CN115144511B - 一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的试剂盒及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的试剂盒及其制备方法和应用，涉及生物医药检测领域，该试剂盒采用小牛血浆作为稀释液进行多种酪氨酸激酶抑制剂类药物标准品溶液和/或质控品溶液的制备，提高了十六种激酶抑制剂样本的冻融稳定性、短期复溶稳定性和长期复溶稳定性，可同时检测16种酪氨酸激酶抑制剂，具有灵敏度高、特异性强、精密度和准确度高、稳定性好的优点，且操作简便快速，通量高，可满足不同药物的检测需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药检测领域，具体而言，涉及一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
酪氨酸激酶抑制剂为一类能抑制酪氨酸激酶活性的化合物。酪氨酸激酶抑制剂主要通过抑制细胞信号转导而抑制肿瘤细胞的生长和增殖，促进细胞凋亡。由于酪氨酸激酶抑制剂具有高亲脂性的特征，其生物利用度，药代动力学特性等在个体中差异很大，且治疗窗狭窄。血药浓度过低或过高可能导致治疗失败或严重的肾、肝毒性，因此需要进行治疗药物浓度监测，以指导临床安全、有效、合理用药。
越来越多的研究表明，在应用酪氨酸激酶抑制剂类药物进行抗肿瘤治疗时，有利于正确评估治疗效果，提高患者依从性，具有一定的临床意义。
现有检测酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的方法存在哪些不足：目前国内外监测ABL酪氨酸激酶抑制剂血药浓度最常用的方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)，荧光偏振免疫法(FPIA)，高效毛细管电泳法(HPCE)，放射免疫法(RIA)等。其中，高效液相色谱法是利用底物或产物与其它成分性质不同而进行分离的方法，要求底物或产物与其它成分完全分离，分离时间长，影响检测通量；荧光偏振免疫法操作繁琐；高效毛细管电泳法，灵敏度低，提高样品浓度易产生样品堆积的现象；放射免疫法产生大量的放射性垃圾，对人体有一定的损害。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的试剂盒及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的试剂盒的制备方法，其包括：冻干多种酪氨酸激酶抑制剂类药物的标准品溶液和/或质控品溶液，获得标准品和/或质控品；
其中，所述标准品溶液和所述质控品溶液采用的稀释液为小牛血浆；
所述酪氨酸激酶抑制剂类药物包括伊马替尼、N-去甲伊马替尼、索拉菲尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、克唑替尼、阿帕替尼、吉非替尼、依鲁替尼、达沙替尼、尼罗替尼、鲁索替尼、阿昔替尼、奥西替尼、厄洛替尼和帕纳替尼中的至少一种。
第二方面，本发明实施例提供了一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的试剂盒，其包括由如前述实施例所述的制备方法配制获得的试剂。
第三方面，本发明实施例提供了一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的方法，其包括以下步骤：采用如权利要求5所述的试剂盒，对样本进行液相色谱串联色谱检测，获得多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度；所述酪氨酸激酶抑制剂类药物包括伊马替尼、N-去甲伊马替尼、索拉菲尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、克唑替尼、阿帕替尼、吉非替尼、依鲁替尼、达沙替尼、尼罗替尼、鲁索替尼、阿昔替尼、奥西替尼、厄洛替尼和帕纳替尼中的至少一种；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的试剂盒采用小牛血浆作为稀释液进行多种酪氨酸激酶抑制剂类药物标准品溶液和/或质控品溶液的制备，提高了十六种激酶抑制剂样本的冻融稳定性、短期复溶稳定性和长期复溶稳定性，可同时检测16种酪氨酸激酶抑制剂，具有灵敏度高、特异性强、精密度和准确度高、稳定性好的优点，且操作简便快速，通量高，可满足不同药物的检测需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为液相色谱-串联质谱检测原理示意图；
图2为样本处理及检测流程图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供了一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的试剂盒的制备方法，其包括：冻干多种酪氨酸激酶抑制剂类药物的标准品溶液和/或质控品溶液，获得标准品和/或质控品；
其中，所述标准品溶液和所述质控品溶液采用的稀释液为小牛血浆；
所述酪氨酸激酶抑制剂类药物包括伊马替尼、N-去甲伊马替尼、索拉菲尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、克唑替尼、阿帕替尼、吉非替尼、依鲁替尼、达沙替尼、尼罗替尼、鲁索替尼、阿昔替尼、奥西替尼、厄洛替尼和帕纳替尼中的至少一种。
