CN112779183A - 番茄半边风病害防控生物有机肥、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物防治技术领域，具体公开了一种番茄半边风病害防控生物有机肥、制备方法及其应用，所述生物有机肥中含有贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏编号为，CGMCC NO.19860；所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏单位为，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏名称为，贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis WSW2；所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏时间为2020年5月11日。本发明具有防治效果较好和发病率较低的特点。

Description

番茄半边风病害防控生物有机肥、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，特别涉及一种番茄半边风病害防控生物有机肥、制备方法及其应用。

背景技术

番茄又称西红柿，其果实营养丰富，具特殊风味，是全世界重要的蔬菜作物之一，在我国各个地区广泛种植，目前全国番茄种植面积约1600万亩，年产量约5500万吨，占蔬菜总量的7％左右。但随着番茄种植面积不断增加，加之番茄连作现象非常普遍，番茄种植基地枯萎病和青枯病等常见土传病害呈高发势态，同时由于种子、种苗在全国范围内的转移，导致许多新的番茄土传病害在全国各地的传播，如在浙江省温州市苍南县近两年来新出现的番茄“半边风”病害，也称番茄半边风病害，该病害造成的番茄发病，常规发病率达到50％～60％，高发病区域发病率能达到80％以上，减产少则30％～40％，高则60％～80％，甚至造成绝收，给番茄正常生产造成严重影响，目前该病害仍缺乏防治药物，因此开发新型绿色的防控技术成为番茄栽培中的迫切需求。

生物防治因其环境友好和病原菌不容易产生抗性，而越来越受到重视。其中生物有机肥是一类兼具有机肥和微生物功能的新型肥料，与单一的微生物菌剂相比，其由于富含有机质和有机养分，能提高土壤有机质含量，增加土壤基础地力，起到疏松土壤、改善土壤团粒结构、生根促根作用；与单一的有机肥相比较，其富含功能微生物，可以增加根际有益微生物数量，抑制有害病原菌的繁殖，增强作物的抗病力，具有以微生物生命活动来改善作物营养条件和生长环境、刺激作物生长发育和抵抗病虫危害的作用，进而达到挖掘土壤潜在肥力、提高农产品产量和品质的功效。现有多项研究表明，生物有机肥不仅对土壤氮、磷、钾具有活化作用，还能稳定氮、磷、钾养分的供应，调控土壤微生物群落结构，抑制土传病害的发生，提高番茄、茄子、白菜和黄瓜等多种蔬菜瓜果作物的产量和品质。因此，生物有机肥料作为一种新型肥料，是发展绿色农业的重要方向。

因此，现有对番茄半边风病害的防治，存在缺乏防治药物和发病率较高的问题。

发明内容

本发明为了解决现有对番茄半边风病害的防治所存在的上述技术问题，提供了一种防治效果较好和发病率较低的番茄半边风病害防控生物有机肥、制备方法及其应用。

本发明的第一种技术方案：番茄半边风病害防控生物有机肥，所述番茄半边风病害防控生物有机肥中含有贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏编号为，CGMCCNO.19860；所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏单位为，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏名称为，贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis WSW2；所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏时间为2020年5月21日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明筛选到的贝莱斯芽孢杆菌对番茄半边风有很强的平板抑制效果、温室盆栽防控效果和田间防控效果，丰富现有的番茄半边风生防菌资源库，具有拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌，对于番茄半边风病菌的解决具有突出的技术效果；本发明选择温州地区发病区域中种植的健壮番茄植株样品，轻轻带土拔出植株，轻轻抖落植株根系上松散的附着土，自根茎处剪断，称取植物根系及其根际土，采用梯度稀释分离法获得对根际营养竞争能力强的拮抗菌菌株，划线纯化后，再采用平板对峙法再次筛选拮抗菌，获得具有高效抗病的拮抗菌菌株，观察抑菌圈的大小，通过比较抑菌圈的大小，选择抑菌圈较大的菌株，菌落呈圆形，不透明，淡土黄色，边缘不光滑，菌落中间有褶皱，再采用显微镜进行观察，发现细胞呈短杆状，形成芽孢，芽孢位于细胞中间，经生理生化特性和16S rRNA基因鉴定，确定所述拮抗菌的分类地位，为贝莱斯芽孢杆菌，其中，16S rRNA基因经比对与现有菌种最大相似率为99％；该菌株最适生长条件为：温度30℃，培养基(LB)为蛋白胨1％(W/V)、酵母膏0.5％(W/V)、氯化钠2％(W/V)和琼脂2％(W/V)，pH5.0～8.0，121℃灭菌20分钟；在LB平板上30℃恒温培养60h～84h；本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis WSW2是一种芽孢杆菌，在番茄半边风防治方面有较高的应用价值，尤其是能够针对本地环境分离出的适应本地气候及生长环境的贝莱斯芽孢杆菌，对于提高作物产量，减少农药使用量，构建良好的生态环境具有积极作用；本发明作为国家目前大力提倡的绿色防控微生物菌剂，对番茄半边风的拮抗效果较好，使得番茄半边风的发病率降低了60％～80％，减少了病害发生，大大提高了农产品的产量和品质，保证了番茄的正常生产；在使用过程中不存在会对农产品造成污染的隐患，病菌不容易产生抗药性，符合国家提倡的减肥、减药和绿色生产发展模式要求；本发明中的番茄半边风病害防控生物有机肥兼具有机肥和微生物功能新型肥料的特点，其富含有机质和有机养分，能提高土壤有机质含量，增加土壤基础地力，起到疏松土壤、改善土壤团粒结构和生根促根作用，同时其也富含功能微生物，可以增加根际有益微生物数量，抑制有害病原菌的繁殖，增强作物的抗病力，具有以微生物生命活动来改善作物营养条件和生长环境、刺激作物生长发育和抵抗病虫危害的作用，进而达到挖掘土壤潜在肥力和提高农产品产量和品质的功效；本发明中的番茄半边风病害防控生物有机肥不仅对土壤氮、磷、钾具有活化作用，还能稳定氮、磷、钾养分的供应，调控土壤微生物群落结构，抑制土传病害的发生，提高番茄的产量和品质。

