CN110907574B - 一种中药组合物的质量控制方法及质控谱图和构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药组合物的质量控制方法及质控谱图和构建方法,所述中药组合物包括西瓜霜、煅硼砂、黄柏、黄连、山豆根、射干、浙贝母、青黛、冰片、无患子果、大黄、黄芩、甘草和薄荷脑,所述质量控制方法包括采用HPLC法同时检测中药组合物中黄柏、黄连、黄岑、射干和甘草成分,所述HPLC法条件如下:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,进行梯度洗脱;理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于300000。所述质量控制方法在HPLC检测获取的药物各成分结果上,设计了多种对照品参照物和对照药材参照物,经过对比分析获取了对应黄柏、黄连、黄岑、射干和甘草成分的特征峰信息,并可在一次进样检测中同时确定上述成分的种类。
Description
技术领域
本发明属于药物质量控制领域,具体地说,涉及一种中药组合物的质量控制方法及质控谱图和构建方法。
背景技术
本发明涉及的中药组合物由西瓜霜、煅硼砂、黄柏、黄连、山豆根、射干、浙贝母、青黛、冰片、无患子果、大黄、黄芩、甘草、薄荷脑等十四味药材制成,现行药物标准主要采用薄层色谱法,以单一成分或主斑点的鉴别模式,实现对处方中多味药材的检测鉴定。该模式需要多次按照薄层色谱法对样品艰辛检测,操作复杂,工作量大,并且该方法容易受到人为影响,其结果的稳定性和重复性不是很好。同时,由于中药材中所含成分较为复杂,以黄柏为例,其中含有多种生物碱类,因此数种此类药材在液相色谱中的特征峰情况较为复杂,具体表现为杂峰,干扰峰,影响了对药材对应成分的鉴别与判定。
此外,不同药材的成分性质、极性和酸碱性差异较大,很难在同一条件的色谱谱图中同时体现,而分别对多种成分单独检测,无疑增加了质量控制的复杂程度和检测成本。
申请号为201110105310.6的中国专利公开了一种治疗口腔疾病的中药组合物及其制备工艺、质量检测方法,所述检测方法分别采用薄层色谱法与液相色谱法对药物中的成分进行鉴别分析,但在液相色谱方法中仅对积雪草苷/羟基积雪草苷进行了检测,鉴于其他药物的性质差异和检测难度,没有对其余多味药材进行鉴别分析。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足,提供一种可同时对多种成分进行鉴定分析的中药组合物的质量控制方法及质控谱图和构建方法,所述质量控制方法在HPLC检测获取的桂林西瓜霜药物各成分结果上,设计了多种对照标准品和对照药材试验组,经过对比分析获取了对应黄柏、黄连、黄芩、射干和甘草成分的特征峰信息,并可在一次进样检测中同时确定上述成分的种类和含量。
为解决上述技术问题,本发明采用技术方案的基本构思是:
本发明提供了一种中药组合物质量控制方法,所述中药组合物包括西瓜霜、煅硼砂、黄柏、黄连、山豆根、射干、浙贝母、青黛、冰片、无患子果、大黄、黄芩、甘草和薄荷脑,所述质量控制方法包括采用HPLC法同时检测中药组合物中黄柏、黄连、黄岑、射干和甘草成分,所述HPLC法的色谱条件如下:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,进行梯度洗脱;理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于300000;
所述梯度洗脱的过程如下:
在0~9min时段,流动相A的比例从18%升至23%,流动相B的比例从82%降至77%;
在9~15min时段,流动相A的比例从23%升至25%,流动相B的比例从77%降至75%;
在15~27min时段,流动相A的比例维持在25%,流动相B的比例维持在75%;
在27~36min时段,流动相A的比例从25%升至35%,流动相B的比例从75%降至65%;
在36~50min时段,流动相A的比例从35%升至45%,流动相B的比例从65%降至55%;
在50~75min时段,流动相A的比例从45%升至80%,流动相B的比例从55%降至20%;
在75~88min时段,流动相A的比例维持在80%,流动相B的比例维持在20%;
在88~90min时段,流动相A的比例从80%降至18%,流动相B的比例从20%升至82%。
由于同时所述中药组合物中的对黄柏,黄连,黄芩,射干和甘草五味药材的成分进行检测鉴定,为了使药物中所含各种成分进行有效分离而得到分离度较好的特征峰,本发明对液相色谱的洗脱条件进行了探索,使单次检测可得到16个分离度较好的峰。
上述方案中,为了更好地分离多味药物中的成分,尤其是盐酸小檗碱和盐酸巴马汀两者,本发明的相关工作人员对流动相的选择进行了试验分析,分别选用甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸和甲醇-乙腈-0.1%磷酸作为流动相,当选用乙腈-0.1%磷酸进行梯度洗脱时,如说明书附图图12所示,盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的保留时间均为33min左右,色谱峰没有分离开,而选用甲醇-乙腈-0.1%磷酸时,如说明书附图图13所示,盐酸小檗碱和盐酸巴马汀的保留时间均为22min左右,两成分的色谱峰重叠。因此选择可将盐酸小檗碱保留时间延后,且可将其与盐酸巴马汀分离的甲醇-0.1%磷酸作为流动相。
上述方案中,进一步的,对不同比例和不同酸度的流动相性能进行考量,比较甲醇-水,甲醇-0.05%磷酸,甲醇-0.1%磷酸为流动相即流动相不同酸度的比较。如说明书附图图14~16所示,其中图14所示的甲醇-0.05%磷酸和图15所示的甲醇-0.1%磷酸为流动相的色谱图基本相似,而以甲醇-水为流动相的色谱图与加酸的差别较大,其中盐酸小檗碱和盐酸巴马汀峰形非常差,峰保留时间差异也很大。故选择甲醇-0.1%磷酸为流动相并在实际质控活动中严格配制0.1%磷酸溶液。
