CN115124442B - 单糖衍生化试剂、其制备方法及单糖异构体的质谱成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单糖衍生化试剂、其制备方法及单糖异构体的质谱成像方法，将所述衍生化试剂喷涂到组织切片的表面进行原位衍生化反应，得到不同单糖衍生化产物；将衍生化反应后的组织切片喷涂基质，然后进行MALDI质谱成像分析，得到不同单糖同分异构体在组织切片中的空间分布特征。单糖衍生化试剂为1‑萘乙酰肼，其结构式如式(I)所示：式(I)。
Description
技术领域
本发明属于质谱检测技术领域，涉及一种单糖衍生化试剂、其制备方法及单糖异构体的质谱成像方法，该质谱成像方法可以在生物组织单糖原位分析中应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。
单糖是碳水化合物在机体中存在的最基本的形式，在许多生物过程中发挥着重要的作用。质谱因分析速度快、通量大，已经成为检测生物样品中单糖的有力工具。然而，由于单糖天然丰度低，疏水性差，电离效率低，对生物组织中单糖进行高灵敏的检测仍然面临着重大的挑战。
在质谱检测的过程中，化学衍生化是提高糖类检测灵敏度的一种有效策略。有研究者采用吉拉德试剂P、吉拉德试剂T为衍生化试剂，在糖分子上引入永久性阳离子基团来提糖分子的检测灵敏度。另外，通过在糖分子的还原端引入疏水基团能够提高糖分子的质谱离子化效率，也可以增强糖分子的质谱检测灵敏度。然而，这些方法都是通过液-质联用技术(LC-MS)进行的，而进行液-质联用分析则必须进行组织匀浆，这势必会造成生物组织中糖类分子空间信息的丢失。MALDI质谱成像技术可以在不破坏组织空间特征的前提下对组织中分子进行可视化分析。但是，对于生物组织中单糖同分异构体而言，由于他们具有相同的质荷比(m/z)值，难以采用MALDI质谱成像技术直接对不同单糖同分异构体进行分析，无法实现生物组织中单糖同分异构体的可视化表征。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种单糖衍生化试剂、其制备方法及单糖异构体的质谱成像方法。通过合成一种新型单糖衍生化试剂并将其喷涂在组织切片表面进行原位衍生化反应，进一步采用MALDI质谱成像技术对经过衍生化的组织切片喷涂基质进行可视化分析，实现了生物组织中单糖同分异构体的原位可视表征。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供一种单糖衍生化试剂，该衍生化试剂为1-萘乙酰肼，其结构式如式(I)所示：
第二方面，本发明提供所述单糖衍生化试剂的制备方法，其合成工艺路线为：
第三方面，本发明提供一种单糖异构体的质谱成像方法，包括如下步骤：
将所述衍生化试剂喷涂到组织切片的表面进行原位衍生化反应，得到不同单糖衍生化产物；
将衍生化反应后的组织切片喷涂基质，然后进行MALDI质谱成像分析，得到不同单糖同分异构体在组织切片中的空间分布特征。
上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下：
(1)所用衍生化试剂为1-萘乙酰肼，该衍生化试剂能够与单糖中的羰基或者醛基快速发生反应，反应条件温和，适合组织切片表面的原位衍生化，通过化学衍生化方法，能够在糖分子中引入疏水性较大的萘环，能够显著提高糖分子的离子化效率，可以显著提高糖类分子的质谱检测灵敏度。
(2)通过对组织切片中单糖分子进行原位衍生化，结合MALDI成像技术，可以实现生物组织中多类单糖分子的原位可视化分析。
通过对衍生化后的单糖分子进行二级质谱分析，能够获得酮糖和醛糖分子的特征碎片离子，对特征碎片离子进行MALDI成像，能够表征不同单糖同分异构体在组织切片中空间分布特征。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是单糖与1-萘乙酰肼的反应式；
图2是不同单糖异构体与1-萘乙酰肼反应后生成衍生物的二级质谱轮廓及碎片离子结构。
图3是本发明实施例2中己酮糖、己醛糖同分异构体在胡萝卜组织中的质谱成像图。
图4是本发明实施例3中己酮糖、己醛糖同分异构体在草莓组织中的质谱成像图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