相对于现有标准品和质控品采用的稀释液(如甲醇)而言，小牛血浆能更好地维持多种酪氨酸激酶抑制剂类药物在基质(小牛血浆)中的稳定性，配合后续的冻干工艺处理，能够有效延长试剂盒的使用期限，提高检测有效性。
本发明试剂盒采用同位素标记内标法，以液相色谱-串联质谱仪，定量测定血浆样本中多项激酶抑制剂类药物的含量。
在一些实施例中，所述冻干的步骤如下：
| 预冻温度/℃ | 持续时间/min | 控制真空(mbar) |
| -40～-55 | 48～72 | / |
| 一次升华 | 持续时间/min | 控制真空(mbar) |
| -38～-50 | 2000～3000 | 0.2-0.8 |
| -20～-30 | 72～108 | 0.2-0.8 |
| -5～-10 | 72～108 | 0.2-0.8 |
| 解析干燥 | 持续时间/min | 控制真空(mbar) |
| 0～5 | 96～144 | / |
| 10～15 | 96～144 | / |
| 25～30 | 192～288 | / |
具体地，预冻温度可以为-40℃、-42℃、-44℃、-46℃、-48℃、-50℃、-52℃、-54℃、-55℃中的任意一种或任意两种之间的范围，持续时间可以为48min、50min、52min、54min、56min、58min、60min、62min、64min、66min、68min、70min、72min中的任意一种或任意两种之间的范围。一次升华的第一阶段的温度具体可以为-38℃、-40℃、-42℃、-44℃、-46℃、-48℃、-50℃中的任意一种或任意两种之间的范围，持续时间可以为2000min、2100min、2200min、2300min、2400min、2500min、2600min、2700min、2800min、2900min、3000min中的任意一种或任意两种之间的范围；第二阶段的温度具体可以为-20℃、-22℃、-24℃、-26℃、-28℃、-30℃中的任意一种或任意两种之间的范围，持续时间可以为72min、76min、80min、84min、88min、92min、96min、100min、104min、108min中的任意一种或任意两种之间的范围；第三阶段的温度具体可以为-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃、-10℃中的任意一种或任意两种之间的范围，持续时间可以为72min、76min、80min、84min、88min、92min、96min、100min、104min、108min中的任意一种或任意两种之间的范围。可以理解的是，一次升华的第一阶段～第三阶段分别对应表格里，“一次升华”的过程中，从上到下的三行反应条件，例如，第一阶段对应-38～-50℃，后续以此类推。
解析干燥第一阶段的温度具体可以为0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃中的任意一种或任意两种之间的范围，持续时间可以为96min、100min、104min、108min、112min、116min、120min、124min、128min、132min、136min、140min、144min中的任意一种或任意两种之间的范围；第二阶段可以为10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃中的任意一种或任意两种之间的范围，持续时间可以为96min、100min、104min、108min、112min、116min、120min、124min、128min、132min、136min、140min、144min中的任意一种或任意两种之间的范围；第三阶段具体可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃中的任意一种或任意两种之间的范围，持续时间可以为192min、202min、212min、222min、232min、242min、252min、262min、272min、282min、288min的任意一种或任意两种之间的范围。
不同的冻干参数对于冻干品的构成和性能影响较大，本发明限定的冻干参数有利于维持多达16种酪氨酸激酶抑制剂类药物的稳定性，使得检测结果的精准度保持在可接受范围内。
在一些实施例中，伊马替尼在标准品溶液的浓度为25～5000ng/mL，具体可以为25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、2500ng/mL和5000ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，索拉菲尼在标准品溶液的浓度为50～10000ng/mL，具体可以为50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL和10000ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，帕唑帕尼在标准品溶液的浓度为25～5000ng/mL；具体可以为25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL和5000ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，拉帕替尼在标准品溶液的浓度为25