CN109541104B - 一种半夏糖浆中半夏的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学分析中药物检测技术领域，特别涉及一种半夏糖浆中半夏的鉴别方法：待检样品提取蛋白质后经过胰蛋白酶酶解处理，离心取上清液；将上清液注入液相色谱‑质谱仪，进行多反应监测。该方法专属性非常强，且操作简单，易于推广使用。该方法可以大大提高半夏药材及其它部分含半夏中成药的质量控制水平，可以确保中药临床用药的安全性和有效性。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析中药物检测技术领域，特别涉及一种半夏糖浆中半夏的鉴别方法。
背景技术
目前中成药中对半夏的真伪定性研究非常少且方法的专属性存在严重问题。含半夏的中成药有四百多种，但仅有保和片、半夏注射液等很少几种中成药采用薄层色谱法对半夏进行定性鉴别，而且主要针对半夏所含的氨基酸或谷甾醇类化学成分进行薄层鉴别，上述成分在动植物药中普遍存在，不具有专属性，根本无法对中成药中半夏进行准确的定性鉴别。现有技术中也有使用高效液相色谱方法对半夏进行定性和定量鉴别和质量控制的记载，同样也因为上述原因在专属性方面不够严谨。
半夏糖浆的生产企业全国共有约80家，年生产量巨大，是临床常用的止咳化痰类中成药，其是由生半夏等八味药组成，标准中仅有挥发油类和氨基酸类两个理化鉴别项及糖浆剂的常规检验项，标准非常落后。特别是半夏为方中君药，是本品止咳化痰的主要功效药味，却没有任何质量控制项目，无法对药品的质量进行有效控制。半夏含有淀粉、蛋白质、氨基酸、生物碱、有机酸、谷甾醇、腺苷等成分，所含化学成分非常复杂，除淀粉外其它成分的含量都相对较低，到目前为止对其有效成分仍不能完全确定，而且半夏属于贵细且具有毒性的中药材，故无论是半夏中药材，还是含半夏的中成药对半夏的质量控制既是重点也是难点，非常有必要对其进行研究。在半夏有效成分尚未完全明确的情况下，半夏糖浆的质量控制中对半夏进行定性鉴别要远优于采用一两个化学成分为指标的含量测定的效果，而且目前对半夏药材含量测定的琥珀酸、柠檬酸、鸟苷、麻黄碱、谷甾醇等成分不具有专属性，特别是在半夏糖浆等复方制剂中上述成分完全没有专属性，故急需立半夏糖浆中专属性的半夏定性鉴别质量控制方法以对方中君药半夏的投料及提取使用情况进行有效的质量控制。
发明内容
为了解决以上现有技术中半夏鉴别中存在的专属性不强的问题，本申请公开了一种专属性强的半夏糖浆中半夏的鉴别方法。
考虑到半夏所含蛋白与其它中药所含蛋白存在差异，可以通过用适当的酶对蛋白进行酶解，再通过与数据库中已知蛋白进行序列比对等方法寻找出半夏相对于其他中药的差异性肽段，通过对该差异性肽段的结构进行分析，推断出该特征肽段质谱离子化的方式，进而确定测定该特征肽段的母离子和子离子，再通过对多批半夏样品及半夏糖浆样品进行实验方法验证，最终建立针对该差异性肽段的检测方法。
本发明是通过以下步骤得到的：
一种半夏糖浆中半夏的鉴别方法，包括以下步骤：
（1）待检样品提取蛋白质后经过胰蛋白酶酶解处理，离心取上清液；
（2）将上清液注入液相色谱-质谱仪，在电喷雾离子化，正离子模式下，进行多反应监测，选择m/z双电荷 642.32→708.38和642.32→878.48作为半夏的检测离子对，在保留时间6.24±0.2min有色谱峰，说明待检样品中含有半夏，在保留时间6.24±0.2min无色谱峰，说明待检样品中不含有半夏。
所述的鉴别方法，优选采集3～10min的质谱信号。
所述的鉴别方法，优选液体待检样品经过醇沉富集蛋白质，醇沉使用无水乙醇，其与液体待检样品的体积比为5：1。
所述的鉴别方法，优选液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件如下：
液相条件：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 ，2.1×100mm，1.7μm，柱温35℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱；
质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化，正离子模式下，进行多反应监测，鞘气流速，46L/hr；辅助气流速，542 L/hr；喷雾电压，3.6KV；离子源温度150℃；辅助气温度，400℃。
所述的鉴别方法，优选蛋白提取和胰蛋白酶酶解处理操作如下：