本发明的进一步方案为:所述HPLC法的色谱条件还包括使用检测波长为260nm二极管阵列检测器采集特征峰信息,使黄柏,黄连,黄岑,射干和甘草在同一色谱图中所对应任选两个特征峰之间的吸光度倍数差不超过20~40倍。
上述方案中,因供试品中药味较多,所含成分较复杂,采用二极管阵列检测器(PDA)获取多层次信息,根据各个对照品、对照药材、供试品溶液的同一保留时间色谱峰的光谱图,在210~400nm紫外区选择波长。说明书附图图9~11中记载了同一中药组合物供试品溶液在采用260nm,273nm和345nm三个不同波长检测的谱图。从图中可明显看出345纳米色谱图中峰面积明显偏小,其在55min后的色谱峰峰高比260nm和273nm波长下同时段的色谱峰高明显较小;而273nm与260nm相比,273nm色谱图中黄芩苷及相关成分的色谱峰明显偏高,使得峰16对应的甘草酸铵峰高明显偏小,峰6的峰面积14612833(黄芩苷,保留时间56.422min)约为峰16的峰面积158225(甘草酸铵,保留时间75.414min)的100倍。综合上述内容,选择峰高对比比较均匀的检测波长——260nm。所述检测波长可使五味药材对应的多个特征峰在同一色谱图中具有良好的分离度和合适的显示比例,任选的两个特征峰之间的倍数差不超过20~40倍。
本发明的进一步方案为:所述质量控制方法还包括通过所述HPLC法色谱条件检测与黄柏,黄连,黄岑,射干和甘草相对应的对照品,对比分析中药组合物供试品和对照品检测结果中的特征峰信息并据此构建中药组合物质控谱图,再利用所述质控谱图对所述中药组合物产品进行检测。
上述方案中,所述对照品包括对使用对照药材制备的照药材参照物溶液,使用一种或多种标准物质制成的对照品参照物溶液,以及在所述中药组合物的基础上缺省黄柏,黄连,黄芩,射干,甘草中的一种或几种药味的阴性样品等。
本发明的进一步方案为:所述“对比分析中药组合物供试品和对照品检测结果中的特征峰信息并据此构建中药组合物质控谱图”包括:对中药组合物供试品和对照品的HPLC图谱中各特征峰的峰面积和保留时间进行对比,确定所有对应中药组合物供试品的特征峰并据此构建质控谱图;优选的,所述特征峰信息还包括由HPLC仪器采集的光谱信息,在获取特征峰的峰面积和保留时间的基础上,结合所述光谱信息确定对应中药组合物供试品的特征峰。
本发明的进一步方案为:所述“利用所述质控谱图对中药组合物产品进行检测”包括:将待测中药组合物产品的HPLC图谱与中药组合物质控谱图进行对比分析,待测中药组合物产品的特征峰与质控谱图中的特征峰相符合即为合格产品。
本发明还提供了一种如上所述的中药组合物质控谱图,所述中药组合物质控谱图中包括按照出峰时间顺序依次编号的16个色谱峰,其中,峰1~5来自黄柏和/或黄连;峰6~9,峰11以及峰13~15来自黄岑;峰10和峰12来自射干;峰16来自甘草;优选的,峰1为黄柏药材特征峰,峰4为盐酸小檗碱特征峰,峰6为黄芩苷特征峰,峰12为次野鸢尾黄素特征峰,峰16为甘草酸铵特征峰;更优选的,所述中药组合物质控谱图中,以峰4为相对保留时间为1的第一主峰,计算峰2~5的相对保留时间依次为0.87,0.90,1.00和1.03,以峰6为相对保留时间为1的第二主峰,计算峰6~11,13~15的相对保留时间为1.00、1.05、1.09、1.10、1.12、1.18、1.21、1.25、1.28。
上述方案中,本发明提供的HPLC法表征了黄连,黄柏,黄芩,射干和甘草5味药材的16个特征峰,通过供试品与阴性样品、对照药材参照物和标准对照品的参照分析,对16个特征峰进行了成分确认或峰归属确认。说明书附图图17中简明表示了16个峰的位置,其中峰1对应黄柏对照药材参照物,峰4(S1)对应盐酸小檗碱,峰6(S2)对应黄芩苷,峰12对应次野鸢尾黄素,峰16对应甘草酸铵。所述峰1与峰16分别与黄柏对照药材参照物和第一标准品的保留时间和峰面积一致。
本发明还提供了一种如上所述中药组合物质控谱图的构建方法,包括:
(1)取多个批次的中药组合物制成供试品溶液,分别取黄柏,黄连,黄岑,射干和甘草的对照药材制成对照药材参照物溶液,分别取对应中药组合物质控谱图中部分特征峰的标准品制成对照品参照物溶液,最后在中药组合物处方的基础上去除黄柏,黄连,黄岑,射干或甘草中的一种或几种成分的阴性样品溶液;
(2)将步骤(1)所述的供试品溶液,对照药材参照物溶液,对照品参照物溶液和阴性样品溶液均采用如权利要求1或2所述的HPLC色谱条件进行检测;
(3)分析对比根据步骤(2)得到的HPLC色谱图,构建中药组合物的HPLC特征图谱,确认对应中药组合物供试品的16个特征峰信息,即得到所述质控谱图;
步骤(3)中所述特征峰信息包括峰面积,峰高,保留时间和光谱指数。
上述方案中,所述中药组合物选自桂林西瓜霜供试品,对20批桂林西瓜霜供试品进行测定,得到桂林西瓜霜供试品图谱,之后分别测定对照药材参照物,标准对照品和阴性样品,得到各组对照品的特征峰信息,将对照药材参照物,标准对照品和阴性样品分别与所述桂林西瓜霜供试品图谱对比,找出成品特征图谱中具有特征指纹意义的各个峰,对其化学成分进行研究指认,从而得到具有16个峰的桂林西瓜霜质控谱图。
本发明的进一步方案为:所述中药组合物供试品溶液的制备包括取中药组合物产品1g,置于具塞锥形瓶中,加入提取溶剂25ml,超声处理40分钟,取出,放冷,摇匀,滤过,取滤液即得;所述对照药材参照物溶液的制备包括取所述对照药材1g,置于具塞锥形瓶中,加入提取溶剂25ml,超声处理40分钟,取出,放冷,摇匀,滤过,取滤液即得;优选的,所述对照药材参照物溶液的制备包括分别取对照药材黄柏、黄连、黄岑、射干和甘草各1g,置于具塞锥形瓶中,加入提取溶剂25ml,超声处理40分钟,取出,放冷,摇匀,滤过,取滤液即得。
