CN115201393B - 一种黄精芡实汤的质量检测方法 - Google Patents

一种黄精芡实汤的质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开一种黄精芡实汤的质量检测方法，利用液相色谱对黄精芡实汤的指纹图谱及芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸含量进行测定，测得黄精芡实汤样品中芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸的含量均值分别为0.119％、0.126％和0.039％。本申请的黄精芡实汤的质量检测方法，通过多方面测量，来评定黄精芡实汤的质量，能够建立黄精芡实汤可行的质量标准，实现黄精芡实汤质量的有效控制。

Description

一种黄精芡实汤的质量检测方法
技术领域
本申请涉及中药材质量控制技术领域，具体是涉及到一种黄精芡实汤的质量检测方法。
背景技术
现代药物需要具有稳定均一、安全和有效的三大特性，中成药在这几个方面难以比拟西药，因此，更需要采用多种手段进行检测，保证检测结果的可靠性和稳定性。黄精芡实汤出自《中医内科临床治疗学》引冷柏枝方，具有补脾阴之功效，主治脾阴不足的中消证。其包括黄精、芡实、山药、白芍、大枣、太子参和佩兰。目前，关于黄精芡实汤还未形成一个***的质量检测方法，仅采用现有的检测手段来检测黄精芡实汤是不够全面的，无法达到中药配方质量控制要求。因此，建立一种用于药材质量控制的黄精芡实汤的质量检测方法是十分必要的。
发明内容
本申请的目的是要解决现有技术的不足，提供一种黄精芡实汤的质量检测方法，以更好的控制黄精芡实汤的质量，表征药物质量，提高药物稳定性。
为达到上述目的，本申请采用如下技术方案：
对黄精芡实汤指纹图谱及对芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸的含量进行测定，指纹图谱及芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸的含量测定均采用液相色谱法；
采用液相色谱法测定指纹图谱包括：进行液相色谱仪分析，以各缺味阴性样品制成的溶液作为参照物溶液，以芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸对照品制成的溶液作为对照品溶液，以黄精芡实汤样品制成的溶液作为供试品溶液，分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸水溶液为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；
表a梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0→3 2 98
3→9 2→16 98→84
9→13 16→18 84→82
13→14 18→30 82→70
14→19 30→34 70→66
19→22 34→45 66→55
22→24 45→90 55→10
流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：280nm。
在其中一个实施例中，采用液相色谱法测定指纹图谱还包括如下步骤:
(1)制备参照物溶液a：称取黄精、芡实、山药、白芍、大枣、太子参、佩兰各单味药饮片适量，分别粉碎成粗粉，过40目筛；按黄精芡实汤比例，精密称取各单味药饮片粉末，以3g为处方总量，分别配制得到不含黄精、芡实、山药、白芍、大枣、太子参或佩兰的缺味阴性样品；分别精密称取上述缺味阴性样品1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入沸水50mL，称定质量，超声提取30min，放至室温后再次称定质量，用沸水补足减失的质量，摇匀，4℃条件避光保存；进样前经0.22μm针式过滤器过滤，取续滤液，即得；
(2)制备对照品溶液a：分别取精密称取芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸对照品适量，精密称定，置于同一容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸质量浓度比为0.5：0.311：0.697的对照品溶液a；
(3)制备供试品溶液a：称取黄精、芡实、山药、白芍、大枣、太子参、佩兰各单味药饮片适量，分别粉碎成粗粉，过40目筛；按黄精芡实汤比例，精密称取各单味药饮片粉末，混匀，即得黄精芡实汤样品；精密称取上述黄精芡实汤样品1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入沸水50mL，称定质量，超声提取30min，放至室温后再次称定质量，用沸水补足减失的质量，摇匀，4℃条件避光保存；进样前经0.22μm针式过滤器过滤，取续滤液，即得。
