CN115161218A - 一种能降解农业枯枝落叶废弃物的细菌菌株、其筛选方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种能降解农业枯枝落叶废弃物的细菌菌株、其筛选方法及应用，该菌株MDD 2020属于Ochrobactrumpseudintermeddium（假中间苍白杆菌属），2021年4月19日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.22199。利用菌株MDD 2020发酵的方法降解农业枯枝落叶废弃物，促进枯枝落叶堆肥的腐熟进程，为枯枝落叶堆肥化的推广利用提供技术支持，达到变废为宝、保护环境，促进农业可持续发展的目的，具有广阔的应用前景。

Description

一种能降解农业枯枝落叶废弃物的细菌菌株、其筛选方法及 应用

技术领域

本发明属于菌株生物技术领域，具体涉及一种能降解农业枯枝落叶废弃物的细菌菌株、其筛选方法及应用。

背景技术

木质素是构成植物木质部的复杂高分子化合物，是仅次于纤维素的第二大丰富的植物源材料。木质素是植物细胞壁的重要组成部分，约占植物体干质量的15% - 40%。自然界中的木质素的年光合产量约为200×10⁸吨。由于木质素结构复杂，富含木质素的农业和园林枯枝落叶废弃物不易腐烂降解，造成了堆肥还田的难度，绝大部分都被随意堆放在路边或就地焚烧，造成严重的大气污染，堆放过程会诱发田间的病虫害，同时也造成了宝贵资源的浪费。

将农业废弃物中的木质素进行固体有机废弃物资源化(堆肥)是解决这一问题简单有效的途径。研究表明，园林废弃物作为堆肥物料的调理剂，对堆肥物料的含水率、孔隙度和碳氮比等有良好的调节作用。而木质素结构复杂，降解难度大。天然条件下的木质素降解菌种类单一，数量较少，限制了木质素降解速率，阻碍了堆肥的腐熟进度。通过接种木质素降解菌菌剂，可以加速堆体升温，加快堆肥底物中木质素的分解，从而缩短堆肥腐熟的周期。通过联合堆肥化实验的结果显示，枯枝落叶堆肥养分丰富全面，病菌数量达到无害化，是一种成熟稳定和富含营养的优质有机肥和土壤改良剂。可见将枯枝落叶进行固体有机废弃物资源化（堆肥）是解决其无害化、再循环问题的有效途径。若能筛选到相应的高效降解功能菌株，并将其用于农业枯枝落叶废弃物堆肥生产，具有良好的应用前景和实用价值。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，从而提供一株能降解农业枯枝落叶废弃物的细菌菌株及其筛选方法，目的在于筛选一种能够高效分解农业枯枝落叶废弃物中木质素的细菌，通过其对木质素的高效降解效果，达到加速枯枝落叶废弃物堆肥腐熟的目的。从而使农业枯枝落叶废弃物能够通过堆肥化得以大规模的资源化再利用，确保可持续农业的顺利发展。

为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案一种能降解农业枯枝落叶废弃物的细菌菌株，其中，该菌株MDD 2020属于假中间苍白杆菌属，2021年4月19日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 22199。

作为本发明的另一方面，本发明提供一种MDD 2020细菌菌株的筛选方法，其对木质素降解菌进行30 d连续两代以枯枝落叶粉末为唯一碳源的固态富集和液态富集，在愈创木酚选择培养基上进行分离纯化。

优选的，所述固态富集和液态富集，其使用的培养基分别为固态富集培养基和液态富集培养基，配方如下，固态富集培养基：枯枝落叶粉末、水，枯枝落叶粉末与水的质量体积比2g/ml；液态富集培养基：（NH₄）₂SO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7 g/L H₂O 0.5 g/L。

优选的，将菌株MDD 2020接入产酶培养基的中，振荡培养9-21d。

优选的，产酶培养基的配方为（/L）：葡萄糖 20 g，酒石酸铵 0.2 g，梨树枝条粉 1g，基础培养基100 mL，0.1 mol / L NaAc-HAc 缓冲液（pH= 4.5） 100 mL，吐温80 1.0 gVB₁ 1.0 mg。