上述方案中,由于优选需要制备多种药材的混合参照物溶液,因此本发明的相关工作人员特意对提取溶剂的选择和提取方法进行了考量,选取了现有技术中常用的提取溶剂甲醇-盐酸(体积比100:1),甲醇,乙醇,70%乙醇,甲醇-水-磷酸(体积比50:50:0.2)和乙醇-水-磷酸(体积比70:30:0.2)进行对比。多味药的混合药材参照物在上述溶剂中提取后0h,24h,48h的溶液进行含量检测,发现其中对应黄芩药材的黄芩苷检测指标在以甲醇-盐酸(体积比100:1),甲醇,乙醇和70%乙醇为提取溶剂时,24h后的含量相比0h时降低了50%以上,遂继续选用甲醇-水-磷酸(体积比50:50:0.2)和乙醇-水-磷酸(体积比70:30:0.2)进行对比,结果在48h后的检测结果与0h峰面积无明显变化,而甲醇-水-磷酸(体积比50:50:0.2)与流动相的组成相近,遂选用甲醇-水-磷酸(体积比50:50:0.2)。
说明书附图1和图2均采用溶剂甲醇-盐酸(体积比100:1)提取,其中图1为0h的色谱图,图2为24h的色谱图,图1中保留时间为50.287min和图2中保留时间为50.280min的峰即为黄芩苷成分,可见其峰面积在24h后有所减少。
说明书附图3和图4均采用溶剂70%乙醇提取,其中图1为0h的色谱图,图2为24h的色谱图,图1中保留时间为55.961min和图2中保留时间为55.945min的峰即为黄芩苷成分,可见其峰面积在24h后有所减少。
说明书附图5和图6均采用溶剂甲醇提取,其中图1为0h的色谱图,图2为24h的色谱图,图1中保留时间为57.175min和图2中保留时间为57.041min的峰即为黄芩苷成分,可见其峰面积在24h后有所减少。
说明书附图7和图8均采用溶剂甲醇-水-磷酸(体积比50:50:0.2)提取,其中图1为0h的色谱图,图2为48h的色谱图,图1中保留时间为57.062min和图2中保留时间为57.024min的峰即为黄芩苷成分,可见其峰面积在48h后无明显变化。
因此,所述提取溶液优选自体积比为50:50:0.2的甲醇-水-磷酸溶液。
本发明的进一步方案为:所述对照品包括标准物质盐酸小檗碱,盐酸巴马汀,黄芩苷,汉黄芩苷,黄芩素,汉黄芩素,次野鸢尾黄素和甘草酸铵中的一种或多种;所述对照品参照物溶液的制备包括取标准品甘草酸铵溶于70%乙醇制成100μg/mL的第一标准对照品溶液,取标准品盐酸小檗碱,黄芩苷,和次野鸢尾黄素溶于甲醇制成盐酸小檗碱浓度为100μg/mL,黄芩苷浓度为120μg/mL,且次野鸢尾黄素浓度为5μg/mL的第二标准对照品溶液;优选的,还包括第三标准对照品溶液,所述第三标准对照品溶液是由如下方式制备的:取标准品盐酸小檗碱,盐酸巴马汀,黄芩苷,汉黄芩苷,黄芩素,汉黄芩素和次野鸢尾黄素溶于甲醇制成盐酸小檗碱和盐酸巴马汀浓度为100μg/mL,黄芩苷,汉黄芩苷,黄芩素和汉黄芩素浓度为120μg/mL,且次野鸢尾黄素浓度为5μg/mL。
上述方案中,为了对质控谱图中的16个特征峰进行精确地确认,在构建质控谱图的过程中,分别采用了五味药材的对照药材做成对照药材参照物,并且利用所述第一标准品溶液和第三标准品溶液综合考察了16个特征峰的信息。在确定质控谱图后,在实际对中药组合物产品进行检测时,采用黄柏对照药材参照物和第二标准对照品溶液的混标即可对16个峰中的主要特征峰进行鉴别和测量,在保证检测精度的基础上,还可降低检测成本。
本发明的进一步方案为:所述阴性样品是在中药组合物处方的基础上,分别去除黄柏,黄连,黄芩,射干或甘草中的一种或几种成分而制成的;优选的,所述阴性样品包括无黄柏阴性样品,无黄连阴性样品,无黄柏黄连阴性样品,无黄芩阴性样品,无射干阴性样品和无甘草阴性样品。
上述方案中,所述阴性样品中的无黄柏黄连对照品为将中药组合物处方中的黄柏和黄连去除后制成的阴性样品,由于黄柏和黄连多含有生物碱并且共同含有盐酸小檗碱,因此为便于对二者进行共同考察,制成此对照品。
采用上述技术方案后,本发明与现有技术相比具有以下有益效果:
1.本发明提供的中药组合物质量控制方法中,对液相色谱的条件进行了探索与改进,使得可在单次检测中对中药组合物中所含的黄柏,黄连,黄芩,射干和甘草进行鉴定和检出,极大地提高了检测效率;
2.本发明提供的中药组合物质量控制方法中,分别制取缺少各成分的阴性样品溶液,并结合对照药材参照物溶液,对照品参照物溶液和供试品溶液对各成分对应的特征峰进行鉴定分析,提高了质量控制标准的精度;
3.本发明提供的中药组合物质量控制方法中,还可同时对五种药材混合的对照药材参照物组,缺少所述五种药材的阴性样品组,对照品参照物组和供试品溶液中的各成分对应的特征峰进行鉴定分析,提高了质控质量的同时,也提高了检测效率。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分,用来提供对本发明的进一步的理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,但不构成对本发明的不当限定。显然,下面描述中的附图仅仅是一些实施例,对于本领域普通技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中:
图1是本发明供试品溶液选择甲醇-盐酸(100:1)为提取溶剂时0h的色谱图;
图2是本发明供试品溶液选择甲醇-盐酸(100:1)为提取溶剂时24h的色谱图;
图3是本发明供试品溶液选择70%乙醇为提取溶剂时0h的色谱图;
图4是本发明供试品溶液选择70%乙醇为提取溶剂液时24h的色谱图;
图5是本发明供试品溶液选择甲醇为提取溶剂时0h的色谱图;
图6是本发明供试品溶液选择甲醇为提取溶剂时24h的色谱图;
图7是本发明供试品溶液选择甲醇-水-磷酸(50:50:0.2)为提取溶剂时0h的色谱图;
图8是本发明供试品溶液选择甲醇-水-磷酸(50:50:0.2)为提取溶剂时48h的色谱图;
图9是本发明供试品溶液在检测波长260nm时的色谱图;
