CN102706952B

CN102706952B - 萘乙二胺无机酸盐或萘乙二胺有机酸盐在作为maldi中基质的应用

Info

Publication number: CN102706952B
Application number: CN201110387156.6A
Authority: CN
Inventors: 聂宗秀; 王佳宁; 陈芮; 侯剑; 陈素明
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2011-11-29
Filing date: 2011-11-29
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2031-11-29
Also published as: CN102706952A

Abstract

本发明公开了一种萘乙二胺无机酸盐或萘乙二胺有机酸盐在作为基质辅助激光解吸电离质谱中的基质的应用。所述应用中，所述基质辅助激光解吸电离质谱为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，所述萘乙二胺无机酸盐为萘乙二胺盐酸盐、萘乙二胺硝酸盐、萘乙二胺磷酸盐或萘乙二胺硫酸盐；所述萘乙二胺有机酸盐为萘乙二胺三氟乙酸盐、萘乙二胺乙酸盐、萘乙二胺甲酸盐、萘乙二胺柠檬酸盐或萘乙二胺草酸盐；本发明从技术上克服了常用有机小分子基质在低分子量区容易产生严重的基质背景干扰现象从而导致不能有效分析小分子样品的缺陷；本发明采用的基质，无需加入离子化试剂，减少了对样本处理的要求；由于在测试范围内(m/z 0～1000)几乎没有背景干扰，因而对多种复杂混合体系也可进行分析。

Description

萘乙二胺无机酸盐或萘乙二胺有机酸盐在作为MALDI中基质的应用

技术领域

本发明涉及一种萘乙二胺无机酸盐或萘乙二胺有机酸盐在作为MALDI中的基质的应用，属于质谱检测技术领域。

背景技术

自1988年Karas et al.和Tanaka et al.报道采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术可以有效的进行生物大分子质谱的分析以来，MALDI-TOFMS技术备受各国研究者的青睐。但由于MALDI-TOF MS技术常用的基质都是小分子有机化合物，如α-腈基-4-羟基肉桂酸(CCA)、2，5-二羟基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)、3-羟基-2-吡啶甲酸(3-HPA)、蒽三酚(DI)和3-氨基喹啉(3-AQ)等。在分析过程中，由于上述基质分子在m/z＜500的范围内容易发生碎裂及分子之间的缔合等产生严重的基质背景干扰现象，因此，采用这些基质不能有效的分析m/z＜500的小分子化合物。

为了避免基质背景干扰现象的产生，研究者们通过对MALDI-TOF MS机理的研究提出了许多可行的改进方法。如先后引入无机物基质、聚合物基质、混合基质等新基质或通过对多孔硅表面进行化学修饰从而采用无基质解吸/电离方法来克服以有机小分子作为基质分析小分子化合物的不足。

采用无机物如二氧化钛作为基质分析样品时，得到的信号峰不仅有质子化的样品分子峰、还有样品分子和碱金属形成的加合物的峰等多种峰；用石墨烯作为基质，分析样品时，灵敏度较低。由于聚合物的合成步骤较多，如果用聚合物作为基质分析样品，不能充分体现MALDI-TOF MS分析样品快速、高效的特点。采用质子海绵作为基质只能分析有机酸类化合物。在多孔硅表面发生解吸/电离时首先要在硅晶表面进行刻蚀使其产生纳米结构的表面，在这样的表面虽然可以直接分析多肽和抗病毒药物，但由于这种表面的重复使用效果不好，因此就需要在同样的纳米结构表面上进行反复处理以得到能重复使用的表面。此外，对多孔硅表面进行化学修饰耗时较长而且经过修饰多孔硅重复使用时分析效果会大大下降。

因此，提供一种操作方法简单，成本低廉，适用范围广，在小于m/z 500内没有或只有很低背景峰的基质以及样品制备分析方法，是对当前基于MALDI的质谱分析的重要和有力补充。具有广泛的实用意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种萘乙二胺无机酸盐或萘乙二胺有机酸盐在作为基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI)中的基质的应用。

本发明提供的萘乙二胺无机酸盐或萘乙二胺有机酸盐在作为基质辅助激光解吸电离质谱中的基质的应用中，所述基质辅助激光解吸电离质谱为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)。

上述的应用中，所述萘乙二胺无机酸盐可为萘乙二胺盐酸盐、萘乙二胺硝酸盐、萘乙二胺磷酸盐或萘乙二胺硫酸盐等；所述萘乙二胺有机酸盐可为萘乙二胺三氟乙酸盐、萘乙二胺乙酸盐、萘乙二胺甲酸盐、萘乙二胺柠檬酸盐或萘乙二胺草酸盐等。

