CN115215851B - 一种1,2,4-噁二唑类化合物及其制备方法和在制备pd-l1小分子抑制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种1,2,4‑噁二唑类化合物及其制备方法和在制备PD‑L1小分子抑制剂中的应用,属于药物合成技术领域。本发明提供的1,2,4‑噁二唑类化合物经计算机辅助药物设计,结果显示与PD‑L1具有良好的亲和能力;经过DS软件打分***进行生物电子等排对接结果打分,本发明提供的1,2,4‑噁二唑类化合物的打分分数为35.3353,说明与PD‑L1具有良好亲和能力,能够用于制备靶向PD‑L1小分子抑制剂。且本发明提供的化合物1,2,4‑噁二唑类化合物具有较好的癌细胞抗增殖活性。
Description
技术领域
本发明涉及药物合成技术领域,特别涉及一种1,2,4-噁二唑类化合物及其制备方法和在制备PD-L1小分子抑制剂中的应用。
背景技术
癌症是目前受到广泛关注的重要疾病之一,预防和治疗癌症依然是亟待探索并需要攻克的领域。传统的手术治疗以及药物治疗中的化疗、采用物理手段进行放疗是初代癌症治疗手段,卓见成效的同时存在较大的副作用,例如术后的转移复发风险、化疗脱发等;对患者应用后的预后效果进行统计分析发现癌症的死亡率主要是由于对化疗和放疗等传统治疗方法产生耐受和抵抗,最终发生转移和恶化。
2013年《自然》杂志公布了***的突破性疗法“免疫疗法”,程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1,PD-L1)和对应受体PD-1(programmed death-1)的相互作用导致的免疫逃逸现象是癌症复发、死亡的极其重要的原因之一。PD-1/PD-L1通路是重要的免疫调节通路。程序性死亡配体-1(PD-L1),在正常机体中表达于T细胞、树突状细胞等多种免疫细胞,是重要的信号转导中间枢纽,承载调节细胞凋亡、免疫效应等多种功能。肿瘤细胞通过过表达PD-L1与T细胞等免疫细胞作用介导T细胞无能或凋亡,从而躲避T细胞的杀伤,同时会影响肿瘤细胞糖代谢,改变肿瘤细胞耐药性。其上下游分子调节作用、表达情况以及应答反应的机制研究也极其广泛,如接收细胞因子的信息从而调节表观遗传学性质改变基因的表达。
目前,针对PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂(Immune checkpoints Inhibitors,ICIs)在临床用药以及基础科研中均体现较明显的疗效,多种靶向PD-1/PD-L1抗体类药物获批上市如帕博利珠单抗获批治疗黑色素瘤,仍针对多种恶性肿瘤进行大量临床研究。但是临床数据显示,单抗类药物虽效果显著,其不良反应发生率较高亟待解决。而发生不良反应的原因主要由于单抗药物容易脱靶导致全身副作用。
发明内容
有鉴于此,本发明目的在于提供一种1,2,4-噁二唑类化合物及其制备方法和在制备PD-L1小分子抑制剂中的应用,本发明提供的1,2,4-噁二唑类化合物用作PD-L1的小分子抑制剂时,具有良好的靶向性和抗增殖活性。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种1,2,4-噁二唑类化合物,具有式I所示结构:
本发明提供了上述1,2,4-噁二唑类化合物的制备方法,包括以下步骤:
具有式a所示结构的化合物与尿素进行胺化反应,得到具有式b所示结构的化合物;
在路易斯酸催化剂的作用下,具有式b所示结构的化合物与还原剂混合,进行还原反应,得到具有式c所示结构的化合物;
具有式c所示结构的化合物与Boc酸酐进行Boc保护反应,得到具有式d所示结构的化合物;
在钯催化剂的作用下,具有式d所示结构的化合物与联硼酸频哪醇酯进行第一Suzuki偶联反应,得到具有式e所示结构的化合物;
3-溴-2-甲基苯腈与羟胺进行亲核加成反应,得到具有式f所示结构的化合物;
具有式f所示结构的化合物与乙酸酐进行成环反应,得到具有式g所示结构的化合物;
在钯催化剂作用下,具有式g所示结构的化合物与具有式e所示结构的化合物进行第二Suzuki偶联反应,得到具有式h所示结构的化合物;
具有式h所示结构的化合物进行脱Boc保护反应,得到具有式I所示结构的1,2,4-噁二唑类化合物。
优选的,所述胺化反应的温度为130~140℃,时间为4~5h。
优选的,所述路易斯酸催化剂为三氟化硼***;所述还原剂为硼氢化钠;所述还原反应的温度为50~60℃。
优选的,所述第一Suzuki偶联反应的温度为100~105℃,时间为16~19h。
优选的,所述亲核加成反应的温度为70~90℃,时间为5~7h。
优选的,所述成环反应的温度为120~130℃,时间为4-5h。