图10是本发明供试品溶液在检测波长273nm时的色谱图;
图11是本发明供试品溶液在检测波长345nm时的色谱图;
图12是本发明供试品溶液在流动相为乙腈-0.1%磷酸时的色谱图;
图13是本发明供试品溶液在流动相为甲醇-乙腈-0.1%磷酸时的色谱图;
图14是本发明供试品溶液在流动相为甲醇-0.05%磷酸时的色谱图;
图15是本发明供试品溶液在流动相为甲醇-0.1%磷酸时的色谱图;
图16是本发明供试品溶液在流动相为甲醇-水时的色谱图;
图17是本发明中五味药材对应的16个特征峰的色谱示意图;
图18是本发明实施例1中针对峰1的桂林西瓜霜供试品,无黄连阴性样品和黄柏对照药材参照物的光谱信息;
图19是本发明实施例1中针对峰1的无黄柏阴性样品,无黄柏黄连阴性样品和黄连对照药材参照物的光谱信息;
图20是本发明实施例1中针对峰2和3的桂林西瓜霜供试品,无黄柏阴性样品和黄连对照药材参照物的光谱信息;
图21是本发明实施例1中针对峰2和3的无黄连阴性样品,无黄柏黄连阴性样品和黄柏对照药材参照物的光谱信息;
图22是本发明实施例1中针对峰4和5的桂林西瓜霜供试品和第三标准对照品的光谱信息;
图23是本发明实施例1中针对峰4和5的无黄柏阴性样品,无黄连阴性样品和无黄柏黄连阴性样品的光谱信息;
图24是本发明实施例1中针对峰4和5的黄连对照药材参照物和黄柏对照药材参照物的光谱信息;
图25是本发明实施例1中针对峰6至峰8的桂林西瓜霜供试品,第三标准对照品和黄芩对照药材参照物的光谱信息;
图26是本发明实施例1中针对峰6至峰8的无黄芩阴性样品的光谱信息;
图27是本发明实施例1中针对峰9和峰11的桂林西瓜霜供试品,第三标准对照品和黄芩对照药材参照物的光谱信息;
图28是本发明实施例1中针对峰9和峰11的无黄芩阴性样品的光谱信息;
图29是本发明实施例1中针对峰13至峰15的桂林西瓜霜供试品,第三标准对照品和黄芩对照药材参照物的光谱信息;
图30是本发明实施例1中针对峰13至峰15的无黄芩阴性样品的光谱信息;
图31是本发明实施例1中针对峰10的桂林西瓜霜供试品,射干对照药材参照物和无射干阴性样品的光谱信息;
图32是本发明实施例1中针对峰12的桂林西瓜霜供试品,第三标准对照品和射干对照药材参照物的光谱信息;
图33是本发明实施例1中针对峰12的无射干阴性样品的光谱信息;
图34是本发明实施例1中针对峰16的桂林西瓜霜供试品,第一标准对照品和甘草对照药材参照物的光谱信息;
图35是本发明实施例1中针对峰16的无甘草阴性样品的光谱信息;
图36是本发明实施例2中混合对照药材参照物,供试样品180920和缺五味药材的阴性样品的色谱信息;
图37是本发明实施例2中供试样品180920和缺五味药材的阴性样品的重叠色谱图;
图38是本发明实施例2中针对峰3干扰峰的光谱指数图;
图39是本发明实施例2中针对峰6无黄芩阴性样品的光谱指数图;
图40是本发明实施例2中针对峰6干扰峰的光谱指数图;
图41是本发明实施例2中针对峰9干扰峰的光谱指数图;
图42是本发明实施例2中针对峰12干扰峰的光谱指数图。
需要说明的是,这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围,而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例中,所述中药组合物选自含有西瓜霜、煅硼砂、黄柏、黄连、山豆根、射干、浙贝母、青黛、冰片、无患子果、大黄、黄芩、甘草和薄荷脑的桂林西瓜霜供试品,结合供试品,对照药材参照物,对照品参照物和多种阴性样品,对桂林西瓜霜中的黄柏,黄连,黄芩,射干和甘草对应的特征峰信息进行了专属性考察,具体方法如下:
首先,选取黄柏,黄连,黄芩,射干和甘草的对照药材分别制取各成分对照药材参照物溶液,制取方法为:取所述对照药材1g,置于具塞锥形瓶中,加入体积比为50:50:0.2的甲醇-水-磷酸溶液25ml,超声处理40分钟,取出,放冷,摇匀,滤过,取滤液即得;
其次,选取标准物质甘草酸铵溶于70%乙醇制成100μg/mL的第一标准对照品溶液,取标准品盐酸小檗碱,盐酸巴马汀,黄芩苷,汉黄芩苷,黄芩素,汉黄芩素和次野鸢尾黄素溶于甲醇制成盐酸小檗碱和盐酸巴马汀浓度为100μg/mL,黄芩苷,汉黄芩苷,黄芩素和汉黄芩素浓度为120μg/mL,且次野鸢尾黄素浓度为5μg/mL的第三标准对照品溶液;
之后,按照以下方法制备桂林西瓜霜供试品溶液:取桂林西瓜霜药品1g,置于具塞锥形瓶中,加入体积比为50:50:0.2的甲醇-水-磷酸溶液25ml,超声处理40分钟,取出,放冷,摇匀,滤过,取滤液即得;
然后,在供试品溶液制备方法的基础上,分别制备无黄柏阴性样品溶液,无黄连阴性样品溶液,无黄柏黄连阴性样品溶液,无黄芩阴性样品溶液,无射干阴性样品溶液和无甘草阴性样品溶液。
分别对上述各组供试品,对照药材参照物,对照品参照物和阴性样品进行色谱分析,所述色谱条件包括以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂,采用梯度洗脱,流动相包括流动相A:0.1wt%的磷酸溶液和流动相B:甲醇,并使用检测波长为260nm二极管阵列检测器。所述梯度洗脱方法如下表所示:
根据检测结果的色谱图及光谱图进行各特征峰的专属性分析,如下:
对于峰1,在黄柏对照药材参照物、缺黄连阴性样品、桂林西瓜供试品中均检出峰1,而缺黄连黄柏阴性样品未检出,缺黄柏阴性样品和黄连对照药材参照物在峰1相应位置有一小峰,其峰高及峰面积均很小,经软件分析其相似度较低,故不认为峰1为黄连黄柏共有特征峰,判定峰1为黄柏特征峰。因综合考虑特征图谱吸收波长选择260nm,而峰1在260nm响应值较低,峰面积峰高值均较小,获取供试品特征图谱时积分参数可进行适度调整并可结合光谱进行判断。说明书附图18记载了桂林西瓜霜供试品,缺黄连阴性样品和黄柏对照药材参照物的光谱信息,说明书附图19记载了缺黄柏阴性样品,缺黄柏黄连阴性样品和黄连对照药材参照物的光谱信息,可进一步印证峰1对应黄柏成分。