～5000ng/mL；具体可以为25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL和5000ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，阿帕替尼在标准品溶液的浓度为25～2000ng/mL；具体可以为10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，吉非替尼在标准品溶液的浓度为10～2000ng/mL；具体可以为10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，依鲁替尼在标准品溶液的浓度为10～2000ng/mL；具体可以为10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，达沙替尼在标准品溶液的浓度为1～200ng/mL；具体可以为1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL和200ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，克唑替尼在标准品溶液的浓度为10～2000ng/mL；具体可以为10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，尼罗替尼在标准品溶液的浓度为25～5000ng/mL；具体可以为25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL和5000ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，N-去甲伊马替尼在标准品溶液的浓度为25～5000ng/mL；具体可以为25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL和5000ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，厄洛替尼在标准品溶液的浓度为10～2000ng/mL；具体可以为10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，鲁索替尼在标准品溶液的浓度为10～2000ng/mL；具体可以为10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，帕纳替尼在标准品溶液的浓度为1～200ng/mL；具体可以为1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL和200ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，奥西替尼在标准品溶液的浓度为1～200ng/mL；具体可以为1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL和200ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，阿昔替尼在标准品溶液的浓度为0.5～100ng/mL。具体可以为0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL和100ng/mL中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述制备方法还包括配制沉淀剂，所述沉淀剂为甲醇溶液。
在一些实施例中，所述制备方法还包括配制用于色谱洗脱的流动相A和/或流动相B。
所述流动相A为含乙酸铵和甲酸的水溶液，其中，乙酸铵的作用浓度为1～5mmol/L，具体可以为1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L中的任意一种或任意两种之间的范围；甲酸的体积分数为0.01％～0.3％，具体可以为0.01％、0.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.25％、0.3％中的任意一种或任意两种之间的范围。
所述流动相B为含甲酸的甲醇溶液，其中，甲酸的体积分数为0.01％～0.3％，具体可以为0.01％、0.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.25％、0.3％中的任意一种或任意两种之间的范围。
本发明实施例还提供了一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的试剂盒，其包括由如前述任意实施例所述的制备方法配制获得的试剂。
本发明实施例还提供了一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的方法，其包括以下步骤：采用如前述任意实施例所述的试剂盒，对样本进行液相色谱串联色谱检测，获得多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度；
所述酪氨酸激酶抑制剂类药物包括伊马替尼、N-去甲伊马替尼、索拉菲尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、克唑替尼、阿帕替尼、吉非替尼、依鲁替尼、达沙替尼、尼罗替尼、鲁索替尼、阿昔替尼、奥西替尼、厄洛替尼和帕纳替尼中的至少一种。
