萃取物中總多酚的含量、還原活性、抗氧化活性、清除醣化終產物之能力、且能顯著提升皮膚細胞中SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、及Ubl-5基因的表現量，並同時降低PARP2基因的表現量；其中，該金銀花發酵物係將由一金銀花萃取物以酵母菌、乳酸菌、及醋酸菌依序進行三段式發酵而獲得。

Description

金銀花發酵物的製備方法及其改善皮膚外觀與抗老化的用途
本發明係關於一種金銀花發酵物的製備方法及其用途，尤其是一種將金銀花萃取物以本發明之三段式發酵的製程所製備出的金銀花發酵物，及其用於改善皮膚外觀與抗老化的用途。
表皮層為皮膚的最外層，由外往內依序為角質層、顆粒層、有棘層及基底層，表皮層主要由基底層中未分化之圓柱型角質細胞持續向上進行分化形成，此過程稱為角質化。角質細胞內含水量高，隨著細胞向上代謝分化，角質細胞形狀會逐漸變成扁平狀，且細胞核及胞器開始退化萎縮，並在角質層形成不具細胞核與胞器之死細胞。表皮層的主要功能為使皮膚保水，並形成皮膚屏障以抵禦各種外來傷害，其中表皮層最外層由一弱酸性的皮脂膜以及如磚牆結構的角質層所構成，此屏障能鎖住皮膚的水分和油脂、抵抗皮膚表面病菌入侵，及對抗外界異物及紫外光等傷害，對人體有非常重要的保護作用。
表皮層中的角質層，其角質細胞雖然為死細胞，但其主要成分為角蛋白(keratin)，角蛋白能吸收水分使皮膚保持濕潤，角質細胞也會分泌如玻尿酸等物質作為細胞間質，以維持表皮層皮膚屏障之結構完整，以防止皮膚水分散失及形成完整防護。當皮膚接觸過冷或過熱之環境以及照射紫外光等刺激，會導致角質細胞無法維持正常的代謝循環，且皮膚保水能力也會下降，並 導致皮膚表皮層屏障受損，讓皮膚變得粗糙、乾燥脫屑、脆弱易受刺激、敏感泛紅，因此角質層的健康與保水能力對於抵禦外來傷害著實非常重要。
然而，隨著年紀漸長皮膚會逐漸地老化(Ageing)，皮膚老化形成原因與過程非常地複雜，且牽涉了無數的生理現象，其中紫外線傷害、自由基傷害、膠原蛋白減少、細胞更新減緩、異常細胞的出現、皮膚脂肪減少、細胞間質缺乏、細胞生長休止、荷爾蒙下降等係較常見的因素。但截至目前為止，市售的皮膚抗老化產品大多只能著手在增加抗氧化活性，並無法直接且有效地改善或延緩皮膚老化的發生。
醣化終產物(Advanced Glycation End Products,AGEs)是一群高度氧化的化合物，因此被認為是一種糖毒素(Glycotoxin)，研究顯示醣化終產物會與細胞表面的接受器結合，而改變其結構與功能，並促使細胞的氧化壓力與發炎反應增加，更與糖尿病、動脈硬化及腎臟慢性疾病等的形成關係密不可分。而除了人體正常代謝過程中會產生醣化終產物外，許多加工食品中也會含有醣化終產物，研究也已指出避免從食物攝取醣化終產物，能有助於延緩慢性疾病與老化的進展。
綜合上面所述，為了改善因角質細胞受損、保水能力下降、以及皮膚老化所導致皮膚變得脆弱、易敏等問題，開發一種能直接且有效地改善或延緩皮膚老化發生，同時又能有效維持角質細胞的正常生理代謝、維持角質層結構完整之組合物、及增加抗醣化活性之有效成分組成的，著實有其必要性。
緣此，本發明之一目的在提供一種用於延緩老化的金銀花發酵物，其係將一金銀花經由一溶劑萃取所得之金銀花萃取物，再將該金銀花水萃取物經由一酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、一乳酸菌(Lactobacillus plantarum)、及一醋酸菌(Acetobacter aceti)依序進行三階段發酵而獲得。
本發明之另一目的在提供一種如前所述之金銀花發酵物用於製備提升皮膚細胞中超氧化物歧化酶3(Superoxide dismutase 3,SOD3)基因、帕金森氏症少年蛋白(Parkinson juvenile disease protein,Parkin)基因、自噬作用相關基因1(Autophagy-related gene 1,Atg1)基因、Ubl基因係泛素樣蛋白5(Ubiquitin-like protein 5,Ubl-5)基因、及抑制皮膚細胞中蛋白質聚(ADP-核糖)聚合酶2(Poly(ADP-Ribose)Polymerase 2,PARP2)基因表現量之組合物的用途。
本發明之又一目的在提供一種金銀花發酵物用於製備一提升抗老化能力之組合物的用途。
本發明之另一目的在提供一種金銀花發酵物之製造方法，係包含：將一金銀花經由一溶劑萃取所得之金銀花萃取物，再將該金銀花萃取物經由一酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、一乳酸菌(Lactobacillus plantarum)、及一醋酸菌(Acetobacter aceti)依序進行三階段發酵而獲得。
在本發明之一實施例中，根據降低鐵氧化之能力(Ferric reducing antioxidant power,FRAP)的比色法，該金銀花發酵物還原鐵離子(Fe3+)的能力相當於300-400μg/mL抗壞血酸還原鐵離子(Fe3+)的能力。