对于峰2和峰3,黄连对照药材参照物、缺黄柏阴性样品、桂林西瓜霜供试品中均检出峰2、峰3,而缺黄连阴性样品、缺黄连黄柏阴性样品未检出,故可判定峰2和峰3为黄连特征峰。说明书附图20记载了桂林西瓜霜供试品,缺黄柏阴性样品和黄连对照药材参照物的光谱信息,说明书附图21记载了缺黄连阴性样品,缺黄柏黄连阴性样品和黄柏对照药材参照物的光谱信息,可进一步印证峰2和峰3对应黄连成分。
峰4为盐酸小檗碱,黄连对照药材参照物、黄柏对照药材参照物、桂林西瓜霜供试品中均检出峰4,与第三标准对照品中的盐酸小檗碱保留时间一致,光谱一致;而缺黄连黄柏阴性样品未检出,故可判定峰4为黄连黄柏共有特征峰;峰5为盐酸巴马汀,黄连对照药材参照物、桂林西瓜霜供试品中均检出峰5,与第三标准对照品中的盐酸巴马汀保留时间一致,光谱一致;而黄柏对照药材参照物、缺黄连黄柏阴性样品未检出,故可判定峰5主要来自黄连对照药材参照物,为黄连特征峰。说明书附图22记载了桂林西瓜霜供试品和第三标准对照品的光谱信息,说明书附图23记载了缺黄柏阴性样品,缺黄连阴性样品和缺黄柏黄连阴性样品的光谱信息,说明书附图24记载了黄连对照药材参照物和黄柏对照药材参照物的光谱信息,可进一步印证峰4和峰5对应黄柏黄连共有成分。
对于黄芩药材,由于其所含黄酮类物质较多且在紫外区270~280nm均有较大吸收,综合考虑特征图谱吸收波长选择260nm,其峰面积峰高值仍较大,因此标记了8个特征峰(峰6黄芩苷、峰7、峰8、峰9汉黄芩苷、峰11黄芩素、峰13、峰14汉黄芩素和峰15),分析见后。
峰6为黄芩苷,紫外最大吸收波长277nm,黄芩对照药材参照物、桂林西瓜霜供试品中均检出峰6,与第三标准对照品中的黄芩苷保留时间一致,光谱一致;而缺黄芩阴性样品中未检出,故可判定峰6(黄芩苷)为黄芩特征峰。峰7、峰8为黄芩特征峰,峰7紫外最大吸收波长280nm,峰8紫外最大吸收波长272nm,黄芩对照药材参照物、桂林西瓜霜供试品中均检出峰7和峰8;而缺黄芩阴性样品未检出,故可判定峰7和峰8为黄芩特征峰。说明书附图25记载了桂林西瓜霜供试品,第三标准对照品和黄芩对照药材参照物的光谱信息,说明书附图26记载了缺黄芩阴性样品的光谱信息,可进一步印证峰6至峰8对应黄芩成分。
峰9为汉黄芩苷,紫外最大吸收波长274nm,黄芩对照药材参照物、桂林西瓜霜供试品中均检出峰9,与第三标准对照品中的汉黄芩苷保留时间一致,光谱一致;缺黄芩阴性样品在峰9保留时间稍后位置有一小峰与峰9有部分重叠,其紫外最大吸收波长265nm,在260nm吸收波长色谱图中其峰高峰面积约为供试品峰9峰面积的十分之一,故可判定峰9(汉黄芩苷)为黄芩特征峰。峰11为黄芩素,紫外最大吸收波长276~324nm,黄芩对照药材参照物、桂林西瓜霜供试品均检出峰11,与第三标准对照品中的黄芩素保留时间一致,光谱一致;而缺黄芩阴性样品未检出,故可判定峰11(黄芩素)为黄芩特征峰。说明书附图27记载了桂林西瓜霜供试品,第三标准对照品和黄芩对照药材参照物的光谱信息,说明书附图28记载了缺黄芩阴性样品的光谱信息,可进一步印证峰9和峰11对应黄芩成分。
峰13、峰15为黄芩特征峰,峰13紫外最大吸收波长269nm,峰15紫外最大吸收波长271nm,黄芩对照药材参照物、桂林西瓜霜供试品中均检出峰13和峰15;而缺黄芩阴性样品未检出,故可判定峰13和峰15为黄芩特征峰。峰14为汉黄芩素,紫外最大吸收波长275nm,黄芩对照药材参照物、桂林西瓜霜供试品中均检出峰14,与第三标准对照品中的汉黄芩素保留时间一致,光谱一致;而缺黄芩阴性样品未检出,故可判定峰14(汉黄芩素)为黄芩特征峰。说明书附图29记载了桂林西瓜霜供试品,第三标准对照品和黄芩对照药材参照物的光谱信息,说明书附图30记载了缺黄芩阴性样品的光谱信息,可进一步印证峰13至峰15对应黄芩成分。
峰10为射干特征峰,紫外最大吸收波长265nm,射干对照药材参照物、桂林西瓜霜供试品中均检出峰10,光谱基本一致;缺射干阴性样品在此保留时间稍后位置有一小峰与峰10有部分重叠,紫外最大吸收波长256nm,在260nm吸收波长其峰面积约为供试品峰面积的五分之一,对供试品的光谱影响不大,故仍可判定峰10为射干特征峰。峰12为次野鸢尾黄素,紫外最大吸收波长265nm,射干对照药材参照物、桂林西瓜霜供试品中均检出峰12,与第三标准对照品中的次野鸢尾黄素保留时间一致,光谱一致;而缺射干阴性样品未检出,故可判定峰12(次野鸢尾黄素)为射干特征峰。说明书附图31记载了桂林西瓜霜供试品,射干对照药材参照物和缺射干阴性样品的光谱信息,可进一步印证峰10对应射干成分。说明书附图32记载了桂林西瓜霜供试品,第三标准对照品和射干对照药材参照物的光谱信息,说明书附图33记载了缺射干阴性样品的光谱信息,可进一步印证峰12对应射干成分。
峰16为甘草酸铵,紫外最大吸收波长251nm,甘草对照药材参照物、桂林西瓜霜供试品中均检出峰16,与第一标准对照品中的甘草酸铵保留时间一致,光谱一致;而缺甘草阴性样品中未检出,故可判定峰16(甘草酸铵)为甘草特征峰。说明书附图34记载了桂林西瓜霜供试品,第一标准对照品和甘草对照药材参照物的光谱信息,说明书附图35记载了缺甘草阴性样品的光谱信息,可进一步印证峰16对应甘草成分。
实施例2
本实施例中,所述中药组合物选自含有西瓜霜、煅硼砂、黄柏、黄连、山豆根、射干、浙贝母、青黛、冰片、无患子果、大黄、黄芩、甘草和薄荷脑的桂林西瓜霜供试品,结合供试品,对照药材参照物,对照品参照物和多种阴性样品,对桂林西瓜霜中的黄柏、黄连、黄芩、射干和甘草对应的特征峰信息进行了专属性考察,具体方法如下:
首先,选取黄柏、黄连、黄芩、射干和甘草的对照药材制取混合成分的对照药材参照物溶液,制取方法为:取所述各对照药材1g,置于具塞锥形瓶中,加入体积比为50:50:0.2的甲醇-水-磷酸溶液25ml,超声处理40分钟,取出,放冷,摇匀,滤过,取滤液即得;