所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
在一些实施例中，所述方法包括：复溶所述试剂盒中的校准品后，进行校准曲线的绘制；校准曲线的绘制方法可通过本领域常规技术内容获得，不再赘述。
在一些实施例中，所述复溶采用的复溶剂包括水。复溶剂的添加量＝冻干前的溶液体积-冻干后的溶液体积，即复溶剂的量为冻干过程中失去的溶液的量。
在一些实施例中，所述方法还包括采用所述试剂盒中的质控品对检测结果进行质控。质控的方法可通过本领域常规技术内容获得，不再赘述。
在一些实施例中，进行液相色谱串联质谱之前，所述方法还包括在样本中添加内标和沉淀剂。可选地，在操作时，可以先将内标和沉淀剂混合后，再与样本混合。
在一些实施例中，所述沉淀剂为甲醇溶液，具体为纯甲醇溶液。
在一些实施例中，每100μL待测样本，添加200～400μL的所述沉淀剂。可选地，每100μL待测样本，可对应添加200μL、220μL、240μL、260μL、280μL、300μL、320μL、340μL、360μL、380μL、400μL中的任意一种或任意两种之间的范围。在一些实施例中，可以先将内标添加入甲醇溶液中形成内标沉淀剂，后续用于与待测样本混合。
采用蛋白沉淀法处理样本后，进行液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析，待测物经色谱分离后，导入质谱仪，在离子源中离子化形成带电离子。在电场的作用下，聚焦进入三重四级杆质量分析器。在第一级四级杆(Q1)中，带电离子按质荷比分离，筛选出母离子，随后进入第二极四级杆(Q2)中，在碰撞气体和碰撞能量的作用下，碎裂形成碎片离子，产生的碎片离子进入到第三极四级杆(Q3)，按质荷比分离，筛选出目标子离子，最终进入检测器，产生信号。记录样品中各待测物及对应内标的色谱图及峰面积。以校准品的浓度为自变量xi，以对应浓度校准品和内标的峰面积比值均值为因变量yi，计算出线性回归方程。将(临床样本、质控品)中的待测物和内标的峰面积比值均值代入校准曲线线性回归方程，计算出样品中待测物的浓度。具体检测原理如图1所示。
在一些实施例中，所述色谱包括采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，所述流动相A为含乙酸铵和甲酸的水溶液，中，乙酸铵的作用浓度为1～5mmol/L，甲酸的体积分数为0.01％～0.3％；所述流动相B为含甲酸的甲醇溶液，其中，甲酸的体积分数为0.01％～0.3％；
在一些实施例中，所述梯度洗脱的程度如下：
0～0.1min，流动相A的体积百分比维持在70％～90％，流动相B的体积百分比维持在10％～30％；
0.1～2.5min，流动相A体积百分比由70％～90％降至10％～20％，流动相B体积百分比由10％～30％增至80％～90％；
2.5～2.9min，流动相A体积百分比维持在10％～20％，流动相B体积百分比维持在80％～90％；
2.9～3.0min，流动相A体积百分比由10％～20％增至70％～90％，流动相B体积百分比由80％～90％降至10％～30％；
3.0～4.0min，流动相A体积百分比保持在70％～90％，流动相B体积百分比保持在10％～30％。
本发明实施例限定的流动相和洗脱程序能够有效缩短分离时间，提高分离效果。
在一些实施例中，色谱条件如下：柱温为38～42℃，进样器温度为6～10℃，色谱柱为Thermo Scientific AccucoreTM aQ 50×2.1mm，粒径为2.6μm。
在一些实施例中，所述样本包括血浆样本和血清样本中的至少一种。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
校准品和质控品的制备。
1.1所用标准品信息如下表所示。
表1标准品信息
1.2将-80℃保存的各个酪氨酸激酶抑制剂内外标储备液取出，恢复至室温，使用前涡旋振荡30秒。
1.3按照下表所示步骤配制内标标准品溶液(内标沉淀剂)。
表2内标标准品溶液配制表
注：沉淀剂为纯甲醇溶液。
1.4按照下表所示步骤配制校准品工作液。
表3-1校准品工作液配制表
表3-2
表3-3
表3-4
表3-5
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表3-6
注：稀释液1为小牛血浆，小牛血浆购自河南巨石生物科技有限公司。上述配制方式可同时配制14套冻干品。
1.5按照下表所示步骤配制质控品工作液。
表4-1
表4-2
注：稀释液1为小牛血浆，小牛血浆购自河南巨石生物科技有限公司。上述配制方式可同时配制14套冻干品。
1.6分装：准确分取2.16mL(根据实际挥发物含量)上述小牛血浆基质校准品工作液、质控品工作液至7mL螺口瓶中，半加塞，待冻干。
1.7冻干
将上述检验合格并分装后的小牛血浆校准品、质控品工作液放入冻干机中进行冷冻干燥，按照真空冷冻干燥机标准操作规程，选取如下冻干参数对产品进行冷冻干燥。
表5冻干参数表
1.8包装试剂盒组分如下表所示。
试剂盒内校准品、质控品的稀释液为小牛血浆制品。
表6产品组成
本试剂盒未提供，检测需要的物品如表7所示，在其他实施例中，试剂盒可包含表7所示的物品。
表7检测用物品
| 名称 | 要求 | |
| 1 | 纯化水 | 去离子水 |
| 2 | 甲酸 | 色谱纯以上 |
| 3 | 甲醇 | 色谱纯以上 |
| 4 | 乙酸铵 | 色谱纯以上 |
| 5 | 聚丙烯离心管 | 1.5mL |
