CN112964808A - 一种生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒和检测方法，所述试剂盒，包括还原剂和蛋白沉淀剂。本发明试剂盒为生物体液中总同型半胱氨酸含量的测定，提供了便利，缩短了检测时间，提高了检测效率，提高了检测准确性。本发明检测方法预处理操作简单，无需对样品进行衍生化，提高了检测结果的重复性；预处理耗时短，分析时间也仅为3分钟，满足了临床检测对时效性和经济成本的要求，具有临床应用价值。

Description

一种生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于分析化学和临床检验技术领域，具体涉及一种生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒和检测方法。
背景技术
同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是一种含巯基的氨基酸，为人体内蛋氨酸的中间代谢产物。Hcy已被国际医学界认为是动脉粥样硬化和血栓、冠心病等心脑血管疾病发病的独立危险因子，其临床意义已被认为超过胆固醇。此外，Hcy升高还是反映人体叶酸和维生素B12缺乏的一个灵敏的生物标记物。
Hcy检测已广泛用于临床心脑血管病的诊治，其对疾病预防和诊治起着重要的作用。临床Hcy常用的检测方法有生化法、免疫法和液相色谱法等，通常使用进口的专用仪器或试剂。由于Hcy分子量较小，生物样品中的检测由于特异性等客观的技术瓶颈，市场上现有的Hcy检测方法存在准确性低、可比性差的问题，难以为临床诊断提供可信的检测结果。
被临床医学检验界誉为小分子化合物定量的金标准方法——液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)则有准确度、精密度、特异性好，通量高的优势，近年来已建立起相关项目的临床质谱检测方法，逐渐成为传统检验方法的有力补充。比如中国专利CN201910644151.3，对样品固液萃取后进行液相色谱-质谱检测；中国专利CN201710447034.9、中国专利CN201811044060.8，对样品进行衍生化处理后进行液相色谱-质谱检测；中国专利CN201810128855.0、中国专利CN201010581678.5，对样品以半胱氨酸同位素标记物进行内标，然后进行液相色谱-质谱检测。但是以上方法，要么过程复杂，预处理时间长，不利于快速获取检测结果；要么对检测过程还存在***偏差校正，检测准确性不足。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒和检测方法，通过对预处理后的含有同位素内标物的生物体液样本，进行液相色谱-质谱检测，将得到的检测数据与标准曲线对照，计算得到生物体液总同型半胱氨酸的含量，能够快速、准确地获得总同型半胱氨酸含量。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面，提出了一种生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒，所述试剂盒，包括还原剂和蛋白沉淀剂。
可选地，还原剂包括二硫苏糖醇、巯基乙醇中的至少一种；
蛋白沉淀剂包括三氯乙酸、三氟乙酸、乙腈、甲醇中的至少一种。
可选地，还原剂为0.01～10M的二硫苏糖醇水溶液；
蛋白沉淀剂为三氯乙酸溶液、三氟乙酸溶液、乙腈、甲醇中的至少一种。
优选地，三氯乙酸溶液为质量百分数为10％～30％的三氯乙酸水溶液；三氟乙酸溶液为质量百分数为10％～30％的三氟乙酸水溶液。
可选地，试剂盒中还包括同位素内标物和/或同位素内标物溶液；
同位素内标物包括高胱氨酸的13C标记物或氘代标记物；
同位素内标物溶液的溶剂为0.01-10M酸性溶液；
同位素内标物溶液的浓度为5～150μmol/L；
优选地，所述同位素内标物为d8-高胱氨酸。
具体地，酸性溶液可以选自盐酸溶液、甲酸水溶液、乙酸水溶液中的任一种。酸性溶液的浓度为0.01-10M。
本发明实施例中酸性水溶液采用盐酸配制，同位素内标工作液的配制具体为：将同位素内标物加入0.01-10M盐酸，配制为一定浓度的储备液，然后用去离子水将储备液稀释至要求浓度。