在其中一个实施例中，采用液相色谱法测定芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸的含量包括：
进行液相色谱仪分析，以芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸对照品制成的溶液作为对照品溶液b，以黄精芡实汤样品制成的溶液作为供试品溶液b，分别精密吸取对照品溶液b和供试品溶液b，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：ThermoHypersil GOLD C18柱；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸水溶液为流动相B，按规定进行梯度洗脱；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：280nm。
在其中一个实施例中，采用液相色谱法测定芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸含量还包括如下步骤：
(1)制备对照品溶液b：精密称取芍药苷5.00mg、芍药内酯苷3.11mg、没食子酸6.97mg，加甲醇溶液，定容于10mL容量瓶中，即得对照品溶液b；
(2)制备供试品溶液b：精密称取黄精芡实汤样品1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入沸水50mL，称定质量，超声提取30min，放至室温后再次称定质量，用沸水补足减失的质量，摇匀，4℃条件避光保存；进样前经0.22μm针式过滤器过滤，取续滤液，即得。
在其中一个实施例中，黄精芡实汤的质量检测方法还包括对黄精芡实汤指纹图谱进行聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析。
在其中一个实施例中，采用外标一点法计算黄精芡实汤样品中没食子酸、芍药内酯苷和芍药苷的含量。
在其中一个实施例中，通过对黄精芡实汤进行指纹图谱测定，确定19个共有峰，构成黄精芡实汤的指纹特征。
在其中一个实施例中，将黄精芡实汤的指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行对照分析，确定8号峰为没食子酸，18号峰为芍药内酯苷，19号峰为芍药苷。
在其中一个实施例中，将黄精芡实汤的指纹图谱与各缺味阴性样品的指纹图谱进行比较，对19个共有峰进行药材归属，峰1和峰18归属于佩兰；峰2和峰11归属于白芍和佩兰；峰5归属于白芍，佩兰和山药；峰6和峰8归属于山药；峰7归属于黄精；峰10归属于佩兰和山药；峰15和峰19归属于白芍。
在其中一个实施例中，将多批次黄精芡实汤指纹图谱数据依次导入中药色谱指纹图谱相似度评价***，选定其中一批次的黄精芡实汤指纹图谱作为参照指纹图谱，经多点校正，采用平均数法生成对照指纹图谱。
本申请的有益效果是：
通过对黄精芡实汤的指纹图谱及芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定黄精芡实汤的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立黄精芡实汤可行的质量标准，实现黄精芡实汤质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。本申请多个批次黄精芡实汤样品的指纹图谱中，各共有峰相对保留时间的RSD为0.023％～2.11％，表明其化学组成一致性较好；各共有峰相对峰面积的RSD为1.23％～2.79％，表明各批次黄精芡实汤样品的某些共有化学成分含量有所差异；各批次黄精芡实汤样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度结果均不低于0.885，表明各批次黄精芡实汤化学组成一致性较好；各批次黄精芡实汤样品中芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸的含量均值分别为0.119％、0.126％和0.039％。本申请建立的黄精芡实汤药材指纹图谱和含量测定方法重复性好，专属性强，可用于黄精芡实汤药材及相关制剂的质量评价。
附图说明
图1为本申请黄精芡实汤指纹图谱测定中15批黄精芡实汤样品的指纹图谱及对照指纹图谱；其中，S1～S15分别表示15批黄精芡实汤样品的指纹图谱，R表示对照指纹图谱。
图2为本申请黄精芡实汤指纹图谱测定中15批黄精芡实汤样品的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度评价图表。
图3为本申请黄精芡实汤指纹图谱测定中药苷、芍药内酯苷和没食子酸混合对照品图谱。