针对背景技术中所记载的，由于生物组织中单糖同分异构体具有相同的质荷比(m/z)值，难以采用MALDI质谱成像技术直接对不同单糖同分异构体进行分析，无法实现生物组织中单糖同分异构体的可视化表征。本发明提出了一种基于化学衍生化的单糖同分异构MALDI质谱成像方法。
第一方面，本发明提供一种单糖衍生化试剂，该衍生化试剂为1-萘乙酰肼，其结构式如式(I)所示：
第二方面，本发明提供所述单糖衍生化试剂的制备方法，其合成工艺路线为：
第三方面，本发明提供一种单糖异构体的质谱成像方法，包括如下步骤：
将所述衍生化试剂喷涂到组织切片的表面进行原位衍生化反应，得到不同单糖衍生化产物；
将衍生化反应后的组织切片喷涂基质，然后进行MALDI质谱成像分析，得到不同单糖同分异构体在组织切片中的空间分布特征。
在一些实施例中，所述衍生化试剂的溶剂为乙腈和乙酸混合溶液，乙腈和乙酸的体积比为1-9:1，优选的，乙腈和乙酸的体积比为7:3。乙腈和乙酸的体积比还可以具体为：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1。
乙腈的作用是溶解衍生化试剂，乙酸溶液可以提供酸性环境，加快衍生化反应的速度。
优选的，所述衍生化试剂的浓度为0.1-1.0mg/mL，如可以为：0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1.0mg/mL等等，优选为0.5mg/mL。
优选的，所述衍生化试剂的喷涂温度为30-70℃，如可以为：30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃。衍生化试剂的喷涂温度优选为55℃。较高温下衍生化试剂的雾化效果更好，在组织切片表面的分布更加均匀。
在一些实施例中，衍生化试剂在组织切片表面的喷涂量为5-20ng/cm2，如，可以为：5ng/cm2、6ng/cm2、7ng/cm2、8ng/cm2、9ng/cm2、10ng/cm2、11ng/cm2、12ng/cm2、13ng/cm2、14ng/cm2、15ng/cm2、16ng/cm2、17ng/cm2、18ng/cm2、19ng/cm2、20ng/cm2。衍生化试剂在组织切片表面的喷涂量优选为10ng/cm2。
优选的，将衍生化试剂喷涂于组织切片表面后，将组织切片进行恒温孵育，衍生化反应，孵育温度为40-70℃，如可以为：40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃。
在一些实施例中，喷涂的基质选自2,5-二羟基苯甲酸、1,5-二氨基萘或α-腈基-4-羟基肉桂酸，优选为1,5-二氨基萘。
在一些实施例中，MALDI质谱成像分析中，选用MALDI-TOF/TOF型质谱成像仪对喷涂完基质的组织切片进行扫描分析，选择MS或MS/MS扫描模式。
优选的，对切片进行MALDI-MS/MS质谱成像分析时，CID能量打开，前体离子的分析窗口选择为0.6％。
优选的，单糖同分异构体为酮糖和醛糖。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
在载玻片上对不同单糖同分异构体进行化学衍生化质谱成像分析：步骤如下：
(1)分别精密称量5.0mg的葡萄糖(己醛糖)和果糖(己酮糖)对照品置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈：乙酸(70:30，v/v)溶液，涡旋混匀，超声5分钟，得浓度为0.5mg/mL的葡萄糖和果糖溶液；
(2)利用HTX TM-SprayerTM喷涂仪，将0.5mg/mL的葡萄糖和果糖溶液分别喷涂到氧化铟锡导电载玻片上，喷涂面积为1cm×1cm，喷涂密度为10ng/cm2。
(3)精密称量5.0mg的1-萘乙酰肼置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈：乙酸(70:30，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，得0.5mg/mL的1-萘乙酰肼溶液。