| 6 | 96孔V型板 | 450μL 96孔V型板和96孔板膜 |
| 7 | 涡旋混合器。 | / |
| 8 | 移液器 | 10-100μL，20-200μL，100-1000μL |
| 9 | 离心机 | 低温离心机 |
1.9冻干品复溶稳定性
考察了人血浆和小牛血浆两种基质对冻干品复溶稳定性的影响。分别考察了十六种激酶抑制剂样本在两种基质中的冻融稳定性、短期稳定性和长期稳定性：五次冻融循环(室温下解冻，再次置于-20℃至少冷冻一天)，在4℃放置4天，在室温下放置5个小时，在-20℃放置1个月。自动进样器稳定性是通过把注射后的样本储存在4℃持续24小时，然后重新注入新制备的校准品来进行评估。对于所有稳定性分析中，如果准确度在±15％范围内，则认为样本是稳定的，具体检测结果见表8和表9。
表8人血浆冻干品复溶稳定性
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表9小牛血浆冻干品复溶稳定性
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【样本要求】
1、样本类型：本试剂盒适用于人血浆样本，样本量要求≥0.5mL。
2、样本采集和制备：
推荐采用EDTA抗凝管进行样本采集，采血时应严格登记，标记无误，确保每个样本的信息准确。
3、样本储存及运输：
已采集的样本，室温(10℃～30℃)储存不超过3h；2℃～8℃条件下储存不超过48h；-20℃±5℃条件下可稳定放置4天；样本制备后于8℃-10℃条件下可稳定放置24h。
运输样本时，必须按照有关临床样本及感染物质运输规定进行包装并添加标签。样本可以在冰袋或者干冰中运输，运输时间不要超过上述相应温度下储存时间的限制。
4.干扰：
溶血、脂血会影响血浆样本的检测结果，采血时需引起注意。
5.注意事项：
样本使用前应恢复至室温(10～30℃)，并彻底混匀。
标准品、质控品、样本避免反复冻融超过3次。
【检验方法】
1.检测前请仔细阅读使用说明书。
2.测试前，将试剂盒和样本恢复至室温(10℃-30℃)。试剂盒中校准品和质控品精密加入2mL去离子水，静置30min待完全溶解后，2000g涡旋混匀3min，确保混合完全。
3.检测前溶液准备
流动相A的配制：精密称取0.154g乙酸铵和1mL甲酸，全部转移至1000mL试剂瓶中，然后加入1000mL去离子水，超声5分钟后，备用。
流动相B的配制：精密称取1mL甲酸，全部转移至1000mL试剂瓶中，然后加入1000mL甲醇，超声5分钟后，备用。
洗针液：精密量取500mL去离子水和500mL甲醇，全部转移至1000mL试剂瓶中，超声5分钟后，备用。
4.样本检测
提示：使用前，校准品、质控品、血浆样本、内标工作液至少2000g涡旋混匀3min，确保混合均匀。
4.1***适用性测试
在1.5mL EP管中精密吸取100μL校准品STD01，300μL内标准品溶液，2000g涡旋混匀3min，于14000r/min离心10min后吸取上清液上机检测，至少连续进样3针，3次进样结果中各项激酶抑制剂类抗肿瘤药物保留时间偏差应在±0.1min范围内，外标与其内标的峰面积比值的CV应≤15％。如***适用性溶液测试结果不满足上述要求，可重复进样3针。
提示：转移上清液时，请勿取到下层沉淀。
4.2样本处理
精密吸取校准品，质控品及待测样本各100μL，分别加入300μL内标标准品溶液，涡旋混匀3min，于14000r/min离心10min后，吸取上清液供LC-MS/MS检测，见图2。
提示：检测序列先进校准品后进质控品，对于一个96孔板，如样本量少于半板48个，确保检测序列首尾需各有一套低中高质控；如样本量多于半板48个，检测序列首尾和中间需各有一套低中高质控。
提示：使用后的校准品、质控品、内标准品需盖好盖，用封口膜封口，-20℃保存。血浆样本于-20℃保存。使用后装有下层沉淀物的1.5mL EP管或450μL 96孔板及废液，需按照医疗废弃物管理制度要求进行处理。
5.检测条件
5.1质谱条件(适用机型推荐检测条件)
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5.2色谱条件
6.数据分析和结果：
校准曲线绘制：以校准样品的浓度为自变量xi，以相应外标和内标的峰面积比值均值为因变量yi，计算线性回归方程y＝ax+b和相关系数r；
质控样品数据分析：当校准曲线的r≥0.990时，将质控品的信号强度带入回归方程，获得质控样品浓度；质控品的检测结果在预期范围内，如不满足，需排查原因，①序列进样位置编写错误，重新进样后满足要求；②前处理过程不当，质控以及质控之后随行的样本均需要重新进行前处理，重新进样后满足要求。
样本数据分析：当质控品的测定结果在允许范围内时，将待测样本的信号强度带入回归方程，获得待测样本中的目标物浓度。
对比例1
校准品中间液和质控品中间液的配制大致同实施例1，区别在于：
对比例1将甲醇作为稀释液，对校准品工作液和质控品工作液(浓度为实施例1配制的最终浓度的10倍)进行稀释，工作液所处环境是甲醇溶液，然后将校准品工作液和质控品工作液分别与小牛血浆按照体积比1:9的方式进行混合，有机试剂(甲醇)占比为10％，以获得与实施例1的校准品中间液和质控品中间液浓度相同的校准品中间液和质控品中间液。需要说明的是，校准品中间液是指冻干前的校准品工作液，质控品中间液指冻干前的质控品工作液。