作为优选，每克番茄半边风病害防控生物有机肥干样中，所述贝莱斯芽孢杆菌的活菌数为1.0× 10⁸CFU/g～1.0×10¹⁰CFU/g干样。即每克番茄半边风病害防控生物有机肥干样中，拮抗菌的浓度不小于1.0 ×10⁸CFU/g。

本发明的第二种技术方案：番茄半边风病害防控生物有机肥的制备方法，将贝莱斯芽孢杆菌菌剂与腐熟有机物料混合，进行好氧堆肥处理后，得到番茄半边风病害防控生物有机肥。本发明将贝莱斯芽孢杆菌与腐熟有机物料载体结合后，进行好氧堆肥发酵得到的番茄半边风病害防控生物有机肥，不仅为贝莱斯芽孢杆菌生长提供养分，也能改善土壤理化和生物性质，促进植物生长，减少病害发生。

作为优选，所述贝莱斯芽孢杆菌菌剂为液体菌剂；所述液体菌剂中贝莱斯芽孢杆菌的活菌数为1.0× 10⁸CFU/ml～1.0×10¹⁰CFU/ml。作为优选，所述贝莱斯芽孢杆菌菌剂的制备包括以下步骤，

(A)将贝莱斯芽孢杆菌接种到LB斜面培养基上进行活化；

(B)将活化后的贝莱斯芽孢杆菌接种到LB液体培养基中得到培养液；

(C)将培养液置于摇床中，在120rpm/min～180rpm/min的转速和10℃～50℃的温度条件下，培养 60h～84h，即制得液体菌剂。

作为优选，步骤(C)中，所述贝莱斯芽孢杆菌的培养温度为25℃～35℃；所述培养液中NaCl浓度为 0.5％～4％；所述培养液的pH为4.0～8.0。更优选，所述培养液的pH为5.0～7.0。

作为优选，所述腐熟有机物料为腐熟茶叶渣。

作为优选，所述腐熟茶叶渣的制备包括以下步骤，

(a)收集茶枝叶；

(b)使用粉碎机将收集到的茶枝叶粉碎至2cm以下；

(c)用木屑、菇渣等调节碎茶枝叶中的含水量为55％～65％；

(d)将符合含水率要求的碎茶枝叶堆置成高0.5～1.5m、宽1～2m的条跺形状，开始进行第一次好氧堆肥发酵；

(e)当第一次好氧堆肥发酵的发酵温度升至50℃以上时，每天翻抛一次，直至发酵温度开始下降时，即制得腐熟茶叶渣。

作为优选，当步骤(e)中的发酵温度下降至37℃～41℃时，将微生物菌剂喷洒到第一次好氧堆肥发酵后的腐熟茶叶渣上；其中微生物菌剂的喷洒量，以每吨腐熟茶叶渣添加10L微生物菌剂的标准计；

将喷洒有微生物菌剂的腐熟茶叶渣继续进行第二次好氧堆肥发酵，每天翻抛一次，待发酵温度继续下降至环境温度时，干燥堆体中含水量为32％～38％，结束发酵，即制得番茄半边风病害防控生物有机肥。

本发明将贝莱斯芽孢杆菌与腐熟有机物料载体结合后，进行二次发酵得到的番茄半边风病害防控生物有机肥，不仅为贝莱斯芽孢杆菌生长提供养分，也能改善土壤理化和生物性质，促进植物生长，减少病害发生；将贝莱斯芽孢杆菌菌剂与有机载体结合进行二次发酵，获得番茄半边风病害防控生物有机肥产品，保障了贝莱斯芽孢杆菌在土壤中的有效定殖，保障其在防控中的应用效果，可显著提高生防效率；好氧堆肥发酵可置于智能堆肥反应器中进行，简便易于操作。

本发明的第三种技术方案：番茄半边风病害防控生物有机肥在番茄半边风病害防控中的应用。有利于保障番茄苗期和移栽后根际土壤中的拮抗菌数量，抵御番茄半边风病原菌的入侵，最终防控病害发生；在番茄育苗和/或番茄种植过程的基质中添加含有贝莱斯芽孢杆菌的番茄半边风病害防控生物有机肥，番茄半边风病害防控生物有机肥在番茄育苗和移栽时期均添加，有利于在番茄根际构建拮抗菌群落体系，提高番茄根际拮抗菌数量，从而增强番茄根际对病原菌的抵抗力，降低病害发生；具体地，番茄半边风病害防控生物有机肥的应用方法包含以下方面：在番茄杯苗育苗基质中，每杯苗按照2％比例添加上述番茄半边风病害防控生物有机肥，充分混匀；杯苗移栽时，在不破坏基质形状的前提下，将其移至盆栽土中；盆栽土在移栽前，预先施入所述番茄半边风病害防控生物有机肥，施入比例为1％。

本发明具有如下有益效果：

(1)筛选到的贝莱斯芽孢杆菌对番茄半边风有很强的平板抑制效果、温室盆栽防控效果和田间防控效果，丰富现有的番茄半边风生防菌资源库，具有拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌，对于番茄半边风病菌的解决具有突出的技术效果；

(2)贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis WSW2是一种芽孢杆菌，在番茄半边风防治方面有较高的应用价值，尤其是能够针对本地环境分离出的适应本地气候及生长环境的贝莱斯芽孢杆菌，对于提高作物产量，减少农药使用量，构建良好的生态环境具有积极作用；

(3)作为国家目前大力提倡的绿色防控微生物菌剂，对番茄半边风的拮抗效果较好，使得番茄半边风的发病率降低了60％～80％，减少了病害发生，大大提高了农产品的产量和品质，保证了番茄的正常生产；在使用过程中不存在会对农产品质量安全造成污染的隐患，病菌不容易产生抗药性，符合国家提倡的减肥、减药和绿色生产发展模式要求；