可选地，试剂盒中还包括：
标准品/标准品工作液、空白基质、洗脱液、质控品/质控品工作液中的至少一种。
可选地，空白基质为0.05wt％～5wt％的小牛血清溶液，溶剂为pH为7的缓冲盐溶液；
洗脱液包括：洗脱液A和洗脱液B；
洗脱液A为体积分数为0.01％～2％的挥发性酸溶液；洗脱液B为含有体积分数为0.01％～2％的挥发性酸的甲醇溶液；挥发性酸包括甲酸、乙酸、三氟乙酸中的至少一种。
标准品工作液包括至少4个不同浓度的同型半胱氨酸标准品溶液；
质控品工作液包括至少2个不同浓度的同型半胱氨酸溶液；
质控品工作液的最低浓度高于标准品工作液的最低浓度；
质控品工作液的最高浓度低于标准品工作液的最高浓度。
具体地，本发明实施例中，小牛血清溶液的溶剂选用1～100mM乙酸铵水溶液，将其pH用氨水调至7。
具体地，质控品工作液浓度分低、中、高3个浓度：QC(L)、QC(M)、QC(H)。质控品工作液用于保证检测***的稳定性和可靠性。本发明实施例中，质控品选用标准品。
由于质控品工作液同样为不同浓度的标准品溶液，将得到的质控品检测数据与标准曲线比对，既可以检验标准曲线是否准确，从而为最终能检测结果提供依据。
同时将质控品工作液在批量生物体液样本液相-质谱检测的不同时期进行液相-质谱检测，能够检验整个检测过程中，检测数据是否因为仪器原因是否发生变化，从而为最终能检测结果提供依据。
可选地，试剂盒包括：
1)标准品工作液：同型半胱氨酸溶液，分4个浓度；
2)质控品工作液：同型半胱氨酸溶液，分3个浓度；
3)内标工作液：用0.01-10M盐酸将同位素内标物配制为1mg/mL储备液，用水稀释至5～100μmol/L；
4)空白基质：0.05wt％～5wt％的小牛血清溶液，溶剂为pH为7的缓冲盐溶液；
5)还原剂：0.01～10M的二硫苏糖醇水溶液；
6)蛋白沉淀剂：三氯乙酸溶液、三氟乙酸溶液、乙腈、甲醇中的至少一种；
7)洗脱液：洗脱液A为体积分数为0.01％～2％的挥发性酸溶液；洗脱液B为体积分数为0.01％～2％挥发性酸的甲醇溶液。
具体地，单个生物体液样本检测试剂盒中，
内标工作液与标准品工作溶液、质控品工作液的体积比均为1：0.05～10；
还原剂与标准品工作液、质控品工作液的体积比均为3～30：1
蛋白沉淀剂与标准品工作溶液、质控品工作液的体积比均为3～30：1；
空白基质与标准品工作溶液、质控品工作液的体积比均为3～30：1：1。
若试剂盒用于多个生物体液样本检测，则还原剂、蛋白沉淀剂、内标工作液以按照生物体液样本数量增加。
本发明另一方面，提出了一种生物体液总同型半胱氨酸的检测方法，采用上述任一生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒进行检测，所述方法至少包括：
对含有同型半胱氨酸的生物体液样本进行预处理，得到待测样品；
对待测样品进行检测分析，得到生物体液总同型半胱氨酸的检测结果；
其中，所述预处理包括：还原处理和蛋白沉淀处理。
可选地，检测方法包括：
在标准品工作液、质控品工作液中均加入内标工作液和空白基质，得到含内标物的标准品工作液和含内标物的质控品工作液；
将内标工作液加入生物体液样本中，得到含内标物的生物体液样本；
在含内标物的标准品工作液、含内标物的质控品工作液、含内标物的生物体液样本中均依次加入还原剂、蛋白沉淀剂进行预处理，分别得到待测标准样品、待测样品和待测质控品；
分别对待测标准样品、待测样品和待测质控品进行液相-质谱检测，得到标准样品检测数据、待测样品检测数据和质控品检测数据；
采用标准样品检测数据制作标准曲线；
将样品检测数据与标准曲线对照，计算得到生物体液总同型半胱氨酸的含量。
其中，采用标准样品检测数据制作标准曲线，具体为：
以标准品浓度为x轴，以质谱得到的标准品与同位素内标物的峰面积的比值为y轴，绘制标准曲线；标准曲线的线性范围为1～100μmol/L。
可选地，生物体液样本与内标工作液的体积比为1～15：1；
内标工作液与标准品工作溶液、质控品工作液的体积比均为1：0.05～10；
还原剂与生物体液样本的体积比为1～3：1；
还原剂与标准品工作液、质控品工作液的体积比均为3～30：1；
蛋白沉淀剂与生物体液样本的体积比为1～3：1；
蛋白沉淀剂与标准品工作溶液、质控品工作液的体积比均为3～30：1；
空白基质与标准品工作溶液、质控品工作液的体积比均为3～30：1。