结果发现，稀释液为纯甲醇时，与小牛血浆混合时有机试剂甲醇会促使小牛血浆中的蛋白从小牛血浆中析出，发生蛋白沉淀现象，产生大量絮状沉淀，影响溶液的均匀性，不易操作，也对检测结果有影响；而实施例1的校准品中间液和质控品中间液产生的絮状沉淀有限，有机试剂占比不超过1％，对溶液的均匀性影响不显著，更利于大批量冻干品的生产。
对比例2
一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的试剂盒的制备方法，大致与实施例1相同，区别在于冻干参数的不同，冻干参数如下：
表10冻干参数表
| 预冻温度/℃ | 持续时间/min | 控制真空(mbar) |
| -55 | 60 | / |
| 一次升华 | 持续时间/min | 控制真空(mbar) |
| -50 | 2500 | 0.2-0.8 |
| -40 | 90 | 0.2-0.8 |
| -10 | 90 | 0.2-0.8 |
| 解析干燥 | 持续时间/min | 控制真空(mbar) |
| 0 | 120 | / |
| 10 | 120 | / |
| 25 | 240 | / |
检测发现，一次升华温度为-40℃时，冻干品出现饼块萎缩的现象，冻干品复溶后进行前处理，上机检测发现检测结果准确度偏差超出±15％的允许偏差。
对比例3
一般以信噪比为10：1时相应的浓度或注入仪器的量确定定量限。将“一种同时测定人血浆中十二种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法(专利申请号为CN 114166987 A)”的定量限作为对照组，与本发明的定量限进行对比，对照组与实施例1的区别主要在于，定量限：吉非替尼1.25ng/mL，厄洛替尼0.5ng/mL，克唑替尼10ng/mL，而本发明定量限具体信息见下表，信噪比均大于10，定量限结果远远小于对照组。
测试结果：对照组定量限较高，而本发明定量限低，检测方法灵敏度高。
| 物质名称 | 信噪比 | 定量限(ng/mL) |
| 伊马替尼 | 22 | 2.84 |
| 索拉菲尼 | 100 | 3.11 |
| 帕唑帕尼 | 78 | 2.18 |
| 拉帕替尼 | 32 | 2.88 |
| 阿帕替尼 | 38 | 1.85 |
| 吉非替尼 | 12 | 0.13 |
| 依鲁替尼 | 31 | 0.13 |
| 达沙替尼 | 44 | 0.005 |
| 克唑替尼 | 34 | 1.17 |
| 尼罗替尼 | 12 | 4.42 |
| 去甲伊马替尼 | 229 | 1.72 |
| 厄洛替尼 | 18 | 0.27 |
| 鲁索替尼 | 13 | 0.09 |
| 帕纳替尼 | 53 | 0.05 |
| 奥西替尼 | 15 | 0.14 |
| 阿昔替尼 | 108 | 0.04 |
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (31)
1.一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的试剂盒的制备方法，其特征在于，其包括：冻干多种酪氨酸激酶抑制剂类药物的标准品溶液和/或质控品溶液，获得标准品和/或质控品；
其中，所述标准品溶液和所述质控品溶液采用的稀释液为小牛血浆；
所述酪氨酸激酶抑制剂类药物包括伊马替尼、N-去甲伊马替尼、索拉菲尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、克唑替尼、阿帕替尼、吉非替尼、依鲁替尼、达沙替尼、尼罗替尼、鲁索替尼、阿昔替尼、奥西替尼、厄洛替尼和帕纳替尼；
所述冻干的步骤如下：
。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，伊马替尼在标准品溶液的浓度为25~5000ng/mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，索拉菲尼在标准品溶液的浓度为50~10000ng/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，帕唑帕尼在标准品溶液的浓度为25~5000ng/mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，拉帕替尼在标准品溶液的浓度为25~5000ng/mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，阿帕替尼在标准品溶液的浓度为25~2000ng/mL。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，吉非替尼在标准品溶液的浓度为10~2000ng/mL。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，依鲁替尼在标准品溶液的浓度为10~2000ng/mL。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，达沙替尼在标准品溶液的浓度为1~200ng/mL。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，克唑替尼在标准品溶液的浓度为10~2000ng/mL。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，尼罗替尼在标准品溶液的浓度为25~5000ng/mL。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，N-去甲伊马替尼在标准品溶液的浓度为25~5000ng/mL。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，厄洛替尼在标准品溶液的浓度为10~2000ng/mL。