上述的应用中，所述基质辅助激光解吸电离质谱中的待测物质的分子量小于1000，只有少量固定的背景峰而不产生背景干扰。

上述的应用中，所述基质辅助激光解析电离质谱中的待测物质可为单糖、寡糖、糖肽、糖醇、糖脂、脂类化合物、氨基酸、多肽、尿素、金属离子、核酸、有机酸、甾体类化合物和胺类化合物中任一种。

上述的应用中，所述单糖和寡糖可为D(+)木糖、D-(-)***糖、L-***糖、L(+)鼠李糖、D-半乳糖、D-果糖、葡萄糖、L-山梨糖、蔗糖、乳糖、D(+)蜜三糖或水苏四糖等；所述糖肽可为糖蛋白水解后糖肽片段；所述糖醇可为木糖醇、甘露醇等；所述糖脂可为甘油糖脂、鞘糖脂或脂多糖等；所述脂类化合物可为甘油三脂、卵磷脂、脑磷脂或肌醇磷脂等；所述金属离子可为铅离子、汞离子、钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、铁离子、钴离子、锰离子、镍离子或金离子等；所述有机酸可为五氟苯甲酸、尿酸或抗坏血酸等；所述甾体类化合物可为胆固醇或肾上腺素等；所述胺类化合物可为尿素或多巴胺等。

上述的应用中，所述基质辅助激光解析电离质谱还可用于检测下述体系：细胞组织样本、微生物样本、体液、化学反应混合物和环境监测样本。因此，本萘乙二胺无机酸盐或萘乙二胺有机酸盐可在有机与生物质谱，质谱成像，蛋白质谱学，代谢组学，生物标记物发现，环境分析等领域得到有效的应用。

上述的应用中，所述环境检测样本具体可为水、大气、或土壤样本。

上述的应用中，所述基质辅助激光解析电离质谱还可用于对待测物质进行质谱成像，如待测样品为组织切片时，可将萘乙二胺无机酸盐或萘乙二胺有机酸盐的溶液(1mg/ml至饱和浓度)喷洒在样品表面，然后进行标准的质谱成像分析。

上述的应用中，所述萘乙二胺无机酸盐或萘乙二胺有机酸盐与所述基质辅助激光解析电离质谱的待测物质的摩尔比可为(1～100)∶(1～5)，如10∶1。

上述的应用中，溶解基质的溶剂原则上与质谱后续分析兼容即刻，通常可以是水、甲醇、乙醇或乙腈等，包括它们的互溶体系；基质溶液的浓度没有限定，可上至饱和溶液。

上述的应用中，待测物质为复杂混合体系时，通常无需特殊处理，吸取混合体系的上清液(也可以是浑浊液)以一定比例和基质溶液混合，点于MALDI靶板后即可用于质谱分析。

本发明从技术上克服了常用有机小分子基质在低分子量区容易产生严重的基质背景干扰现象从而导致不能有效分析小分子样品的缺陷；本发明采用的基质，无需加入离子化试剂，减少了对样本处理的要求；由于在测试范围内(m/z 0～1000)几乎没有背景干扰，因而对多种复杂混合体系也可进行分析。而且样本兼容性好，无需特殊复杂处理即可分析。

附图说明

图1为盐酸萘乙二胺的质谱背景。

图2为实施例1中细菌鉴定的质谱谱图和主成分分析结果，其中，图2(a)为细菌鉴定的质谱谱图的代表性谱图，图2(b)为细菌鉴定的主成分分析结果。

图3为实施例2中小鼠脑组织的质谱成像。

图4为实施例3中血清中铅离子的检测的质谱图，其中，图4a为硝酸萘乙二胺基质为基质的检测谱图，图4b为盐酸萘乙二胺为基质的检测谱图。

图5为实施例4中结肠癌细胞和红血球细胞中溶出物的质谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明下述实施例所用的盐酸萘乙二胺购自天津市鑫铂特化工有限公司和美国Sigma公司。

硝酸萘乙二胺是按照如下方法制备的：室温下，将33.50mg盐酸萘乙二胺和44.71mg AgNO₃(盐酸萘乙二胺与AgNO₃的摩尔比为1∶2)加至1.200ml体积比为30∶70的乙醇/水中，使两者通过超声混合均匀，并进行反应；反应过程中，会产生白色的AgCl沉淀；待白色的AgCl沉淀不再增加时，表明反应完全，上层的清液即为硝酸萘乙二胺的乙醇/水溶液，下层的沉淀物即为AgCl。分离并过滤掉沉淀物AgCl后，使上层的硝酸萘乙二胺的乙醇/水溶液通过732型强酸性阳离子交换树脂，流出液即为纯净的硝酸萘乙二胺的乙醇/水溶液，分离即得硝酸萘乙二胺。

本发明下述实施例所用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的型号为BIFLEXTM III(Bruker)和ultrafleXtreme(Bruker)。