(4)番茄半边风病害防控生物有机肥兼具有机肥和微生物功能新型肥料的特点，其富含有机质和有机养分，能提高土壤有机质含量，增加土壤基础地力，起到疏松土壤、改善土壤团粒结构和生根促根作用，同时其也富含功能微生物，可以增加根际有益微生物数量，抑制有害病原菌的繁殖，增强作物的抗病力，具有以微生物生命活动来改善作物营养条件和生长环境、刺激作物生长发育和抵抗病虫危害的作用，进而达到挖掘土壤潜在肥力和提高农产品产量和品质的功效；本发明中的番茄半边风病害防控生物有机肥不仅对土壤氮、磷、钾具有活化作用，还能稳定氮、磷、钾养分的供应，调控土壤微生物群落结构，抑制土传病害的发生，提高番茄的产量和品质；

(5)将贝莱斯芽孢杆菌与腐熟有机物料载体结合后，进行好氧堆肥发酵得到的番茄半边风病害防控生物有机肥，不仅为贝莱斯芽孢杆菌生长提供养分，也能改善土壤理化和生物性质，促进植物生长，减少病害发生；

(6)有利于保障番茄苗期和移栽后根际土壤中的拮抗菌数量，抵御番茄半边风病原菌的入侵，最终防控病害发生。

附图说明

图1是本发明分离的WSW2菌株中具有较大抑制圈的编号为KS1的菌落形态图；

图2是本发明中将菌株WSW2涂布在LB平板上，菌落表现出呈圆形、不透明和淡土黄色的形态图；

图3是本发明中将菌株WSW2涂布在LB平板上，菌落表现出边缘不光滑和中间有褶皱的形态图；

图4是本发明中将菌株WSW2涂布在LB平板上，采用显微镜进行观察，细胞呈短杆状，形成芽孢，芽孢位于细胞中间的菌落显微图；

图5是本发明中菌株WSW2在不同温度下的生长情况柱状图；

图6是本发明中菌株WSW2在不同NaCl浓度下的生长情况柱状图；

图7是本发明中菌株WSW2在不同pH下的生长情况柱状图；

图8是本发明中菌株WSW2对不同单糖类物质的利用情况柱状图；

图9是本发明中菌株WSW2对不同二糖类物质的利用情况柱状图；

图10是本发明中菌株WSW2对不同多糖类物质的利用情况柱状图；

图11是本发明中菌株WSW2对不同酯类物质的利用情况柱状图；

图12是本发明中菌株WSW2对不同醇类物质的利用情况柱状图；

图13是本发明中菌株WSW2对不同氨基酸类物质的利用情况柱状图；

图14是本发明中菌株WSW2对不同胺类物质的利用情况柱状图；

图15是本发明中菌株WSW2对不同有机酸类物质的利用情况柱状图；

图16是本发明中选择苍南县马站镇番茄半边风发病严重的连作地块，对番茄植株未做处理的生长状态图；

图17是本发明中选择苍南县马站镇番茄半边风发病严重的连作地块，对番茄植株使用有机肥处理过之后的生长状态图；

图18是本发明实施例5中空白对照、接茄病镰刀菌病原菌对照和贝莱斯芽孢杆菌抗病处理的盆栽对比图；

图19是本发明实施例5中空白对照、接茄病镰刀菌病原菌对照和贝莱斯芽孢杆菌抗病处理的盆栽发病率柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂和仪器设备：供试病原菌采用温州地区发病区域中种植的番茄半边风植株中分离；拮抗菌从发病区域健康植株中根际土壤样品进行分离，取样后低温保存，至实验室立即进行分离；培养基采用马铃薯葡萄糖培养基-PDA和LB培养基；MSSPX-250型生化培养箱；MLS-3020高压蒸汽灭菌锅；SW-CJ-1FB型单人双面净化工作台；E360K离心机；恒温摇床HWY-100；PCR仪Eppendorf No： 5345；PCR预混液，其余试剂均为分析纯。

贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏编号为，CGMCC NO.19860；所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏单位为，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏名称为，贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis WSW2；所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏时间为2020年5月21日。

贝莱斯芽孢杆菌作为番茄半边风拮抗菌的应用。

微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌。所述微生物菌剂为液体菌剂；所述液体菌剂中贝莱斯芽孢杆菌的活菌数为1.0×10⁸CFU/ml～1.0×10¹⁰CFU/ml。

微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤，

(A)将贝莱斯芽孢杆菌接种到LB斜面培养基上进行活化；

(B)将活化后的贝莱斯芽孢杆菌接种到LB液体培养基中得到培养液；

(C)将培养液置于摇床中，在120rpm/min～180rpm/min的转速和10℃～50℃的温度条件下，培养 60h～84h，即制得液体菌剂。更优选，所述贝莱斯芽孢杆菌的培养温度为25℃～35℃。

所述培养液中NaCl浓度为0.5％～4％；所述培养液的pH为5.0～8.0。

所述贝莱斯芽孢杆菌在培养液中的生长，以β-甲酰-D-葡糖苷、α-D-葡糖、D-甘露糖、D-果糖或D- 半乳糖中的一种或多种单糖类化合物作为碳源；所述贝莱斯芽孢杆菌的生长，以D-麦芽糖、D-海藻糖、α -D-乳糖或蜜二糖中的一种或多种二糖类化合物作为碳源；所述贝莱斯芽孢杆菌在培养液中的生长，以棉子糖、糊精或果胶中的一种或多种二多糖类化合物作为碳源；所述贝莱斯芽孢杆菌在培养液中的生长，以吐温40、丙酮酸甲酯或D-乳酸甲酯中的一种或多种酯类物质作为碳源；所述贝莱斯芽孢杆菌在培养液中的生长，以D-山梨醇、D-甘露醇、D-***醇或肌醇中的一种或多种醇类物质作为碳源；所述贝莱斯芽孢杆菌在培养液中的生长，以氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸或L-丝氨酸中的一种或多种氨基酸作为碳源；所述贝莱斯芽孢杆菌在培养液中的生长，以D-半乳糖醛酸、D-葡糖酸、 p-羟基-苯乙酸、L-乳酸、L-苹果酸、溴-丁二酸、r-氨基-丁酸、β-羟基-D，L丁酸或甲酸中的一种或多种有机酸作为碳源。