14.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，鲁索替尼在标准品溶液的浓度为10~2000ng/mL。
15.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，帕纳替尼在标准品溶液的浓度为1~200ng/mL。
16.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，奥西替尼在标准品溶液的浓度为1~200ng/mL。
17.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，阿昔替尼在标准品溶液的浓度为0.5~100ng/mL。
18.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括配制沉淀剂，所述沉淀剂为甲醇溶液。
19.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括配制用于色谱洗脱的流动相A和/或流动相B；
所述流动相A为含乙酸铵和甲酸的水溶液，其中，乙酸铵的作用浓度为1~5mmol/L，甲酸的体积分数为0.01%~0.3%；
所述流动相B为含甲酸的甲醇溶液，其中，甲酸的体积分数为0.01%~0.3%。
20.一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的试剂盒，其特征在于，其包括由如权利要求1~19任一项所述的制备方法配制获得的试剂。
21.一种用于检测多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度的方法，其特征在于，其包括以下步骤：采用如权利要求20所述的试剂盒，对待测样本进行液相色谱串联色谱检测，获得多种酪氨酸激酶抑制剂类药物浓度；
所述酪氨酸激酶抑制剂类药物包括伊马替尼、N-去甲伊马替尼、索拉菲尼、拉帕替尼、帕唑帕尼、克唑替尼、阿帕替尼、吉非替尼、依鲁替尼、达沙替尼、尼罗替尼、鲁索替尼、阿昔替尼、奥西替尼、厄洛替尼和帕纳替尼；
所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述方法包括：复溶所述试剂盒中的校准品后，进行校准曲线的绘制。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述复溶采用的复溶剂包括水。
24.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述方法还包括采用所述试剂盒中的质控品对检测结果进行质控。
25.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，进行液相色谱串联质谱之前，所述方法还包括在待测样本中添加内标和沉淀剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述沉淀剂为甲醇溶液。
27.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，每100μL待测样本，添加200~400μL的所述沉淀剂。
28.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述色谱包括采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，所述流动相A为含乙酸铵和甲酸的水溶液，中，乙酸铵的作用浓度为1~5mmol/L，甲酸的体积分数为0.01%~0.3%；所述流动相B为含甲酸的甲醇溶液，其中，甲酸的体积分数为0.01%~0.3%。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程度如下：
0～0.1min，流动相A的体积百分比维持在70%～90％，流动相B的体积百分比维持在10%～30％；
0.1~2.5min，流动相A体积百分比由70%～90％降至10%～20％，流动相B体积百分比由10%～30％增至80%～90％；
2.5~2.9min，流动相A体积百分比维持在10%~20%，流动相B体积百分比维持在80%~90%；
2.9~3.0min，流动相A体积百分比由10%~20%增至70%~90%，流动相B体积百分比由80%~90%降至10%~30%；
3.0~4.0min，流动相A体积百分比保持在70%~90%，流动相B体积百分比保持在10%~30%。
30.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，色谱条件如下：柱温为38~42℃，进样器温度为6~10℃，色谱柱为Thermo Scientific AccucoreTM aQ 50×2.1mm，粒径为2.6μm。
31.根据权利要求21~30任一项所述的方法，其特征在于，所述样本包括血浆样本和血清样本中的至少一种。
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