取液体待检样品2ml，加入无水乙醇10ml，摇匀，静置1h，离心，沉淀于60℃烘干，加入1ml 1%NH4HCO3溶液和20μL 0.50M的二硫苏糖醇溶液，溶解，置100℃处理10min，取出放冷至室温，加入50μL 0.55M的碘代乙酰胺溶液，避光反应30min，混匀，离心；加入10μL 10mg/ml的牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置100℃处理5min，取出放冷至室温，离心，得上清液。
所述的鉴别方法，优选蛋白提取和胰蛋白酶酶解处理操作如下：
取固体待检样品20mg，加入1ml1%NH4HCO3溶液和20μL 0.50M的二硫苏糖醇溶液，摇匀，置100℃处理10min，取出放冷至室温，加入50μL 0.55M的碘代乙酰胺溶液，避光反应30min，混匀，离心；加入10μL 10mg/ml的牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置100℃处理5min，取出放冷至室温，离心，得上清液。
所述的鉴别方法，优选梯度洗脱程序：0→3min，流动相A 95%，流动相B 5%；3→8min，流动相A 95%→70%，流动相B 5%→30%；8→8.1min,流动相A 70%→0%，流动相B 30%→100%；8.1→10min,流动相A 0%，流动相B 100%。
本发明的有益效果：
本发明方法是基于物种所含差异特征肽段进行质谱检测来对半夏进行定性鉴别，该方法专属性非常强，且操作简单，易于推广使用。该方法可以大大提高半夏药材及部分含半夏中成药的质量控制水平，可以确保中药临床用药的安全性和有效性。
附图说明
图1为半夏药材（编号1）的色谱图（提取642.32→708.38和642.32→878.48离子），
图2为半夏对照药材（编号6）的色谱图（提取642.32→708.38和642.32→878.48离子），
图3为半夏糖浆（编号7）的色谱图（提取642.32→708.38和642.32→878.48离子），
图4为半夏糖浆（编号10）的色谱图（提取642.32→708.38和642.32→878.48离子），
图5为阴性对照（编号15）的色谱图（提取642.32→708.38和642.32→878.48离子）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
试验中相关溶液的制备：
DTT溶液：称取DTT（二硫苏糖醇）适量，用水溶解，即得（浓度为0.50M）；
IAA溶液：称取IAA（碘代乙酰胺）适量，用水溶解，即得（浓度为0.55M，临用现配）；
碳酸氢铵溶液：称取碳酸氢铵适量，用水溶解，即得（浓度为1.0%）；
牛胰蛋白酶溶液：称取牛胰蛋白酶适量，用乙酸溶液溶解，即得（浓度为10mg/ml），分装成小份，贮存于-20℃，备用。
实施例1
1 仪器、试剂与样品
仪器：Waters Quattro Premier XE高效液相色谱-质谱联用仪；SartoriusCP225D电子天平。
试剂：胰蛋白酶（Sigma公司生产，批号：SLBS8956）、二硫苏糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）、碳酸氢铵、乙酸均为分析纯。
样品：半夏糖浆（来自市场抽样）；半夏药材（市场收集）；半夏对照药材（中检院提供，批号： 121272-201605）。
2 液相及质谱条件
液相条件：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1×100mm，1.7μm)，柱温35℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱，见下表。
表 梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
| 0 | 95 | 5 |
| 3 | 95 | 5 |
| 8 | 70 | 30 |
| 8.1 | 0 | 100 |
| 10 | 0 | 100 |
质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测，鞘气流速，46L/hr；辅助气流速，542 L/hr；喷雾电压，3.6KV；离子源温度150℃；辅助气温度，400℃。选择m/z（双电荷） 642.32→708.38和642.32→878.48作为半夏的检测离子对，进样体积为5µl。
3 溶液的制备
3.1 供试品溶液的制备