优选的,所述第二Suzuki偶联反应的温度为100~105℃,时间为5~6h。
本发明提供了上述1,2,4-噁二唑类化合物在制备抗癌药物中的应用。
本发明提供了一种1,2,4-噁二唑类化合物,化学名称为3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑,具有式I所示结构。本发明提供的1,2,4-噁二唑类化合物经计算机辅助药物设计(CDOCKER模块),结果显示与PD-L1具有良好的亲和能力;经过DLS软件打分***进行生物电子等排对接结果打分,本发明提供的1,2,4-噁二唑类化合物的打分分数为35.3353,说明本发明1,2,4-噁二唑类化合物与PD-L1具有良好亲和能力,能够用于制备靶向PD-L1小分子抑制剂。抗增殖活性测试显示,针对鼠源结直肠癌细胞系CT-26、MC-38,本发明提供的1,2,4-噁二唑类化合物的IC50在12.5μmol/L左右;针对人源结直肠癌细胞系HCT-116,本发明提供的1,2,4-噁二唑类化合物的IC50在40~50μmol/L之间,说明本发明提供的化合物1,2,4-噁二唑类化合物具有较好的抗增殖活性。
附图说明
图1为1,2,4-噁二唑类化合物的合成路线;
图2为3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑的红外光谱图;
图3为3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑高效液相色谱图;
图4为CDOCKER模块下的3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑与靶点PD-L1的相互作用;
图5为3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑进行细胞毒性测定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种1,2,4-噁二唑类化合物,具有式I所示结构:
在本发明中,所述1,2,4-噁二唑类化合物的名称为3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑。
本发明提供了上述1,2,4-噁二唑类化合物的制备方法,包括以下步骤:
具有式a所示结构的化合物与尿素进行胺化反应,得到具有式b所示结构的化合物;
在路易斯酸催化剂的作用下,具有式b所示结构的化合物与还原剂混合,进行还原反应,得到具有式c所示结构的化合物;
具有式c所示结构的化合物与Boc酸酐进行Boc保护反应,得到具有式d所示结构的化合物;
在钯催化剂的作用下,具有式d所示结构的化合物与联硼酸频哪醇酯进行第一Suzuki偶联反应,得到具有式e所示结构的化合物;
3-溴-2-甲基苯腈与羟胺进行亲核加成反应,得到具有式f所示结构的化合物;
具有式f所示结构的化合物与乙酸酐进行成环反应,得到具有式g所示结构的化合物;
在钯催化剂作用下,具有式g所示结构的化合物与具有式e所示结构的化合物进行第二Suzuki偶联反应,得到具有式h所示结构的化合物;
具有式h所示结构的化合物进行脱Boc保护反应,得到具有式I所示结构的1,2,4-噁二唑类化合物。
在本发明中,具有式a所示结构的化合物与尿素进行胺化反应,得到具有式b所示结构的化合物。在本发明中,所述具有式a所示结构的化合物与尿素的摩尔比优选为1:1.2。
在本发明中,所述胺化反应使用的反应溶剂优选为DMF。在本发明中,所述胺化反应的温度优选为130~140℃,更优选为135℃;时间优选为4~5h。在本发明中,所述胺化反应的过程中,本发明优选使用TLC检测胺化反应的进行,所述TLC条件优选为DCM:MeOH=5:1,Rf=0.5。
所述胺化反应后,本发明优选对所得胺化反应液进行后处理;在本发明中,所述后处理优选包括以下步骤:
将所述胺化反应液与水或冰块混合,析出固体,对所述固体进行干燥。
在本发明中,所述干燥优选为自然风干。
在本发明中,所述胺化反应的过程如式i-1所示。
在本发明中,在路易斯酸催化剂的作用下,具有式b所示结构的化合物与还原剂混合,进行还原反应,得到具有式c所示结构的化合物。
在本发明中,所述路易斯酸催化剂优选为三氟化硼***;所述还原剂优选为硼氢化钠。在本发明中,所述还原反应的反应溶剂优选为THF。
在本发明中,所述具有式b所示结构的化合物与还原剂的质量比优选为1。
在本发明中,所述还原反应的温度优选为50~60℃,更优选为55℃;时间优选为4~5h。本发明优选使用TLC检测还原反应的进行,所述TLC条件优选为PE:EtOAc=1:1。
所述还原反应后,本发明优选对所得还原反应液进行后处理;在本发明中,所述后处理优选包括:
在冰浴条件下,将所述还原反应液与甲醇和盐酸混合,得到淬灭反应液;
去除所述淬灭反应液的有机溶剂,将去除有机溶剂后的剩余物质与水、乙酸乙酯混合,进行分液,得到水相和乙酸乙酯相;
将水相ph至调节至10,使用乙酸乙酯对所述水相进行萃取,所得萃取相与乙酸乙酯向进行合并,将所得合并向依次进行干燥和蒸发,得到具有式c所示结构的化合物纯品。
在本发明中,所述淬灭反应液的pH值优选为2。
在本发明中,所述去除有机溶剂的方式优选为旋蒸。
在本发明中,具有式c所示结构的化合物与Boc酸酐进行Boc保护反应,得到具有式d所示结构的化合物。在本发明中,所述具有式c所示结构的化合物与Boc酸酐的摩尔比优选为1:1.4。
在本发明中,所述Boc保护反应的反应溶剂优选为4-二甲氨基吡啶。在本发明中,所述Boc保护反应优选在氮气保护下进行。在本发明中,所述Boc保护反应的温度优选为室温,时间优选为4h。本发明优选使用TLC检测Boc保护反应的进行,所述TLC条件优选为PE:EtOAc=5:1,Rf=0.7。
所述Boc保护反应后,本发明优选对所得Boc保护反应液进行后处理;在本发明中,所述后处理优选包括以下步骤:
对所述Boc保护反应液依次进行柱层析分离和去除有机溶剂,得到具有式d所示结构的化合物纯品。
在本发明中,所述柱层析分离的流动性优选为石油醚:乙酸乙酯,所述石油醚与乙酸乙酯的体积比优选为10:1。
在本发明中,所述去除有机溶剂的方式优选为旋蒸。
在本发明中,所述还原反应和Boc保护反应的过如式i-2所示:
在本发明中,在钯催化剂的作用下,具有式d所示结构的化合物与联硼酸频哪醇酯进行第一Suzuki偶联反应,得到具有式e所示结构的化合物。在本发明中,所述钯催化剂为Pd(II)催化剂,所述具有式d所示结构的化合物与钯催化剂的摩尔比优选为1:0.1。
在本发明中,所述具有式d所示结构的化合物与联硼酸频哪醇酯的摩尔比优选为1:1。在本发明中,所述第一Suzuki偶联反应的反应溶剂优选为二氧六环。本发明还优选在所述第一Suzuki偶联反应的反应体系中加入醋酸钾,所述具有式d所示结构的化合物与醋酸钾的质量比优选为1:3~4。
本发明优选在氮气保护下进行所述第一Suzuki偶联反应。在本发明中,所述第一Suzuki偶联反应的温度优选为100~105℃,时间优选为16~19h,更优选为18h。
在本发明中,所述第一Suzuki偶联反应后,本发明优选对所得第一Suzuki偶联反应液进行后处理;在本发明中,所述后处理优选包括以下步骤:
去除所述第一Suzuki偶联反应液的反应溶剂,将剩余物体与二氯甲烷混合,分液,得到二氯甲烷相;对所述二氯甲烷相进行柱层析分离,得到得到具有式e所示结构的化合物。
在本发明中,所述去除反应溶剂的方式优选为旋蒸。在本发明中,所述柱层析分离的条件优选为PE:EA=10:1。
在本发明中,所述第一Suzuki偶联反应的过程如式i-3所示:
在本发明中,3-溴-2-甲基苯腈与羟胺进行亲核加成反应,得到具有式f所示结构的化合物。在本发明中,所述羟胺优选为盐酸羟胺。在本发明中,所述3-溴-2-甲基苯腈与羟胺的摩尔比优选为1:4。在本发明中,所述亲核加成反应的反应溶剂优选为水和乙醇,所述水和乙醇的体积比优选为1:1。在本发明中,反应同时使用乙醇和水是由于考虑底物与羟胺溶解性的差异,为了促进底物与羟胺的反应。
在本发明中,所述亲核加成反应优选在碱性条件下进行,提供所述碱性条件的碱性试剂优选为氢氧化钠。在本发明中,所述溴-2-甲基苯腈与氢氧化钠的摩尔比优选为1:5。
在本发明中,所述亲核加成反应的温度优选为80℃,时间优选为6h。本发明优选使用TLC监测亲核加成反应的进行,所述TLC条件优选为PE:EA=1:1,Rf=0.4。
在本发明中,所述亲核加成反应后,本发明优选对所得亲核加成反应液进行后处理,所述后处理优选包括以下步骤:
去除所述亲核加成反应液的反应溶剂,加入冷水,析出固体,对所述固体进行干燥,得到具有式f所示结构的化合物纯品。
在本发明中,所述去除反应溶剂的方式优选为旋蒸。本发明对所述干燥的方式没有特殊的要求,使用本领域技术人员熟知的干燥方式即可。
在本发明中,所述亲核加成反应的过程如式i-4所示:
在本发明中,具有式f所示结构的化合物与乙酸酐进行成环反应,得到具有式g所示结构的化合物。在本发明中,所述成环反应中,所述乙酸酐既作为反应原料,也作为反应溶剂。在本发明中,所述具有式f所示结构的化合物与乙酸酐的质量比优选为1:5-1:10。
在本发明中,所述成环反应的温度优选为120~130℃,时间优选为4~5h。本发明优选使用TLC监测成环反应的进行,所述TLC条件优选为PE:EtOAc=5:1,Rf=0.8。
在本发明中,所述成环反应的反应过程如式i-5所示:
在本发明中,在钯催化剂作用下,具有式g所示结构的化合物与具有式e所示结构的化合物进行第二Suzuki偶联反应,得到具有式h所示结构的化合物。在本发明中,所述钯催化剂为Pd(II)催化剂。在本发明中,所述具有式g所示结构的化合物与钯催化剂的摩尔比优选为1:0.1。
在本发明中,所述具有式g所示结构的化合物与具有式e所示结构的化合物的摩尔比优选为1:1。
在本发明中,所述第二Suzuki偶联反应优选在氮气保护下进行。在本发明中,所述第二Suzuki偶联反应的反应溶剂优选为二氧六环。在本发明中,所述第二Suzuki偶联反应的反应体系中还优选包括醋酸钾,所述具有式g所示结构的化合物与醋酸钾的摩尔比优选为1:4。
在本发明中,所述第二Suzuki偶联反应的温度优选为100~105℃,时间优选为5~6h。本发明优选使用TLC监测第二Suzuki偶联反应的进行,所述TLC条件优选为TLC条件为PE:EA=5:1,Rf=0.6。
所述第二Suzuki偶联反应后,本发明优选对所得第二Suzuki偶联反应液进行后处理,所述后处理优选包括以下步骤:
去除所述第二Suzuki偶联反应液中的反应溶剂,将剩余物体与二氯甲烷混合,分液,得到二氯甲烷相;对所述二氯甲烷相进行柱层析分离,得到得到具有式h所示结构的化合物。
在本发明中,所述去除反应溶剂的方式优选为旋蒸。在本发明中,所述柱层析分离的条件优选为PE:EA=10:1。
在本发明中,所述第二Suzuki偶联反应的过程如式i-6所示:
在本发明中,具有式h所示结构的化合物进行脱Boc保护反应,得到具有式I所示结构的1,2,4-噁二唑类化合物。在本发明中,所述脱Boc保护反应使用的催化剂优选为三氟乙酸。在本发明中,所述脱Boc保护反应的反应溶剂优选为二氯甲烷。
在本发明中,所述脱Boc保护反应的反应温度优选为室温,时间优选为20min。本发明优选使用TLC监测脱Boc保护反应的进行,所述TLC条件优选为TLC条件为DCM:MeOH=10:1,Rf=0.4。
在本发明中,所述脱Boc保护反应后,本发明优选对所得脱Boc保护反应液进行后处理,所述后处理优选包括以下步骤:
调剂所述脱Boc保护反应液的pH值至11,所得固体与二氯甲烷混合,分液,得到二氯甲烷相;
对所述二氯甲烷相依次进行柱层析分离、去除有机溶剂和重结晶,得到具有式I所示结构的1,2,4-噁二唑类化合物纯品。
在本发明中,所述柱层析分离的流动相优选为二氯甲烷和甲醇,所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为15:1。在本发明中,所述去除有机溶剂的方式优选为旋蒸。在本发明中,所述重结晶使用的溶剂优选为石油醚。
在本发明中,所述脱Boc保护反应的过程如式i-7所示:
在本发明中,所述1,2,4-噁二唑类化合物的合成路线如图1所示。
本发明提供了上述1,2,4-噁二唑类化合物或上述制备方法制备得到的1,2,4-噁二唑类化合物在制备靶向PD-L1的小分子抑制剂的应用。
本发明提供了上述1,2,4-噁二唑类化合物或上述制备方法制备得到的1,2,4-噁二唑类化合物在制备抗癌药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的1,2,4-噁二唑类化合物及其制备方法和在制备PD-L1小分子抑制剂中的应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例11,2,4-噁二唑类化合物的制备
(1)5-溴异吲哚-1,3-二酮的制备
称取2.27g(0.1mol,1eq)4-溴-邻苯二甲酸酐加入3mLDMF,向其中加入720mg(0.12mol,1.2eq)尿素,于130℃下加热,用TLC(DCM:MeOH=5:1,Rf=0.5)监测反应,4h反应完全后停止加热,向其中加入过量冷水或冰块终止反应,析出大量黄色固体,抽滤自然风干得到产物2.1554g,产率为95%。TLC条件为DCM:MeOH=5:1,Rf=0.5。
1H NMR(300MHz;DMSO):δ=11.476(bs,1H),7.990-8.004(m,2H),7.13(d,J=7.8Hz,1H);13C NMR(75MHz;DMSO):δ=125.310,126.295,128.291132.029135.095137.466168.325168.916。
(2)具有式d所示结构化合物的合成