作为本发明的另一方面，本发明提供一种用于MDD 2020细菌菌株筛选的培养基，其特征在于：包括固态富集培养基和/或液态富集培养基，配方如下，固态富集培养基：枯枝落叶粉末、水，枯枝落叶粉末与水的质量体积比2g/ml；液态富集培养基：（NH₄）₂SO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L。

作为本发明的另一方面，本发明提供一种MDD 2020细菌菌株的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供一株能降解农业枯枝落叶废弃物的细菌菌株，该菌株MDD 2020属于Ochrobactrum pseudintermeddium(假中间苍白杆菌属)，2021年4月19日寄存于中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCC NO.22199，建议的分类命名为 Ochrobactrumciceri。其生物学特性为：在LB培养基上，37℃，培养36h，菌落近圆形、呈乳白色、表面湿润、光滑微凸、单菌落直径4mm左右，革兰氏阴性，接触酶、氧化酶阳性。吲哚阴性。利用微生物菌株MDD 2020发酵的方法降解农业枯枝落叶废弃物，促进枯枝落叶堆肥的腐熟进程，为枯枝落叶堆肥化的推广利用提供技术支持，达到变废为宝、保护环境，促进农业可持续发展的目的，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明细菌MDD 2020的退色反应图；

图2是本发明的细菌MDD 2020基于16S rDNA序列相似性的***发育树；

图3是本发明的细菌MDD 2020发酵粗酶液中Lip木质素过氧化物酶的活性图；

图4是本发明的细菌MDD 2020发酵粗酶液中MnP锰过氧化物酶的活性图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。

本发明中使用的培养基配方和酶活力、固态降解能力测定方法如下：

固态富集培养基：枯枝落叶粉末20 g（桃园土壤上层覆盖的桃树落叶和断枝，蒸馏水洗净，烘干粉碎后过60目筛），蒸馏水 10 ml。

液态富集培养基（/L）：（NH₄）₂SO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g。

愈创木酚选择培养基（/L）：愈创木酚1 g，KNO₃ 2 g，MgSO₄ 0.5 g，KH₂PO₄ 1 g，NaCl 1 g，Na₂HPO₄ 1 g，琼脂20 g。

LB-愈创木酚培养基：LB培养基中加入1 g·L^-1愈创木酚。

LB-愈创木酚培养基：LB培养基中加入1 g·L^-1愈创木酚。

LB-苯胺蓝培养基：LB培养基加入0.1 g·L^-1苯胺蓝。

产酶培养基（/L）：葡萄糖 20 g，酒石酸铵 0.2 g，枯枝落叶粉末1 g（桃园土壤上层覆盖的桃树落叶和断枝，蒸馏水洗净，烘干粉碎后过60目筛） 1 g，基础培养基100 mL，0.1 mol / L NaAc-HAc 缓冲液（pH= 4.5） 100 mL，吐温80 1.0 g VB₁ 1.0 mg。

基础培养基（/L）：K₂PO₄ 20 g ，MnSO₄ 5 g，CaCl₂ 1 g，微量元素液 100 mL。

微量元素液（/L）：MgSO₄ 3.0g，MnSO₄ 0.5 g，NaCl 1.0 g，FeSO₄·7H₂SO₄ 0.1 g，CoCl₂ 0.1 g， CuSO₄ 0.1 g， H₃BO₃ 0.01 g， ZnSO₄·7H₂O 0.1 g ， AlK（SO₄）₂·12H₂O0.01 g， Na₂MoO₄· 2H₂O 0.01 g。

固态培养营养液（/L）:NH₄Cl 2.0 g，MgSO₄·7H2O 0.5 g，KH₂PO₄ 1.0 g，Na₂HPO₄0.2 g，MnSO₄ 0.035 g，CuSO₄·5H₂O 0.007 g，FeSO₄·7H₂O 0.007 g。