图4为本申请黄精芡实汤指纹图谱测定中一黄精芡实汤样品的指纹图谱。
图5为本申请黄精芡实汤指纹图谱测定中各缺味阴性样品与黄精芡实汤样品的对比图谱；其中S1～S7分别依次表示白芍阴性样品、大枣阴性样品、黄精阴性样品、佩兰阴性样品、芡实阴性样品、山药阴性样品和太子参阴性样品，S8表示黄精芡实汤样品。
图6为本申请15批黄精芡实汤样品的聚类分析树状图。
图7为本申请15批黄精芡实汤样品的主成分分析图。
图8为本申请15批黄精芡实汤样品的OPLS-DA模型的置换检验结果图。
图9为本申请15批黄精芡实汤样品的OPLS-DA得分图。
图10为本申请黄精芡实汤样品指纹图谱19个共有峰的PCA载荷图；其中，p1～p19代表共有峰1～19。
图11为本申请黄精芡实汤样品指纹图谱19个共有峰峰面积VIP值图。
图12为对比例1的色谱图。
图13为对比例2的色谱图。
图14为对比例3的色谱图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本申请进一步详细说明。
实施例1
1.指纹图谱测定
1.1液相色谱法
(1)制备参照物溶液：称取黄精、芡实、山药、白芍、大枣、太子参、佩兰各单味药饮片适量，分别粉碎成粗粉，过40目筛；按黄精芡实汤比例，精密称取各单味药饮片粉末，以3g为处方总量，分别配制得到不含黄精、芡实、山药、白芍、大枣、太子参或佩兰的缺味阴性样品；分别精密称取上述缺味阴性样品1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入沸水50mL，称定质量，超声提取30min，放至室温后再次称定质量，用沸水补足减失的质量，摇匀，4℃条件避光保存；进样前经0.22μm针式过滤器过滤，取续滤液，即得七种缺味阴性样品参照物溶液；
(2)制备对照品溶液：精密称取芍药苷5.00mg、芍药内酯苷3.11mg、没食子酸6.97mg，加甲醇溶液，定容于10mL容量瓶中，即得对照品溶液；
(3)制备供试品溶液：称取黄精、芡实、山药、白芍、大枣、太子参、佩兰各单味药饮片适量，分别粉碎成粗粉，过40目筛；按黄精芡实汤比例，精密称取各单味药饮片粉末，混匀，即得黄精芡实汤样品；精密称取上述黄精芡实汤样品1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入沸水50mL，称定质量，超声提取30min，放至室温后再次称定质量，用沸水补足减失的质量，摇匀，4℃条件避光保存；进样前经0.22μm针式过滤器过滤，取续滤液，即得。
色谱条件：
色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱(2.1mm×100mm，1.9μm)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸水溶液为流动相B，按表1的规定进行梯度洗脱；
表1梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0→3 2 98
3→9 2→16 98→84
9→13 16→18 84→82
13→14 18→30 82→70
14→19 30→34 70→66
19→22 34→45 66→55
22→24 45→90 55→10
流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：280nm。
测定法：分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。将所得15批黄精芡实汤色谱图数据依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012版)》，以样品S1图谱为参照指纹图谱，采用平均数法(时间窗宽度＝0.10)生成对照指纹图谱，采用多点校正后进行自动匹配，结果见图1。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0％。对15批黄精芡实汤样品高效液相色谱图与对照指纹图谱进行相似度评价，结果S1～S15号样品与对照指纹图谱的相似度均高于0.85，见图2，表明不同批次黄精芡实汤样品化学成分组成基本相同，差异较小。
15批黄精芡实汤各共有峰相对保留时间的RSD为0.023％～2.11％，表明其化学组成一致性较好；各共有峰相对峰面积的RSD为1.23％～2.79％，提示15批黄精芡实汤的某些共有化学成分含量有所差异。
1.2分析方法验证
重复性试验：取黄精芡实汤(S15)样品适量，按1.1项下方法平行制备六份供试品溶液，按1.1项下色谱条件进样测定。以芍药苷色谱峰为参照峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于2.00％，相对峰面积的RSD均小于3.00％，表明本方法重复性良好。
