CN103992957B - 一株梨树枝条降解真菌及其菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业废弃物资源利用技术，公开了一株能分解梨树修剪枝条的降解真菌及其菌剂，该菌株D10属于撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerata)，2013年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.7852。该菌株可在以梨树枝条为唯一碳源的培养基上生长。在21d的液态发酵过程中，菌株D10的漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的酶活力最高值分别为11.03，36.71和152.75U·mL-1。本发明是利用微生物发酵的方法降解农业废弃梨树修剪枝条，使其转化为有机肥料，可以变废为宝、保护环境，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于农业集约化生产技术，涉及一株梨树枝条降解真菌及其菌剂，专用于降解废弃梨树枝条生产有机肥料，实现有机废弃物资源化利用。
背景技术
修剪是一项梨树栽培和管理的重要技术措施，适量的修剪对果树的生长和果实的产量品质都有积极的影响。处于盛果期的梨园，修剪枝条量一般在1500-2250kg·hm-2。农业部市场与经济信息司统计的数据表明，2011年我国梨树的栽培面积为110万多公顷，据这个数字推算，我国梨园每年枝条的修剪数量可达161-242万吨。枝条中含有丰富的纤维素、木质素、蛋白质、糖类和脂肪等有机物，以及各种大中微量无机养分，是宝贵的农业资源，因此，梨树枝条资源的开发和利用有着非常广阔的前景。然而，梨树枝条中含有大量的木质素和纤维素，因此不易腐烂，不能就地进行还田处理。除了部分枝条应用于食用菌的栽培以外，绝大部分梨树枝条都被随意堆放在路边或就地焚烧，焚烧会造成严重的大气污染，堆放会诱发田间的病虫害，同时也造成了宝贵资源的浪费。
研究表明，修剪枝条等园林废弃物，作为堆肥物料的调理剂，对堆肥物料的含水率、孔隙度和碳氮比等有良好的调节作用。随着果树修剪枝条资源规模的不断扩大和再利用难度的困扰，将果树修剪枝条作为主要堆肥材料进行堆肥技术化的研究逐步增加。通过联合堆肥化实验的结果显示，枝条堆肥养分丰富全面，病菌数量达到无害化，是一种成熟稳定和富含营养的优质有机肥和土壤改良剂。可见将梨树枝条进行固体有机废弃物资源化(堆肥)是解决梨树枝条再利用问题的简单有效途径。
然而在堆肥过程中，纤维素、半纤维素和木质素等大分子的分解是限制堆肥腐熟的主要因素，白腐真菌是目前报道对木质素降解效果最强的一类真菌。在堆肥中接种木质素降解真菌，可以利用真菌菌丝对木材的机械穿透作用和降解真菌分泌的降解酶类，加快堆肥底物中木质素的分解，从而缩短堆肥腐熟的周期。若能筛选到相应的高效降解功能菌株，并将其用于梨树修剪枝条堆肥生产，具有良好的应用前景和实用价值。
发明内容
1.技术问题
本发明的目的在于筛选一种能够高效分解梨树枝条木质素的真菌，通过其对木质素的高效降解效果，达到加速梨树枝条堆肥腐熟的目的，从而使梨树修剪枝条能够通过堆肥化得以大规模的资源化再利用，确保可持续农业的顺利发展。
2.技术方案
一株能降解梨树枝条的真菌D10，该菌株属于撕裂蜡孔菌(Ceriporialacerata)，2013年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCCNO.7852。其生物学特性为，在PDA平板上，10天后长满平板，菌落呈白色绒毛状，菌丝生长蓬松，速度慢，多为气生菌丝，菌丝在显微镜下观察无隔，有旱螺旋状扭结。菌丝直径4.1-5.5μm。
梨树枝条降解真菌D10在PDA-愈创木酚培养基上产生红棕色氧化圈；在PDA-苯胺蓝培养基上产生褪色圈。PDA-愈创木酚培养基为：PDA培养基中加入1g·L-1愈创木酚。PDA-苯胺蓝培养基为：PDA培养基中加入0.1g·L-1苯胺蓝。PDA培养基为：土豆200.0g，蔗糖20.0g，琼脂18.00g，水1000mL。
本发明所述的用于降解梨树枝条的真菌在梨树修剪枝条降解方面的应用。
一种含有所述的梨树枝条降解真菌D10的真菌菌剂，其制备方法为：将上述菌株D10接种至梨树枝条粉末培养基上，25～35℃条件下静止培养6～8天，加无菌水震荡，过滤培养物后得到孢子悬液菌剂，调节孢子悬液菌剂中孢子数不少于104个/mL得到真菌菌剂；
所述的梨树枝条粉末培养基的配制方法为：梨树枝条粉末中添加等质量的无机营养液，至湿润状态，在121℃高压灭菌20min。
所述的无机营养液为：NH4Cl2.0g，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO41.0g，Na2HPO40.2g，MnSO40.0035g，CuSO4·5H2O0.007g，FeSO4·7H2O0.007g，ZnSO40.002g，CoCl2，0.003g，水1000mL，pH自然。