酶活力测定：将菌株MDD 2020接入已装有100 mL产酶培养基的三角瓶（250 mL）中，置28℃下160 r·min^-1振荡培养21 d。每2 d取样1次，离心过滤除去菌体和杂质，得到粗酶液，测定粗酶液中Lip（木质素过氧化物酶）和MnP（锰过氧化物酶）的活性。

固态降解测定：向分化罐中加入5 g枯枝落叶粉末（桃园土壤上层覆盖的桃树落叶和断枝，蒸馏水洗净，烘干粉碎后过60目筛）和10 mL固态培养营养液，至固液混匀并显平坦状，灭菌后接种1%细菌MDD 2020的菌种悬液（10⁷/mL）后分别置于30 ℃和50 ℃恒温箱中培养30 d。培养期间，适当补充水分以维持湿度。培养结束后，于105 ℃下烘干至恒重称重，测定30 d后枯枝落叶粉末培养基的失重率。

实施例1

本发明提供一株能降解农业枯枝落叶废弃物的细菌菌株，该菌株MDD 2020属于Ochrobactrumpseudintermeddium（假中间苍白杆菌属），2021年4月19日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 22199。其生物学特性为：在LB培养基上，37℃，培养36 h，菌落近圆形、呈乳白色、表面湿润、光滑微凸、单菌落直径4mm左右，革兰氏阴性，接触酶、氧化酶阳性。吲哚阴性。

采用细菌通用引物27f和1492r进行PCR扩增，在GenBank中以BLAST进行序列同源性比较，MDD 2020与Ochrobactrum pseudintermedium同源性达98%，选取和它相近的一些菌株绘制***发育进化树，以及结合菌落形态学特征，鉴定该菌株为Ochrobactrum pseudintermeddium（假中间苍白杆菌属）。

菌株MDD 2020通过以枯枝落叶粉末为唯一碳源的液态富集培养基和固态富集培养基富集，富集过后在愈创木酚选择培养基上挑选生长良好且得以分离纯化，在LB-愈创木酚平板上检测显色反应，在LB-苯胺蓝平板上检测褪色反应。具体的：

1）木质素高效降解菌的富集：降解菌样品挑选常年堆置腐败变碎的枯枝落叶，采自无锡桃园中。分别通过30 d连续两代以枯枝落叶粉末为唯一碳源的固态富集和液态富集。获得对枯枝落叶中的木质素有高效降解效果的菌株。

具体操作为：取0.2 g降解菌样品于20 g的固态培养基中混合，隔5 d添加10 mL无菌水，30 ℃恒温培养30 d后，挑选培养基表面有黑色降解斑的部分0.2 g，重新接种到20 g新的固态培养基中，隔5 d添加10 mL无菌水，30 ℃恒温继续培养30 d，然后挑选培养基表面有黑色降解斑的部分1 g到100 mL的液态富集培养基中，隔5 d添加10 mL无菌水，30 ℃恒温继续培养30 d，取液态富集培养基1 ml，重新接种到新的100 mL的液态富集培养基中，隔5 d添加10 mL无菌水，30 ℃条件下继续培养30 d，形成富集样品的悬液。

2）木质素降解菌的分离筛选：利用梯度稀释涂布法将富集样品的悬液进行稀释分离，具体操作为：从富集样品的悬液中吸取1 mL到9 mL 无菌水中试管，涡旋10 s，此时的稀释梯度为10^-1，再取1 mL到新的9 mL无菌水的试管中，涡旋10 s，此时稀释梯度为10^-2，按照此方法依次稀释到10^-4。取1 μg稀释的过的菌悬液涂布到愈创木酚选择培养基上，30 ℃恒温培养2-3 d，挑选生长较快菌株，进行反复划线分离，直至得到一株纯菌株，4 ℃保存备用。

将分离到的菌株接种到LB-愈创木酚平板和LB-苯胺蓝平板上观察其显色圈和退色圈产生的时间和大小，结果如图1所示。实验发现，菌株MDD 2020在LB-愈创木酚平板上无显色反应，但可以在LB-苯胺蓝平板上产生褪色圈。该菌株基于16S rDNA序列相似性的***发育树结果如图2。