精密度试验：取黄精芡实汤(S1)样品适量，按1.1项下方法制备供试品溶液，按1.1项下色谱条件连续进样六次，记录色谱图。以芍药苷色谱峰(其色谱峰较稳定、分离度良好且保留时间、峰面积适中)为参照峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于2.11％，相对峰面积的RSD均小于2.79％，表明所用仪器精密度良好。
稳定性试验：取黄精芡实汤(S15)样品适量，按1.1项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、3、6、9、12、24和48h，按1.1项下色谱条件进样测定。以芍药苷色谱峰为参照峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于2.00％，相对峰面积的RSD均小于3.00％，表明供试品溶液于室温下放置48h内稳定性良好。
1.3指纹图谱共有峰的指认与归属
取黄精芡实汤供试品溶液和对照品溶液，按1.1项下色谱条件进样，对照品溶液色谱图如图3所示，黄精芡实汤供试品溶液色谱图如图4所示。通过保留时间和图谱对照分析，确定8号峰为没食子酸，18号峰为芍药内酯苷，19号峰为芍药苷。
将七种缺味阴性样品参照物溶液和黄精芡实汤供试品溶液按1.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果如图5所示。将黄精芡实汤样品、七种缺味阴性样品的色谱图进行比较，对19个共有峰进行药材归属。其中，峰1和峰18归属于佩兰；峰2和峰11归属于白芍和佩兰；峰5归属于白芍，佩兰和山药；峰6和峰8归属于山药；峰7归属于黄精；峰10归属于佩兰和山药；峰15和峰19归属于白芍。
2.含量测定
2.1试验方法
经黄精芡实汤指纹图谱色谱峰指认，黄精芡实汤指纹图谱中的8、18和19号色谱峰分别为没食子酸、芍药内酯苷和芍药苷。因此选择这三个成分进行含量测定。
采用液相色谱法测定没食子酸、芍药内酯苷和芍药苷含量，以没食子酸、芍药内酯苷和芍药苷对照品制成的溶液作为对照品溶液，以黄精芡实汤样品制成的溶液作为供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱(2.1mm×100mm，1.9μm)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸水溶液为流动相B，按表1的规定进行梯度洗脱；
流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：280nm。
制备对照品溶液：精密称取芍药苷5.00mg、芍药内酯苷3.11mg、没食子酸6.97mg，加甲醇溶液，定容于10mL容量瓶中，即得对照品溶液。
制备供试品溶液：精密称取黄精芡实汤样品1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入沸水50mL，称定质量，超声提取30min，放至室温后再次称定质量，用沸水补足减失的质量，摇匀，4℃条件避光保存；进样前经0.22μm针式过滤器过滤，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.2黄精芡实汤中药材含量测定
照上述拟定的含量测定方法，采用外标一点法计算15批黄精芡实汤样品中没食子酸、芍药内酯苷和芍药苷含量，结果见表2。
表2主要成分含量测定(n＝2)
编号 芍药苷(mg/g) 芍药内酯苷(mg/g) 没食子酸(mg/g)
S1 0.116 0.119 0.041
S2 0.120 0.127 0.036
S3 0.122 0.126 0.033
S4 0.115 0.133 0.045
S5 0.118 0.125 0.035
S6 0.119 0.134 0.037
S7 0.114 0.118 0.039
S8 0.123 0.123 0.042
S9 0.124 0.126 0.043
S11 0.115 0.129 0.031
S12 0.123 0.117 0.047
S13 0.119 0.135 0.039
S14 0.118 0.124 0.032
S15 0.120 0.128 0.046
2.3线性关系考察
精密称取芍药苷5.00mg、芍药内酯苷3.11mg、没食子酸6.97mg，加甲醇溶液，定容于10mL容量瓶中，即得混合对照品溶液。精密吸取上述混合对照品溶液5、10、15、20、25、30μL分别进样，按1.1项下色谱条件进行测定。以没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷进样量为横坐标(X,mg)、以峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得到回归方程。
芍药苷的回归方程为Y＝90716904.99X-6750.79178，R2＝0.9999；