番茄半边风病害防控生物有机肥，每克番茄半边风病害防控生物有机肥干样中，所述贝莱斯芽孢杆菌的活菌数为1.0×10⁸CFU/g～1.0×10¹⁰CFU/g干样。

番茄半边风病害防控生物有机肥的制备方法，将微生物菌剂与腐熟有机物料混合，进行好氧堆肥处理后，得到番茄半边风病害防控生物有机肥。；所述腐熟有机物料为腐熟茶叶渣。

所述腐熟茶叶渣的制备包括以下步骤，

(a)收集茶枝叶；

(b)使用粉碎机将收集到的茶枝叶粉碎至叶宽2cm以下；

(c)用木屑和/或菇渣调节碎茶枝叶中的含水量为55％～65％；

(d)将符合含水率要求的碎茶枝叶堆置成高0.5～1.5m、宽1～2m的条跺形状，开始进行第一次好氧堆肥发酵；

(e)当第一次好氧堆肥发酵的发酵温度升至50℃以上时，每天翻抛一次，直至发酵温度开始下降时，即制得腐熟茶叶渣；当发酵温度下降至37℃～41℃时，将微生物菌剂喷洒到第一次好氧堆肥发酵后的腐熟茶叶渣上；其中微生物菌剂的喷洒量，以每吨腐熟茶叶渣添加10L微生物菌剂的标准计；

将喷洒有微生物菌剂的腐熟茶叶渣继续进行第二次好氧堆肥发酵，每天翻抛一次，待发酵温度继续下降至环境温度时，干燥堆体中含水量为32％～38％，结束发酵，即制得番茄半边风病害防控生物有机肥。

实施例1：贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis CGMCC NO.19860的分离、筛选和鉴定

(1)拮抗菌的分离和筛选

梯度稀释分离法：选择温州地区发病区域中种植的健壮番茄植株样品，轻轻带土拔出植株，轻轻抖落植株根系上松散的附着土，自根茎处剪断，称取10g植物根系及其根际土，置于盛有灭菌玻璃珠和90mL 无菌水的锥形瓶中，在28℃的温度和150r·min^-1的搅拌速度条件下振荡30min，得到浓度为10^-1的根际土壤悬浮液，然后利用梯度浓度稀释法分别稀释成10^-4、10^-5和10^-6稀释液；各取0.1ml 10^-4、10^-5和10^-6三个梯度的稀释液分别涂布于LB培养基上，每个梯度重复3次，在28℃的温度条件下倒置培养18h，挑取生长迅速和不同形态的单个典型菌落，即获得对根际营养竞争能力强的根际微生物菌株，将挑选出的菌株在LB平板上进行划线纯化3～4次，分别编号，将纯化后的菌株加入体积分数为15％的灭菌甘油中，于-80℃的温度下保藏待用。

平板对峙法筛选拮抗菌：为了筛选获得具有高效拮抗作用的功能拮抗菌菌株，采用平板对峙法，先将从植株中分离到的1株番茄半边风病原菌接种到PDA平板中，同时在平板四周接种分离到的根际微生物菌株，进行对峙试验，在28℃的培养箱中培养，观察抑菌圈的大小，通过比较抑菌圈的大小，选择抑菌圈较大的菌株，即具有高效抗病的拮抗菌菌株，用于进一步验证和纯化。试验表明，分离的菌株中如图1所示的KS1号菌株具有较大的抑制圈，表明其抑菌活性较强，用于进一步进行鉴定和功能验证，同时根据实验室菌株的保藏要求，将其命名为WSW2。

(2)拮抗菌的鉴定

采用分子生物学手段，利用16S rDNA测序对获得的拮抗菌菌株进行分子鉴定。

PCR扩增16S rDNA片段的引物为一对通用引物；

正向引物BSF8/20SEQ ID N0:1：5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3'；

反向引物BSR1541/20SEQ ID N0:2：5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3'；

PCR反应体系为50μl：10×PCR缓冲液5.0μl，MgCl₂(25mM)3.0μl，dNTP 4.0μl，引物BSF8/20和引物BSR1541/20各1.0μl，模板DNA1.0μl，Taq酶(10000U/mL，宝生物工程大连有限公司)0.25μl，重蒸水36.0μl。

PCR扩增程序为：(1)94℃5min；(2)94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，第(2)步循环35次；(3)72℃10min；(4)4℃10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，PCR扩增产物在生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。

16S rDNA序列SEQ ID N0:3为：

TTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCG GGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAAC AGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGA TGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTT GCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCC TATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCC CCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCC CCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTAC AGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACT CAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAA TAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCC GCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACT TTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTC GGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGT TACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGAGAAGTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGCCTGAGCCA GATCAAAACTCTAAA

将测序得到的16S rDNA序列在NCBI网站或RDP网站上进行比对，经比对后与Bacillus velezensis(T)的相似性最高，达到了99％。

将拮抗菌菌株涂布在LB平板上，如图2和图3所示，发现菌落呈圆形，不透明，淡土黄色，边缘不光滑，菌落中间有褶皱；再采用显微镜进行观察，如图4所示，发现细胞呈短杆状，形成芽孢，芽孢位于细胞中间。

高的相似度结合菌株菌落形态和显微观察形态，确定所得到的拮抗菌为贝莱斯芽孢杆菌，并将其命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis WSW2。

实施例2：贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis CGMCC NO.19860的生长条件

(1)温度对菌株WSW2生长的影响

培养基采用LB培养基，初始pH为7.0，摇瓶的装液量50ml/250ml，接种量为0.5％，培养温度分别设置为10℃、20℃、30℃、40℃和50℃，摇床转速150rpm，培养时间24h，培养结束后测定不同温度下的菌液OD₆₀₀值，每个温度重复3次。

