DE102022132082A1

DE102022132082A1 - Verfahren zur Herstellung von genetisch transfizierten und mit Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff beladenen immunokompetenten Zellen sowie immunokompetente Zellen und medizinische Zusammensetzung.

Info

Publication number: DE102022132082A1
Application number: DE102022132082.0A
Authority: DE
Inventors: Klaus SPOHR
Original assignee: Horia Hulubei Nat Institute For R & D In Physics And Nuclear Engineering Ifin Hh; Horia Hulubei National Institute For R & D In Physics And Nuclear Engineering Ifin Hh
Current assignee: Horia Hulubei Nat Institute For R & D In Physics And Nuclear Engineering Ifin Hh; Horia Hulubei National Institute For R & D In Physics And Nuclear Engineering Ifin Hh
Priority date: 2022-12-02
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2024-06-13
Also published as: US20240181096A1; EP4385526A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von genetisch transfizierten und mit Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff beladenen immunokompetenten Zellen zur theranostischen Behandlung von patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen, insbesondere von viral genetisch veränderten Zellen oder eines patientenspezifischen malignen Tumors, in einem befallenen Patienten, das den Schritt des Bereitstellens von immunokompetenten Zellen umfasst, die mit zumindest einem Gen transfiziert wurden, dessen Genprodukt eine Spezifität für die immunokompetenten Zellen gegenüber den patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen vermittelt. Darüber hinaus umfasst das Verfahren den Schritt des Beladens der immunokompetenten Zellen mit den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff. Dieser Beladungsschritt umfasst wiederum das Aufbringen der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffs auf die immunokompetenten Zellen oder Vermischen der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffs mit den immunokompetenten Zellen in einer Trägerflüssigkeit zu einer Zelllösung. Ferner umfasst der Beladungsschritt das Porieren, insbesondere durch Sonoporation, Elektroporation oder Laserporation, der immunokompetenten Zellen, um die Permeabilität der Zellmembranen der immunokompetenten Zellen für die Nanopartikel und/oder den zytotoxischen Stoff zu erhöhen und hierdurch die immunokompetenten Zellen mit den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff zu beladen.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von genetisch transfizierten und mit Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff beladenen immunokompetenten Zellen zur theranostischen Behandlung von patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen, insbesondere von viral genetisch veränderten Zellen oder eines patientenspezifischen malignen Tumors, in einem befallenen Patienten.
Ferner betrifft die Erfindung immunokompetente Zellen, immunokompetente Zellen zur Anwendung in einem Verfahren für die theranostische Behandlung von patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen sowie eine medizinische Zusammensetzung.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Die T-Zelltherapie ist eine neuartige und erprobte Methode zur Behandlung von genetisch veränderten Zellen, insbesondere von viral genetisch veränderten Zellen, darunter auch zuletzt Covid-19, oder eines patientenspezifischen malignen Tumors.
Jüngste Studien heben das einzigartige Potential für neue γδ-CAR-T-Zell-basierte Behandlungen hervor (Mirzaei et al. (2016). „Prospects for chimeric antigen receptor (CAR) T cells: A potential game changer for adoptive T cell cancer immunotherapy“). Diese speziellen Zellen haben einen spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) auf ihrer Oberfläche. In ihrer natürlichen Form machen γδ-T-Zellen 2% bis 10% der peripheren Blut-T-Lymphozyten aus. Unter anderem können die Techniken, die für ocß-T-Zell-Therapien entwickelt wurden, angewandt werden.
Ein entscheidender Vorteil von γδ-T-Zellen gegenüber ocß-T-Zellen ist die angeborene Tumorerkennungsfähigkeit von γδ-T-Zellen, welche eine gezielte Abtötung von Krebsgewebe ermöglicht. Wenn genetisch veränderte γδ-CAR-T-Zellen, bei welchen die Spezifität gegenüber patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen durch einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) erhöht wurde, verwendet werden, können die Nebenwirkungen einer Behandlung geringgehalten werden.
Die besondere Krebsselektivität von genetisch veränderten γδ-CAR-T-Zellen beruht auf der Fähigkeit des durch gentechnische Verfahren in die Zellen eingebrachten chimären Antigen-Zellrezeptors (CAR), das auf der Oberfläche der Krebszelle befindliche Isopentenylpyrophosphat (IPP)-Antigen aufgrund eines gestörten Isoprenoid-Signalwegs im Körper der betroffenen Zelle zu erkennen (Zeng, Jieming et al. (May 2019). „Derivation of mimetic T cells endowed with cancer recognition receptors from reprogrammed T cell“).
Als Reaktion auf die Erkennung einer Krebszelle aktivieren die angreifenden γδ-CAR-T-Zellen entzündliche zytotoxische Substanzen, die sie über den sogenannten „Todeskuss“ („Kiss-of-Death“)-Mechanismus in die bösartige Zelle injizieren (Rozenbaum, Meir et al. (July 2020). „Gamma-Delta CAR-T Cells Show CAR-Directed and Independent Activity Against Leukemia“). γδ-T-Zellen haben bei Experimenten in vitro und klinischen Studien bereits vielversprechende Ergebnisse gezeigt und etablieren sich zunehmend in der Behandlung von Leukämie, Neuroblastomen, verschiedenen Karzinomen und zuletzt auch Covid-19 (Caron et al. (Mar. 2021). „How to Train Your Dragon: Harnessing Gamma Delta T Cells Antiviral Functions and Trained Immunity in a Pandemic Era“). Da sich das Feld der Immuntherapie über die wiederholte Iteration etablierter Methoden hinaus zu kreativeren Lösungen hin bewegt, bieten γδ-CAR-T-Zellen die Möglichkeiten, etablierte Krebsbehandlungen voranzutreiben und neue Wege der Onkologie einzuschlagen. Diese neuen Methoden sind breitgefächert und weisen ein viel günstigeres Sicherheitsprofil als herkömmliche Therapien auf, da das umgebende gesunde Zellgewebe während der Behandlung aufgrund der Spezifität der γδ-CAR-T-Zellen geschont wird.
Bei der konventionellen Therapie mit z.B. αβ-CAR-T-Zellen werden zwei die T-Zellen stimulierende Signale ausgelöst, indem der chimäre Antigen-Rezeptor (CAR) an der Außenseite der T-Zelle aktiviert wird. Ein Nachteil von αβ-CARs ist, dass diese auch an gesunde Zellen binden können, was nach Aktivierung der T-Zellen zum Tod gesunder Zellen führt. Dieses Phänomen wird als „Off-Tumor-Toxizität“ bezeichnet und verursacht starke Nebenwirkungen, wie sie beispielsweise bei der klassischen Chemotherapie zu beobachten sind. Die hier beanspruchten γδ-CAR-T-Zellen unterscheiden sich im Kern von anderen T-Zellen, da sie einen spezifischen γδ-T-Zell (TCR)-Rezeptor haben, der nur an Antigene bindet, die charakteristisch für beeinträchtigte ungesunde Zellen sind. Der TCR dient sozusagen als Sicherheitssperre gegen eine Aktivierung der T-Zellen bei gesunden Zellen. Eine genetisch modifizierte γδ-CAR-T-Zelle, die nur eine co-stimulatorische Domäne besitzt, bindet sich nur an eine geschädigte Zelle. Nebenwirkungen werden hierdurch reduziert, da gesunde Zellen nicht angegriffen werden.
Um ausreichend viel Zellmaterial zu erhalten, wird derzeit an allogenen Zellpools gearbeitet, für welche γδ-T-Zellen von gesunden Spendern entnommen, vervielfacht und über ein Verteilersystem weltweit vertrieben werden.
Das Potential von γδ-T-Zellen wird weiter erhöht durch die kürzlich entwickelte Methode, die es erlaubt, von der mit verschiedensten Nebenwirkungen verbundenen individuellen autologen-Therapie (vergleiche US 9,855,298 B2 ) zur allogenen Therapie überzugehen.
Die allogene Verwendung von γδ-T-Zellen vermindert Graft-versus-Host-Erkrankungen (GvHD), auch wenn das zunächst ein Widerspruch zu sein scheint. Dies ist möglich, da es die jetzige γδ-CAR-T-Zell-Technologie erlaubt, die Einschränkung ausgelöst durch den Major-Histocompatibility-Complex (MHC) zu überwinden. Daher wird das GvHD-Risiko minimiert (Handgretinger et al. (Mar. 2018). „The potential role of T cells after allogeneic HCT for leukemia“). Darüber hinaus wurde in verschiedenen Studien eine insgesamt günstige Wirkung einer hohen γδ-CAR-T-Zell-Immunrekonstitution aufgezeichnet, z.B. nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT). In begleitenden klinischen Studien hatten Patienten mit einer erhöhten Anzahl von γδ-CAR-T-Zellen eine signifikant höhere Gesamtüberlebensrate und nicht nachweisbare akute GvHD-Manifestationen. Darüber hinaus ist die Wahrscheinlichkeit von Transplant-Abstoßungen bei Patienten mit schweren Virusinfektionen wie HIV, Influenza und Covid-19 gering, und entsprechende fortgeschrittene klinische Studien laufen seit Anfang 2022.
Es ist ferner bekannt, dass solide Tumore mit der Zeit weiteren Mutationen unterliegen, die auch die Struktur der von außen zugänglichen Rezeptoren verändern, die zur Zeit nur nach einer histologischen oder histo-pathologischen Untersuchung, gefolgt von feineren Untersuchungsmethoden, erkannt werden können.
Aus dem Stand der Technik bekannte Therapieansätze mit immunokompetenten Zellen gehen beispielsweise aus WO 2022241151 A2 , WO 2022238962 A1 , WO 2022241036 A1 , WO 2022147014 A2 und WO 2020109953 A1 hervor. Weitere Therapieansätze können WO 2019 181018 A1 , WO 9817342 A2 , CN 115215851 A , CN 115232129 A , FR 3120630 A1 , CN 112675442 A und JP 2016159107 A entnommen werden.
Nachteilig an bisherigen Behandlungsmethoden gegen patientenspezifisch genetisch veränderte Zellen, insbesondere gegen Krebs, ist, dass bei der klassischen Chemotherapie Stoffe verabreicht werden, die zwar eine gute toxische Wirkung gegenüber den Krebszellen aufweisen, allerdings gänzlich ungerichtet auch gesunde Zellen abtöten, wodurch es zu massiven Nebenwirkungen und allgemein schlechten Erfolgsaussichten einer Behandlung kommt, denn die verabreichten Stoffe gelangen nicht zielgerichtet an das befallene, insbesondere tumoröse, Gewebe.
Selbst diejenigen Therapien, bei welchen αβ-T-Zellen verwendet werden, die mit einem Gen transfiziert wurden, das für einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) codiert, bieten nicht die gewünschte Spezifität der Behandlung, da der CAR auch an Oberflächenproteine von Zellen bindet, die nicht genetisch verändert, d.h. gesund sind. Zwar sind bei diesen Ansätzen weniger Nebenwirkungen zu beobachten als bei der herkömmlichen Chemotherapie, aber selbst das hat sich als unzureichend herausgestellt. Hinzu kommt, dass diese Therapien mit derartigen Zellen es nur unter Umwegen erlauben, den Therapiefortschritt zu kontrollieren und zu überwachen. Ein weiterer Nachteil ist, dass selbst bei erfolgreicher Therapie ein hohes Risiko dafür besteht, dass Zellen eines betroffenen Gewebes überleben und sich die genetisch veränderten Zellen erneut teilen. Hierdurch kann es dann im Falle einer viralen Infektion zu einem erneuten Aufflammen der Infektion und im Falle von tumorösem Gewebe zu (weiteren) Metastasen kommen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Herstellung von genetisch transfizierten und mit Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff beladenen immunokompetenten Zellen zur theranostischen Behandlung von patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen, insbesondere von viral genetisch veränderten Zellen oder eines patientenspezifischen malignen Tumors, in einem befallenen Patienten anzugeben, das es ermöglicht, immunokompetente Zellen herzustellen, die den erwähnten Nachteilen aus dem Stand der Technik begegnen und eine gegenüber patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen verbesserte Toxizität aufweisen und die Behandlung mit diesen höhere Erfolgsaussichten versprechen.
Diese Aufgabe wird bei diesem Herstellungsverfahren durch die folgenden Schritte gelöst:

a) Bereitstellen von immunokompetenten Zellen, die mit zumindest einem Gen transfiziert wurden, dessen Genprodukt eine Spezifität für die immunokompetenten Zellen gegenüber den patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen vermittelt;
b) Beladen der immunokompetenten Zellen mit den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff, umfassend die Schritte:
- - Aufbringen der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffs auf die immunokompetenten Zellen oder Vermischen der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffs mit den immunokompetenten Zellen in einer Trägerflüssigkeit zu einer Zelllösung;
- - Porieren, insbesondere durch Sonoporation, Elektroporation oder Laserporation, der immunokompetenten Zellen, um die Permeabilität der Zellmembranen der immunokompetenten Zellen für die Nanopartikel und/oder den zytotoxischen Stoff zu erhöhen und hierdurch die immunokompetenten Zellen mit den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff zu beladen.

Erfindungsgemäß wurde erkannt, dass genetisch veränderte immunokompetente Zellen, deren Spezifität hinsichtlich patientenspezifisch genetisch veränderter Zellen erhöht wurde und die bereits eigene, d.h. native, zytotoxische Substanzen herstellen und in die patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen injizieren, dadurch verbessert werden können, dass ihnen weitere Substanzen in Form von Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff mitgegeben werden, die unmittelbar oder mittelbar eine zytotoxische Wirkung auf die patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen haben. Hierdurch wird die Wahrscheinlichkeit erhöht, bei erfolgreicher Entladung der Nanopartikel und/oder dem zytotoxischen Stoff der immunokompetenten Zellen in die patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen auch zum Absterben der entsprechenden Zelle zu führen.
Vorzugsweise sind die immunokompetenten Zellen T-Zellen, insbesondere allogene γδ-T-Zellen, vorzugsweise allogene γδ-CAR-T-Zellen.
Es ist günstig, wenn die immunokompetenten Zellen neben dem zumindest einen Gen für die Spezifität der immunokompetenten Zellen gegenüber den patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen mit einem Satz von Genen transfiziert wurden, der für zumindest einen Teil eines chimären Antigen-Rezeptors (CAR) codiert, wobei der CAR zumindest eine extrazelluläre spezifitätsvermittelnde scFv-Antikörperdomäne, eine intrazelluläre T-Zell-Aktivierungsdomäne und eine die scFv-Antikörperdomäne und die T-Zell-Aktvierungsdomäne miteinander verbindende und das Protein in der Zellmembran verankernde Transmembrandomäne umfasst, wobei das spezifitätsvermittelnde Gen für die scFv-Antikörperdomäne codiert.
Darüber hinaus ist es vorteilhaft, wenn es sich bei den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff um zumindest ein stabiles Isotop und/oder zumindest ein Radioisotop aus der folgenden Gruppe von stabilen Isotopen oder Radioisotopen handelt: ¹⁰B, ¹¹B, ^natB, ¹⁵⁷Gd, ^99mTc, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸F und ²¹¹At.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Porationsschritt um einen Sonoporationsschritt und

a) in der Zelllösung befinden sich freie Mikrobläschen und/oder
b) die Nanopartikel oder der zytotoxische Stoff werden vor dem Sonoporationsschritt mit Mikrobläschen gekoppelt, wobei die Nanopartikel oder der zytotoxische Stoff derart mit den Mikrobläschen gekoppelt werden, dass diese nach der Kopplung in einem Innenraum der Mikrobläschen, in einer Mikrobläschenmembran eingelagert oder kovalent von außen an die Mikrobläschenmembran gebunden vorliegen.

Ein weiterer Vorteil ergibt sich, wenn der Schritt des Koppelns der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffes mit den Mikrobläschen vor oder nach dem Aufbringen oder Vermischen der Nanopartikel oder des zytotoxischen Stoffes auf die bzw. mit den immunokompetenten Zellen erfolgt.
Es ist ferner günstig, wenn der Durchmesser der Mikrobläschen 0,5 µm bis 4 µm, vorzugsweise 1 µm bis 3 µm, vorzugsweise etwa 2 µm beträgt.
Günstig ist es ferner, wenn zur Kontrolle des Porationsschrittes, insbesondere zur Kontrolle einer Permeabilisierung der Zellmembranen, während der Sonoporation ein stationäres oder ein nicht-stationäres elektrisches oder elektromagnetisches Feld an die Zelllösung angelegt wird. Diese Maßnahme wird insbesondere zur Kontrolle und Überwachung des Wiederverschließens oder Ausheilens der Zellmembranen nach der Poration durchgeführt.
Vorzugsweise wird vor dem Beladungsschritt der folgende Schritt ausgeführt:

- Kultivieren der immunokompetenten Zellen über einen Kultivierungszeitraum hinweg bis zum Erreichen einer vorab festgelegten Anzahl von immunokompetenten Zellen je Volumeneinheit.

Es ist ferner vorteilhaft, wenn nach dem Beladungsschritt der immunokompetenten Zellen der folgende Schritt ausgeführt wird:

- Kultivieren der mit den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff beladenen immunokompetenten Zellen über einen Kultivierungszeitraum hinweg bis zum Erreichen einer im Vergleich zur Anzahl der Zellen vor Beginn dieses Kultivierungsschrittes um den Faktor 1000 bis 100000 höheren Anzahl von mit den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff beladenen immunokompetenten Zellen je Volumeneinheit, wobei die Ladung der beladenen immunokompetenten Zellen bei jeder Zellteilung jeweils gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt wird.