取400mg5-溴异吲哚-1,3-二酮溶于14mL THF中,加入870mg硼氢化钠,冰浴下(体系温度在加料过程中不超过7℃)加入三氟化硼***,继续搅拌2min,将反应体系置于60℃油浴中加热,用氮气气球插于冷凝管上方,使体系充满氮气,用TLC(PE:EtOAc=1:1)监测原料点是否消失,消失后进行后处理。在冰浴条件下,缓慢10mL甲醇和3mL盐酸(6M),pH为2,保持10分钟,TLC检测小极性点消失后,用旋转蒸发仪去除溶剂,加入适量水将固体完全溶解,倒入分液漏斗中,加入EtOAc,振荡,在将分液漏斗放在铁圈上静置使其分层。打开分液漏斗活塞,再打开旋塞,让水层从分液漏斗下端放出,待油水界面与旋塞上口相切时关闭旋塞。合并水层,将水层用15%NaOH溶液调节pH至10,再用EtOAc进行萃取合并乙酸乙酯层,干燥,旋蒸得到粗产物直接进行Boc保护。
由于其不稳定,室温下放置12h后可观察到变质,于是粗产物不进行进一步纯化直接用于合成化合物d,将粗产物用3mL THF溶解,加入80mg(cat)DMAP搅拌,加入520mg(Boc)2O(1.4eq)用单通氮气球对反应进行保护,搅拌4h后点板监测反应完成。利用石油醚:乙酸乙酯作为流动相对反应完成后的粗产物进行柱层析提纯,在PE:EtOAc=10:1时可将收得产物,减压旋转蒸发去除溶剂,得到白色固体525.7mg,综合两步产率为55%。TLC条件为PE:EtOAc=5:1,Rf=0.7。
1H NMR(300MHz;CDCl3):δ=7.197-7.246(m,2H),6.9755(m,1H),4.485(m,5H),1.434(s,9H);13C NMR(75MHz;CDCl3):δ=28.612 51.811(51.875)51.950(51.993)79.439120.646 125.428 126.352 130.559 136.500(137.036)139.854(140.383)153.904
(3)具有式e所示结构的化合物的合成
称取457mg(1.67mmol,1eq.)化合物006溶于6ml二氧六环中,加入469mg(1.67mmol,1eq.)联硼酸频哪醇酯、604mg醋酸钾,将体系用氮气保护并混匀置于100℃加热,加入129mgPd(Ⅱ)(0.16mmol,0.1eq.)催化剂反应18h后停止反应,减压去除体系中的二氧六环溶剂,用二氯甲烷将固体溶解,倒入分液漏斗中,加入水润洗瓶壁,振荡,在将分液漏斗放在铁圈上静置使其分层。打开分液漏斗活塞,再打开旋塞,让二氯甲烷层从分液漏斗下端放出,待油水界面与旋塞上口相切时关闭旋塞。合并二氯甲烷层进行干燥。去除醋酸钾等水溶性杂质,柱层析(PE:EA=10:1)分离纯化获得007化合物364.8mg,产率为69%。TLC条件为PE:EA=5:1,Rf=0.7。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ=7.768–7.648(m,2H),7.312–7.193(m,1H),4.688(d,J=8.3Hz,3H),4.634(s,1H),1.528(s,9H),1.357(s,11H);13C NMR(201MHz,CDCl3)δ=171.113,154.560,153.570,140.578,140.234,136.808,136.450,133.886,133.797,129.125,128.890,127.963,122.538,122.174,121.962,83.894,83.873,81.976,79.686,66.424,63.908,60.379,53.424,52.438,52.174,52.004,51.781,31.341,28.550,27.785,24.872,21.049,20.947,18.409,14.209
(4)具有式f所示结构的化合物的合成
称取2.2540g盐酸羟胺(28.4mmol,4eq.),加入5mL蒸馏水,再加入1.5726g氢氧化钠(35mmol,5eq.),混匀后向其中加入5mL乙醇,补加1.3916g3-溴-2-甲基苯腈化合物(7.1mmol,1eq.),混匀后将反应体系置于80℃油浴条件下加热搅拌,用TLC监测反应进度,6h反应完全,反应完成后,用旋转蒸发仪去除乙醇,向其中加入冷水或冰块终止反应,目标产物f析出白色固体,抽滤晾干得白色固体3.2518g产物,产率为87%。TLC条件为PE:EA=1:1,Rf=0.4。
1H NMR(300MHz;DMSO):δ=9.394(bs,1H,OH),7.606(d,J=4.5Hz,1H),7.241(d,J=3.9Hz,1H);7.128(t,J=4.5Hz,1H),5.867(bs,2H),2.349(s,3H);13C NMR(75MHz;DMSO):δ=125.310,126.295,128.291132.029135.095137.466168.325168.916
(5)具有式g所示结构化合物的合成