在本發明又之一實施例中，該金銀花發酵物係進一步提升抗氧化活性和提升抗醣化活性。
在本發明之又一實施例中，該金銀花發酵物係促進SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、及Ubl-5基因之表現量；並係抑制PARP2基因之表現量。
在本發明之又一實施例中，該金銀花發酵物係提升皮膚細胞中NAD+的濃度、維持細胞中分解老廢蛋白質之正常機能、增進細胞中廢物降解、增進細胞中自噬作用的正常運作、提升修護DNA損傷的能力、及/或促進粒線體代謝的活性。
在本發明之又一實施例中，該金銀花發酵物係提升抗氧化活性、提升還原活性、提升抗醣化活性、及/或提升總多酚含量。
在本發明之又一實施例中，該金銀花發酵物之有效濃度為至少0.5%(v/v)。
在本發明之另一實施例中，該金銀花萃取物係以水為溶劑萃取該金銀花所獲得；且該金銀花及水係以1：10-20(w/w)比例混合；該酵母菌之添加量為0.01-0.5%(w/w)；該乳酸菌之添加量為0.01-0.25%(w/w)；該醋酸菌之添加量為3-10%(w/w)；且該酵母菌、該乳酸菌、及該醋酸菌之發酵時間比為1-2.5：1-3：3-10。
本發明將金銀花萃取物以酵母菌、乳酸菌、及醋酸菌進行三段式發酵所得之金銀花發酵物，能藉由該微生物發酵製程顯著提高本發明金銀花發酵物中總多酚的含量、顯著提高本發明金銀花發酵物的還原活性、顯著提高本發明金銀花發酵物於皮膚細胞的抗氧化活性、顯著提升本發明金銀花發酵物清除醣化終產物之能力、且能顯著提高本發明金銀花發酵物提升細胞中SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、及Ubl-5基因表現量，並同時降低PARP2基因表現量的能力；以達到增強抗氧化及抗醣化的功效，有助於延緩慢性疾病與老化的進展，且能提升細胞中NAD+的濃度、維持細胞中分解老廢蛋白質之正常機能、增進細胞中廢物降解、及增進細胞中自噬作用的正常運作、並能提升修護DNA損傷、及促進粒線體代謝的活性，以延長細胞的壽命，達到抗老化的功效。因此，本發明之金銀花發酵物可用於製備改善皮膚外觀及抗老化之組合物的用途，且該組合物是一醫藥品、一保養品、或一食品，可藉由口服、塗抹等方式給予一個體。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1係為本發明之一實施例的三段式發酵方法提升金銀花發酵物中總多酚之功效的長條圖。
圖2係為本發明之一實施例的金銀花發酵物還原活性之功效的長條圖。
圖3係為本發明之一實施例的金銀花發酵物於提升皮膚細胞抗氧化活性之功效的長條圖。** p<0.01。
圖4係為本發明之一實施例的金銀花發酵物抗醣化活性之功效的長條圖。
圖5係為本發明之一實施例的金銀花發酵物提升SOD3基因表現量之效果的長條圖。* p<0.05；** p<0.01。
圖6係為本發明之一實施例的金銀花發酵物提升Parkin基因表現量之效果的長條圖。* p<0.05；** p<0.01。
圖7係為本發明之一實施例的金銀花發酵物提升Atg1基因表現量之效果的長條圖。* p<0.05；** p<0.01。
圖8係為本發明之一實施例的金銀花發酵物降低PARP2基因、及提升Ubl-5基因表現量之效果的長條圖。* p<0.05；** p<0.01。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，個此之間的差異以學生t檢驗(student's t-test)分析。
金銀花(Lonicera japonica Thunb.)為忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera)多年生常綠纏繞性木質藤本植物，原產於台灣、中國、及日本等地，其又稱忍冬、銀藤、二寶藤、、蜜桷藤、通靈草、甜藤等別名。金銀花的花成對生長，子房相連，夏秋開花，花初開為白色，後轉為黃色，隨著時間的 增加會逐漸變黃，因有白色與黃色混雜其間故稱為金銀花，採其花苞曬乾，即為中藥材的金銀花，俗稱忍冬花。有解毒、退火、消炎的功效。
如本文中所使用的，用語「金銀花發酵物」意為金銀花與溶劑以1：10-20(w/w)比例經一特定時間與溫度萃取而得之金銀花萃取物，再以酵母菌、乳酸菌、及醋酸菌依序進行一三段式發酵而獲得，其中該酵母菌之添加量為0.01-0.5%(w/w)；該乳酸菌之添加量為0.01-0.25%(w/w)；該醋酸菌之添加量為3-10%(w/w)。
本文所述之「有效濃度」係表示能有效提高還原活性、抗氧化活性、清除醣化終產物之能力、提升細胞中SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、及Ubl-5基因表現量，並同時降低PARP2基因表現量所需本發明之金銀花發酵物的濃度。有效濃度依所作用的對象而可能不同，但可藉由例如劑量遞增試驗(dose escalation)以實驗決定其有效濃度。