结果：菌株WSW2在不同温度下培养24h的菌液OD₆₀₀如图5所示，从图5中可以看出，在培养温度为 10℃时，菌株WSW2的菌体浓度较低，平均OD₆₀₀为0.085，菌株WSW2基本未生长；菌株在30℃时的生长量最高，OD₆₀₀达到了2.504；菌株WSW2可以耐受较高的培养温度，培养温度在50℃时，其生长量OD₆₀₀仍然达到1.19。

(2)不同NaCl浓度(w/v)对菌株WSW2生长的影响

培养基采用LB培养基，初始pH为7.0，NaCl浓度设置4个梯度，分别为0.5％、1％、2％和4％，采用微生物生长曲线分析仪测定不同NaCl浓度下菌株的生长曲线，转速为中速，培养温度为30℃，培养时间 48h，培养结束后测定不同温度下的菌液吸光度值(OD₆₀₀值)，每个接种量重复4次。

结果：不同NaCl浓度试验结果如图6所示，从图6中可以看出，菌株具有较强的渗透压抗性，在0.5％～4.0％的NaCl浓度下均能生长，但不同的NaCl浓度对菌株的生长具有一定的影响，NaCl浓度为0.5％～ 2.0％时，接种后菌株没有迟滞期，且2.0％时对菌株生长具有一定的促进作用，2.0％NaCl浓度时具有最大 OD₆₀₀值；4％NaCl对菌株初始生长具有一定的影响，其生长迟滞期比其它浓度要长，达到约5h，而且生长速率要低于其它浓度。

(3)初始pH对菌株WSW2生长的影响

培养基采用LB培养基，初始pH设置5个梯度，分别为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，接种量为0.5％，采用微生物生长曲线分析仪测定不同初始pH下菌株的生长曲线，转速为中速，培养温度为30℃，培养时间48h，培养结束后测定不同温度下的菌液OD₆₀₀值，每个pH重复4次。

结果：测定不同pH对菌株WSW2生长情况的影响，其菌液OD₆₀₀随时间的变化如图7所示，从图7中可以看出，当初始培养基的pH为4.0时，菌株WSW2的生长迟滞期显著延长，在38h后才开始进入对数生长期；当pH为5.0时，菌株WSW2生长速度最快，在接种后2h就进入了对数生长期，在12h时就进入了稳定期，且其OD值最大，达到1.62；pH为6.0～8.0之间时，菌株WSW2生长速率较快，且较为接近，在14h 时进入稳定期，但最大生长量要小于pH5.0时。

(4)菌株WSW2对不同碳源的利用能力和对化合物的敏感性分析

利用BIOLOG GENIII微生物鉴定板对菌株碳源利用能力进行鉴定。

首先，将活化的WSW2菌株接种BUG培养基上，30℃的温度条件下培养至形成单菌落，将单菌落接种至含有接种液的干净接种管，利用浊度仪调整接种液中的菌体浓度应为90％～98％T；其次，将制备好的菌悬液倒入V型加样水槽中，使用8道移液器将菌悬液吸入移液器吸头中，按每孔100μl的量将菌悬液按顺序加入微孔板的所有孔中，盖好微孔板的盖子；最后，将微孔板放入温度为33℃的培养箱中进行孵育，24h 后使用BIOLOG鉴定***进行读数，测定菌株WSW2对不同碳源的利用能力和对化合物的敏感性。

(4.1)菌株对单糖类物质的利用

如图8所示，菌株WSW2可以利用β-甲酰-D-葡糖苷、α-D-葡糖、D-甘露糖、D-果糖和D-半乳糖等单糖类化合物的作为碳源，利用肌酐的活性较低，不能够利用D-水杨苷、3-甲酰葡糖、D-岩藻糖、L-果糖、 L-鼠李糖、6-PO₄D-葡糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸这些单糖物质作为碳源。

(4.2)菌株对二糖类物质的利用

如图9所示，菌株WSW2可以利用D-麦芽糖、D-海藻糖、α-D-乳糖和蜜二糖等二糖类化合物作为碳源，不能够利用D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖及D-松二糖这些二糖物质作为碳源。

(4.3)菌株对多糖类物质的利用

如图10所示，菌株WSW2可以利用棉子糖、糊精和果胶等多糖类物质作为碳源，不能够利用水苏糖。

(4.4)菌株对酯类物质的利用

如图11所示，菌株WSW2可以利用吐温40、丙酮酸甲酯和D-乳酸甲酯等酯类作为碳源，不能够利用 L-半乳糖醛酸内酯作为碳源。

(4.5)菌株对醇类物质的利用

如图12所示，菌株WSW2可以利用D-山梨醇、D-甘露醇、D-***醇和肌醇作为碳源，但不能利用甘油作为碳源。

(4.6)菌株对氨基酸类物质的利用

如图13所示，菌株WSW2可以利用氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸和L-丝氨酸等多种氨基酸作为碳源，其中对L-丙氨酸和L-精氨酸的利用率最高，但不能利用D-天冬氨酸、D-丝氨酸和L-焦谷氨酸作为碳源。

(4.7)菌株对胺类物质的利用

如图14所示，菌株WSW2均不能利用N-乙酰-D-葡糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、 N-乙酰神经氨酸、L-组胺和葡糖醛酰胺这些胺类化合物作为碳源。

(4.8)菌株对有机酸类物质的利用

如图15所示，菌株WSW2可以利用D-半乳糖醛酸、D-葡糖酸、p-羟基-苯乙酸、L-乳酸、L-苹果酸、溴-丁二酸、r-氨基-丁酸、β-羟基-D，L丁酸和甲酸等多种有机酸作为碳源，但不能利用D-葡糖醛酸、粘液酸、奎宁酸、糖质酸、柠檬酸、α-酮-戊二酸、D-苹果酸、α-羟基-丁酸、α-酮-丁酸、乙酰乙酸、丙酸和乙酸作为碳源。