具体地，生物体液样本与内标工作液的体积比独立选自为1：1、3：1、5：1、10：1、15：1。
具体地，标准品工作溶液/质控品工作液与内标工作液的体积比独立选自为0.05：1、0.5：1、1：1、5：1、10：1。
具体地，还原剂与生物体液样本的体积比的体积比独立选自为1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1。
具体地，还原剂与标准品工作溶液/质控品工作液的体积比独立选自为3：1、10：1、15：1、20：1、30：1。
具体地，蛋白沉淀剂与生物体液样本的体积比的体积比独立选自为1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1。
具体地，蛋白沉淀剂与标准品工作溶液/质控品工作液的体积比独立选自为3：1、10：1、15：1、20：1、30：1。
具体地，空白基质与标准品工作溶液/质控品工作液的体积比独立选自为3：1、10：1、15：1、20：1、30：1。
可选地，生物体液样本包括血浆、血清、尿液和唾液中的至少一种。
本发明的有益效果在于：
1、本发明试剂盒为生物体液中总同型半胱氨酸含量的测定，提供了便利，缩短了检测时间，提高了检测效率，提高了检测准确性。
2、本发明检测方法，首先对含有同位素内标物的生物体液样本进行预处理，进行液相色谱-质谱检测，得到待测样品检测数据；然后将待测样品检测数据与标准曲线对照，计算得到生物体液总同型半胱氨酸的含量，无需对样本进行衍生化反应或者固液萃取，缩短了预处理时间，提高了检测结果的重复性，同时降低了检测成本。
3、本发明检测方法采用高胱氨酸的同位素标记物为同位素内标物，预处理过程中高胱氨酸被还原为半胱氨酸，不但校正了预处理过程及仪器偏差，同时还对还原剂的还原效率进行校正，进一步提高了检测结果的准确性。
4、本发明检测方法，标准曲线制作中，采用pH为7的缓冲体系作为空白基质溶剂，对用无机酸配制的同位素内标工作液进行缓冲能力，是标准品溶液更接近生物体液的真实情况，能够避免酸碱性差异对质谱信号的影响而导致的测定结果不准确。
5、本发明检测方法所采用的标准曲线的线性范围涵盖了其参考值范围，检测限和回收率均达到临床检测要求，且预处理过程简单、耗时短，分析时间仅为3分钟，通量高、成本低，能够满足临床同型半胱氨酸液质检测需求。
附图说明
图1是实施例中标准曲线最低浓度点5μmol/L时，同型半胱氨酸和其同位素内标物的提取离子流图，其中左图为同型半胱氨酸的提取离子流图，右图为同位素内标物的提取离子流图；
图2是实施例中37号实测样本的同型半胱氨酸及其同位素内标物的提取离子流图，其中左图为同型半胱氨酸的提取离子流图，右图为同位素内标物的提取离子流图；
图3是实施例中得到的同型半胱氨酸标准曲线图；
图4是实施例中84例血清样本同型半胱氨酸浓度分布直方图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
本发明实施例检测了84例血清样本的总同型半胱氨酸含量。
1、样品采集
样本采集于大连市海港医院，所有志愿者均于上午7:00～8:00空腹采血。用不含抗凝剂的真空采血管收集全血，静置凝固后3000rpm离心十分钟，取上层血清分装后置-80℃保存备用。
2、试剂盒组成
1)标准品溶液：4个浓度分别为：50μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、450μmol/L的系列标准品溶液；
2)质控品工作液：QC(L)、QC(M)、QC(H)浓度分别为100μmol/L、250μmol/L、400μmol/L。
3)内标工作液：浓度为25μmol/L的d8-高胱氨酸盐酸水溶液。
配制方法：用0.1M盐酸将d8-高胱氨酸配置1mg/mL储备液，用去离子水将储备液稀释为25μmol/L。
4)空白基质：2.5wt％的小牛血清溶液，溶剂为50mM乙酸铵水溶液(用氨水调至pH＝7)；
5)还原剂：0.3M二硫苏糖醇水溶液；
6)蛋白沉淀剂：15wt％的三氯乙酸水溶液。
3、样品预处理
1)标准品：在45μL空白基质中加入5μL系列标准品工作液，再加入10μL内标工作液和50μL还原剂，涡旋60秒，室温放置30分钟；然后加入50μL蛋白沉淀剂，涡旋1分钟，15000rpm离心5分钟后，取上清液，得系列标准样品；