Vorzugsweise wird das Wachstum der beladenen immunokompetenten Zellen sowie die Verteilung der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffes in den immunokompetenten Zellen während des Kultivierungsschritts kontrolliert, wobei hierfür von den beladenen immunokompetenten Zellen ausgehende ionisierende Teilchenstrahlung detektiert und vorzugsweise visualisiert wird, wobei im Falle von stabilen Isotopen diese Isotope zuvor einer thermischen Neutronenstrahlung (n_th) oder im Falle des Isotops ¹¹B einer Protonenstrahlung ausgesetzt werden.
Vorteilhafterweise werden vor dem Schritt des Bereitstellens der immunokompetenten Zellen eine für die patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen spezifische Mutation in einem codierenden Gen eines auf der Zellmembran dieser Zellen präsentierten Antigens ermittelt sowie ein für diese Mutation Spezifität vermittelndes Gen zur Transfektion der immunokompetenten Zellen bereitgestellt und die immunokompetenten Zellen mit diesem Gen transfiziert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die obengenannte Aufgabe darüber hinaus durch immunokompetente Zellen gelöst, insbesondere T-Zellen, insbesondere γδ-T-Zellen, insbesondere theranostische γδ-CAR-T-Zellen, die mit Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff beladen sind, insbesondere hergestellt nach einem Verfahren mit einigen oder allen der oben zum Herstellungsverfahren genannten Merkmale.
Gemäß noch einem Aspekt der Erfindung wird die obengenannte Aufgabe außerdem durch immunokompetente Zellen mit einigen oder allen der zu den immunokompetenten Zellen genannten Merkmalen zur Anwendung in einem Verfahren für die theranostische Behandlung von patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen, insbesondere von viral genetisch veränderten Zellen oder eines patientenspezifischen malignen Tumors, in einem befallenen Patienten, gelöst.
Gemäß noch einem Aspekt der Erfindung wird die genannte Aufgabe auch durch eine medizinische Zusammensetzung gelöst, umfassend immunokompetente Zellen mit einigen oder allen Merkmalen der oben zu den immunokompetenten Zellen genannten Merkmale und eine Trägerflüssigkeit, in welcher diese Zellen vorliegen, wobei die medizinische Zusammensetzung dazu eingerichtet und dazu vorgesehen ist, einem Patienten verabreicht zu werden.
Es ist vorteilhaft, wenn die beladenen immunokompetenten Zellen dazu ausgelegt sind, sich innerhalb von maximal 60 Minuten, vorzugsweise innerhalb von maximal 30 Minuten, derart innerhalb des Körpers des Patienten zu verteilen, dass ihre Verteilung im Körper des Patienten räumlich aufgelöst detektiert werden kann.
Darüber hinaus ist es günstig, wenn die beladenen immunokompetenten Zellen dadurch räumlich aufgelöst detektierbar sind, dass diese einen visualisierbaren Marker aufweisen und/oder von diesen ausgehende ionisierende Teilchenstrahlung detektiert werden kann, im Falle von stabilen Isotopen nach einem vorangegangenen Aussetzen in thermischer Neutronenstrahlung (n_th) oder im Falle von ¹¹B in Protonenstrahlung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert. In diesen zeigen:

1 eine schematische Wiedergabe einer γδ-CAR-T Zelle;
2 eine schematische Wiedergabe von Nanopartikel tragenden Mikrobläschen;
3a bis d eine schematische und theoretische Wiedergabe eines Ladevorgangs durch Sonoporation;
4 eine schematische Wiedergabe von Ausführungsbeispielen der γδ-CAR-T Zellen, die im Weiteren als „T-Ninja-Zellen“ bezeichnet werden;
5 eine schematische Wiedergabe einer Sonoporations-Ladevorrichtung;
6 eine schematische Wiedergabe einer gleichmäßigen Aufteilung von Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff auf Tochterzellen nach Teilung der T-Ninja-Zellen;
7 eine schematische Wiedergabe einer Aktivitätskontrolle von beladenen T-Ninja-Zellen;
8 eine schematische Wiedergabe des modus operandi einer beladenen T-Ninja-Zelle in vivo;
9 eine schematische Wiedergabe einer Interaktion zwischen einer beladenen T-Ninja-Zelle mit einer Krebszelle;
10a und 10b eine schematische Widergabe einer Krebszelle nach der Behandlung mit den beladenen T-Ninja-Zellen.

BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Die Figuren zeigen Ausführungsbeispiele der Erfindung und die nachfolgenden Ausführungen beziehen sich auf diese Ausführungsbeispiele. Dem Fachmann ist klar, dass sich die Ausführungen zu den konkreten Ausführungsbeispielen der Erfindung in keiner Weise einschränkend auf den allgemeinen Erfindungsgedanken auswirken. Konkret gezeigt ist in den Figuren ein funktionelles Design basierend auf genetisch veränderten immunokompetenten Zellen in Form von allogenen γδ-CAR-T-Zellen, jedoch werden auch autologe Anwendungen, wo sie notwendig sind, nicht ausgeschlossen.
Ein wirksames Expansions- und Verteilungsverfahren für den allogenen Transfer ist beispielsweise aus WO 2016005752 A1 bekannt und hat zu positiven Ergebnissen in klinischen Studien geführt. Das dort beschriebene Verfahren beginnt mit der anfänglichen Entnahme von γδ-T-Zellen, die einem gesunden ersten Spender oder zum Beispiel Nabelschnurblut entnommen wurden. Danach wird eine Anreicherung auf 99% von γδ-T-Zellen erreicht, bevor in diesem Verfahren eine Vervielfältigung um mehrere Größenordnungen erfolgt. Hierbei können Mengen von 2.5×10¹⁰ Zellen innerhalb von 10 bis 18 Tagen von nur einem einzigen Spender erreicht werden. Der optimale Zeitpunkt für eine Beladung mit Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff wird nach eingehenden Prüfungen mit den Kliniken abgestimmt, in denen das Expansions- und Anreicherungsverfahren der γδ-CAR-T-Zellen durchgeführt wird.
Ein internationales Netzwerk dedizierter allogener Lieferketten in Europa, den USA und Asien, das kryogene Einrichtungen umfasst, wird die Lagerung der γδ-CAR-T-Zellen ermöglichen, die nach ihrer exponentiellen Vervielfältigung für einen Zeitraum von bis zu zwei bis drei Wochen für Therapien eingesetzt werden können.
Die erfindungsgemäße Beladung mit den Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff stellt eine vorteilhafte Erweiterung der Vielzahl von sich abzeichnenden γδ-CAR-T-Zelltherapien dar. Bei den vorliegenden Ausführungsbeispielen wird zum Beispiel die einzigartige Krebserkennungsfähigkeit von γδ-CAR-T-Zellen genutzt, die darauf abgestimmt werden können, dass nur bestimmte Krebszellen angegriffen werden. Mit Unterstützung von Zytokinen (zum Beispiel IL-2 oder IL-12) werden die Krebszellen dann gezielt angegriffen, sodass durch Zellen, die durch das beschriebene Herstellungsverfahren hergestellt werden, die Nebenwirkungen, die durch einen Angriff auf gesunde Zellen des Patienten bedingt sind, stark reduziert werden.
Patientenspezifisch genetisch veränderte Zellen in Form von bösartig-tumorösen Zellen im Patienten werden bei den vorliegenden Ausführungsbeispielen zunächst durch T-Zell-eigene zytotoxische Stoffe angegriffen und können dann durch Freisetzung der beladenen Nanopartikel bzw. des beladenen zytotoxischen Stoffs weiter angegriffen werden. Bei den Nanopartikeln kann es sich beispielsweise um Nanopartikel handeln, die zu einem späteren Zeitpunkt durch eine unterstützende Strahlentherapie aktiviert werden können.
Nanopartikeltechnologien haben einen erheblichen Einfluss auf die Entwicklung von therapeutischen und diagnostischen Wirkstoffen (Theranostik). An der Schnittstelle zwischen Behandlung und Diagnose ist das Interesse an darauf beruhenden klinisch wirksamen Formulierungen gewachsen. Die meisten dieser neuen Entwicklungen sehen Nanopartikel als Träger von Arzneimitteln oder Kontrastmitteln. Verschiedene Kontrastmittel wurden in klinischen Untersuchungen verwendet, um deren Wechselwirkungen mit der spezifischen Krankheit zu beobachten. Meistens werden hierbei optisch aktive kleine Moleküle, Metalle und Metalloxide verwendet sowie Ultraschallkontrastmittel und Radionuklide. Die Theranostik ist von großer Bedeutung für Wirkstoffe, die auf molekulare Biomarker einer Krankheit abzielen, und wird daher zur personalisierten Medizin für effiziente Behandlungen beitragen.
Der Schwerpunkt bei diesen Nanopartikeln liegt auf spezifischen Isotopen, die für die Krebsbehandlung relevant sind, wobei ¹⁰B, das in der Bor-Neutronen-Einfang-Therapie (BNCT) (Malouff et al. (Feb. 2021). „Boron Neutron Capture Therapy: A Review of Clinical Applications“) verwendet wird, das wichtigste Beispiel für die hier beschriebenen Nanopartikel ist, wobei gleichzeitig, auch andere Nanopartikel und/oder ein zytotoxischer Stoff zum Zweck einer Überwachung und Kontrolle der Dichte und Verteilung der erfolgten γδ-CAR-T-Zellen-Beladung zu einem gewünschten Zeitpunkt, auch vor einer Bestrahlung, beispielsweise mit einer Neutronenstrahlung, separat oder zusammen, beladen werden können.
Die Nanopartikel können alle Nanopartikel sein, die derzeit relevant in der Nuklearmedizin sind. Zur Zeit wird, wie bereits erwähnt, allen voran ¹⁰B für die BNCT verwendet. Gadolinium ¹⁵⁷Gd ist für eine ähnliche Prozedur sehr interessant, hier GdNCT in Anlehnung an BNCT genannt, da dieses Isotop in der Natur den höchsten Neutronen-Wirkradius hat, so dass eine viel geringere Bestrahlung im Rahmen einer GdNCT benötigt wird und somit auch sehr empfindliche Regionen des Körpers behandelt werden können. Beide Isotope sind von Natur aus nicht radioaktiv, sondern werden nur dann zum Zerfall angeregt, wenn sie durch eine externe Neutronenquelle, zum Beispiel durch einen Beschleuniger oder einen Kernreaktor, aktiviert werden. Der maximale Wirkungsquerschnitt zum Auslösen der notwendigen Zerfälle liegt im epithermischen bis thermischen Energiebereich der Neutronen, entsprechend einer kinetischen Energie von etwa 0,025 eV.
Die BNCT nutzt die Spaltreaktion (Fission), die auftritt, wenn nicht-radioaktives ¹⁰B mit thermischen oder epithermischen Neutronen n_th bestrahlt wird. Das Gewebe des Körpers ist transparent für solche Neutronen, so dass diese das Gewebe ungehindert durchdringen können. Die epithermischen Neutronen verlieren jedoch geringfügig an Energie, wenn sie Gewebe durchdringen, sodass sie zu thermischen Neutronen werden - sie werden „thermalisiert“. ${}^{10}B + n_{th} \to {}^{4}H e + {}^{7}L i + 2,8 MeV$
Gemäß der Formel (1) werden ein energiereiches α-Teilchen und ein ⁷Li-lon generiert, wobei beide eine durch den Q-Wert der Reaktion bestimmte kinetische Energie durch den linearen Energietransfer (LET) beim Durchgang durch die Zelle verlieren. ⁷Li sowie das leichtere ⁴He erreichen bei der Fission eine maximale Flugreichweite von ~ 4 µm für ⁷Li und ~ 9 µm für ⁴He. Da diese Längen mit dem Durchmesser einer menschlichen Zelle übereinstimmen, ist die Letalität der Fangreaktion nur auf Zellen in der unmittelbaren Nähe der Bornanopartikel beschränkt. Der Erfolg von BNCT hängt also von der selektiven Abgabe ausreichend hoher Mengen an ¹⁰B an den Tumor selbst ab, wobei nur geringe Mengen im umgebenden gesunden Gewebe lokalisiert werden. Dies ist eines der Kernziele einer Behandlung mit den genetisch veränderten und beladenen immunokompetenten Zellen der vorliegenden Erfindung.
Im besten Fall kann eine nur drei- bis vierfache Erhöhung der Bor-Beladung einer patientenspezifisch genetisch veränderten Zelle, insbesondere einer Krebszelle, im Vergleich zu den benachbarten gesunden umgebenden Zellen erreicht werden, was erfindungsgemäß um vier bis sechs Größenordnungen bei gleichzeitiger Reduktion von Nebeneffekten verbessert wird. Die Beschränkung der bisherigen Methoden ist nachteilig, da normales Gewebe den Fluss langsamer Neutronen aufgrund der relativ geringen nuklearen Einfangreaktionen, welche bei Wasserstoff und Stickstoff auftreten, toleriert. Im Vergleich hierzu sind die mit thermischer und epithermischer Neutronenbestrahlung verbundenen unerwünschten Strahlendosen, denen gesundes Gewebe ausgesetzt ist, durch die erfindungsgemäß beladenen genetisch veränderten immunokompetenten Zellen in Verbindung mit der BNCT minimal. Es genügt bereits eine einzige Fission eines ¹⁰B-Isotops, um eine patientenspezifisch genetisch veränderte, insbesondere eine tumorös-bösartige, Zelle zu zerstören.
Das Isotop ¹⁰B macht etwa 20% des preisgünstigen ^natB aus. ^natB-Nanopartikel enthalten zu einem großen Anteil ¹¹B, welches ebenfalls stabil ist und gleichsam für eine Strahlentherapie eingesetzt werden kann. ¹¹B-Nanopartikel weisen einen großen Wirkradius für Protonenstrahlung mit einer Energie von ca. 600 keV auf, d.h. hiermit beladene immunokompetente Zellen in Form von γδ-CAR-T-Zellen können auch für eine Protonen-Strahlentherapie verwendet werden.
Zu den oben genannten nicht-radioaktiven Isotopen können andere Radioisotope und/oder Isomere beispielsweise für eine Krebstheranostik in Betracht gezogen werden, z.B. ^99mTc, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸F und ²¹¹At sowie alle anderen Isotope und/oder Isomere von derzeitiger medizinischer Relevanz für Krebs oder andere Behandlungen, die gegen patientenspezifisch genetisch veränderte Zellen gerichtet sind, die ein zumindest potentiell krankmachendes Potential aufweisen. Generell sind diese entweder häufig verwendete radiologische Isotope oder solche, die zur Zeit in fortgeschrittenen Stadien klinischer Studien verwendet werden, wo sie eine Behandlung einer Vielzahl von bösartigen Erkrankungen versprechen.
Für die im vorherigen Absatz beschriebenen Isotope unterscheidet sich die radioaktive Aktivität als Funktion der Zeit A(t), worauf hier für die beschriebene biologische Aktivierung der γδ-CAR-T-Zellen Bezug genommen wird.
Die Aktivität A(t) beschreibt den Zerfall einer radioaktiven Probe pro Sekunde und ist definiert durch $A (t) = λ \times N (t)$
wobei N(t) = N₀ × exp(-λ × t) die Anzahl der Isotope in der Probe darstellt, λ die Zerfallskonstante für ein bestimmtes Isotop und N₀ die Menge an Isotopen zu einer willkürlich gewählten Referenzzeit t₀ ist.
Mediziner können den Zeitrahmen und die Menge der Nanopartikel der oben genannten Isotope mit vergleichsweise hoher Präzision errechnen. Im Gegensatz zu A(t) folgt die biologische Aktivierung nicht einer so einfachen Exponentialregel. Stattdessen ist sie abhängig von einer Vielzahl kontrollierbarer, externer Faktoren, wie beispielsweise Zellwachstum, Überlebensrate und Kryokonservierung für eine spätere „Wiederbelebung“.
Die zur Aktivierung einer therapeutischen Menge radioaktiver Zerfälle erforderlichen Dosisraten werden auf der Grundlage kontinuierlicher oder gepulster Quellen berechnet, die zur Zeit an speziell erweiterten Kernreaktorstandorten, hochfrequenzbetriebenen (RF) Beschleunigern oder Tandembeschleunigern verfügbar sind. Weiterhin stehen bald für den klinischen Einsatz moderne laserbetriebene Beschleuniger zur Verfügung, welche vergleichsweise hohe temporale Strahldosen liefern werden und somit die Gesamtzeit für die Patientenbestrahlung minimieren können.
Die Aktivitäten A(t) der theranostischen Probe werden für jede Behandlung entsprechend angepasst, um die optimale Dosisrate zu ermitteln: $D = d E / d m = (1 / ρ) d E / d V$
wobei dE die Energie beschreibt, die innerhalb eines Massesegments dm im Körper des Patienten mit einer spezifischen Dichte von ρ freigesetzt wird, die sich über ein Volumenelement von dV erstreckt.
Für genaue Berechnungen müssten die heterogenen Strukturen des Gewebes in Inhomogenitätsvolumina Di gruppiert werden, bevor sie für die Ableitung eines Behandlungsplans zu D aufsummiert werden. Die Dosisrate D wird in Mikrogray pro Stunde [µGy/h] angegeben und in die äquivalente Dosisleistung HT, angegeben in Sievert pro Stunde [Sv/h], für eine Behandlung umgerechnet.
Verfahrensschritte im Detail
Schritt 1 - Beladung von genetisch veränderten immunokompetenten Zellen in Form von γδ-CAR-T-Zellen mit Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff durch Sonoporation
Im Folgenden wird nun Bezug auf die Figuren und die in diesen wiedergegebenen Bezugszeichen genommen, wobei in den Figuren lediglich konkrete Ausführungsformen der Erfindung beschrieben werden. Bezugszeichen werden nachfolgend in der Regel nur jeweils ein einziges Mal vergeben. Dem Fachmann erschließt sich jedoch ohne Probleme, dass dieselben Strukturen in den Figuren mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet sind, sofern nicht explizit ein anderes Bezugszeichen vergeben wurde.
Genetisch veränderte immunokompetente Zellen in Form von kultivierten γδ-CAR-T-Zellen 1, z.B. vγ9vδ2-T-Zellen, die in ihre Zellmembran eingelagert einen durch genetische Transfektion in diese eingebrachten co-stimulierenden chimären Antigen-Rezeptor (CAR) 2 sowie einen nativen γδ-T-Zell-Rezeptor (γδ-TCR) 3 aufweisen, können die endogenen Isopentenylpyrophosphat (IPP)-Antigene auf der Zelloberfläche von Krebszellen erkennen. Sie werden in einem frühen Stadium ihres Expansionsprozesses in geeigneten Chargengrößen entnommen und auf eine Petrischale gegeben. In ihrer Zellmembran 5 enthalten sie Zytokine 4 (vgl. 1). Eine typische Menge von Zellen in einem frühen Stadium des Expansionsprozesses liegt im Bereich von 10⁶ bis 10⁸. Die Schale enthält einen Probenhalter von Opticell™ oder eine ähnliche Anordnung unter Verwendung einer Petrischale.
Die Nanopartikel und/oder der zytotoxische Stoff können als eine Schicht aus freien Atomen bzw. Molekülen dazugegeben werden, wobei sie auch, wie der 2 zu entnehmen ist, zuvor in sogenannten Mikrobläschen integriert vorliegen können. Falls sie als eine Schicht aus freien Nanopartikeln bzw. Molekülen vorliegen, kann anschließend eine dosierte Schicht von leeren Mikrobläschen hinzugegeben werden. Die Zellen befinden sich hierbei in einer Trägerflüssigkeit und durch das Hinzugeben der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffs wird eine Zelllösung gebildet.
Die Nanopartikel bzw. der zytotoxische Stoff können also wie erwähnt frei vorliegen. Sie können aber auch in einem Innenraum der Mikrobläschen 6 vorzugsweise chemisch aneinander oder beispielsweise in Form eines Chelat-Komplexes gebunden 7, in Mikrobläschenmembranen insbesondere mechanisch eingelagert 9 oder kovalent von außen an die Mikrobläschen gebunden 10 vorliegen. Ein vorzugsweiser Durchmesser eines Mikrobläschens liegt bei ca. 2 µm (kleiner 3 µm). Vorzugsweise werden die Nanopartikel und/oder der zytotoxische Stoff sowie die immunokompetenten Zellen schichtweise zu der Petrischale hinzugegeben. Es ist ferner von Vorteil, eine Durchmessertoleranz der Mikrobläschen durch entsprechende Vorfiltrierung gering zu halten, d.h. dass alle Mikrobläschen im Wesentlichen dieselbe Größe aufweisen.
Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel wird, sobald die Ladeproben verteilt sind, die Petrischale umgedreht, was dazu führt, dass sich die γδ-CAR-T-Zellen oben in der Anordnung befinden. Die aufeinanderliegenden Schichten dieses Präparats werden sodann mit Hilfe von Ultraschalldruck verdichtet, so dass die Abstände der Bestandteile der Schichten auf eine vorher festgelegte und vergleichsweise kleine mittlere Distanz gebracht werden.
Der vom Ultraschallwandler aufgebrachte Druck P(t) treibt die Nanopartikel, den zytotoxischen Stoff und/oder die beladenen Mikrobläschen in die Nähe der γδ-CAR-T-Zellen bis hin zu einem optimalen Abstand zu den γδ-CAR-T-Zellen, damit die Mikrobläschen ihre Ladung an die γδ-CAR-T-Zellen abgeben können.
P(t) und die Zeitdauer t_total der Einwirkung des Ultraschalldrucks auf die Zelllösung basieren teilweise auf empirischen Daten, die aus Laborarbeiten unter Berücksichtigung von Überlegungen zur radioaktiven und biologischen Aktivierung stammen. Die genauen Verfahrenseinstellungen sind spezifisch für die verwendeten Mikrobläschen und die spezialisierten γδ-CAR-T-Zellen, die in einer Behandlung verwendet werden sollen.
Der Zerfall eines Mikrobläschens wird durch die Rayleigh-Plesset-Formel bestimmt, die die zeitliche Änderung des Blasenradius R(t) beschreibt: $R (t) \frac{d^{2} R (t)}{d t^{2}} + \frac{3}{2} {(\frac{d R (t)}{d t})}^{2} + \frac{4 ν_{L}}{R (t)} \frac{d R (t)}{d t} + \frac{2 γ}{ρ_{L} R (t)} + \frac{Δ P (t)}{ρ_{L}} = 0$
wobei ρ_L die Dichte der umgebenden Flüssigkeit darstellt, v_L die kinematische Viskosität der umgebenden Flüssigkeit, γ die Oberflächenspannung der Mikrobläschen-Flüssigkeits-Grenzfläche, ΔP(t) = P_∞(t) - P_B(t) die Druckdifferenz zwischen dem gleichmäßigen Druck innerhalb der Blase P_B(t) und P_∞(t) den äußeren Druck „unendlich“ weit von der Blase entfernt angibt. Die Anwendung der Formel (4) ermöglicht somit die Optimierung des Treibersignals des Wandlers in Bezug auf den Zeitpunkt des Zerfalls eines Mikrobläschens, wodurch die freien oder die in Mikrobläschen eingebundenen Nanopartikel bzw. der zytotoxische Stoff in die T-Zellen gelangen.
Um eine zumindest partielle Permeabilisierung der Zellmembranen der vorliegend beispielhaft verwendeten γδ-CAR-T-Zellen schonend und kontrolliert durchführen zu können, ist es beim vorliegenden Ausführungsbeispiel günstig, wenn folgende Schritte durchgeführt werden:

Alle Komponenten, die am Sonoporationsprozess beteiligt sind, können einer präzisen Toleranzkontrolle der Abmessungen unterzogen werden, denn diese beeinflussen empfindlich die Eigenmoden des Set-Ups. Insbesondere betrifft diese Anforderung den Durchmesser der verwendeten Mikrobläschen, sodass diese vor der Anwendung durch eine Mikroporen-Filterfolie auf eine ±10%-Durchmesser-Toleranz gebracht werden.

Es versteht sich für den Fachmann, dass die Geräteeinstellungen präzise eingehalten und dokumentiert werden und zur Kontrolle des Wiederschließens der Zellenmembranen vorzugsweise elektrische oder elektromagnetische Felder beispielsweise in einer geschlossenen Feedbackschleife zur Anwendung kommen. P(t) in der Formel (4) ist periodischer Natur, P(t') = P(t + t_period), und auch wenn eine sinusförmige Ultraschall-Wellenform gute Ergebnisse bringt, ist eine optimierte Puls-Profilform mit konstanter Periode günstiger für eine optimale Sonoporation im Sinne der gesetzten Ziele. Es wird von industriell hergestellten und am Markt verfügbaren Standard-Mikrobläschen ausgegangen.
P(t) wird optimiert in Bezug auf die Amplitude P₀(t), die Periode t_period und die Gesamtdauer des Sonoporationsprozesses (t_insgesamt). Für jede spezifische Sorte von γδ-CAR-T-Zellen wurden zelluläre Reaktionen wie Zellmembranpermeabilität und Zerlegung des Zytoskeletts hinsichtlich der Abhängigkeit von den Kernparametern wie dem akustischen Antriebsdruck P(t) und den Abständen zwischen den abgebenden Mikrobläschen untersucht. Bei einem gegebenen Blasendurchmesser von ~ 2 µm und einer Zelle mit Abmessungen von wenigen µm ergibt ein zweidimensionales Simulationsmodell nach Formel (4) erforderliche Druckamplituden von P₀(t) ~ 400 hPa. Eine typische Zeit für die Endozytose des Inhalts der Mikrobläschen in die immunokompetenten Zellen liegt unter 1 µs. Ein Ziel der Simulationen und des Designs besteht darin, die sorgsam hergestellten γδ-CAR-T-Zellen vor unnötigem Stress zu schützen und so die Wirksamkeit des Herstellungsverfahrens zu optimieren.
Der Ablauf des Sonoporationsprozesses, wie der 3 entnommen werden kann, nach dem Einschalten des Ultraschallwandlers wird in vier Phasen t_{1, 2, 3, 4} unterteilt. Nach dem Befüllen eines Probenhalters, vorliegend eines Opticell™-Probenhalters 11, mit der entsprechenden Anzahl von vorliegend verwendeten γδ-CAR-T-Zellen als genetisch veränderte immunokompetente Zellen wird die Anordnung umgedreht, sodass die freien Nanopartikel und/oder der zytotoxische Stoff aus den beladenen Mikrobläschen 12 in Richtung der γδ-CAR-T-Zellen diffundieren können. In unmittelbarer Nähe der Mikrobläschen gegenüber den γδ-CAR-T-Zellen führt die Anwendung von Ultraschalldruck über die Ultraschallwandler zu einer Einbuchtung 13 mit der Tiefe d_t der Zellmembranen der γδ-CAR-T-Zellen. Die Größe von d_t hängt von der Entfernung d_s zwischen den Mikrobläschen und den γδ-CAR-T-Zellen ab, vgl. das Bezugszeichen 14. Beide Parameter d_t und d_s sind Funktionen des angelegten Drucks P(t), siehe das Bezugszeichen 15, und damit implizit der Zeit t, vgl. das Bezugszeichen 16.
Die Nanopartikel und/oder der zytotoxische Stoff, siehe das Bezugszeichen 17 in der 3b, dringen in die γδ-CAR-T-Zelle ein, sobald die Sonoporation zur Erhöhung der Permeabilität der Zellmembranen der γδ-CAR-T-Zellen geführt hat, vgl. das Bezugszeichen 18. Danach zerfallen die Mikrobläschen 12, vgl. das Bezugszeichen 19, zum Zeitpunkt t₂, typischerweise in weniger als 1,0 µs nach dem Beginn der Einwirkung von P(t). Zeitlich parallel zum Zerfall der Mikrobläschen wird die Ladung, die die Mikrobläschen 12 tragen, in die immunokompetenten Zellen in Form der γδ-CAR-T-Zellen übertragen, beispielsweise durch Endozytose, freie Diffusion und/oder osmotischen Druck in die γδ-CAR-T-Zellen hinein.
Damit ist der Beladungsvorgang für die γδ-CAR-T-Zellen abgeschlossen. Nach der Beladung der γδ-CAR-T-Zellen befinden sich die Nanopartikel und/oder der zytotoxische Stoff im Zelllumen der γδ-CAR-T-Zellen, vgl. hierfür das Bezugszeichen 20 in der 3c, und die Zellmembranen der γδ-CAR-T-Zellen schließen sich wieder, vgl. hierfür das Bezugszeichen 21, nachdem der Druck zum Zeitpunkt t₃ verringert wurde. Der Zerfall der Mikrobläschen ist zu diesem Zeitpunkt in einer Weise fortgeschritten, dass diese in kleinere und nicht mehr brauchbare Mikrobläschen zerfallen sind, vgl. hierfür das Bezugszeichen 22.
In der 3d ist der Zustand der γδ-CAR-T-Zellen am Ende des Beladungsvorgangs zum Zeitpunkt t₄ veranschaulicht, zu welchem sich die Zellmembranen wieder geschlossen haben, vgl. hierfür das Bezugszeichen 23, und die Mikrobläschen vollständig zerfallen sind, worauf mit dem Bezugszeichen 24 verwiesen ist.
Reste von Mikrobläschen werden mit molekularbiologischen Standardverfahren gefiltert. Die Beladung hängt von der für die Behandlung vorab festgelegten radiologischen und biologischen Aktivität der patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen im Patienten ab. Es wird davon ausgegangen, dass der Beladungsvorgang in einem früheren Stadium des Zellkulturwachstums stattfindet. Daher sollte die vorgesehene Nutzlast pro Zelle die biologisch akzeptable, d.h. die nicht-letale, Schwelle nicht überschreiten. Für die Bor-Beladung würde das einer Nutzlast von etwa 0,13 Picogramm [pg] pro Zelle entsprechen. Dies entspricht 3×10¹⁰ Atomen von Bor, beispielsweise ¹¹Bor, ¹⁰Bor oder ^natBor, pro Zelle. Bei Radioisotopen sollte die Dosisbelastung für die behandelnde Person berücksichtigt werden. Die patientenspezifische Belastung wird außerdem durch Faktoren wie die Proliferation der γδ-CAR-T-Zellen im Körper eines Patienten und einer Zeitspanne von zwei bis vier Tagen bestimmt, in der diese sich üblicherweise um die patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen, beispielsweise Tumorzellen, herum ansammeln.
Für eine einfachere Beschreibung werden nachfolgend die mit den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff beladenen und vorliegend verwendeten γδ-CAR-T-Zellen als „T-Ninjas“ bezeichnet. Wie in der 4 veranschaulicht ist, werden für eine genauere Differenzierung die T-Ninjas außerdem in drei Untergruppen nach der Beschaffenheit der beladenen Nanopartikel und/oder des beladenen zytotoxischen Stoffs unterteilt:

a) T-Ninja-R oder γδ-CAR-T-R, vgl. das Bezugszeichen 28, wenn die T-Ninjas mit einem zytotoxischen Stoff, vorliegend Radioisotopen 29 wie z.B. ^99mTc oder ²¹¹At, beladen sind, mittels welchen eine sofortige radiologisch relevante Therapie als erste Stufe einer kombinierten Therapie gegen patientenspezifisch veränderte Zellen, beispielsweise einer kombinierten Krebstherapie, ohne einen Aktivatorstrahl, beispielsweise einem Neutronenstrahl oder einem Protonenstrahl, durchgeführt werden kann;
b) T-Ninja-S oder γδ-CAR-T-S, vgl. das Bezugszeichen 26, wenn die T-Ninjas mit Nanopartikeln in Form stabiler Isotope 27 wie z.B. ¹⁰B oder ¹⁵⁷Gd, beladen sind, mittels welchen eine radiologisch relevante Kernreaktion zu einem gewünschten Zeitpunkt als zweite Stufe einer kombinierten Therapie gegen patientenspezifisch genetisch veränderte Zellen, beispielsweise einer kombinierten Krebstherapie, die mit einem Aktivatorstrahl, vorzugsweise thermische oder epithermische Neutronen, durchgeführt werden kann;
c) T-Ninja-SR oder γδ-CAR-T-SR, die nicht eigens veranschaulicht sind, als Kombination der T-Ninja-R- und der T-Ninja-S-Zellen, wobei die Kombination des zytotoxischen Stoffs vorliegend in Form von Radioisotopen und Nanopartikeln vorliegend in Form von stabilen Isotopen besonders effizient und flexibel eingesetzt werden kann.

Außerdem können alle beschriebenen T-Ninjas gleichzeitig auch mit zusätzlichen Stoffen beladen werden, die in bestimmten Phasen der Therapie eine bessere Überwachbarkeit und Kontrolle des Herstellungsverfahrens und darüber hinaus der Behandlung von Patienten ermöglichen.
Ultraschallstöße mit einer Gesamtdauer von 20 s bis 40 s werden vorliegend lediglich beispielsweise in mehreren Zyklen angewandt, um die erreichbare Nutzlast der γδ-CAR-T-Zellen unter ständiger Beobachtung abschätzen und die tatsächlichen Eigenmoden des Set-Ups ermitteln zu können. Die Mikrobläschen selbst befinden sich z.B. in einer Phosphatpufferlösung. Eine Gesamtmenge von sechs Millionen Mikrobläschen pro ml gilt als ideale Konzentration für den Sonoporationsprozess.
Nach einer Gesamtzahl von 100000 Ultraschallperioden kann vorliegend eine Beladungseffizienz der Mikrobläschen von mindestens 10% angenommen werden, wenn das Schalldruckprofil, die Dauer der Schalldruckperioden und die Schallwandlergeometrie optimiert wurden.
Wie der 5 zu entnehmen ist, umfasst eine bevorzugte Vorrichtung zum Beladen der γδ-CAR-T-Zellen eine Sonoporationsladevorrichtung, mit der vorzugsweise eine simultane Bildüberwachung ermöglicht wird, die für das Laden der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffs verwendet wird. Dieses in Fachkreisen auch als solches bezeichnete „Loading-Apparatus-Assembly“ (LAA) umfasst eine geschlossene Petrischale 30, Befestigungselemente 31, ein Kopplungsgel 32 und einen Ultraschallwandler, der nicht eigens mit einem Bezugszeichen versehen ist, der eine Leistung von >200 W bei Frequenzen von bis zu mehreren MHz, vgl. das Bezugszeichen 33, mit einem Brennfleck von > 18 mm bereitstellt. Der Ultraschallwandler wird von einem Wellenformgenerator 36 aus angesteuert, der durch einen Breitbandverstärker 37 der Klasse A verstärkt wird, um eine lineare Leistungsabgabe im Frequenzbereich von 10 kHz bis 12 MHz für beliebige Wellenformen zu ermöglichen. Eine typische Einstellung umfasst einen Verlauf mit einer konstanten Periode von P(t) mit einem Durchschnittswert von <P_∞(t) und >400 kPa bei einer Frequenz von > 1 MHz. Mittels eines Mikroskopaufbaus mit einer monochromatischen Lichtquelle 34 und einer CCD-Kamera 35 kann der Sonoporationsprozess überwacht werden.
Es versteht sich für den Fachmann, dass es für die Beladung der immunokompetenten Zellen im Wesentlichen darauf ankommt, die Permeabilität der Zellmembranen zu erhöhen, sodass die ggf. mit den Mikrobläschen gekoppelten Nanopartikel bzw. der mit den Mikrobläschen gekoppelte zytotoxische Stoff in das Zelllumen der immunokompetenten Zellen gelangen kann. Daher kann statt einer Sonoporation auch eine Elektroporation oder eine Laserporation durchgeführt werden, wobei die Sonoporation vergleichsweise vorteilhaft ist, wie oben eingehend erläutert wurde.
Schritt 2 - Verteilung der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffs auf Tochterzellen von beladenen T-Ninja-Zellen nach der Sonoporation
Wie der 6 zu entnehmen ist, teilt sich ausgehend von der zuvor vorbereiteten T-Ninja-Zellkultur, die in dem LAA unter optimalen Wachstumskonditionen angelegt wurde, die Nutzlast einer jeden T-Nina-Zelle der Zellkultur während der Proliferation derselben zu gleichen Teilen von der ersten Generation (n_g = 1) 38 auf die jeweils nachfolgenden Generationen 39, 40 auf. Bei jeder mitotischen Zellteilung wird die individuelle Zellnutzlast der Tochterzellen im Vergleich zur vorherigen Generation um die Hälfte reduziert. Die Proliferation der Zellen kann über einen Zeitraum hinweg von bis zu drei Wochen stattfinden. Durch die ständige Beobachtung dieser Proliferationsphase wird sichergestellt, dass ein Abbruch der Proliferationsphase erfolgt, sobald eine Stagnation der Zellteilungen festgestellt wurde. $P L (n_{g}) = {(\frac{1}{2} P L (1))}^{n_{g}}$
Die klinischen Erfordernisse und die ständige Beobachtung geben Aufschluss über den optimalen Zeitpunkt und den Umfang der Zellproliferation und bestimmen die endgültige durchschnittliche Nutzlast der entwickelten T-Ninja-Zellen auf der Grundlage der Formel (5). Bei Radioisotopen ist es von Vorteil, wenn die Beladung der T-Ninja-Zellen unmittelbar vor der Infusion der T-Ninja-Zellen in den Körper eines Patienten durchgeführt wird, da die T-Ninja-Zellen aufgrund der ionisierenden Teilchenstrahlung der Radioisotope nicht lange überleben.
Schritt 3 - Messung der Nutzlast von Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff in mittels Sonoporation und Mikrobläschen beladenen T-Ninja-Zellen
Wie der 7 zu entnehmen ist, ist beim vorliegenden Ausführungsbeispiel nach jedem Schritt der T-Ninja-Entwicklung eine Überwachung und Kontrolle der nachfolgend als Dosisleistung D bezeichneten Nutzlast vorgesehen.
Vorliegend wird hierfür ein aktivierender Elektronen-, Neutronen-, Protonen oder γ-Strahl 41 für ein stabiles Isotop wie ¹⁰B oder ¹⁵⁷Gd verwendet, mit welchen T-Ninja-S-Zellen 42 der Zellkultur beladen sind, vorzugsweise wird aber ein thermischer oder ein epithermischer Neutronenstrahl verwendet. Unter dem Einfluss des Aktivierungsstrahles wird in den T-Ninja-S-Zellen eine Fissionsreaktion gemäß Formel (1) angestoßen, welche mit einem Detektor 43 überwacht werden kann. T-Ninja-R-Zellen, die vorliegend nicht veranschaulicht sind, die mit einem zytotoxischen Stoff in Form eines Radioisotops wie z.B. ¹⁸F beladen sind, benötigen keinen derartigen Aktivierungsstrahl, da von diesen bereits eine ionisierende Teilchenstrahlung ausgeht. Sie können aber auf ähnliche Weise mit den gleichen Detektoren erfasst werden. Der Detektor 43 kann durch einen hochreinen Germanium-Detektor (HPGe) oder einen Lanthan-Bromid-Detektor (LaBr₃) ausgeführt sein. In Bezug auf die räumliche und zeitliche Auflösung bessere Detektoren, die sich derzeit in der Entwicklung befinden, werden allerdings bevorzugt in diesem Verfahren eingesetzt.
Darüber hinaus können auch geeignete Messungen der Dichte und Verteilung der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffes in der Zellkultur sowie eine Auswertung und Speicherung des relativen Fortschritts vorgenommen werden.
Schritt 4 - Ansatz, Erkennung und Verabreichung von Nanopartikeln und/oder eines zytotoxischen Stoffes mittels mit diesen beladenen γδ-CAR-T-Zellen
Die Hauptakteure einer Therapie gegen patientenspezifisch genetisch veränderte Zellen, beispielsweise einen Tumor oder durch eine virale Infektion genetisch veränderte Zellen, sind, wie bereits erwähnt wurde, als T-Ninja-Zellen zusammengefasst. Nachfolgend wird sich auf die 8 bezogen werden.
T-Ninja-Zellen weisen aufgrund des TCR und des CAR eine besonders hohe Spezifität für entsprechende patientenspezifisch genetisch veränderte Zellen auf und „suchen“ die befallenen Körperzellen 46. Sie lagern sich an diese an, vgl. das Bezugszeichen 50, vermittelt durch die Spezifität der T-Ninjas beispielsweise für ein biologisches „Stresssignal“ 48 und ein Zielantigen 49.
Der Annäherungsprozess der T-Ninja-Zellen zu den patientenspezifisch veränderten Zellen kann in sechs Sequenzen 52 bis 57 unterteilt werden, wie der 9 zu entnehmen ist.
Die Sequenz 52 zeigt hierbei vorliegend die letzte Stufe des Erkennungsprozesses einer Krebszelle 46, wobei durch das Bezugszeichen 51 eine Richtung der T-Ninja-Bewegung anzeigt wird. Die Sequenz 53 zeigt eine anfängliche Andockphase der T-Ninja-Zellen, die durch die hohe Spezifität der T-Ninja-Zellen bezüglich der Krebszellen bedingt ist. Die Sequenz 54 zeigt eine Interaktion des CAR-T-Zell-Rezeptors und des γδ-T-Zell-Rezeptors (γδ TCR) mit den Zielantigenen der Krebszelle sowie eine Anregung von zwei unabhängigen Triggersignalen für eine Zytokin-Freisetzung der T-Ninja-Zellen 58, 59.
Die Kombination der beiden intrazellulären Signale, die von dem CAR-T- und dem γδ-T-Zell-Rezeptor aktiviert werden, „schalten“ die T-Ninja-Zellen in einen zytokin-unterstützten Angriffsmodus. Durch diese beiden Signale wird eine zelluläre Antwort der T-Ninja-Zellen induziert, die man auch als „Kiss-of-Death“ (Todeskuss) bezeichnet. Dies wird in den Sequenzen 55 und 56 dargestellt.
Die Sequenz 55 zeigt, wie die Zellmembran der Krebszelle durch die T-Ninja-Zelle geöffnet wird. Mit dem Bezugszeichen 56 wird auf den eigentlichen „Kiss-of-Death“ verwiesen, bei dem die T-Ninja-Zellen eigene, d.h. native, zytotoxische Substanzen sowie geladene Nanopartikel und/oder einen zytotoxischen Stoff wie oben beschrieben durch osmotischen Druck in die patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen einbringen.
Mit dem Bezugszeichen 57 wird auf einen Ablösungsvorgang der T-Ninja-Zellen verwiesen. Die T-Ninja-Zellen werden sodann ihren Weg 63 fortsetzen, um weitere patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen, wie vorliegend Krebszellen, desselben Typs zu finden. Die ungesunde Zelle verbleibt mit den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff in ihrem Zelllumen 64.
Schritt 5 - Induzieren einer Zerstörung der patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen: Infusion von Präparaten und/oder Auslösung mittels Teilchenströmen
Nachfolgend wird auf die 10 Bezug genommen. Eine patientenspezifisch genetisch veränderte Zelle, d.h. eine ungesunde Zelle 66 (UHC-Typ-B), wird bald nach Aufnahme von einem zytotoxischen Stoff in Form von Radioisotopen 29 aus T-Ninja-R-Zellen, auch ohne einen Stimulus durch den Aktivierungsstrahl, zerstört werden, vgl. das Bezugszeichen 70 und 10a. Hingegen benötigt eine solche Zelle, die Nanopartikel in Form von stabilen Isotopen 27 durch eine T-Ninja-S-Zelle erhalten hat, den Aktivierungsstrahl 67, um die Fission der Isotope 68 (z.B. ¹⁰B) und damit diesen Teil der Therapie zu beginnen und die patientenspezifisch genetisch veränderte Zelle 69, vgl. 10b, zu zerstören.
Ein erster Teil einer radiologischen Therapie erfolgt vorzugsweise mit Radioisotopen und ein zweiter Teil der Therapie beginnt erst nach dem Einschalten des Aktivierungsstrahls zu einem während der Therapie ermittelten Zeitpunkt, jedenfalls nach dem ersten Teil der Therapie und in Abhängigkeit vom erzielten Erfolg desselben. Die Nanopartikel können in getrennten T-Ninja-Kulturen, oder gemeinsam in einer einzigen, beladen werden, sodass anstelle von T-Ninja-R- und T-Ninja-S- T-Ninja-SR-Zellen verwendet werden.
Übersicht über ein Ausführungsbeispiel der Erfindung von der Anzucht immunokompetenter Zellen bis zur theranostischen Therapie gegen patientenspezifisch genetisch veränderte Zellen am Patienten
Ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen immunokompetenten Zellen sowie ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Anwendung in einer auf die Herstellung folgenden theranostischen Therapie gegen patientenspezifisch genetisch veränderte Zellen am betroffenen Patienten kann übersichtsweise wie folgt zusammengefasst werden:

a) aufgrund der Selektivität des Verfahrens wird damit begonnen, dass eine histologische und/oder histo-pathologische Untersuchung des betroffenen Gewebes des Patienten durchgeführt wird, um beispielsweise zu erfassen, um welchen konkreten Krebs es sich bei dem Patienten handelt;
b) vorzugsweise allogene γδ-T-Zellen in ausreichender Zahl und Qualität werden entsprechend den Ergebnissen von a), d.h. - um beim Beispiel zu bleiben - spezifisch für den jeweiligen Krebs des Patienten, mit einem CAR-Gen transfiziert, das unter anderem für eine für den jeweiligen Krebs Spezifität vermittelnde scFv-Antikörperdomäne codiert, wodurch patientenspezifische γδ-CAR-T-Zellen erhalten werden;
c) die so transfizierten patientenspezifischen γδ-CAR-T-Zellen werden einer Kultivierungsphase unterzogen, während sie kontinuierlich überwacht und kontrolliert werden, um den richtigen Zeitpunkt für den nächsten Schritt des Verfahrens auszuwählen;
d) die Nanopartikel und/oder der zytotoxische Stoff werden vorzugsweise schichtweise aufgetragen oder willkürlich mit den γδ-CAR-T-Zellen vermischt und mit einer Mikrobläschen-Lösung vermengt, um so eine Zelllösung zu erhalten, wobei die Nanopartikel und/oder der zytotoxische Stoff mit den Mikrobläschen gekoppelt sind;
e) Sonoporation der Zelllösung mit vorher festgelegten Ultraschallparametern und unter ständiger Beobachtung, mit oder ohne Feedback-Regelung des Porationsprozesses. Die Poration kann alternativ auch mittels Laserporation bewerkstelligt werden. Hierbei tritt eine zeitlich begrenzte Permeabilisierung der Zellmembranen der γδ-CAR-T-Zellen auf, die die Aufnahme der umliegenden Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffs ermöglicht;
f) zur besseren Kontrolle der partiellen Permeabilisierung der Zellmembranen der γδ-CAR-T-Zellen wird die Sonoporation in der Anwesenheit von stationären oder nicht stationären elektrischen oder elektromagnetischen Feldern durchgeführt, wobei sowohl die Sonoporation als auch die hier beschriebene Feld-Kontrolle mit oder ohne eine Feedback-Regelung erfolgen kann;
g) das so bearbeitete Gemisch wird einer weiteren Kultivierungsphase unterzogen, in der die Anzahl der beladenen γδ-CAR-T-Zellen üblicherweise um den Faktor 1000 bis 100000 wächst, wobei die Beladung einer γδ-CAR-T-Zelle jeweils gleichmäßig nach Zellteilung auf die resultierenden Tochterzellen verteilt wird,
h) der Schritt g) erfolgt unter ständiger Beobachtung, wobei beispielsweise, falls als zytotoxischer Stoff Radioisotope verwendet werden, die einen schnellen β-Zerfall aufweisen, wie z.B. ¹⁸F, ^99mTc oder ¹⁷⁷Lu, die Dichte und Verteilung der Beladung in der Zelllösung ohne Aktivierung mittels eines n_th-Strahls ermittelt werden kann;
i) die vorbereitete Zelllösung wird mit einer vorzugsweise isotonischen Infusionslösung vermischt und als Infusion dem vorgesehenen Patienten zugeführt;
j) für gewöhnlich ist die Infusionslösung innerhalb von ca. 30 min im Körper verteilt, sodass nach relativ kurzer Zeit nach der Infusion mit Hilfe der beladenen Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffs die Dichte und Verteilung der beladenen γδ-CAR-T-Zellen im Körper räumlich ermittelt werden können, sodass z.B. die angegriffenen Zielgebiete in regelmäßigen Zeitabständen oder kontinuierlich identifiziert bzw. überwacht werden können;
k) es ist anzumerken, dass die γδ-CAR-T-Zellen unabhängig von ihrer eingebrachten Beladung nach Kontakt mit den patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen eigene, d.h. native, zytotoxische Substanzen in die angegriffenen Zellen liefern;
l) eine angepasst langsame Vorgehensweise ist empfehlenswert, um eine Überlastung der Ausscheidewege, beispielsweise durch Nierenversagen, durch die zerstörten Zellen zu verhindern. Der Körper nutzt die Zeit bis zum nächsten Schritt der Therapie, um die nicht in die γδ-CAR-T-Zellen aufgenommenen aber in der Infusion noch befindlichen Nanopartikel und/oder den zytotoxischen Stoff auf natürlichem Weg abzubauen bzw. auszuscheiden;
m) basierend auf der regelmäßigen Überwachung, können der richtige Zeitpunkt für die erste Boron-Neutron-Capture-Therapy (BNCT) ermittelt und eine oder in bestimmten zeitlichen Abständen mehrere Therapien so durchgeführt werden, dass je nach Lokalisierung und Art der patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen, insbesondere des Tumors, die BNCT auf einen räumlich begrenzten Bereich des Patientenkörpers oder eventuell, wie vorzugsweise im Falle von hämatologischen Krebserkrankungen, auf den ganzen Patientenkörper erfolgt, wobei die BNCT-Wiederholung auch durch die eventuell im Körper metastasierenden Tumorzellen nach einer ersten Behandlung begründet wird. Hierbei wird die Neutronenenergie so klein gewählt, dass das betroffene Gewebe von thermischen Neutronen mit Energien von beispielsweise 0,025 eV erreicht wird, womit die Risiken von Strahlenschädigungen des Gewebes minimiert werden;
n) während der Durchführung der BNCT können die entstehenden Fissionsprodukte dazu genutzt werden, um die BNCT in Echtzeit zu lokalisieren und zu überwachen;
o) die Notwendigkeit von etwaigen Wiederholungen der Prozedur mit oder ohne veränderte Parameter wird der behandelnde Arzt bzw. die behandelnde Klinik festlegen, wobei die lückenlose Überwachung eine kontinuierliche Erfolgskontrolle sicherstellt.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 9855298 B2 [0010]
WO 2022241151 A2 [0013]
WO 2022238962 A1 [0013]
WO 2022241036 A1 [0013]
WO 2022147014 A2 [0013]
WO 2020109953 A1 [0013]
WO 2019181018 A1 [0013]
WO 9817342 A2 [0013]
CN 115215851 A [0013]
CN 115232129 A [0013]
FR 3120630 A1 [0013]
CN 112675442 A [0013]
JP 2016159107 A [0013]
WO 2016005752 A1 [0037]