其次,选取标准物质甘草酸铵溶于70%乙醇制成100μg/mL的第一标准对照品溶液,取标准品盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和次野鸢尾黄素溶于甲醇制成盐酸小檗碱和盐酸巴马汀浓度为100μg/mL,黄芩苷,汉黄芩苷,黄芩素和汉黄芩素浓度为120μg/mL,且次野鸢尾黄素浓度为5μg/mL的第三标准对照品溶液;
之后,按照以下方法制备桂林西瓜霜供试品溶液:取桂林西瓜霜药品1g,置于具塞锥形瓶中,加入体积比为50:50:0.2的甲醇-水-磷酸溶液25ml,超声处理40分钟,取出,放冷,摇匀,滤过,取滤液即得;
然后,在供试品溶液制备方法的基础上,制备无黄柏,无黄连,无黄芩,无射干并且无甘草的阴性样品溶液。
分别对上述各组供试品,对照药材参照物,对照品参照物和阴性样品进行色谱分析,所述色谱条件包括以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂,采用梯度洗脱,流动相包括流动相A:0.1wt%的磷酸溶液和流动相B:甲醇,并使用检测波长为260nm二极管阵列检测器。所述梯度洗脱方法如下表所示:
根据检测结果的色谱图及光谱图进行各特征峰的专属性分析,如下:
检测结果表明,黄柏、黄连、黄芩、射干和甘草五味药材混合粉制备的对照药材参照物与桂林西瓜霜药品(180920批)制备的供试品所得谱图一致,均检出制定标准中标定的16个色谱峰;缺五味药材的阴性样品谱图中在峰3、峰6、峰9、峰10和峰12保留时间前后位置有小的干扰峰,从重叠色谱图可知,桂林西瓜霜药品(180920批)制备的供试品扣除干扰峰后的谱图仍可标定16个色谱峰(见说明书附图36和图37);通过色谱图及光谱图比较,可表明干扰峰与标定的色谱峰保留时间及光谱图并不完全一致,分析见后。
干扰峰峰3与标定的色谱峰保留时间不一致,干扰峰保留时间为41.506,供试样品180920峰3的保留时间为41.0456,从光谱指数图对比可看出峰3无干扰,因此可判定干扰峰峰3为标定的峰3保留时间后的一个峰,与标定的峰3保留时间相差约0.5分钟。光谱指数图见图38,保留时间及峰面积见下表:
名称 | 保留时间(min) | 峰面积 | 峰高 |
混合对照药材参照物 | 40.956 | 824082 | 68030 |
供试样品180920 | 41.045 | 360307 | 30832 |
缺五种阴性样品 | 41.506 | 141931 | 10962 |
干扰峰峰6保留时间为56.361与供试样品180920峰6(保留时间56.368)相近,干扰峰峰6的峰面积为238128,约为供试样品180920峰6的峰面积(9956358)的2.4%。从缺黄芩阴性样品的光谱指数图图39可看出峰6无干扰,因此可判定干扰峰峰6的干扰很小,可忽略。另附供试样品,混合对照药材参照物和阴性样品的光谱指数图图40,保留时间及峰面积见下表:
名称 | 保留时间(min) | 峰面积 | 峰高 |
混合对照药材参照物 | 56.416 | 11541483 | 852254 |
供试样品180920 | 56.368 | 9956358 | 738888 |
缺五种阴性样品 | 56.361 | 238128 | 19069 |
干扰峰峰9保留时间为62.074,与供试样品180920峰9(保留时间62.047)相近,干扰峰峰9的峰面积为101934,约为供试样品180920峰9的峰面积(2547852)的4.0%。干扰很小,因此可判定干扰峰峰9的干扰很小,可忽略。光谱指数图见图41,保留时间及峰面积见下表:
名称 | 保留时间(min) | 峰面积 | 峰高 |
混合对照药材参照物 | 62.061 | 2765383 | 243637 |
供试样品180920 | 62.047 | 2547852 | 222679 |
缺五种阴性样品 | 62.074 | 101934 | 7309 |
干扰峰峰10保留时间为63.293,与供试样品180920峰10(保留时间63.281)相近,干扰峰峰10的紫外最大吸收波长256nm,在260nm吸收波长其峰面积(254106)约为供试样品180920(662330)峰面积的三分之一,对供试样品的光谱影响不大,故干扰峰峰10有一定干扰但仍可判定峰10为特征峰。光谱指数图见图41,保留时间及峰面积见下表:
干扰峰峰12与标定的色谱峰保留时间不一致,干扰峰保留时间为67.275,供试样品180920峰12的保留时间为67.800,从光谱指数图对比可看出峰12无干扰,因此可判定干扰峰峰12为标定的峰12保留时间前的一个峰,与标定的峰12保留时间相差约0.55分钟。光谱指数图见图42,保留时间及峰面积见下表:
名称 | 保留时间(min) | 峰面积 | 峰高 |
混合对照药材参照物 | 67.829 | 115149 | 12251 |
供试样品180920 | 67.800 | 192831 | 20026 |
缺五种阴性样品 | 67.275 | 123014 | 11836 |
实施例3
本实施例中,对实施例1或2记载的特征图谱方法进行精密度和耐用性测试。
A.精密度试验
(1)重复性试验及范围
取同一批号的供试品(批号:180920),设计3个不同样品浓度即取3个不同取样量(0.5g、1g、1.5g),按供试品制备方法,每个浓度分别制备3份供试品溶液进行测定,计算相对保留时间的RSD%值,计算结果16个特征峰相对保留时间的RSD%值均小于1,表明重复性符合要求。结果表明样品取样量在0.5~1.5g范围均可获得特征图谱,因此将样品取样量确定为:取本品约1g。
(2)中间精密度及供试品稳定性