称取1.79g化合物f(7.8mmol,1eq.)于茄瓶中加入10mL乙酸酐,加热至130℃,用TLC监测反应进度,原料点消失后加入大量冰水将产物析出终止反应即可。抽滤获得白色固体1.6418g。产率为83%。TLC条件为PE:EtOAc=5:1,Rf=0.8。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ=7.828(d,J=11.0Hz,1H),7.792(d,J=7.8Hz),7.311(t,J=7.9Hz,1H),2.679(s,3H),2.573(s,3H);13C NMR(75MHz,DMSO)δ=182.024,173.173,141.828,140.041,134.739,133.322,133.125,131.427,45.601,45.323,45.046,44.768,44.490,44.212,43.934,26.060,17.167.
(6)具有式h所示结构的化合物的合成
称取828mg(2.4mmol,1eq.)化合物e溶于16mL二氧六环中,加入613mg(2.4mmol,1eq.)化合物g、940mg(9.6mmol,4eq.)醋酸钾,将体系用氮气保护并混匀置于100℃加热,加入200mgPd(II)(0.24mmol,0.1eq.)催化剂开始反应,TLC监测反应进度,6h后反应完全。减压去除体系中的溶剂,用二氯甲烷将固体溶解,倒入分液漏斗中,加入水润洗瓶壁,振荡,在将分液漏斗放在铁圈上静置使其分层。打开分液漏斗活塞,再打开旋塞,让二氯甲烷层从分液漏斗下端放出,待油水界面与旋塞上口相切时关闭旋塞。合并二氯甲烷层进行干燥。去除醋酸钾等水溶性杂质。柱层析(PE:EA=10:1)分离纯化获得化合物h364.8mg。产率为67%。TLC条件为PE:EA=5:1,Rf=0.6。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ=7.861(t,J=3.8Hz,1H),7.326(dd,J=8.4,5.6Hz,2H),7.224(m,2H),4.757(s,2H),4.718(s,2H),2.678(s,3H),2.426(s,3H),1.542(s,9H);13CNMR(201MHz,CDCl3)δ=175.628,169.354,154.547,143.303(143.266),141.093(141.037),137.484(137.148),136.232,135.883(135.544),132.156,129.478,128.624(128.577),127.272,125.647,123.681(123.429),122.554(122.281),79.725,52.305,52.200,52.025,51.904,28.558,19.046,12.331.MS(ESI)for C23H25N3O3[M+H]+:calcd.392.2;found,392.6.IR(cm-1):2975.04(m),2928.72(m),2863.50(m),1693.91(vs);1599.72(m),1579.43(m),1393.83(vs),1364.86(m),1169.49(s),1110.12(s)
(7)3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑的合成
称取360.6mg化合物h,溶于4ml二氯甲烷中,向其中加入1ml三氟乙酸,用TLC监测反应,20分钟后原料点消失表示反应完成。用NaOH调节脂层pH值至11,用二氯甲烷将固体溶解,倒入分液漏斗中,加入水润洗瓶壁,振荡,在将分液漏斗放在铁圈上静置使其分层。打开分液漏斗活塞,再打开旋塞,让二氯甲烷层从分液漏斗下端放出,待油水界面与旋塞上口相切时关闭旋塞。合并二氯甲烷层进行干燥,用二氯甲烷/甲醇体系柱层析纯化产物(DCM:Me=15:1),减压去除溶剂用少量二氯将完全溶解后,加入大量石油醚沉淀,析出沉淀,抽滤得到白色固体344.7mg。产率为91%。TLC条件为DCM:MeOH=10:1Rf=0.4。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ=7.854(dd,J=6.1,3.1Hz,1H),7.403–7.279(m,3H),7.207(d,J=8.1Hz,2H),4.310(s,4H),2.697(s,3H),2.444(s,3H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ=175.607,169.449,143.728,142.041,140.767,140.402,135.627,132.249,129.290,127.975,127.187,125.569,123.275,122.006,53.053,52.913,19.069,12.348.[M+H]+:calcd.292.1;found,292.3.IR(cm-1):3330.08(vs),2922.34(m),2851.06(s),1693.91(vs);1599.72(m),1579.43(m),1393.83(vs),1364.86(m),1169.49(s),1110.12(s)。