精密量取半夏糖浆中2ml，加入无水乙醇10ml，摇匀，静置1h，离心（12000rpm，10min），沉淀于60℃烘干，精密加入1ml 1%NH4HCO3溶液和20μL DTT溶液，充分溶解，置100℃处理10min，取出放冷至室温，精密加入50μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心（12000rpm，10min）；精密加入10μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置100℃处理5min，取出放冷至室温，离心（14000rpm，15min），取上清液，即得。
3.2 药材溶液的制备
取半夏药材及对照药材各20mg，精密称重，精密加入1ml1%NH4HCO3溶液和20μL DTT溶液，摇匀，置100℃处理10min，取出放冷至室温，精密加入50μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心（12000rpm，10min）；精密加入10μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置100℃处理5min，取出放冷至室温，离心（14000rpm，15min），取上清液，即制得对照药材溶液。
3.3 阴性对照溶液的制备
按半夏糖浆的处方比例称取相应的药材，按半夏糖浆的制备工艺制备缺半夏的阴性对照溶液。精密量取阴性对照溶液2ml，加入无水乙醇10ml，摇匀，静置1h，离心（12000rpm，10min），沉淀于60℃烘干，精密加入1ml 1%NH4HCO3溶液和20μL DTT溶液，摇匀，置100℃处理10min，取出放冷至室温，精密加入50μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心（12000rpm，10min）；精密加入10μL牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置100℃处理5min，取出放冷至室温，离心（14000rpm，15min），取上清液，即得。
4 样品的测定
取供试品溶液、半夏药材及对照药材溶液和阴性对照溶液各5μl，分别注入液相色谱-质谱仪，在电喷雾离子化（ESI），正离子模式下，进行多反应监测，为减少样品对质谱分析器的污染，仅采集3～10min的质谱信号，其他时间段携带样品经色谱柱流出后的流动相直接进入废液管。选择m/z（双电荷） 642.32→708.38和642.32→878.48作为检测离子对，进行分析。
5 结果与分析
5.1 结果
将收集到的不同样品按照上述方法进行测试。其中8批半夏糖浆按其现行质量标准检验，全部合格。结果如下。
表 样品检验结果
| 编号 | 名称 | 产地或生产单位 | 是否检出半夏离子对/保留时间（min） | 结论 |
| 1 | 半夏 | 山东 | 是/ 6.24 | 检出半夏 |
| 2 | 半夏 | 四川 | 是/ 6.24 | 检出半夏 |
| 3 | 半夏 | 安徽 | 是/ 6.23 | 检出半夏 |
| 4 | 半夏 | 湖北 | 是/ 6.24 | 检出半夏 |
| 5 | 半夏 | 甘肃 | 是/ 6.23 | 检出半夏 |
| 6 | 半夏对照药材 | 中检院 | 是/ 6.23 | 检出半夏 |
| 7 | 半夏糖浆 | 山东某制药公司 | 是/ 6.23 | 检出半夏 |
| 8 | 半夏糖浆 | 广东某制药公司 | 是/ 6.24 | 检出半夏 |
| 9 | 半夏糖浆 | 广西某制药公司 | 是/ 6.23 | 检出半夏 |
| 10 | 半夏糖浆 | 甘肃某制药公司 | 否 | 未检出半夏 |
| 11 | 半夏糖浆 | 广州某制药公司 | 是/ 6.23 | 检出半夏 |
| 12 | 半夏糖浆 | 河南某制药公司 | 是/ 6.24 | 检出半夏 |
| 13 | 半夏糖浆 | 江苏某制药公司 | 是/ 6.23 | 检出半夏 |
| 14 | 半夏糖浆 | 江西某制药公司 | 是/ 6.23 | 检出半夏 |
| 15 | 阴性对照 | 实验室自制 | 否 | 未检出半夏 |
5.2 分析