依據本發明，有關萃取的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，有關微生物發酵反應的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或局部地(topically)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。
依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、 崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。
依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。
依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的醫藥品與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。
依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蠟(wax)[諸如石蠟 (paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普®974P(carbopol®974P)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，保養品可進一步包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如，該可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。
依據本發明，保養品亦可與一或多種選自於下列之已知活性的外用劑(external use agents)一起合併使用：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、抗發炎劑(anti-inflammatory agents)、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agents)、止癢劑(antipruritics)、止痛劑(analgesics)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質類固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。
依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。
本發明提供一種金銀花發酵物用於改善皮膚外觀及抗老化的用途，本發明之金銀花發酵物是將金銀花與溶劑以1：10-20(w/w)比例經一特定時間與溫度萃取而得之金銀花萃取物，再以酵母菌、乳酸菌、及醋酸菌依序進行三段式發酵而獲得，其中該酵母菌為BCRC20271之菌株、該乳酸菌為BCRC910805之菌株、該醋酸菌為BCRC11688之菌株。本發明之金銀花發酵物可有效提高還原活性、抗氧化活性、清除醣化終產物之能力、提升細胞中SOD3 基因、Parkin基因、Atg1基因、及Ubl-5基因表現量，並同時降低PARP2基因表現量。
同時，本發明用於改善皮膚外觀及抗老化之組合物，亦可包含一有效量之金銀花發酵物及一醫藥上可接受之載體，該組合物係一醫藥品、一保養品、或一食品。
以下將詳細說明本發明金銀花發酵物之詳細製備方法、本發明三段式發酵方法提升該金銀花發酵物中總多酚之功效的測試、本發明三段式發酵方法提升該金銀花發酵物還原活性之功效的測試、該金銀花發酵物提升皮膚細胞抗氧化活性之功效的測試、本發明三段式發酵方法提升該金銀花發酵物抗醣化活性之功效的測試、及該金銀花發酵物調控SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、PARP2基因、及Ubl-5基因表現量之功效的測試，以證實本發明之金銀花發酵物具有提高還原活性、抗氧化活性、清除醣化終產物之能力、提升細胞中SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、及Ubl-5基因表現量，並同時降低PARP2基因表現量之功效，有助於延緩慢性疾病與老化的進展，且能提升細胞中NAD+的濃度、維持細胞中分解老廢蛋白質之正常機能、增進細胞中廢物降解、及增進細胞中自噬作用的正常運作、並能提升修護DNA損傷、及促進粒線體代謝的活性，以延長細胞的壽命，達到抗老化的功效。
實施例1 本發明之金銀花發酵物的製備方法