所得3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑的红外光谱图如图2所示。
所得3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑高效液相色谱如图3所示。
对所得3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑的纯度进行测试,方法如下:取约1mg产物溶解于1mL色谱甲醇中,用0.22μm滤膜过滤后制备成为待测溶液。选择Waters X Bridge C18对化合物的纯度进行检测,体系选择甲醇:水=80:20进行等度洗脱。HPLC结果如表1所示。经高效液相色谱进行纯度检测,确定目标化合物3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑在80%甲醇的流动相中保留时间为2.836min,纯度为98.57%。
表1 3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑的HPLC结果
对所得3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑的熔点进行测试,方法如下:取适量产物放在载玻片上,使其均匀分布,盖上盖玻片,然后放在加热台上,将保护盖关闭,调节显微镜,可在镜下看到清晰的化合物固体可以开始测定。升温速度选择最高档加热到接近熔点30℃时调节加热速度至最低,测定三次取平均值。熔点测试结果如表2所示。
表2 3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑的熔点测试结果
经测定后,可知化合物(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑的熔程为96.3~97.1℃。
测试例1计算机辅助药物设计——分子对接
利用计算机辅助药物设计对目标化合物进行数据上的模拟和计算,分子对接的软件是Discovery Studio。
假定新化合物的结合位点与目前活性较好的小分子抑制剂BMS202(百时美公司2016年研发的抑制PD-1/PD-L1直接结合的小分子药物:N-[2-[[[2-甲氧基-6-[(2-甲基[1,1'-联苯]-3-基)甲氧基]-3-吡啶基]甲基]氨基]乙基]乙酰胺,公开专利号:WO2015/034820A1)位点相同的情况下,利用CDOCKER对化合物与PD-L1的结合力进行模拟对接判断是否具有一定亲和力。
在PDB(protein database)中下载BMS202与PD-L1共晶(PDB ID:5j89)导入至Discovery Studio对目标蛋白进行准备(包括加氢、去水等操作),导入目标化合物,对其进行能量最小化处理。在“Ligand-Receptor Interaction”界面拟定结合位点的大小和位置,将受体和配体导入对应的CDOCKER模块进行对接,得到最终的计算结果。
化合物A是百时美公司公开授权的专利中的系列化合物之一,其IC50在10~100nM之间。化合物A的结构式如式A所示。
CDOCKER模块下的3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑与靶点PD-L1的相互作用如图4所示。图4中,A为3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑与PD-L1的结合位点全视图,B为3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑与PD-L1的氨基酸残基相互作用示意图。由配体受体的相互作用可知,将上述A化合物的苯基更换为1,2,4-甲基噁二唑后,保留了疏水相互作用的芳基-烷基(115位甲硫氨酸、56位酪氨酸、54位异亮氨酸)相互作用,增加了烷基-烷基相互作用,增加了一定的亲和力;同时具有与A化合物相同基团存在的其他疏水相互作用(68位缬氨酸),不同的结合构象也会产生新的氢键相互作用体现亲和力。
经过DS软件打分***得到打分函数,结果如表3所示。可见模拟情况下在A化合物的基础上进行生物电子等排的优化后对接结果打分为35.3353,原结构打分为33.221,证明设计的目标化合物与靶点的亲和力有所提高。