芍药内酯苷的回归方程为Y＝90716904.99X-6750.79178，R2＝0.9997；
没食子酸的回归方程为Y＝2725712543X-322861.3857，R2＝0.999131197。
结果表明，三种成分在相应的质量范围内与峰面积的线性关系良好。
2.4精密度试验
取黄精芡实汤药材样品(S1)约5g，精密称定，按照1.1项下方法制备供试品溶液，然后按照1.1项下色谱条件连续进样六次，记录色谱峰面积。计算没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷峰面积的RSD分别为0.92％、0.99％、0.87％，表明仪器精密度良好。
2.5稳定性试验
精密称取黄精芡实汤药材样品(S1)约5g，按照1.1项下方法制备供试品溶液，分别于供试品溶液制备后的0、3、6、9、12、24h按照项下色谱方法进样，记录色谱峰面积。计算没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷各成分峰面积的RSD分别为1.1％、0.99％、0.97％，表明24h内供试品溶液的稳定性良好。
2.6重复性试验
取黄精芡实汤药材样品(S1)约5g，精密称定，分别按照1.1项下方法平行制备六份供试品溶液，按1.1项下色谱方法进样,记录色谱峰面积，并按外标一点法计算量。结果没芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸的平均质量分数分别为0.119mg/g、0.126mg/g、0.039mg/g，RSD分别为1.2％、1.9％、2.1％，表明该方法重复性良好。
2.7加样回收试验
取黄精芡实汤药材样品(S1)约1g，按照对照品量-样品中含量约1:1的比例，按1.1项下方法制备供试品溶液，平行制备六份样品溶液，按照1.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算回收率。结果表明，没食子酸、芍药内酯苷、芍药苷的平均加样回收率分别为101.0％、101.1％,100.9％，RSD分别为2.1％、3.5％，表明该方法准确度良好。
3.统计分析
3.1聚类分析(cluster analysis，CA)
聚类分析是一种无监督模式识别方法，可将具有相似特点的样品归位一类。以15批黄精芡实汤图谱数据的共有峰峰面积为变量,使用SPSS26.0软件,采用瓦尔德连接方法(即离差平方和法),以平方欧氏距离为测度进行聚类分析。结果如图6所示，当距离为5时,15批黄精芡实汤可聚为两类,其中S3、S5、S13、S12、S4、S6、S11、S8为一类，S7、S10、S9、S15、S1、S14、S2为一类，表明组S3、S5、S13、S12、S4、S6、S11、S8与S7、S10、S9、S15、S1、S14、S2各组黄精芡实汤存在差异。
3.2主成分分析(principal component analysis，PCA)
PCA是多元统计分析中最常见的数据分析方法，它能够通过“降维”处理简化大量相关数据，利用代表数据特征的不相关变量来描述样本，在“无监督”模式下根据数据特征进行分析。为更好地客观反映各批次黄精芡实汤之间的差异性，将15批黄精芡实汤样品的共有峰的峰面积结果导入SIMCA14.1软件，进行主成分分析。提取出四个变量，累计方差贡献率为87.067％，提示该模型的预测能力较好。提取前两个主成分作15批黄精芡实汤药材的PCA得分图，如图7所示。结果表明，15批黄精芡实汤聚为两类，与聚类分析结果相互印证：S3、S5、S13、S12、S4、S6、S11、S8为一类,S7、S10、S9、S15、S1、S14、S2为一类,可见不同批次的黄精芡实汤之间存在一定差异。
3.3正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)
OPLS-DA是有监督的模式识别方法，可用于寻找引起样品间差异的变量。因此，在PCA分析的基础上,为进一步分析不同来源黄精芡实汤样品之间的差异，以15批黄精芡实汤药材指纹图谱的19个共有峰峰面积为变量，采用SIMCA14.1软件进行OPLS-DA分析，分析结果显示，OPLS-DA模型参数R2X为0.751，R2Y为0.984，Q2为0.921，说明该模型稳定性及预测能力较好。为进一步验证该模型的有效性，利用SIMCA14.1软件对其进行200次置换检验，检验结果见图8，所有Q2均在R2之下，且Q2的回归直线与y轴的交点在负半轴，说明该模型有效。由图9所示的OPLS-DA得分图可以看出，15批样品被很好地区分为两类。如图10所示，OPLS-DA载荷图中的点离原点越远，表明对应变量权重值越大，可知对第一主成分影响较大的有峰2、峰7、峰9、峰10、峰11、峰13、峰14、峰16、峰19，对第二主成分影响较大的有峰1、峰3、峰4、峰5、峰8、峰12。如图11所示，通过VIP值筛选出导致黄精芡实汤差异的标志性成分，以VIP值大于1.4为筛选标准，标记出5个贡献较大的成分，依次为8、4、19、18、5号色谱峰。经对照品比对指认出其中的8号峰为没食子酸、18号峰为芍药内酯苷、19号峰为芍药苷，并对这三个主要成分进行了含量测定，化学计量学分析结果表明这三个测定指标的选择是合理的。