3）降解酶活力的测定：按1%接种量接种细菌MDD 2020的菌种悬液（10⁷/mL）接入已装有100 mL产酶培养基的三角瓶（250 mL）中，置28℃下160 r/min振荡培养21 d。每2 d取样1次，发酵液离心过滤除去菌体和杂质，得到粗酶液。通过接种入液态产酶测定21 d中菌种产酶活力的变化，测定其中Lip（木质素过氧化物酶）和MnP（锰过氧化物酶）的活性。Lip的酶活定义为每分钟氧化1 μmol 的藜芦醇为一个酶活单位（U）。MnP的酶活的定义为每分钟氧化1 μmoL的Mn²⁺为Mn³⁺为一个酶活单位（U）。

经过21 d的液体发酵，测定粗酶液中木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶活力。木质素过氧化物酶的产酶最高峰是在第12 d，其值为18.46 U·mL^-1，而后开始下降。锰过氧化物酶的产酶最高峰是在第15 d，其值为9.64 U·mL^-1，菌株MDD 2020可以产木质素降解酶能力较强，产酶较快，产酶维持时间较长。

4）固态降解能力测定：向分化罐中加入5 g枯枝落叶粉末（桃园土壤上层覆盖的落叶和断枝，蒸馏水洗净，烘干粉碎后过60目筛）和10 mL固态培养营养液，至固液混匀并显平坦状，灭菌后按1 %接种量接种细菌MDD 2020的菌种悬液（10⁷/mL）到固态降解培养基，将所筛选出的菌株分别置于30 ℃和50 ℃恒温箱中培养30 d。培养期间，适当补充水分以维持湿度。培养结束后，于105 ℃下烘干至恒重称重。降解率计算方法如下：

降解率=（降解前总质量-降解后总质量）/5 g×100%。

固态降解试验表明，30℃条件下，固态降解30 d，接种细菌MDD 2020培养基降解率可到达8.67 %。50℃条件下，固态降解30 d，接种细菌MDD 2020培养基降解率可到达8.33%。

本发明是利用微生物菌株MDD 2020发酵的方法降解农业枯枝落叶废弃物，促进枯枝落叶堆肥的腐熟进程，为枯枝落叶堆肥化的推广利用提供技术支持，达到变废为宝、保护环境，促进农业可持续发展的目的，具有广阔的应用前景。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种能降解农业枯枝落叶废弃物的细菌菌株，其特征在于：该菌株MDD 2020属于假中间苍白杆菌属，2021年4月19日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO. 22199。

2.权利要求1所述的细菌菌株的筛选方法，其特征在于：对降解菌进行30 d连续两代以枯枝落叶粉末为唯一碳源的固态富集和液态富集，在愈创木酚选择培养基上进行分离纯化。

3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：所述固态富集和液态富集，其使用的培养基分别为固态富集培养基和液态富集培养基，配方如下，

固态富集培养基：枯枝落叶粉末、水，枯枝落叶粉末与水的质量体积比2g/ml；

液态富集培养基：（NH₄）₂SO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7 g/L ，H₂O 0.5 g/L。

4.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于：将分离纯化后的菌株MDD 2020接入产酶培养基的中，振荡培养21 d。

5.如权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：产酶培养基的配方为（/L）：葡萄糖 20g，酒石酸铵 0.2 g，梨树枝条粉 1 g，基础培养基100 mL，0.1 mol / L、 pH= 4.5 NaAc-HAc 缓冲液100 mL，吐温80 1.0 g VB₁ 1.0 mg。

6.用于权利要求1所述的细菌菌株筛选的培养基，其特征在于：包括固态富集培养基和/或液态富集培养基，配方为，

固态富集培养基：枯枝落叶粉末、水，枯枝落叶粉末与水的质量体积比2g/ml；

液态富集培养基：（NH₄）₂SO₄ 0.5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L。

7.权利要求1所述的细菌菌株的应用。

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