在本發明一實施例中，將金銀花的花與水、醇、或醇水混合物之萃取溶劑以1：10-20(w/w)之比例均勻混合，萃取溶劑較佳為水，並於50-100℃下同時滅菌萃取0.5-1.5小時後，根據總重量加入5-10%(w/w)的葡萄糖後，得到一金銀花萃取物，再將該金銀花萃取物冷卻至室溫供後續三段式發酵使用，以下列三種菌依序進行發酵：酵母菌、乳酸菌、醋酸菌，此三種菌之發酵順序無法前後對調，且其發酵時間比為1-2.5：1-3：3-10。在本發明一較佳實施例中，首先於該萃取溶液中植入0.01-0.5%(w/w)之酵母菌(S'accharomyces cerevisiae，購 買於生物資源保存與研究中心，台灣，編號為BCRC20271)，於25-35℃下進行前發酵1-2.5天，實際時間視發酵狀態而異。接著直接植入0.01-0.25%(w/w)之乳酸菌(Lactobacillus plantarum TCI028，專利寄存於生物資源保存與研究中心，台灣，編號為BCRC910805)，於25-35℃下進行後發酵1-3天，實際時間視發酵狀態而異。接著再直接植入3-10%(w/w)之醋酸菌(Acetobacter aceti，購買於生物資源保存與研究中心，台灣，編號為BCRC11688)，於25-35℃下進行深層發酵3-10天，實際時間視發酵狀態而異；其中，該乳酸菌TCI028係已於中華民國專利申請號第106145146號完成專利寄存。最後在不移除此三種菌之情況下，使用設定的糖度範圍2-4°、pH<4、酒精<5%等規格，如檢驗符合該規格，則判定發酵完成並得到發酵液。接著，將該發酵液於45-70℃進行減壓濃縮，並以200-400mesh的網篩進行過濾，再添加40-70%異麥芽寡糖調整規格後，於95-105℃下加熱70-90分鐘進行滅菌，即得到本發明之金銀花發酵物。
實施例2 本發明三段式發酵方法提升金銀花發酵物中總多酚之功效
本發明之一實施例為進行本發明之三段式發酵方法提升金銀花發酵物中總多酚之功效的測試實驗，因此使用Folin-Ciocalteu比色法測定代測物中的總多酚含量；該測定法係利用多酚的抗氧化特性來進行，試劑中磷鎢酸(Phosphotungstic acid)及磷鉬酸(Phosphomolybdic acid)被多酚類還原(由Mo6+變為Mo5+)後會生成藍色化合物(750nm之吸光值)，而該藍色化合物的深淺與總多酚含量呈正比，因此可用於定量代測物中總多酚的含量。
首先，將沒食子酸(Gallic acid，購自Sigma，美國，編號為G7384)作為標準品以製作標準曲線，精密秤取10.0g之沒食子酸置於10mL之容量瓶中，再加入ddH2O至總體積達10mL，並完成沒食子酸之標準品(Gallic acid stock,1000μg/mL)，接著先將該標準品稀釋10倍至濃度為100μg/mL(100μL之Gallic acid stock+900μL之ddH2O，未使用完之Gallic acid stock儲存於-20℃下)，接 著將該100μg/mL的沒食子酸進行系列稀釋成0、20、40、60、80、及100μL/mL之沒食子酸(如表一所示)，並分別取100μL之各濃度的標準溶液至10mL之玻璃試管中，再加入500μL之Folin-Ciocalteu的酚試劑(購自Merck，德國，編號為1.09001.0100)混合均勻並靜置3分鐘後，加入400μL之7.5%的碳酸鈉(Sodium carbonate，將7.5g之無水碳酸鈉定量至100mL之ddH2O中，其中該無水碳酸鈉係購自Sigma，美國，編號為31432，)均勻混合後靜置反應30-60分鐘，較佳為30分鐘，再以震盪(Vortex)混合靜置至確定無氣泡後，取出200μL的各管反應溶液置於96孔培養板中，並測量其於750nm之吸光值，以繪製標準溶液之迴歸曲線公式。
Figure 108148425-A0305-02-0013-1
接著，分別取100μL之實施例1所述的金銀花萃取物、及本發明之金銀花發酵物於10mL之玻璃試管中，再分別加入500μL之Folin-Ciocalteu的酚試劑混合均勻並靜置3分鐘後，加入400μL之7.5%的碳酸鈉均勻混合後靜置反應30-60分鐘，較佳為30分鐘，再以震盪(Vortex)混合靜置至確定無氣泡後，取出200μL的各管反應溶液置於96孔培養板中，測量其於750nm之吸光值，並以上述之標準溶液的迴歸曲線公式，以內差法算出濃度後，再回乘稀釋倍數以取得原本金銀花萃取物、及本發明之金銀花發酵物中總多酚之濃度。
本發明之三段式發酵方法提升本發明之金銀花發酵物中總多酚之功效的測試結果如圖1所示。金銀花水萃取物僅含有853.75μg/mL的總多酚含量，本發明之金銀花發酵物中總多酚含量卻顯著的高達1131.92μg/mL，為金銀 花水萃取物的1.34倍。此結果顯示，本發明之三段式發酵方法可顯著提高本發明金銀花發酵物中總多酚的含量，以達到提升功效成份，增強保健抗氧化功效之目的。
實施例3 本發明三段式發酵方法提升金銀花發酵物還原活性之功效
本發明之一實施例為進行本發明之三段式發酵方法提升本發明之金銀花發酵物還原活性之功效的測試實驗，因此使用降低鐵氧化之能力(Ferric reducing antioxidant power,FRAP)的比色法，以測定待測物的抗氧化能力；其中，係利用具有還原活性的待測物能夠將鐵離子(Fe3+)還原成亞鐵離子(Fe2+)，而溶液顏色回由紅褐色轉變為綠色，而該綠色化合物的深淺與還原能力呈正比，因此可用於定量代測物的還原活性。