中药材成分复杂，受不同生长环境、生长期、采收期以及加工、炮制方法等多方面的影响，其内在质量会有很大差异。本申请在生成对照指纹图谱时采用中位数法，可弥补用平均数法易受个别超常样本影响的缺点，使生成的对照图谱更具代表性。本申请在前期实验基础上，从化学成分特有性、传统功效和化学成分可测性等方面对黄精芡实汤质量标志物进行预测分析，选择与中药质量特性密切相关的标志物，建立黄精芡实汤指纹图谱，确定19个共有峰，并指认出其中的没食子酸、芍药苷、芍药内酯苷三个化学成分,15批黄精芡实汤样品中芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸的含量均值分别为0.119％、0.126％和0.039％。15批黄精芡实汤各共有峰相对保留时间的RSD为0.023％～2.11％，表明其化学组成一致性较好；各共有峰相对峰面积的RSD为1.23％～2.79％，提示15批黄精芡实汤的某些共有化学成分含量有所差异。各批次样品图谱与对照图谱的相似度结果均不低于0.885，表明各批次黄精芡实汤化学组成一致性较好。
对黄精芡实汤药材指纹图谱，共有峰峰面积进行CA、PCA和OPLS-DA分析，结果显示各批次黄精芡实汤质量基本相似。此外色谱峰8、4、19、18、5号色谱峰是影响黄精芡实汤成分差异的标志性成分，因此本文选择8、18和19号色谱峰进行定量测定是合理的。本申请建立的黄精芡实汤药材指纹图谱和含量测定方法重复性好，专属性强，可用于黄精芡实汤药材及相关制剂的质量评价。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，指纹图谱测定采用的色谱条件有所不同，具体区别为，采用表3而非表1的规定进行梯度洗脱，其他色谱条件均相同。
表3梯度洗脱程序
时间(min) 甲醇(％) 0.1％甲酸水(％)
0→5 1 98
5→10 2→16 98→84
10→15 16→18 84→82
15→20 18→30 82→70
20→25 30→34 70→66
25→30 34→45 66→55
其色谱图如图12所示，结果显示：各峰分离度不匀均且出现前延锋和拖尾峰。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，指纹图谱测定采用的色谱条件有所不同，具体区别为，采用表4而非表1的规定进行梯度洗脱，其他色谱条件均相同。
表4梯度洗脱程序
时间(min) 甲醇(％) 0.1％甲酸水(％)
0→3 4 96
3→9 4→20 96→80
9→13 20→24 80→76
13→14 24→30 76→70
14→19 30→35 70→65
19→22 35→50 65→50
22→24 50→90 50→10
其色谱图如图13所示，结果显示：出锋率低且出现前延锋和拖尾峰。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于，指纹图谱测定采用的色谱条件有所不同，具体区别为，其流动相采用乙腈-0.1％甲酸水，其他色谱条件均相同。
其色谱图如图14所示，各峰分离度不匀均。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本申请的保护范围限于这些例子；在本申请的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入本申请的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种黄精芡实汤的质量检测方法，其特征在于，包括测定黄精芡实汤指纹图谱及对芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸的含量进行测定，黄精芡实汤指纹图谱及芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸的含量测定均采用液相色谱法；
采用液相色谱法测定黄精芡实汤指纹图谱包括：进行液相色谱仪分析，以各缺味阴性样品制成的溶液作为参照物溶液，以芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸对照品制成的溶液作为对照品溶液，以黄精芡实汤样品制成的溶液作为供试品溶液，分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱，2.1mm×100mm，1.9μm，流动相：以甲醇为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B，按表1的规定进行梯度洗脱；