所述的梨树枝条粉末的制备方法：梨树枝条烘干至恒重，粉碎过20目筛。
上述含有梨树枝条降解真菌D10的真菌菌剂在降解梨树枝条方面的应用。
3.有益效果
菌株D10通过以梨树枝条为唯一碳源的液态和固态培养基富集，可以在愈创木酚选择培养基上生长良好且得以分离纯化。在PDA-愈创木酚培养基上产生红棕色氧化圈；在PDA-苯胺蓝平板上产生褪色圈。试验表明，30℃条件下，固态降解30天，接种真菌D10的培养基失重率可到达26％。经过21天的液体发酵，测定粗酶液中漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶活力。期间菌株D10的漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶活力最高值分别为：11.03、36.71和152.75U·mL-1。
本发明是利用微生物发酵的方法降解农业废弃物梨树修剪枝条，促进梨树枝条堆肥的腐熟进程，为梨树枝条堆肥化的推广利用提供技术支持。达到变废为宝、保护环境，促进农业可持续发展的目的，具有广阔的应用前景。
附图表说明
图1为本发明菌株D10的PDA-愈创木酚平板第10天显色反应图。
图2为本发明菌株D10的PDA-苯胺蓝平板第8天退色反应图。
图3为本发明菌株D10基于rDNA-ITS序列相似性的***发育树。
图4为本发明菌株D10的漆酶的活性。
图5为本发明菌株D10的木质素过氧化物酶的活性。
图6为本发明菌株D10的锰过氧化物酶的活性。
生物材料保藏信息
D10，分类命名为Ceriporialacerata，于2013年7月8日保藏于位于的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.7852。
具体实施方式
实施例1梨树枝条降解真菌D10筛选及鉴定
1)梨树枝条降解真菌的筛选：降解菌样品采自河北辛集常年堆置的梨树腐烂枝条。分别通过30天以梨树枝条为唯一碳源的固态富集培养基富集(固态富集培养基为：烘干粉碎后过20目筛的梨树枝条粉末20g，均匀添加超纯水20g)，挑选生长良好且快速的菌落，接种到新的固态富集培养基上继续培养第二代，获得对梨树枝条有高效降解效果的菌株。将在固态富集培养基上生长良好的菌落分别接种到愈创木酚选择培养基(愈创木酚选择培养基为：愈创木酚1g，KNO32g，MgSO40.5g，KH2PO41g，NaCl1g，Na2HPO41g，琼脂20g，水1000mL)上，挑选生长较快尤其是可以产生红棕色氧化圈的菌株进行分离纯化，最终得到能高效降解梨树枝条的真菌D10。
2)梨树枝条降解真菌的鉴定：真菌D10生物学特性：在PDA平板上，10天后长满平板，菌落呈白色绒毛状，菌丝生长蓬松，速度慢，多为气生菌丝，菌丝在显微镜下观察无隔，有旱螺旋状扭结。菌丝直径4.1-5.5μm。
真菌D10接种到PDA-愈创木酚平板和PDA-苯胺蓝平板，观察其显色圈和退色圈产生的时间和大小(见表1)，在PDA-愈创木酚平板上产生红棕色氧化圈(见图1)，在PDA-苯胺蓝平板上产生褪色圈(见图2)。PDA-愈创木酚培养基为：PDA培养基中加入1g·L-1愈创木酚。PDA-苯胺蓝培养基为：PDA培养基中加入0.1g·L-1苯胺蓝。PDA培养基为：土豆200.0g，蔗糖20.0g，琼脂18.00g，水1000mL。
表1菌株的平板显色反应和退色反应结果
注：d为菌落直径；D为透明圈直径；A＝D/d。
参照《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》初步鉴定该菌株D10为撕裂蜡孔菌(Ceriporialacerata)。
采用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，所得序列经NCBI比对，与CeriporialaceratastiainHJ有99％的相似度。选取和它相近的一些菌株绘制***发育进化树(见图3)，结合菌落和菌丝形态学特征，鉴定该菌株为撕裂蜡孔菌(Ceriporialacerata)。
实施例2梨树枝条降解菌D10菌剂的制备
将菌株D10接种至梨树枝条粉末培养基上，30℃条件下静止培养7天，加30mL无菌水在摇床上震荡30min，用纱布过滤培养物后得到孢子悬液菌剂，用无菌水调节孢子悬液菌剂中孢子数至104个/mL。
所述的梨树枝条粉末培养基为：梨树枝条粉末10g，无机营养液10g，梨树枝条粉末上均匀添加无机营养液至湿润状态，在121℃高压灭菌20min。
所述的梨树枝条粉末为经烘干至恒重、粉碎后过20目筛的梨树枝条粉末。
所述的无机营养液的配制方法为：NH4Cl2.0g，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO41.0g，Na2HPO40.2g，MnSO40.0035g，CuSO4·5H2O0.007g，FeSO4·7H2O0.007g，ZnSO40.002g，CoCl2，0.003g，水1000mL，pH自然。