首先，利用已知具有還原活性的抗壞血酸製作標準曲線。精密秤取10mL的L-抗壞血酸(L-Ascorbic acid,Vit C，維他命C，購自Sigma，美國，編號A5960-25g)，置於10mL的容量瓶中，再加入ddH2O制定量至10mL，配置為1mg/mL之L-抗壞血酸。接著，取1mL配好的L-抗壞血酸置於10mL的容量瓶中，再加入ddH2O制定量至10mL，配置為1μg/mL之L-抗壞血酸，並將該100μg/mL的L-抗壞血酸進行系列稀釋成0、10、20、40、60、80、及100μL/mL之L-抗壞血酸(如表二所示)，並分別取250μL之各濃度的標準溶液至試管中，再各加入250μL之磷酸鹽緩衝溶液(以無水磷酸二氫鈉(NaH2PO4，購自J.T.Baker，編號3828-01)及磷酸氫二鈉(Na2HPO4，購自Sigma，編號04270)以1：1比例混合所配製而成)以震盪儀(Vortex)混合均勻後，加入250μL之1%的赤血鹽(Potassium ferricyanide,K3Fe(CN)，購自Sigma，編號244023)以震盪儀混合均勻後，於50℃水浴槽中加熱20分鐘，再加入250μL之10%的三氯醋酸(Trichloroacetic acid,TCA,CCl3COOH，購自J.T Baker，編號0414-01)以震盪儀混合均勻後，以300g離心10分鐘，並注意取出時不要搖晃，接著取出300μL的各管反應溶液之上清液，在加入300μL之ddH2O及120μL之1%的氯化鐵(FeCl3，購自Alfa Aesar，編 號A16231)以震盪儀混合均勻後反應10分鐘，並測量其於700nm之吸光值，以繪製標準溶液之迴歸曲線公式。
Figure 108148425-A0305-02-0015-2
接著，分別取25μL之實施例1所述的金銀花萃取物、及本發明之金銀花發酵物於10mL之玻璃試管中，以ddH2O稀釋十倍(1：10稀釋)，再分別加入250μL之磷酸鹽緩衝溶液以震盪儀混合均勻後，加入250μL之1%的赤血鹽以震盪儀混合均勻後，於50℃水浴槽中加熱20分鐘，再加入250μL之10%的三氯醋酸以震盪儀混合均勻後，以300g離心10分鐘，並注意取出時不要搖晃，接著取出300μL的各管反應溶液之上清液，在加入300μL之ddH2O及120μL之1%的氯化鐵以震盪儀混合均勻後反應10分鐘，並測量其於700nm之吸光值，再以上述之標準溶液的迴歸曲線公式，以內差法算出濃度後，再回乘稀釋倍數以取得原本金銀花萃取物、及本發明之金銀花發酵物的還原能力。
本發明之三段式發酵方法提升本發明之金銀花發酵物還原活性之功效的測試結果如圖2所示。金銀花水萃取物僅含有138.19單位的還原活性，本發明之金銀花發酵物的還原活性卻顯著的高達376.67單位，為金銀花水萃取物的2.73倍。此結果顯示，本發明之三段式發酵方法可顯著提高本發明金銀花發酵物的還原活性，以達到提升功效成份，增強保健抗氧化功效之目的。
實施例4 本發明之金銀花發酵物提升皮膚細胞抗氧化活性之功效
本發明之一實施例以人類皮膚纖維母細胞(Human skin fibroblast,CCD-966sk)進行本發明之金銀花發酵物於提升皮膚細胞抗氧化活性之功效的測試。其中，該人類皮膚纖維母細胞購自美國典型培養物保藏中心(ATCC®)，細胞編號為CRL-1881，該細胞係培養於含有10%之胎牛血清(Fetal Bovine Serum，購自Gibco，美國)以及90%之Minimum Essential Medium(MEM，購自Gibco，美國)之培養液中，其中含有1mM之丙酮酸鈉(Sodium pyruvate，購自Gibco，美國)以及1%之青黴素/鏈黴素(penicillins/streptomycin，購自Gibco，美國)。
首先，將1×105個人類皮膚纖維母細胞種植於含2mL之上述培養液之6孔培養盤中，並於37℃培養24小時後，在不擾動細胞之情況下，移除細胞培養液，並以1倍之磷酸鹽緩衝溶液(1xPhosphate buffered saline,1xPBS)沖洗細胞後移除，接著將細胞分成以下四組：(1)僅加入細胞培養液處理2小時之空白控制組、(2)加入500μM之H2O2(購自Sigma，美國)處理2小時之控制組，(3)以2mg/mL金銀花萃取物預處理1小時再以500μM之H2O2處理1小時之比較組、及(4)以2mg/mL本發明之金銀花發酵物預處理1小時再以500μM之H2O2處理1小時之實驗組。接著，於各組分別加入5μg/mL之DCFH-DA於37℃處理15分鐘，再以500μM之H2O2於37℃處理細胞1小時後，以1mL之1倍之磷酸鹽緩衝溶液清洗細胞兩次，並加入200μL胰蛋白酶(Trypsin)在黑暗中反應5分鐘，使細胞由培養盤上脫落，加入適當的培養液終止反應，並將細胞連同培養液收集至1.5mL離心管，以400g離心5分鐘後移除上清液，再以1mL之1xPBS沖洗細胞一次後，再以400g離心10分鐘後並除上清液，以1mL之1xPBS重新懸浮細胞，並加入2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA，購自Sigma，美國，編號SI-D6883-50MG，5mg/mL保存於DMSO中)標記細胞，並使用流式細胞儀檢測細胞於激發波長450-490nm、放射波長510-550nm的螢光數值。再利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異。