取同一批号的供试品(批号:180920),平行制备6份以上供试品溶液进行测定,计算相对保留时间的RSD%值,计算结果16个特征峰相对保留时间的RSD%值均小于1,表明中间精密度符合要求。在不同时间对同一份供试品溶液进行测定,结果表明供试品在24小时内均可获得一致的谱图,计算结果16个特征峰相对保留时间的RSD%值均小于1,表明供试品溶液在24小时内是稳定的。
B.耐用性试验
(1)提取溶剂浓度
取同一批号的供试品(批号:180920),设计3个不同提取溶剂浓度即甲醇-水-磷酸溶液分别按45:55:0.2、50:50:0.2、55:45:0.2配制,按供试品制备方法,每个溶剂浓度分别制备3份供试品溶液进行测定,计算相对保留时间的RSD%值,计算结果16个特征峰相对保留时间的RSD%值均小于1,获得的谱图一致,表明提取溶剂浓度的微小变化对测定结果影响很小。
(2)提取时间
取同一批号的供试品(批号:180920),设计3个不同提取时间(30min、40min、50min),按供试品制备方法,每个提取时间分别制备3份供试品溶液进行测定,计算相对保留时间的RSD%值,计算结果16个特征峰相对保留时间的RSD%值均小于1,获得的谱图一致,表明提取时间的微小变化对测定结果影响很小。
(3)不同流速
取同一批号的供试品(批号:180920),设计3个不同流速(0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min),按供试品制备方法,每个提取时间分别制备3份供试品溶液进行测定,计算相对保留时间的RSD%值,计算结果除峰1相对保留时间的RSD%值为5.8%外,其余15个特征峰相对保留时间的RSD%值均小于1.5,获得的谱图一致,表明流速的微小变化对测定结果影响较小。
(4)不同进样体积
取同一批号的供试品(批号:180920),按供试品制备方法制备供试品溶液,分别进样2μL、5μL、10μL进行测定,计算相对保留时间的RSD%值,计算结果16个特征峰相对保留时间的RSD%值均小于1,进样2μL、5μl获得的色谱图峰高峰面积较小不利于特征峰的标记,故进样体积规定为10μl。
(5)不同柱温
取同一批号的供试品(批号:180920),按供试品制备方法制备供试品溶液,分别在30℃、35℃、40℃柱温条件下进行测定,计算相对保留时间的RSD%值,计算结果除峰1相对保留时间的RSD%值为8.5%、峰16相对保留时间的RSD%值为2.3%外,其余14个特征峰相对保留时间的RSD%值均小于2,获得的谱图一致,表明柱温变化对测定结果有一定影响。
(6)色谱柱
选用三根不同生产厂家的柱子进行比较,柱子类型规格见下表。按供试品制备方法制备供试品溶液,在35℃柱温条件下进行测定,计算结果除峰1相对保留时间的RSD%值为4.9%外,其余15个特征峰相对保留时间的RSD%值均小于1.5,获得的谱图一致。根据试验结果,色谱条件确定为:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;理论板数按黄芩苷峰计算应不低于300000。
实施例4
本实施例中,采用实施例1或2构建的质控谱图,对桂林西瓜霜药品进行检测,采用黄柏对照药材参照物和第二标准对照品制成混标,同时采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件将待测桂林西瓜霜药品的HPLC图谱与所述质控谱图进行对比分析,待测桂林西瓜霜产品出现所有特征峰,并且所有特征峰的相似度均大于0.90,判定为合格产品。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (14)
1.一种中药组合物的质量控制方法,所述中药组合物包括西瓜霜、煅硼砂、黄柏、黄连、山豆根、射干、浙贝母、青黛、冰片、无患子果、大黄、黄芩、甘草和薄荷脑,其特征在于,所述质量控制方法包括采用HPLC法同时检测中药组合物中黄柏、黄连、黄岑、射干和甘草成分,所述HPLC法的色谱条件如下:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,进行梯度洗脱;理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于300000;
所述梯度洗脱的过程如下:
在0~9min时段,流动相A的比例从18%升至23%,流动相B的比例从82%降至77%;
在9~15min时段,流动相A的比例从23%升至25%,流动相B的比例从77%降至75%;
在15~27min时段,流动相A的比例维持在25%,流动相B的比例维持在75%;
在27~36min时段,流动相A的比例从25%升至35%,流动相B的比例从75%降至65%;
在36~50min时段,流动相A的比例从35%升至45%,流动相B的比例从65%降至55%;
在50~75min时段,流动相A的比例从45%升至80%,流动相B的比例从55%降至20%;
在75~88min时段,流动相A的比例维持在80%,流动相B的比例维持在20%;
在88~90min时段,流动相A的比例从80%降至18%,流动相B的比例从20%升至82%;
所述质量控制方法还包括通过所述HPLC法的色谱条件检测与黄柏,黄连,黄岑,射干和甘草相对应的对照品,对比分析中药组合物供试品和对照品检测结果中的特征峰信息并据此构建中药组合物质控谱图,再利用所述质控谱图对中药组合物产品进行检测;
中药组合物供试品溶液的制备包括取中药组合物产品1g,置于具塞锥形瓶中,加入提取溶剂25ml,超声处理40分钟,取出,放冷,摇匀,滤过,取滤液即得;
所述提取溶剂选自体积比为50:50:0.2的甲醇-水-磷酸溶液。
2.根据权利要求1所述的中药组合物的质量控制方法,其特征在于,所述HPLC法的色谱条件还包括使用检测波长为260nm二极管阵列检测器采集特征峰信息。
3.根据权利要求1所述的中药组合物的质量控制方法,其特征在于,所述“对比分析中药组合物供试品和对照品检测结果中的特征峰信息并据此构建中药组合物质控谱图”包括:对中药组合物供试品和对照品的HPLC图谱中各特征峰的峰面积和保留时间进行对比,确定所有对应中药组合物供试品的特征峰并据此构建质控谱图。