实施例3：菌株WSW2番茄半边风病害防控生物有机肥的制备

拮抗菌菌剂制备：将贝莱斯芽孢杆菌接种到LB斜面上进行活化，将活化后的贝莱斯芽孢杆菌，接种到LB液体培养基中，在30℃的摇床中，以150rpm的转速下振荡培养3天，获得拮抗菌菌剂，测定拮抗菌剂的活菌数为8.9*10¹⁰CFU/ml。

番茄半边风病害防控生物有机肥：番茄半边风病害防控生物有机肥通常以腐熟的有机物料为载体，经过对不同物料的比较，具体是选择pH符合拮抗菌最适生长要求和杂菌率含量最低的有机物料作为载体，最终以腐熟后的茶叶渣作为有机物料载体，具体腐熟茶叶渣有机物料的理化特性如表1所示；

表1：腐熟茶叶渣有机物料的理化特性

将修剪后的废弃茶枝叶收集后，经粉碎机粉碎至2cm以下，调节含水率至60％左右，将其堆置成高约 1m、宽约1.5m的条跺状，进行好氧高温发酵，当温度上升到50度以上时，每天翻抛一次，直至堆肥温度逐渐下降；当温度下降至40度左右时，按照1％的接种量，即每吨腐熟辅料添加制备好的抗病菌剂10L，使物料中的活菌数达到10⁸CFU/g以上，将菌剂均匀的喷洒到经过高温发酵腐熟后的茶叶渣有机物料上，继续翻堆促进拮抗菌在物料上的定殖与增殖，待发酵温度继续下降至环境温度时，结束发酵，发酵时间为30d，获得番茄半边风病害防控生物有机肥。

番茄半边风病害防控生物有机肥有效菌数的测定：废弃物茶叶枝条经过高温发酵腐熟后，添加WSW2 菌剂进行二次发酵制备抗病番茄半边风病害防控生物有机肥，二次发酵结束后，测定番茄半边风病害防控生物有机肥中的有效活菌数，并且每隔1个月测定活菌数量一次，观察拮抗菌在番茄半边风病害防控生物有机肥中的存活率，连续测定6个月，经过二次发酵后有机物料中有效菌数有所增加，初始存放2个月内又有所降低，但后续存放期间无显著变化，存放6个月以后，仍然达到7.9*10⁸CFU/g，具体测定结果如表2所示。

表2：番茄半边风病害防控生物有机肥中的有效菌数

实施例4：菌株WSW2番茄半边风病害防控生物有机肥在番茄半边风病害防控中的应用

本研究从番茄连作“半边风”发病地块中，采集了发病植株和健康植株，从发病植株中分离了病原微生物，经鉴定为茄病镰刀菌(Fusarium solani)，从健康植株根际土壤中分离筛选了多个根际微生物，并优选了高效拮抗微生物一株，通过平板对峙验证了其抗病性能，进一步通过有机物料的筛选，获得了适宜于番茄半边风病害防控生物有机肥制备的腐熟有机物料，制备了抗病番茄半边风病害防控生物有机肥，开展了田间试验，获得了较好的抑菌和防病效果，为番茄“半边风”病害的生物防控提供了绿色新技术。

抗病试验点选择苍南县马站镇前茬番茄“半边风”发病严重的连作地块，以评价番茄半边风病害防控生物有机肥的防病效果；试验设置1个空白对照和1个番茄半边风病害防控生物有机肥处理，均设3个重复，每个重复1个小区，小区面积20m²。

空白对照：按照常规方式进行栽培，底肥按照50kg/亩施用复合肥，复合肥选用N-P₂O₅-K₂O：15-15-15；生长状态如图16所示。

番茄半边风病害防控生物有机肥处理：按照常规方式进行栽培，底肥按照40kg/亩施用复合肥，复合肥选用N-P₂O₅-K₂O：15-15-15，同时按照200kg/亩施用番茄半边风病害防控生物有机肥；生长状态如图17所示。

番茄育苗：选择常见的番茄种子，采用商品化育苗基质，利用75孔穴盘，将番茄种子播种于穴盘中，每穴1粒种子；经过25天，待番茄幼苗长大到三叶一心的时候进行移栽。

番茄幼苗移栽：待番茄长到三叶一心后，将番茄幼苗移栽到空白对照小区和抗病番茄半边风病害防控生物有机肥处理小区中，每个小区定植50株。

发病率调查：定期观察和记录番茄发病数量，统计发病率，如表3所示。

表3：对照小区和处理小区发病率统计情况

试验效果分析：由表3可知，番茄定植后观察试验中番茄的发病率，其中对照地块的三个重复区，发病较早，番茄开花前部分植株就已经出现病害症状了，到了番茄结果期，经统计平均发病率达到70％；处理采用番茄半边风病害防控生物有机肥部分替代化肥的三个重复区，发病率显著降低，在开花结果期发病率仅为24.67％，比对照降低了65.09％，显著降低了番茄“半边风”造成的番茄土传病害的发病率。

实施例5：菌株WSW2在番茄半边风防控中的应用

本研究从番茄连作番茄“半边风”发病地块中，采集了发病植株和健康植株，从发病植株中分离了病原微生物，经鉴定为茄病镰刀菌(Fusarium solani)，从健康植株根际土壤中分离筛选了多个贝莱斯芽孢杆菌拮抗微生物，并优选了高效贝莱斯芽孢杆菌拮抗微生物一株，开展了平板对峙和盆栽试验，均获得了较好的抑菌和方便效果，为番茄“半边风”病害的生物防控提供新的防控手段。