2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)是一種穩定的非極性化合物，可自由通透細胞膜，當DCFH-DA進入細胞後，會被細胞內的脂質酶水解，形成具有極性的2’,7’-dichlorodihydrofluorescin(DCFH)，停留在細胞內無法出來，而細胞內的活性氧類物質(Reactive Oxygen Species,ROS) 與DCFH產生氧化還原反應形成2’,7’-dichlorofluorescin(DCF)，以450-490nm波長激發後，會產生的綠色螢光可以被於510-550nm波長被偵測出，因此偵測經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度，能反映細胞內活性氧物質之含量。
本發明之三段式發酵方法提升本發明之金銀花發酵物於提升皮膚細胞抗氧化活性之功效的測試結果如圖3所示。經H2O2處理過之空白控制組及控制組，可分別測得9.9%及15.1%的人類皮膚纖維母細胞中含有ROS，顯示H2O2確實可誘導皮膚細胞之氧化壓力；經金銀花水萃取物處理後，僅能使含有ROS的人類皮膚纖維母細胞降為2.8%；而經本發明之金銀花發酵物作用後，能夠顯著的使含有ROS的人類皮膚纖維母細胞降為1.1%。此結果顯示，本發明之三段式發酵方法可顯著提高本發明金銀花發酵物於皮膚細胞的抗氧化活性，以達到提升功效成份，增強保健抗氧化功效之目的。
實施例5 本發明三段式發酵方法提升金銀花發酵物抗醣化活性之功效
本發明之一實施例為進行本發明之三段式發酵方法提升金銀花發酵物抗醣化活性之功效的測試實驗以抑制D-果糖(D-fructose)使牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)產生醣化的效率，進行醣化活性之定量；抗醣化能夠抑制非酵素褐變，以避免體內功能性蛋白質之變性。首先，分別取0.25mL稀釋為20%(v/v)之金銀花水萃取物或本發明金銀花發酵物，二者分別為對照組及實驗組，並以及0.25mL之水作為控制組，接著該三組各加入0.25mL之含有0.06%之NaN3的60mg/mL之BSA溶液(以200mM之磷酸鈉緩衝液配置，pH7.4)中，並與0.25mL的1.5M之D-果糖(以200mM之磷酸鈉緩衝液配置，pH7.4)溶液均勻混合，再取0.1mL之混合溶液於激發光360nm、放射光460nm下測定螢光值，以此為反應前之零點，並取0.45mL之混合溶液於50℃下培養24小時後，取出0.1mL測定螢光值，以此為反應之終點。並以等量的3mM之氨基胍(Aminoguanidine,AG，以200mM之磷酸鹽緩衝液配置，pH7.4)回溶溶劑至相等 體積以作為正對照組，其中已知Aminoguanidine(AG)具有抑制醣化作用的功效。最後，以下列公式計算清除醣化終產物(AGEs)能力之效率，以代表其抗醣化作用的活性。
Figure 108148425-A0305-02-0018-3
本發明之三段式發酵方法提升本發明之金銀花發酵物抗醣化活性之功效的測試結果如圖4所示，其中以控制組為100%。金銀花水萃取物僅能降低2.1%醣化終產物的形成，而本發明之金銀花發酵物卻能顯著降低的高達33.61%醣化終產物的形成，為金銀花水萃取物的16倍。此結果顯示，本發明之金銀花發酵物具有強效之抑制醣化反應的活性，本發明之三段式發酵方法可顯著提升本發明金銀花發酵物清除醣化終產物之能力，有助於延緩慢性疾病與老化的進展。
實施例6 本發明金銀花發酵物調控基因表現量之功效
本發明之一實施例以人類初代皮膚角質細胞HPEK-50進行本發明之金銀花發酵物調控SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、PARP2基因、及Ubl-5基因表現量之功效的測試；其中，該HPEK-50細胞係購自CELLnTEC公司(瑞士)，且培養於無血清之角質細胞培養液(Keratinocyte-SFM)，該細胞培養液係購自Gibco公司(美國)，編號為#17005042，並於含有5% CO2之37℃細胞培養箱中進行培養。