2)质控品：在45μL空白基质中加入5μL质控品工作液，再加入10μL内标工作液和50μL还原剂，涡旋60秒，室温放置30分钟；然后加入50μL蛋白沉淀剂，涡旋1分钟，15000rpm离心5分钟后，取上清液，得质控样品；
3)血清样品：在50μL血清样本中加入10μL内标工作液和50μL还原剂，涡旋60秒，室温放置30分钟；然后加入50μL蛋白沉淀剂，涡旋1分钟，15000rpm离心5分钟后，取上清液，得待测样品。
4、高效液相色谱串联质谱分析
对上述得到的系列标准样品、质控样品和待测样品分别进行高效液相色谱串联质谱分析：
所用仪器为ABI Q TRAP 5500(AB SCIEX)；
高效液相色谱条件：流动相A为体积分数为0.2％的甲酸溶液；流动相B为甲醇(含体积分数为0.2％的甲酸)；色谱柱为：InfinityLabPoroshell120EC-C18,50mm×2.1mm,2.7μm；流速为0.3mL/min，柱温为35℃，进样体积为5μL；洗脱梯度为体积分数10％B；
质谱条件为：电喷雾电离源，正离子模式，采用多反应监测(MRM)的扫描模式；气帘气(CUR)为20kPa；碰撞气(CAD)为Medium；喷雾电压(IS)为5000V；加热气温度为500℃；同型半胱氨酸及d4-同型半胱氨酸的定量离子对、去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)如表1所示：
表1
Figure BDA0002317141330000081
5、结果
图1是标准曲线最低浓度点5μmol/L时，质谱检测到的同型半胱氨酸和其同位素内标物的提取离子流图(分别如左、右图所示)。标准曲线最低浓度点的提取离子流图反应了检测限(即标准曲线最低点)是否符合要求，检测限的信噪比(S/N)要求大于10。从图1可以看出，信噪比远远大于10。
图2是质谱检测到的37号实测样本的同型半胱氨酸及其同位素内标物的提取离子流图(分别如左、右图所示)。通过随机抽取37号实测样本的检测数据，可以看出，实际样品中同型半胱氨酸及其内标的质谱数据与图1的质谱数据相对应，表明标准曲线能够用于实测样本浓度的计算。
从图1、2中可以看出同型半胱氨酸的出峰时间仅为1.1分钟，因此整个分析在3分钟内就可以完成，通量高；分析时间的缩短大大降低了检测所需成本。
以标准品浓度为x轴，以标准品与同位素内标物的峰面积的比为y轴绘制标准曲线，计算总同型半胱氨酸含量；
在待测样品检测序列开始前和完成所有待测样品序列检测后，分别各检测获得一条标准曲线(标准曲线1和标准曲线2)，用以拟合标准曲线计算样本中同型半胱氨酸浓度。
拟合得到的标准曲线如图3所示：y＝0.0803x+0.0297(r＝0.9998)，同型半胱氨酸在5～45μmol/L的浓度范围内呈现良好的线性，标准曲线各点回收率见表2和表3。
将质控品检测数据代入标准曲线，计算回收率，回收率在80％～120％范围内，表明检测***稳定，结果可靠。
表2 同型半胱氨酸的标准曲线1加标回收率(％)
Figure BDA0002317141330000091
表3 同型半胱氨酸的标准曲线2加标回收率(％)
Figure BDA0002317141330000092
从上表可以看出，待测样品序列检测前后的加标回收率均在误差范围内，表明检测过程稳定。
将质谱检测得到的84例血清样本的同型半胱氨酸数据分别与标准曲线进行对照，计算得到84例血清样本的同型半胱氨酸的含量。
84例血清样本同型半胱氨酸浓度分布直方图如图4所示，84例志愿者同型半胱氨酸浓度基本符合正态分布，其中有4例志愿者浓度高于参考值范围(5～15μmol/L)。表明采用本发明检测方法检测得到的同型半胱氨酸浓度结果准确。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒，包括还原剂和蛋白沉淀剂。
2.根据权利要求1所述的生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述还原剂包括二硫苏糖醇、巯基乙醇中的至少一种；
所述蛋白沉淀剂包括三氯乙酸、三氟乙酸、乙腈、甲醇中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述还原剂为0.01～10M的二硫苏糖醇水溶液；