(1)菌种活化：将保藏的茄病镰刀菌接种到大PDA斜面培养基上进行活化，将贝莱斯芽孢杆菌接种到LB斜面培养基上进行活化。

(2)病原菌制备和拮抗菌制备：将活化后的茄病镰刀菌接入PDA平板上，在30℃培养箱中培养，在培养7d后，用无菌水将茄病镰刀菌孢子洗涤后，调整孢子浓度为10⁶CFU/ml,作为病原菌接种液；将活化后的贝莱斯芽孢杆菌，接种到LB液体培养基中，在30℃的摇床中，以150rpm的转速下振荡培养3天，测定拮抗菌剂的数量为10¹⁰CFU/ml，将其稀释到10⁸CFU/ml作为拮抗菌接种剂。

(3)番茄育苗：选择常见的番茄种子，采用商品化育苗基质，利用75孔穴盘，将番茄种子播种于穴盘中，每穴1粒种子；经过25天，待番茄幼苗长大到三叶一心的时候进行移栽。

(4)栽培土壤的准备：采集浙江省杭州市江干区浙江省农业科学院试验区设施大棚土壤，进行盆栽试验，每盆装土10kg，按照正常的施肥量，每盆施用复合肥4g，其中复合肥选用N-P₂O₅-K₂O：15-15-15。

(5)试验处理：试验设置2个对照和1个处理，分别为如图18所示的空白对照、接茄病镰刀菌病原菌对照和贝莱斯芽孢杆菌抗病处理；空白对照为不做任何处理的常规栽培，不接种茄病镰刀菌病原菌和贝莱斯芽孢杆菌抗病微生物；接茄病镰刀菌病原菌对照为，在土壤中接种制备好的茄病镰刀菌病原菌孢子悬液，按照100ml/盆添加致病病原菌孢子悬液，使土壤中的茄病镰刀菌病原菌浓度达到10⁴CFU/g；贝莱斯芽孢杆菌抗病处理为，在接种茄病镰刀菌病原菌对照基础上，接种贝莱斯芽孢杆菌抗病菌剂100ml，使贝莱斯芽孢杆菌抗病菌在土壤中的浓度到10⁶CFU/g。

(6)番茄幼苗移栽：待番茄长到三叶一心后，如图18所示，将番茄幼苗移栽到对应的对照花盆和处理花盆中进行盆栽试验，每盆1株。

(7)发病率调查：定期观察和记录番茄发病数量，统计发病率，统计结果如图19所示。

试验结果：定期观察试验中植株的发病率，由图19可以看出，不做任何处理的常规栽培空白对照盆栽CK，番茄栽培中没有发现番茄半边风病害的发生；接种茄病镰刀菌病原菌的对照CK-F，在番茄开花结果期开始发病，发病率达到了100％；贝莱斯芽孢杆菌抗病处理T，发病率较低，发病率仅为20％，比接茄病镰刀菌对照CK-F降低了80％。

本发明筛选到的贝莱斯芽孢杆菌对番茄半边风有很强的平板抑制效果、温室盆栽防控效果和田间防控效果，丰富现有的番茄半边风生防菌资源库，具有拮抗作用的贝莱斯芽孢杆菌，对于番茄半边风病菌的解决具有突出的技术效果；本发明选择温州地区发病区域中种植的健壮番茄植株样品，轻轻带土拔出植株，轻轻抖落植株根系上松散的附着土，自根茎处剪断，称取植物根系及其根际土，采用梯度稀释分离法获得对根际营养竞争能力强的根际微生物菌株，划线纯化后，再采用平板对峙法再次筛选拮抗菌，获得具有高效抗病的拮抗菌菌株，通过比较抑菌圈的大小，选择抑菌圈较大的拮抗菌株，菌株菌落呈圆形，不透明，淡土黄色，边缘不光滑，菌落中间有褶皱，再采用显微镜进行观察，发现细胞呈短杆状，形成芽孢，芽孢位于细胞中间，经生理生化特性和16S rRNA基因鉴定，确定所述拮抗菌的分类地位，为贝莱斯芽孢杆菌，其中，16S rRNA基因序列在数据库中经比对，与贝莱斯芽孢杆菌相似率最高为99％，筛选到的贝莱斯芽孢杆菌与其它多种芽孢杆菌不同，其在土传病害生物防控上的应用效果少见报道，尤其是在茄病镰刀菌造成的番茄半边风病害上；该菌株最适生长条件为：温度30℃，培养基(LB)为蛋白胨1％(W/V)、酵母膏0.5％(W/V)、氯化钠2％(W/V)和琼脂2％(W/V)，pH5.0～8.0，121℃灭菌20分钟；在LB平板上30℃恒温培养 60h～84h；本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis WSW2是一种芽孢杆菌，在番茄半边风防治方面有较高的应用价值，尤其是能够针对本地环境分离出的适应本地气候及生长环境的贝莱斯芽孢杆菌，对于提高作物产量，减少农药使用量，构建良好的生态环境具有积极作用；本发明作为国家目前大力提倡的绿色防控微生物菌剂，对番茄半边风的拮抗效果较好，使得番茄半边风的发病率降低了60％～80％，减少了病害发生，大大提高了农产品的产量和品质，保证了番茄的正常生产；在使用过程中不存在会对农产品造成污染的隐患，病菌不容易产生抗药性，符合国家提倡的减肥、减药和绿色生产发展模式要求；本发明中的番茄半边风病害防控生物有机肥兼具有机肥和微生物功能新型肥料的特点，其富含有机质和有机养分，能提高土壤有机质含量，增加土壤基础地力，起到疏松土壤、改善土壤团粒结构和生根促根作用，同时其也富含功能微生物，可以增加根际有益微生物数量，抑制有害病原菌的繁殖，增强作物的抗病力，具有以微生物生命活动来改善作物营养条件和生长环境、刺激作物生长发育和抵抗病虫危害的作用，进而达到挖掘土壤潜在肥力和提高农产品产量和品质的功效；本发明中的番茄半边风病害防控生物有机肥不仅对土壤氮、磷、钾具有活化作用，还能稳定氮、磷、钾养分的供应，调控土壤微生物群落结构，抑制土传病害的发生，提高番茄的产量和品质。