(4)利用HTX TM-SprayerTM喷涂仪，将0.5mg/mL的1-萘乙酰肼溶液喷涂到有葡萄糖和果糖的载玻片上，1-萘乙酰肼溶液的喷涂密度为10ng/cm2。
(5)将喷涂有单糖和1-萘乙酰肼的氧化铟锡导电载玻片置于恒温孵育箱中，孵育箱温度设置为60℃，孵育时间为2h。
(6)精密称量25mg的1,5-二氨基萘置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈：水(70:30，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，得2.5mg/mL的1,5-二氨基萘溶液；
(7)利用HTX TM-SprayerTM喷涂仪，将2.5mg/mL的1,5-二氨基萘溶液喷涂到衍生化后的氧化铟锡导电载玻片上，溶液喷涂速率75μL/min，喷涂循环次数10次；
(8)用布鲁克Rapiflex MALDI-TOF/TOF型质谱成像仪对在氧化铟锡导电载玻片衍生化后的葡萄糖和果糖进行二级质谱分析，发现葡萄糖(己醛糖)能够产生特征碎片离子m/z 265.1，果糖(己酮糖)能够产生特征碎片离子m/z 295.1，见图2。
(9)通过SCiLS Lab 2018b数据处理软件，分别靶向提取葡萄糖(己醛糖)、果糖(己酮糖)的特征碎片离子m/z 265.1、m/z 295.1在氧化铟锡导电载玻片上的质谱成像图，见图3。
实施例2
胡萝卜中单糖及单糖同分异构体的衍生化质谱成像分析
(1)取新鲜的胡萝卜，制作厚度为20μm的冰冻切片；
(2)将胡萝卜组织冰冻切片转移到ITO-氧化铟锡导电载玻片上，真空中干燥15分钟。
(3)精密称量5.0mg的1-萘乙酰肼置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈：乙酸(70:30，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，得0.5mg/mL的1-萘乙酰肼溶液。
(4)利用HTX TM-SprayerTM喷涂仪，将0.5mg/mL的1-萘乙酰肼溶液喷涂到胡萝卜切片上，组织表面1-萘乙酰肼溶液的喷涂密度为10ng/cm2。
(5)将喷涂有1-萘乙酰肼的胡萝卜组织切片置于恒温孵育箱中，孵育箱温度设置为60℃，孵育时间为2h。
(6)精密称量25mg的1,5-二氨基萘置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈：水(70:30，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，得2.5mg/mL的1,5-二氨基萘溶液；
(7)利用HTX TM-SprayerTM喷涂仪，将2.5mg/mL的1,5-二氨基萘溶液喷涂到衍生化后的胡萝卜切片上，溶液喷涂速率75μL/min，喷涂循环次数10次；
(8)用布鲁克Rapiflex MALDI-TOF/TOF型质谱成像仪对胡萝卜组织切片进行二级质谱分析，发现胡萝卜中既有己醛糖的特征碎片离子m/z 265.1，又有己酮糖的特征碎片离子m/z 295.1，表明胡萝卜中既有己醛糖，又有己酮糖。
(9)借助SCiLS Lab 2018b数据处理软件，通过靶向提取己醛糖和己酮糖特征二级碎片离子对己醛糖和己酮糖在胡萝卜组织切片中的分布特征进行可视化成像，见图3。
实施例3
草莓中单糖及单糖同分异构体的衍生化质谱成像分析
(1)取新鲜的草莓，制作厚度为20μm的草莓组织冰冻切片；
(2)将草莓组织冰冻切片转移到ITO-氧化铟锡导电载玻片上，真空中干燥15分钟。
(3)精密称量5.0mg的1-萘乙酰肼置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈：乙酸(70:30，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，得0.5mg/mL的1-萘乙酰肼溶液。
(4)利用HTX TM-SprayerTM喷涂仪，将0.5mg/mL的1-萘乙酰肼溶液喷涂到草莓切片上，组织表面1-萘乙酰肼溶液的喷涂密度为10ng/cm2。
(5)将喷涂有1-萘乙酰肼的草莓组织切片置于恒温孵育箱中，孵育箱温度设置为60℃，孵育时间为2h。