首先，將1.5x105個人類初代皮膚角質細胞培養於每孔含有2mL上述培養液之6孔培養盤中，於37℃培養16-18小時，接著將細胞分成以下三組：(1)僅加入細胞培養液之控制組、(2)加入0.125%金銀花水萃取物的比較組、及(3)加入0.125%本發明之金銀花發酵物的實驗組，並將該三組分別於37℃下作用48小時後，測試各組人類初代皮膚角質細胞中目標基因的表現量。首先，將該三組之細胞以細胞裂解液(RB buffer，購自Geanaid公司，臺灣，Cat No. RBD300)回收細胞後，使用RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，臺灣，Cat No.RBD300)分別收集該三組細胞內之總RNA，接著利用SuperScript® III反轉錄酶(購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051)以2000ng之萃取RNA為模板，並以表三之組合引子及反轉錄酶進行反轉錄作用，以產生該些基因之mRNA所相應之cDNA產物，接著利用ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，以及KAPA SYBR FAST(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)將該三組反轉錄後產物分別以表三之組合引子進行定量即時聚合酶連鎖反應(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)試驗，條件為95℃反應1秒，60℃反應20秒，總共40個循環。用以定量該二組人類初代皮膚角質細胞中SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、PARP2基因、及Ubl-5基因之mRNA的表現量，其中定量數值係取由閾值循環數(Ct)，而目標基因的mRNA相對量係推導自方程式2-ΔΔCt，其中ΔCT=CT比較組或實驗組目標基因/控制組目標基因-CTTBP(TATA結合蛋白，TATA-binding protein)；ΔΔCT=CT比較組或實驗組目標基因-CT控制組目標基因；各組中各基因的fold change則為2-ΔΔCt。接著，再利用Excel軟體決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異(* p值<0.05；** p值<0.01；*** p值<0.001)。
Figure 108148425-A0305-02-0019-4
Figure 108148425-A0305-02-0020-5
Parkin基因所編碼的蛋白質為一種存在於泛素-蛋白酶體系(Ubiquitin-proteasome system)中之酵素，並作為蛋白質分解的調節劑，已知該基因之突變與帕金森氏症有關，且先前研究亦指出增加該基因的表現量能夠延緩細胞的老化作用，因此被認為與細胞的老化作用相關。
Atg基因為與自噬作用相關之基因，其所編碼的蛋白質會參與細胞中廢物降解、及循環的自噬作用，先前研究指出該基因的過量表現，能夠延長小鼠的壽命，因此被認為與細胞的老化作用相關。
先前研究已指出和年老的小鼠相比，年輕的小鼠體內含有較多的NAD+；且增加年老小鼠體內的NAD+濃度，能使其生理狀況更為年輕，因此NAD+被認為與延緩個體老化相關，研究結果已知Ubl-5基因及SOD3基因所編碼的蛋白質與調節NAD+相關。
PARP2基因所編碼的蛋白質聚(ADP-核糖)聚合酶2(Poly(ADP-Ribose)Polymerase 2)的為NAD+為受質，主要功能為催化二磷酸腺苷-核醣(ADP-ribose)以形成poly(ADP-ribose)的聚合物(簡稱為PAR)。當細胞中DNA產生結構上的破壞時，PARP-2會因為DNA單股或是雙股斷裂而被活化，因此被視為DNA損傷的感應器，且PARP-2活化後會影響粒線體活性，進而調控細胞能量代謝，因此，PARP和粒線體相關疾病以及老化等現象亦有重要關聯。
本發明之三段式發酵方法提升本發明之金銀花發酵物於提升SOD3基因表現量的測試結果如圖5所示。人類初代皮膚角質細胞經金銀花水萃取物處理後，僅能提升SOD3基因表現量達控制組的1.1倍；而本發明之金銀花發酵物能顯著提升SOD3基因表現量達控制組的1.5倍。此結果顯示本發明之三段式發酵方法可顯著提高本發明金銀花發酵物提升皮膚細胞中SOD3基因的表現量的能力，以提升皮膚細胞中NAD+的濃度，達到皮膚抗老化的功效。
本發明之三段式發酵方法提升本發明之金銀花發酵物於提升Parkin基因表現量的測試結果如圖6所示。人類初代皮膚角質細胞經金銀花水萃取物處理後，僅能提升Parkin基因表現量達控制組的1.2倍；而本發明之金銀花發酵物能顯著提升Parkin基因表現量達控制組的1.4倍。此結果顯示本發明之三段式發酵方法可顯著提高本發明金銀花發酵物提升皮膚細胞中Parkin基因的表現量的能力，能夠維持細胞中蛋白質分解之正常機能的運作，具有預防細胞老化的功效。
本發明之三段式發酵方法提升本發明之金銀花發酵物於提升Atg1基因表現量的測試結果如圖7所示。人類初代皮膚角質細胞經金銀花水萃取物處理後，僅能提升Atg1基因表現量達控制組的1.0倍；而本發明之金銀花發酵物能顯著提升Atg1基因表現量達控制組的1.3倍。此結果顯示本發明之三段式發酵方法可顯著提高本發明金銀花發酵物提升皮膚細胞中Atg1基因的表現量的能力，能夠增進細胞中廢物降解、及循環的自噬作用，以延長細胞的壽命，達到細胞抗老化的功效。