表3化合物分子对接打分
测试例2
称取2.91mg化合物3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑溶于500μLDMSO中,用9.5mLPBS缓冲液稀释得到浓度为1mmol/L的母液,再用PBS缓冲液进行梯度稀释,获得最终浓度为50μmol/L,40μmol/L,25μmol/L,20μmol/L,12.5μmol/L,6.25μmol/L的药液。
选择MC-38、CT-26、HCT116三种不同的结直肠癌细胞系,选用1640+10%胚胎牛血清+1%双抗配成完全培养基在25cm2培养瓶中培养,覆盖率到达70%进行传代,胰蛋白酶消化细胞时间均为1min左右,根据肿瘤细胞的特点,传代到第三代开始使用。
细胞传代到第三代消化后制成细胞悬液均匀吹打并进行计数。将细胞悬液稀释至3×104个/mL的肿瘤细胞细胞(最***一圈用PBS液封),每孔加入100μL细胞悬液并在放入37℃,5%CO2的孵箱内孵育8h,向每孔加入25μL药液,加完药后将96孔板继续置于孵箱中孵育40h。孵育结束后,取出96孔板,向每孔中加入25μLMTT,放入孵箱孵育4h。孵育后取出96孔板,吸出MTT,加入150μLDMSO,震荡20min。用酶标仪测定490nm处的吸光度值,数据经处理后得到不同浓度下的细胞活力。
对目标化合物3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑进行细胞毒性的测定,选择三种不同结肠癌细胞株测定IC50。所得结果如图5所示。数据显示化合物3-(3-异吲哚啉-5-基)-2-甲基苯基-1,2,4-噁二唑对肿瘤细胞增殖的抑制作用具有一定浓度依赖性且对不同的细胞具有一定选择性。针对鼠源结直肠癌细胞系CT-26、MC-38,IC50在12.5μmol/L左右;针对人源结直肠癌细胞系HCT-116,IC50在40~50μmol/L之间。据此可推断该化合物具有较好的抗增殖活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种1,2,4-噁二唑类化合物,具有式I所示结构:
2.权利要求1所述1,2,4-噁二唑类化合物的制备方法,包括以下步骤:
具有式a所示结构的化合物与尿素进行胺化反应,得到具有式b所示结构的化合物;
在路易斯酸催化剂的作用下,具有式b所示结构的化合物与还原剂混合,进行还原反应,得到具有式c所示结构的化合物;
具有式c所示结构的化合物与Boc酸酐进行Boc保护反应,得到具有式d所示结构的化合物;
在钯催化剂的作用下,具有式d所示结构的化合物与联硼酸频那醇酯进行第一Suzuki偶联反应,得到具有式e所示结构的化合物;
3-溴-2-甲基苯腈与羟胺进行亲核加成反应,得到具有式f所示结构的化合物;
具有式f所示结构的化合物与乙酸酐进行成环反应,得到具有式g所示结构的化合物;
在钯催化剂作用下,具有式g所示结构的化合物与具有式e所示结构的化合物进行第二Suzuki偶联反应,得到具有式h所示结构的化合物;
具有式h所示结构的化合物进行脱Boc保护反应,得到具有式I所示结构的1,2,4-噁二唑类化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述胺化反应的温度为130~140℃,时间为4~5h。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法,其特征在于,所述路易斯酸催化剂为三氟化硼***;所述还原剂为硼氢化钠;所述还原反应的温度为50~60℃。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述第一Suzuki偶联反应的温度为100~105℃,时间为16~19h。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述亲核加成反应的温度为70~90℃,时间为5~7h。
7.根据权利要求2或6所述的制备方法,其特征在于,所述成环反应的温度为120~130℃,时间为4-5h。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述第二Suzuki偶联反应的温度为100~105℃,时间为5~6h。
9.权利要求1所述的1,2,4-噁二唑类化合物或权利要求2~8任意一项所述制备方法制备得到的1,2,4-噁二唑类化合物在制备抗结直肠癌药物中的应用。
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