番茄半边风病害情况介绍：

浙江省温州市苍南县是我国重要的春番茄供应基地，番茄种植面积达到4万多亩。随着种植年限的延长以及外来番茄种子种苗的推广应用，近些年来，除了常见的番茄青枯病、枯萎病等土传病害以外，出现了许多新的番茄土传病害，其中番茄半边风是近年来新发现的番茄土传病害。该病害在番茄种植后始花期开始发病，并逐渐加重，发病时番茄植株一边叶片首先变黄萎焉，然后另外一边也逐渐变黄萎焉，同时番茄茎基部出现许多凸起小疙瘩，切断发病植株茎秆可发现其根部维管束部分变灰并逐渐变成褐色，且呈木质化状，最后整株植株发黄萎焉死亡。因该病造成的典型症状与茄子半边风病害较为相似，且不是常见的由大丽轮枝菌造成的黄萎病，该地区称其为“番茄半边风”。该病害造成的番茄发病率较高，常规在50％～60％，重病地块达到80％以上，甚至绝收。调查中采集了发病植株进行病原菌的分离，在发病严重植株根部、茎中部以及顶部中均发现了同一病原微生物，经鉴定该病原菌为茄病镰刀菌(Fusarium solani)，该菌株在PDA平板上生长良好，菌落表面产生大量白色菌丝，背面呈***，显微镜观察下小型分生孢子以假头状方式着生，孢子呈椭圆形，回接试验表明，该菌株会造成番茄半边疯的发生。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 番茄半边风病害防控生物有机肥、制备方法及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 2

aaggaggtga tccagccgca 20

<210> 3

<211> 1467

<212> DNA

<213> Bacillus velezensis

<400> 3

ttcggcggct ggctccataa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg 60

tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120

ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag 180

atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac 240

gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt 300

ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt 360

gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420

acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga ggatgtcaag 480

acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540

cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa 600

tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc atcgtttacg 660

gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctcccacg ctttcgctcc tcagcgtcag 720

ttacagacca gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc 780

gctacacgtg gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc 840

tccccggttg agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac 900

gcccaataat tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 960

tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt 1020

cttccctaac aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc 1080

gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140

gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg 1200

tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga 1260

agccaccttt tatgtctgaa ccatgcggtt cagacaacca tccggtatta gccccggttt 1320

cccggagtta tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct 1380

aacatcagga gaagtcccat ctgtccgctc gacttgatgt attaggcacg ccgccagcgt 1440

tcgcctgagc cagatcaaaa ctctaaa 1467

Claims (10)

1.番茄半边风病害防控生物有机肥，其特征是：所述番茄半边风病害防控生物有机肥中含有贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏编号为，CGMCC NO.19860；所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏单位为，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏名称为，贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis WSW2；所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏时间为2020年5月11日。

2.根据权利要求1所述的番茄半边风病害防控生物有机肥，其特征是：每克生物有机肥干样中，所述贝莱斯芽孢杆菌的活菌数为1.0×10⁸CFU/g～1.0×10¹⁰CFU/g干样。

3.根据权利要求1所述番茄半边风病害防控生物有机肥的制备方法，其特征是：将贝莱斯芽孢杆菌菌剂与腐熟有机物料混合，进行好氧堆肥处理后，得到生物有机肥。

4.根据权利要求3所述番茄半边风病害防控生物有机肥的制备方法，其特征是：所述贝莱斯芽孢杆菌菌剂为液体菌剂；所述液体菌剂中贝莱斯芽孢杆菌的活菌数为1.0×10⁸CFU/ml～1.0×10¹⁰CFU/ml。

5.根据权利要求3所述番茄半边风病害防控生物有机肥的制备方法，其特征是：所述贝莱斯芽孢杆菌菌剂的制备包括以下步骤，

(A)将贝莱斯芽孢杆菌接种到LB斜面培养基上进行活化；

(B)将活化后的贝莱斯芽孢杆菌接种到LB液体培养基中得到培养液；

(C)将培养液置于摇床中，在120rpm/min～180rpm/min的转速和10℃～50℃的温度条件下，培养60h～84h，即制得液体菌剂。

6.根据权利要求5所述番茄半边风病害防控生物有机肥的制备方法，其特征是：步骤(C)中，所述贝莱斯芽孢杆菌的培养温度为25℃～35℃；所述培养液中NaCl浓度为0.5％～4％；所述培养液的pH为4.0～8.0。

7.根据权利要求3所述番茄半边风病害防控生物有机肥的制备方法，其特征是：所述腐熟有机物料为腐熟茶叶渣。

8.根据权利要求7所述番茄半边风病害防控生物有机肥的制备方法，其特征是：所述腐熟茶叶渣的制备包括以下步骤，

(a)收集茶枝叶；

(b)使用粉碎机将收集到的茶枝叶粉碎至叶宽2cm以下；

(c)用木屑和/或菇渣调节碎茶枝叶中的含水率为55％～65％；

(d)将符合含水率要求的碎茶枝叶堆置成高0.5～1.5m、宽1～2m的条跺形状，开始进行第一次好氧堆肥发酵；

(e)当第一次好氧堆肥发酵的发酵温度升至50℃以上时，每天翻抛一次，直至发酵温度开始下降时，即制得腐熟茶叶渣。

9.根据权利要求8所述番茄半边风病害防控生物有机肥的制备方法，其特征是：当步骤(e)中的发酵温度下降至37℃～41℃时，将微生物菌剂喷洒到第一次好氧堆肥发酵后的腐熟茶叶渣上；其中微生物菌剂的喷洒量，以每吨腐熟茶叶渣添加10L微生物菌剂的标准计；

将喷洒有微生物菌剂的腐熟茶叶渣继续进行第二次好氧堆肥发酵，每天翻抛一次，待发酵温度继续下降至环境温度时，干燥堆体中含水量为32％～38％，结束发酵，即制得番茄半边风病害防控生物有机肥。

10.番茄半边风病害防控生物有机肥在番茄半边风病害防控中的应用。

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