所述蛋白沉淀剂为三氯乙酸溶液、三氟乙酸溶液、乙腈、甲醇中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括同位素内标物和/或同位素内标物溶液；
所述同位素内标物包括高胱氨酸的13C标记物或氘代标记物；
所述同位素内标物溶液的溶剂为0.01-10M的酸性溶液；
所述同位素内标物溶液的浓度为5～150μmol/L；
优选地，所述同位素内标物为d8-高胱氨酸。
5.根据权利要求1所述的生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：
标准品/标准品工作液、空白基质、洗脱液、质控品/质控品工作液中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述空白基质为0.05wt％～5wt％的小牛血清溶液，溶剂为pH为7的缓冲盐溶液；
所述洗脱液包括：洗脱液A和洗脱液B；
所述洗脱液A为体积分数为0.01％～2％的挥发性酸溶液；所述洗脱液B为含有体积分数为0.01％～2％的挥发性酸的甲醇溶液；所述挥发性酸包括甲酸、乙酸、三氟乙酸中的至少一种。
所述标准品工作液包括至少4个不同浓度的同型半胱氨酸标准品溶液；
所述质控品工作液包括至少2个不同浓度的同型半胱氨酸溶液；
所述质控品工作液的最低浓度高于标准品工作液的最低浓度；
所述质控品工作液的最高浓度低于标准品工作液的最高浓度。
7.根据权利要求1所述的生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
1)标准品工作液：同型半胱氨酸溶液，分4个浓度；
2)质控品工作液：同型半胱氨酸溶液，分3个浓度；
3)内标工作液：用0.01-10M盐酸将同位素内标配置为1mg/mL储备液，用水稀释至5～100μmol/L；
4)空白基质：0.05wt％～5wt％的小牛血清溶液，溶剂为pH为7的缓冲盐溶液；
5)还原剂：0.01～10M的二硫苏糖醇水溶液；
6)蛋白沉淀剂：三氯乙酸溶液、三氟乙酸溶液、乙腈、甲醇中的至少一种；
7)洗脱液：洗脱液A为体积分数为0.01％～2％的挥发性酸溶液；洗脱液B为体积分数为0.01％～2％挥发性酸的甲醇溶液。
8.一种生物体液总同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的生物体液总同型半胱氨酸检测试剂盒进行检测，所述方法至少包括：
对含有同型半胱氨酸的生物体液样本进行预处理，得到待测样品；
对所述待测样品进行检测分析，得到生物体液总同型半胱氨酸的检测结果；
其中，所述预处理包括：还原处理和蛋白沉淀处理。
9.根据权利要求8所述的生物体液总同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
在标准品工作液、质控品工作液中均加入内标工作液和空白基质，得到含内标物的标准品工作液和含内标物的质控品工作液；
将内标工作液加入生物体液样本中，得到含内标物的生物体液样本；
在含内标物的标准品工作液、含内标物的质控品工作液、含内标物的生物体液样本中均依次加入还原剂、蛋白沉淀剂进行预处理，分别得到待测标准样品、待测样品和待测质控品；
分别对待测标准样品、待测样品和待测质控品进行液相-质谱检测，得到标准样品检测数据、待测样品检测数据和质控品检测数据；
采用所述标准样品检测数据制作标准曲线；
将所述样品检测数据与标准曲线对照，计算得到生物体液总同型半胱氨酸的含量。
10.根据权利要求9所述的生物体液总同型半胱氨酸的检测方法，其特征在于，
所述生物体液样本与所述内标工作液的体积比为1～15：1；
所述内标工作液与所述标准品工作溶液、所述质控品工作液的体积比均为1：0.05～10；
所述还原剂与所述生物体液样本的体积比为1～3：1；
所述还原剂与所述标准品工作液、所述质控品工作液的体积比均为3～30：1；
所述蛋白沉淀剂与所述生物体液样本的体积比为1～3：1；
所述蛋白沉淀剂与所述标准品工作溶液、所述质控品工作液的体积比均为3～30：1；
所述空白基质与所述标准品工作溶液、所述质控品工作液的体积比均为3～30：1。
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