Claims

Verfahren zur Herstellung von genetisch transfizierten und mit Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff beladenen immunokompetenten Zellen zur theranostischen Behandlung von patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen, insbesondere von viral genetisch veränderten Zellen oder eines patientenspezifischen malignen Tumors, in einem befallenen Patienten, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen von immunokompetenten Zellen, die mit zumindest einem Gen transfiziert wurden, dessen Genprodukt eine Spezifität für die immunokompetenten Zellen gegenüber den patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen vermittelt; b) Beladen der immunokompetenten Zellen mit den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff, umfassend die Schritte: - Aufbringen der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffs auf die immunokompetenten Zellen oder Vermischen der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffs mit den immunokompetenten Zellen in einer Trägerflüssigkeit zu einer Zelllösung; - Porieren, insbesondere durch Sonoporation, Elektroporation oder Laserporation, der immunokompetenten Zellen, um die Permeabilität der Zellmembranen der immunokompetenten Zellen für die Nanopartikel und/oder den zytotoxischen Stoff zu erhöhen und hierdurch die immunokompetenten Zellen mit den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff zu beladen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die immunokompetenten Zellen T-Zellen sind, insbesondere allogene γδ-T-Zellen, vorzugsweise γδ-CAR-T-Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die immunokompetenten Zellen neben dem zumindest einen Gen für die Spezifität der immunokompetenten Zellen gegenüber den patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen mit einem Satz von Genen transfiziert wurden, der für zumindest einen Teil eines chimären Antigen-Rezeptors (CAR) codiert, wobei der CAR zumindest eine extrazelluläre spezifitätsvermittelnde scFv-Antikörperdomäne, eine intrazelluläre T-Zell-Aktivierungsdomäne und eine die scFv-Antikörperdomäne und die T-Zell-Aktvierungsdomäne miteinander verbindende und das Protein in der Zellmembran verankernde Transmembrandomäne umfasst, wobei das spezifitätsvermittelnde Gen für die scFv-Antikörperdomäne codiert.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff um zumindest ein stabiles Isotop und/oder zumindest ein Radioisotop aus der folgenden Gruppe von stabilen Isotopen oder Radioisotopen handelt: ¹⁰B, ¹¹B, ^natB, ¹⁵⁷Gd, ^99mTc, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸F und 211At.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Porationsschritt um einen Sonoporationsschritt handelt und a) sich in der Zelllösung freie Mikrobläschen befinden und/oder b) die Nanopartikel oder der zytotoxische Stoff vor dem Sonoporationsschritt mit den Mikrobläschen gekoppelt werden, wobei die Nanopartikel oder der zytotoxische Stoff derart mit den Mikrobläschen gekoppelt werden, dass diese nach der Kopplung in einem Innenraum der Mikrobläschen, in einer Mikrobläschenmembran eingelagert oder kovalent von außen an die Mikrobläschenmembran gebunden vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Koppelns der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffes mit den Mikrobläschen vor oder nach dem Aufbringen oder Vermischen der Nanopartikel oder des zytotoxischen Stoffes auf die bzw. mit den immunokompetenten Zellen erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Durchmesser der Mikrobläschen 0,5 µm bis 4 µm, vorzugsweise 1 µm bis 3 µm, vorzugsweise etwa 2 µm beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Kontrolle des Porationsschrittes, insbesondere zur Kontrolle einer Permeabiliserung der Zellmembranen, während der Sonoporation ein stationäres oder ein nicht-stationäres elektrisches oder elektromagnetisches Feld an die Zelllösung angelegt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Beladungsschritt der folgende Schritt ausgeführt wird: - Kultivieren der immunokompetenten Zellen über einen Kultivierungszeitraum hinweg bis zum Erreichen einer vorab festgelegten Anzahl von immunokompetenten Zellen je Volumeneinheit.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Beladungsschritt der immunokompetenten Zellen der folgende Schritt ausgeführt wird: - Kultivieren der mit den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff beladenen immunokompetenten Zellen über einen Kultivierungszeitraum hinweg bis zum Erreichen einer im Vergleich zur Anzahl der Zellen vor Beginn dieses Kultivierungsschrittes um den Faktor 1000 bis 100000 höheren Anzahl von mit den Nanopartikeln und/oder dem zytotoxischen Stoff beladenen immunokompetenten Zellen je Volumeneinheit, wobei die Ladung der beladenen immunokompetenten Zellen bei jeder Zellteilung jeweils gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt wird.
Verfahren nach Anspruch 10 mit Rückbezug auf Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Wachstum der beladenen immunokompetenten Zellen sowie die Verteilung der Nanopartikel und/oder des zytotoxischen Stoffes in den immunokompetenten Zellen während des Kultivierungsschritts kontrolliert wird, wobei hierfür von den beladenen immunokompetenten Zellen ausgehende ionisierende Teilchenstrahlung detektiert und vorzugsweise visualisiert wird, wobei im Falle von stabilen Isotopen diese Isotope zuvor einer thermischen Neutronenstrahlung (n_th) oder im Falle des Isotops ¹¹B einer Protonenstrahlung ausgesetzt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Schritt des Bereitstellens der immunokompetenten Zellen eine für die patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen spezifische Mutation in einem codierenden Gen eines auf der Zellmembran dieser Zellen präsentierten Antigens ermittelt sowie ein für diese Mutation Spezifität vermittelndes Gen zur Transfektion der immunokompetenten Zellen bereitgestellt wird und die immunokompetenten Zellen mit diesem Gen transfiziert werden.
Immunokompetente Zellen, insbesondere T-Zellen, insbesondere γδ-T-Zellen, insbesondere theranostische γδ-CAR-T-Zellen, die mit Nanopartikeln und/oder einem zytotoxischen Stoff beladen sind, insbesondere hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
Immunokompetente Zellen nach Anspruch 13 zur Anwendung in einem Verfahren für die theranostische Behandlung von patientenspezifisch genetisch veränderten Zellen, insbesondere von viral genetisch veränderten Zellen oder eines patientenspezifischen malignen Tumors, in einem befallenen Patienten.
Medizinische Zusammensetzung, umfassend immunokompetente Zellen nach Anspruch 13 und eine Trägerflüssigkeit, in welcher diese Zellen vorliegen, wobei die medizinische Zusammensetzung dazu eingerichtet und dazu vorgesehen ist, einem Patienten verabreicht zu werden.
Medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die beladenen immunokompetenten Zellen dazu ausgelegt sind, sich innerhalb von maximal 60 Minuten, vorzugsweise innerhalb von maximal 30 Minuten, derart innerhalb des Körpers des Patienten zu verteilen, dass ihre Verteilung im Körper des Patienten räumlich aufgelöst detektiert werden kann.
Medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die beladenen immunokompetenten Zellen dadurch räumlich aufgelöst detektierbar sind, dass diese einen visualisierbaren Marker aufweisen und/oder von diesen ausgehende ionisierende Teilchenstrahlung detektiert werden kann, im Falle von stabilen Isotopen nach einem vorangegangenen Aussetzen in thermischer Neutronenstrahlung (n_th) oder im Falle von ¹¹B in Protonenstrahlung.