由上表结果可知，半夏药材、半夏对照药材及7批半夏糖浆均在保留时间6.24min左右出现色谱峰（提取离子642.32→708.38色谱图和提取离子642.32→878.48色谱图），不含有半夏的阴性对照在保留时间6.24min左右均没有色谱峰（提取离子642.32→708.38色谱图和提取离子642.32→878.48色谱图）。仅有1批半夏糖浆(编号10)未检出半夏，经将该批半夏糖浆的取样量调整为10ml，加50ml乙醇进行处理，其它制备方法不变，结果可以检出半夏，说明该企业半夏糖浆中半夏蛋白含量与其它企业产品相比很低，在该试验条件下结果为阴性，可以判其半夏未检出，可能与该企业半夏质量或投料量有关。该8批半夏糖浆样品经现行标准检验是合格的，而采用该方法检出1批不合格，可以对半夏糖浆质量进行区分，说明该方法可以用于半夏糖浆中半夏的质量控制。为保证检验结果的准确性，待测样品色谱图提取离子642.32→708.38和642.32→878.48色谱图必须同时具有明显的色谱峰方可判为检出半夏。
为保证检验结果的准确性，在该实验条件下半夏对照药材的提取离子642.32→708.38和642.32→878.48色谱图必须同时具有明显的色谱峰方可进行检验，否则应检查仪器状态或样品的制备方法直到满足实验要求。
试验中曾对供试品溶液的制备方法进行了考察，不经过醇沉直接酶解半夏糖浆样品，则因样品中其他成分存在严重干扰，无法检测到上述特征离子对。因半夏糖浆粒含有大量蔗糖等小分子干扰物质，而半夏蛋白为大分子物质，故可以利用醇沉方式进行富集和纯化半夏蛋白，醇沉时曾对乙醇用量进行了考察，分别比较了相对于半夏糖浆取样体积的1、3、5和7倍量，结果加入5倍量和7倍量的乙醇信号响应强度相近，加入1倍量信号响应强度比较弱，故选择加入5倍量乙醇。对半夏糖浆的取样量进行了考察，分别比较了取样1、2和3ml，结果取样量1ml信号响应强度比较弱，取样2ml的信号响应强度适中，为减少对质谱仪器的污染，故选择取样量为2ml。
该技术可用于半夏药材及半夏糖浆等部分含半夏中成药的专属性鉴别，该方法可以提高半夏药材、饮片及部分含半夏中成药的质量控制水平，很好地解决了半夏专属性鉴别的问题，对确保中药的用药安全和临床疗效具有重要意义。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种半夏糖浆中半夏的鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）待检样品提取蛋白质后经过胰蛋白酶酶解处理，离心取上清液；
（2）将上清液注入液相色谱-质谱仪，在电喷雾离子化，正离子模式下，进行多反应监测，选择m/z双电荷 642.32→708.38和642.32→878.48作为半夏的检测离子对，在保留时间6.24±0.2min有色谱峰，说明待检样品中含有半夏，在保留时间6.24±0.2min无色谱峰，说明待检样品中不含有半夏；
液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件如下：
液相条件：色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18 ，2.1×100mm，1.7μm，柱温35℃，流速0.3mL/min，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，进行梯度洗脱；梯度洗脱程序：0→3min，流动相A 95%，流动相B 5%；3→8min，流动相A 95%→70%，流动相B 5%→30%；8→8.1min,流动相A 70%→0%，流动相B 30%→100%；8.1→10min,流动相A 0%，流动相B100%；
质谱条件：采用质谱检测器，电喷雾离子化，正离子模式下，进行多反应监测，鞘气流速，46L/hr；辅助气流速，542 L/hr；喷雾电压，3.6KV；离子源温度150℃；辅助气温度，400℃。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于采集3～10min的质谱信号。
3.根据权利要求1或2所述的鉴别方法，其特征在于液体待检样品经过醇沉富集蛋白质，醇沉使用无水乙醇，其与液体待检样品的体积比为5：1。
4.根据权利要求1或2所述的鉴别方法，其特征在于蛋白提取和胰蛋白酶酶解处理操作如下：
取液体待检样品2ml，加入无水乙醇10ml，摇匀，静置1h，离心，沉淀于60℃烘干，加入1ml 1%NH4HCO3溶液和20μL 0.50M的二硫苏糖醇溶液，溶解，置100℃处理10min，取出放冷至室温，加入50μL 0.55M的碘代乙酰胺溶液，避光反应30min，混匀，离心；加入10μL 10mg/ml的牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解15min；然后置100℃处理5min，取出放冷至室温，离心，得上清液。
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