(6)精密称量25mg的1,5-二氨基萘置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈：水(70:30，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，得2.5mg/mL的1,5-二氨基萘溶液；
(7)利用HTX TM-SprayerTM喷涂仪，将2.5mg/mL的1,5-二氨基萘溶液喷涂到衍生化后的草莓切片上，溶液喷涂速率75μL/min，喷涂循环次数10次；
(8)用布鲁克Rapiflex MALDI-TOF/TOF型质谱成像仪对草莓组织切片进行二级质谱分析，发现草莓中既有己醛糖的特征碎片离子m/z 265.1，又有己酮糖的特征碎片离子m/z 295.1，表明草莓中既有己醛糖，又有己酮糖。
(9)借助SCiLS Lab 2018b数据处理软件，通过靶向提取己醛糖和己酮糖特征二级碎片离子对己醛糖和己酮糖在草莓组织切片中的分布特征进行可视化成像，见图4。
实施例4
牛蒡中单糖及单糖同分异构体的衍生化质谱成像分析
(1)取新鲜的牛蒡，制作厚度为20μm的牛蒡组织冰冻切片；
(2)将牛蒡组织冰冻切片转移到ITO-氧化铟锡导电载玻片上，真空中干燥15分钟。
(3)精密称量5.0mg的1-萘乙酰肼置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈：乙酸(70:30，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，得0.5mg/mL的1-萘乙酰肼溶液。
(4)利用HTX TM-SprayerTM喷涂仪，将0.5mg/mL的1-萘乙酰肼溶液喷涂到牛蒡切片上，组织表面1-萘乙酰肼溶液的喷涂密度为10ng/cm2。
(5)将喷涂有1-萘乙酰肼的牛蒡组织切片置于恒温孵育箱中，孵育箱温度设置为60℃，孵育时间为2h。
(6)精密称量25mg的1,5-二氨基萘置于10mL容量瓶中，加入10mL乙腈：水(70:30，v/v)溶液，涡旋混匀，超声10分钟，得2.5mg/mL的1,5-二氨基萘溶液；
(7)利用HTX TM-SprayerTM喷涂仪，将2.5mg/mL的1,5-二氨基萘溶液喷涂到衍生化后的牛蒡切片上，溶液喷涂速率75μL/min，喷涂循环次数10次；
(8)用布鲁克Rapiflex MALDI-TOF/TOF型质谱成像仪对牛蒡组织切片进行二级质谱分析，发现牛蒡中既有己醛糖的特征碎片离子m/z 265.1，又有己酮糖的特征碎片离子m/z 295.1，表明牛蒡中既有己醛糖，又有己酮糖。
(9)借助SCiLS Lab 2018b数据处理软件，通过靶向提取己醛糖和己酮糖特征二级碎片离子对己醛糖和己酮糖在牛蒡组织切片中的分布特征进行可视化成像。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种单糖异构体的质谱成像方法，其特征在于：包括如下步骤：
将单糖衍生化试剂喷涂到组织切片的表面进行原位衍生化反应，得到不同单糖衍生化产物；
将衍生化反应后的组织切片喷涂基质，然后进行MALDI质谱成像分析，得到不同单糖同分异构体在组织切片中的空间分布特征；
所述单糖衍生化试剂为1-萘乙酰肼，其结构式如式(I)所示：
单糖同分异构体为酮糖和醛糖；
所述衍生化试剂的溶剂为乙腈和乙酸混合溶液，乙腈和乙酸的体积比为1-9:1；所述衍生化试剂的浓度为0.1-1.0mg/mL；
所述衍生化试剂的喷涂温度为30-70℃；
将衍生化试剂喷涂于组织切片表面后，将组织切片进行恒温孵育，衍生化反应，孵育温度为40-70℃；
喷涂的基质选自2,5-二羟基苯甲酸、1,5-二氨基萘或α-腈基-4-羟基肉桂酸。
2.根据权利要求1所述的单糖异构体的质谱成像方法，其特征在于：衍生化试剂在组织切片表面的喷涂量为5-20ng/cm2。
3.根据权利要求1所述的单糖异构体的质谱成像方法，其特征在于：MALDI质谱成像分析中，选用MALDI-TOF/TOF型质谱成像仪对喷涂完基质的组织切片进行扫描分析，选择MS或MS/MS扫描模式；
对切片进行MALDI-MS/MS质谱成像分析时，CID能量打开，前体离子的分析窗口选择为0.6％。
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