4.根据权利要求3所述的中药组合物的质量控制方法,其特征在于,所述特征峰信息还包括由HPLC仪器采集的光谱信息,在获取特征峰的峰面积和保留时间的基础上,结合所述光谱信息确定对应中药组合物供试品的特征峰。
5.根据权利要求3所述的中药组合物的质量控制方法,其特征在于,所述“利用所述质控谱图对中药组合物产品进行检测”包括:将待测中药组合物产品的HPLC图谱与中药组合物质控谱图进行对比分析,待测中药组合物产品的特征峰与质控谱图中的特征峰相符合即为合格产品。
6.一种中药组合物的质控谱图的构建方法,所述中药组合物包括西瓜霜、煅硼砂、黄柏、黄连、山豆根、射干、浙贝母、青黛、冰片、无患子果、大黄、黄芩、甘草和薄荷脑,其特征在于,所述构建方法包括:
(1)取多个批次的中药组合物制成供试品溶液,分别取黄柏,黄连,黄岑,射干和甘草的对照药材制成对照药材参照物溶液,分别取对应中药组合物质控谱图中部分特征峰的标准品制成对照品参照物溶液,最后在中药组合物处方的基础上去除黄柏,黄连,黄岑,射干或甘草中的一种或几种成分的阴性样品溶液;
(2)将步骤(1)所述的供试品溶液,对照药材参照物溶液,对照品参照物溶液和阴性样品溶液均采用以下 HPLC法的色谱条件进行检测:
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,进行梯度洗脱;理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于300000;
所述梯度洗脱的过程如下:
在0~9min时段,流动相A的比例从18%升至23%,流动相B的比例从82%降至77%;
在9~15min时段,流动相A的比例从23%升至25%,流动相B的比例从77%降至75%;
在15~27min时段,流动相A的比例维持在25%,流动相B的比例维持在75%;
在27~36min时段,流动相A的比例从25%升至35%,流动相B的比例从75%降至65%;
在36~50min时段,流动相A的比例从35%升至45%,流动相B的比例从65%降至55%;
在50~75min时段,流动相A的比例从45%升至80%,流动相B的比例从55%降至20%;
在75~88min时段,流动相A的比例维持在80%,流动相B的比例维持在20%;
在88~90min时段,流动相A的比例从80%降至18%,流动相B的比例从20%升至82%;
(3)分析对比根据步骤(2)得到的HPLC色谱图,构建中药组合物的HPLC特征图谱,确认对应中药组合物供试品的16个特征峰信息,即得到所述质控谱图;
中药组合物供试品溶液的制备包括取中药组合物产品1g,置于具塞锥形瓶中,加入提取溶剂25ml,超声处理40分钟,取出,放冷,摇匀,滤过,取滤液即得;
所述提取溶剂选自体积比为50:50:0.2的甲醇-水-磷酸溶液。
7.根据权利要求6所述的中药组合物的质控谱图的构建方法,其特征在于,所述对照药材参照物溶液的制备包括取所述对照药材1g,置于具塞锥形瓶中,加入提取溶剂25ml,超声处理40分钟,取出,放冷,摇匀,滤过,取滤液即得。
8.根据权利要求7所述的中药组合物的质控谱图的构建方法,其特征在于,所述对照药材参照物溶液的制备包括分别取对照药材黄柏,黄连,黄岑,射干和甘草各1g,置于具塞锥形瓶中,加入提取溶剂25ml,超声处理40分钟,取出,放冷,摇匀,滤过,取滤液即得。
9.根据权利要求6所述的中药组合物的质控谱图的构建方法,其特征在于,所述对照品包括标准物质盐酸小檗碱,盐酸巴马汀,黄芩苷,汉黄芩苷,黄芩素,汉黄芩素,次野鸢尾黄素和甘草酸铵;所述对照品参照物溶液的制备包括取标准品甘草酸铵溶于70%乙醇制成100μg/mL的第一标准对照品溶液,取标准品盐酸小檗碱,黄芩苷,和次野鸢尾黄素溶于甲醇制成盐酸小檗碱浓度为100μg/mL,黄芩苷浓度为120μg/mL,且次野鸢尾黄素浓度为5μg/mL的第二标准对照品溶液。
10.根据权利要求9所述的中药组合物的质控谱图的构建方法,其特征在于,还包括第三标准对照品溶液,所述第三标准对照品溶液是由如下方式制备的:取标准品盐酸小檗碱,盐酸巴马汀,黄芩苷,汉黄芩苷,黄芩素,汉黄芩素和次野鸢尾黄素溶于甲醇制成盐酸小檗碱和盐酸巴马汀浓度为100μg/mL,黄芩苷,汉黄芩苷,黄芩素和汉黄芩素浓度为120μg/mL,且次野鸢尾黄素浓度为5μg/mL;
所述阴性样品是在中药组合物处方的基础上,分别去除黄柏,黄连,黄芩,射干或甘草中的一种或几种成分而制成的。
11.根据权利要求10所述的中药组合物的质控谱图的构建方法,其特征在于,所述阴性样品包括无黄柏阴性样品,无黄连阴性样品,无黄柏黄连阴性样品,无黄芩阴性样品,无射干阴性样品和无甘草阴性样品。
12.根据权利要求6-11任一所述的中药组合物的质控谱图的构建方法,其特征在于,根据所述构建方法构建的质控谱图中包括按照出峰时间顺序依次编号的16个色谱峰,其中,峰1~5来自黄柏和/或黄连;峰6~9,峰11以及峰13~15来自黄岑;峰10和峰12来自射干;峰16来自甘草。
13.根据权利要求12所述的中药组合物的质控谱图的构建方法,其特征在于,峰1为黄柏药材特征峰,峰4为盐酸小檗碱特征峰,峰6为黄芩苷特征峰,峰12为次野鸢尾黄素特征峰,峰16为甘草酸铵特征峰。
14.根据权利要求13所述的中药组合物的质控谱图的构建方法,其特征在于,根据所述构建方法构建的质控谱图中,以峰4为相对保留时间为1的第一主峰,计算峰2~5的相对保留时间依次为0.87,0.90,1.00和1.03,以峰6为相对保留时间为1的第二主峰,计算峰6~11,13~15的相对保留时间为1.00、1.05、1.09、1.10、1.12、1.18、1.21、1.25、1.28。
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