表1梯度洗脱程序
Figure QLYQS_1
流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：280nm；
其中，采用液相色谱法测定指纹图谱还包括如下步骤:
(1)制备参照物溶液a：称取黄精、芡实、山药、白芍、大枣、太子参、佩兰各单味药饮片适量，分别粉碎成粗粉，过40目筛；按黄精芡实汤比例，精密称取各单味药饮片粉末，以3g为处方总量，分别配制得到不含黄精、芡实、山药、白芍、大枣、太子参或佩兰的缺味阴性样品；分别精密称取上述缺味阴性样品1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入沸水50mL，称定质量，超声提取30min，放至室温后再次称定质量，用沸水补足减失的质量，摇匀，4℃条件避光保存；进样前经0.22μm针式过滤器过滤，取续滤液，即得；
(2)制备对照品溶液a：精密称取芍药苷5.00mg、芍药内酯苷3.11mg、没食子酸6.97mg，加甲醇溶液，定容于10mL容量瓶中，即得对照品溶液；
(3)制备供试品溶液a：称取黄精、芡实、山药、白芍、大枣、太子参、佩兰各单味药饮片适量，分别粉碎成粗粉，过40目筛；按黄精芡实汤比例，精密称取各单味药饮片粉末，混匀，即得黄精芡实汤样品；精密称取上述黄精芡实汤样品1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入沸水50mL，称定质量，超声提取30min，放至室温后再次称定质量，用沸水补足减失的质量，摇匀，4℃条件避光保存；进样前经0.22μm针式过滤器过滤，取续滤液，即得；
（4）分别精密吸取参照物溶液a、对照品溶液a及供试品溶液a各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；
其中，采用液相色谱法测定芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸的含量包括：
(1)制备对照品溶液b：精密称取芍药苷5.00mg、芍药内酯苷3.11mg、没食子酸6.97mg，加甲醇溶液，定容于10mL容量瓶中，即得对照品溶液b；
(2)制备供试品溶液b：精密称取黄精芡实汤样品1.0g，置于具塞锥形瓶中，精密加入沸水50mL，称定质量，超声提取30min，放至室温后再次称定质量，用沸水补足减失的质量，摇匀，4℃条件避光保存；进样前经0.22μm针式过滤器过滤，取续滤液，即得；
（3）进行液相色谱仪分析，以芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸对照品制成的溶液作为对照品溶液b，以黄精芡实汤样品制成的溶液作为供试品溶液b，分别精密吸取对照品溶液b和供试品溶液b，分别注入液相色谱仪，测定，即得；采用的色谱条件为，色谱柱：ThermoHypersil GOLD C18柱，2.1mm×100mm，1.9μm；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B，按所述表1的规定进行梯度洗脱；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：280nm。
2.如权利要求1所述的黄精芡实汤的质量检测方法，其特征在于，还包括对黄精芡实汤指纹图谱进行聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析。
3.如权利要求1所述的黄精芡实汤的质量检测方法，其特征在于，采用外标一点法计算黄精芡实汤样品中没食子酸、芍药内酯苷和芍药苷的含量。
4.如权利要求1所述的黄精芡实汤的质量检测方法，其特征在于，通过对黄精芡实汤进行指纹图谱测定，确定19个共有峰，构成黄精芡实汤的指纹特征。
5.如权利要求4所述的黄精芡实汤的质量检测方法，其特征在于，将黄精芡实汤的指纹图谱与对照品溶液的指纹图谱进行对照分析，确定8号峰为没食子酸，18号峰为芍药内酯苷，19号峰为芍药苷。
6.如权利要求4所述的黄精芡实汤的质量检测方法，其特征在于，将黄精芡实汤的指纹图谱与各缺味阴性样品的指纹图谱进行比较，对19个共有峰进行药材归属，峰1和峰18归属于佩兰；峰2和峰11归属于白芍和佩兰；峰5归属于白芍，佩兰和山药；峰6和峰8归属于山药；峰7归属于黄精；峰10归属于佩兰和山药；峰15和峰19归属于白芍。
7.如权利要求1所述的黄精芡实汤的质量检测方法，其特征在于，将多批次黄精芡实汤指纹图谱数据依次导入中药色谱指纹图谱相似度评价***，选定其中一批次的黄精芡实汤指纹图谱作为参照指纹图谱，经多点校正，采用平均数法生成对照指纹图谱。
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