本發明之三段式發酵方法提升本發明之金銀花發酵物於降低PARP2基因、及提升Ubl-5基因表現量的測試結果如圖8所示。人類初代皮膚角質細胞經金銀花水萃取物處理後，僅能降低PARP2基因表現量達控制組的0.85倍，並僅能提升Ubl-5基因表現量達控制組的1.0倍；而本發明之金銀花發酵物能顯著降低PARP2基因表現量達控制組的0.75倍，並能顯著提升Ubl-5基因表現量達控制組的1.1倍。此結果顯示本發明之三段式發酵方法可有效提升本發明金銀花發酵物降低皮膚細胞中PARP2基因的表現量及提升Ubl-5基因表現量的能力，能夠以提升皮膚細胞中NAD+的濃度，並提升修護DNA損傷及促進粒線體代謝的活性，以達到皮膚抗老化的功效。
綜上所述，本發明將金銀花萃取物以酵母菌、乳酸菌、及醋酸菌進行三段式發酵所得之金銀花發酵物，能藉由該微生物發酵製程顯著提高本發 明金銀花發酵物中總多酚的含量、顯著提高本發明金銀花發酵物的還原活性、顯著提高本發明金銀花發酵物於皮膚細胞的抗氧化活性、顯著提升本發明金銀花發酵物清除醣化終產物之能力、且能顯著提高本發明金銀花發酵物提升細胞中SOD3基因、Parkin基因、Atg1基因、及Ubl-5基因表現量，並同時降低PARP2基因表現量的能力；以達到增強抗氧化及抗醣化的功效，有助於延緩慢性疾病與老化的進展，且能提升細胞中NAD+的濃度、維持細胞中分解老廢蛋白質之正常機能、增進細胞中廢物降解、及增進細胞中自噬作用的正常運作、並能提升修護DNA損傷、及促進粒線體代謝的活性，以延長細胞的壽命，達到抗老化的功效。因此，本發明之金銀花發酵物可用於製備改善皮膚外觀及抗老化之組合物的用途，且該組合物是一醫藥品、一保養品、或一食品，可藉由口服、塗抹等方式給予一個體。
【生物材料寄存】
食品工業發展研究所(台灣)；民國106年12月20日；編號BCRC910805。
<110> 大江生醫股份有限公司
<120> 金銀花發酵物的製備方法及其改善皮膚外觀與抗老化的用途
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引子
<400> 9
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<210> 10
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Claims (8)

  1. 一種金銀花發酵物之製造方法，係包含：將一金銀花以水為溶劑萃取所得之金銀花萃取物，該金銀花及水係以1：10-20(w/w)比例混合，再將該金銀花萃取物分別依序以一酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、一乳酸菌(Lactobacillus plantarum)、及一醋酸菌(Acetobacter aceti)進行三階段發酵而獲得，其中該酵母菌之添加量為0.01-0.5%(w/w)；該乳酸菌之添加量為0.01-0.25%(w/w)；該醋酸菌之添加量為3-10%(w/w)，該酵母菌、該乳酸菌、及該醋酸菌之發酵時間比為1-2.5：1-3：3-10。
  2. 一種如請求項1所述的金銀花發酵物用於製備延緩老化之組合物的用途。
  3. 如請求項2所述之用途，其中根據降低鐵氧化之能力(Ferric reducing antioxidant power,FRAP)的比色法，該金銀花發酵物還原鐵離子(Fe3+)的能力相當於300-400μg/mL抗壞血酸還原鐵離子(Fe3+)的能力。
  4. 如請求項2所述之用途，其中該金銀花發酵物係進一步提升抗氧化活性和提升抗醣化活性。
  5. 如請求項2所述之用途，其中該金銀花發酵物係促進超氧化物歧化酶3(Superoxide dismutase 3,SOD3)基因、帕金森氏症少年蛋白(Parkinson juvenile disease protein,Parkin)基因、自噬作用相關基因1(Autophagy-related gene 1,Atg1)基因、及Ubl基因係泛素樣蛋白5(Ubiquitin-like protein 5,Ubl-5)基因之表現量；並係抑制蛋白質聚(ADP-核糖)聚合酶2(Poly(ADP-Ribose)Polymerase 2,PARP2)基因之表現量。
  6. 如請求項2所述之用途，其中該金銀花發酵物係提升皮膚細胞中NAD+的濃度、維持細胞中分解老廢蛋白質之正常機能、增進細胞中廢物降 解、增進細胞中自噬作用的正常運作、提升修護DNA損傷的能力、及/或促進粒線體代謝的活性。
  7. 一種如請求項1所述的金銀花發酵物用於製備一提升抗老化能力之組合物的用途，其中提升該抗老化能力為改善皮膚外觀，其中該金銀花發酵物係提升人類皮膚纖維之抗氧化活性、提升還原活性、提升抗醣化活性、及/或提升總多酚含量。
  8. 如請求項2至7中任一項所述之用途，其中該金銀花發酵物之有效濃度為至少0.5%(v/v)。
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