实施例3菌株D10木质素降解酶活力测定
将菌株D10接种至装有50mL梨树枝条粉末培养基(同实施例2)的三角瓶中，30℃条件下静止培养7天，加30mL无菌水去三角瓶中，放在摇床上震荡30min，用纱布过滤培养物后得到孢子悬液菌剂，用无菌水调节孢子悬液菌剂中孢子数为104个/mL。接种1％上述孢子悬浮菌剂到100mL至以梨树枝条粉末为唯一碳源的液态产酶培养基的三角瓶(250mL)中，置30℃下160r/min振荡培养21天，每2天取样1次，发酵液离心过滤除去菌体和固体杂质后得到粗酶液，测定其中漆酶(Lac)，木质素过氧化物酶(Lip)和锰过氧化物酶(MnP)的活性。
Lac的酶活定义为每分钟氧化1μmol的ABTS为一个酶活单位(U)。Lip的酶活定义为每分钟氧化1μmol的藜芦醇为一个酶活单位(U)。MnP的酶活的定义为每分钟氧化1μmoL的Mn2+为Mn3+为一个酶活单位(U)。
液态产酶培养基为：葡萄糖20g，酒石酸铵0.2g，梨树枝条粉末1g，基础培养基100mL，0.1mol/LNaAc-HAc缓冲液(pH＝4.5)100mL，吐温801.0g，VB11.0mg，pH自然，121℃高压灭菌20min。
基础培养基为：K2PO420g，MnSO45g，CaCl21g，微量元素液100mL。
微量元素液为：MgSO43.0g，MnSO40.5g，NaCl1.0g，FeSO4·7H2SO40.1g，CoCl20.1g，CuSO40.1g，H3BO30.01g，ZnSO4·7H2O0.1g，AlK(SO4)2·12H2O0.01g，Na2MoO4·2H2O0.01g。
结果如图4、图5和图6所示，真菌D10可以产生大量的木质素降解酶类，产酶较快，产酶维持时间较长。结果表明，菌株D10产以上三种酶的酶活力均在第15天达到最高值，Lac，Lip，Mnp的酶活力最高值分别为11.03，36.71和152.75U·mL-1。菌株D10产Lac酶活力较高值维持在15-18天内，18天后酶活力下降较快。菌株D10产Lip酶活力的变化幅度较大，在12天到15天内酶活力大幅度上升，15天后酶活力大幅度下降，维持高酶活力的时间较短。菌株D10产Mnp酶活力值最高，产酶时间最早且产酶时间最长，产酶曲线稳步上升和下降，15-18天内可以维持稳定的产酶高峰。从酶活力的结果可见，菌株D10对枝条的降解能力主要是由于其产Mnp酶的能力。
实施例4菌株D10对梨树枝条的降解
向分化罐中加入5g过20目筛的烘干至恒重的梨树枝条粉末和10mL培养营养液(NH4Cl2.0g，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO41.0g，Na2HPO40.2g，MnSO40.035g，CuSO4·5H2O0.007g，FeSO4·7H2O0.007g，水1000mL)，至固液混匀并显平坦状，121℃灭菌后，接种1％实施例2制备的孢子悬液菌剂，置于30℃恒温箱中培养30天。培养期间，适当补充水分以维持培养基含水量在50％左右，实验设置重复三次。以接种等量无菌水作为空白试验。
培养结束后，去除表面覆盖的菌丝体，于105℃下烘干至恒重称重，测定降解率，降解率＝(降解前总质量-降解后总质量)/5g×100％。结果表明，菌株D10的降解率可达26±0.04％，空白对照降解率为0.08±0.02％。
Claims (6)
1.一株梨树枝条降解真菌D10，该菌株属于撕裂蜡孔菌(Ceriporialacerata)，2013年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.7852。
2.权利要求1所述的梨树枝条降解真菌D10在降解梨树枝条方面的应用。
3.一种含有权利要求1所述的梨树枝条降解真菌D10的真菌菌剂。
4.权利要求3所述的真菌菌剂的制备方法，包括：将权利要求1所述的菌株D10接种至梨树枝条粉末培养基上，25～35℃条件下静止培养6～8天，加无菌水震荡，过滤培养物后得到孢子悬液菌剂，调节孢子悬液菌剂中孢子数不少于104个/mL得到真菌菌剂；
所述的梨树枝条粉末培养基的配制方法为：梨树枝条粉末中添加等质量的无机营养液，至湿润状态，在121℃高压灭菌20min；
所述的无机营养液为：NH4Cl2.0g，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO41.0g，Na2HPO40.2g，MnSO40.0035g，CuSO4·5H2O0.007g，FeSO4·7H2O0.007g，ZnSO40.002g，CoCl2，0.003g，水1000mL，pH自然。
5.根据权利要求4所述的真菌菌剂的制备方法，其特征在于所述的梨树枝条粉末为经烘干至恒重、粉碎后过20目筛的梨树枝条粉末。
6.权利要求3所述的含有梨树枝条降解真菌D10的真菌菌剂在降解梨树枝条方面的应用。
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