基质的质谱背景非常简单，对测试样本，包括复杂体系均无干扰，图1为盐酸萘乙二胺的质谱背景。

实施例1、盐酸萘乙二胺鉴定区分不同微生物(细菌)

培养的耻垢分枝杆菌和大肠杆菌及其不同的亚种和突变株细菌生长到大于OD0.6后收集，磷酸盐缓冲液洗涤后-20℃冷冻保存或者直接用于进一步处理；磷酸盐缓冲液悬浮的细菌用去离子水置换，5000rpm离心留沉淀，向沉淀中加入3倍体积的80％乙醇水溶液(体积百分含量)，悬浮后静置15min，再5000rpm离心后取上清，或者不离心直接取适量样品用于质谱分析。

取样品和基质溶液(盐酸萘乙二胺的乙醇水溶液(其中，乙醇与水的体积比为1∶2，盐酸萘乙二胺的质量体积浓度为10mg/ml)以1∶1体积比，向MALDI靶板加入1ul样品，充分干燥；入质谱分析，质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：1.000Hz；激光器能量：75～80％。负离子模式。

通过将获得的质谱谱图(图2-1为代表性谱图)进行主成分分析(PCA)(图2-2)，可以快速灵敏度区分细菌的种，亚种和多种单基因突变，其结果优于当前已知的同类方法。

实施例2、小鼠脑组织切片质谱成像

小鼠脑组织速冻后，不进行固定和包埋，经标准冰冻切片组织处理方法，切得10um厚切片置于ITO导电载玻片上喷洒基质溶液(盐酸萘乙二胺的乙醇水溶液，其中，乙醇与水的体积比为1∶2，盐酸萘乙二胺的质量体积浓度为10mg/ml)；基质的喷洒是自动完成的，按照特定成像质谱的默认方法；按照标准质谱成像方法进行分析，质谱：BrukerUltraflextreme TOF；100um分辨率(极限分辨率10um)；每个像素300张谱图；激光波长355nm，脉冲频率1000Hz；38％强度；m/z 100-1000；负离子模式。

图3为小鼠脑组织两种不同脂类在白质和灰质的不同分布；利用上述的方法测试在不同组织样本(肝、心脏和肾)中均可获得良好的成像。

实施例3、金属离子在血清背景下的检测

盐酸萘乙二胺和硝酸萘乙二胺都可以进行金属离子的检测。在MALDI电离方式下，基质中的负离子(Cl^-或者NO₃ ^-)与带正电荷的金属离子结合，额外多结合一个负离子使整体带一个负电荷，从而被分离和检测。

取100ug/L标准加入醋酸铅标准样品的血清和基质溶液(硝酸萘乙二胺的乙醇水溶液，其中，乙醇与水的体积比为1∶2，硝酸萘乙二胺的质量体积浓度为10mg/ml)以1∶1体积比(硝酸萘乙二胺与醋酸铅的摩尔比为10∶1)，向MALDI靶板加入1ul样品，充分干燥。入质谱分析，质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：1.000Hz；激光器能量：75-80％。负离子模式。

利用盐酸萘乙二胺作为基质对铅离子进行检测的方法同上。

图4a和图4b分别表示了100ug/L标准加入醋酸铅标准样品的血清在硝酸萘乙二胺基质和盐酸萘乙二胺的辅助下，得到的硝酸根与铅离子、氯离子与铅离子结合的谱图。除了与基质的混合过程，血清并没有经过进一步处理。检测灵敏度符合血铅检测标准。

本例也表明血清的小分子物质也可被检测。

除了铅离子，其它金属离子只要能在盐酸/硝酸/三氟乙酸中等可溶就都可以被检测到，并且根据同位素峰分布可以判断金属离子的价态。

实施例4、检测细胞样本

结肠癌细胞和红血球细胞经磷酸盐缓冲液洗涤后，再用体积百分含量为75％的乙醇水溶液固定保存，测试前样品用75％的乙醇水溶液洗涤两次，静置15min(细胞浓度1x10E5个/毫升)；低速离心取上清，获得不使细胞破碎的溶出物，然后与基质溶液以1∶1体积比混合(基质溶液为盐酸萘乙二胺的乙醇水溶液(乙醇与水的体积比为1∶2，盐酸萘乙二胺的浓度为10mg/ml)混合后干燥于MALDI靶板；经质谱分析，可得到小分子区域的谱图，如图5所示，所用方法条件与实施例1类似，质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：1.000Hz；激光器能量：75-80％，负离子模式。

图5显示未经破碎的不同细胞的溶出物有显著不同，说明萘乙二胺基质可以分析细胞的小分子物质。

Claims

1.萘乙二胺无机酸盐或萘乙二胺有机酸盐在作为基质辅助激光解吸电离质谱中的基质的应用；所述基质辅助激光解吸电离质谱用于检测下述体系：细胞组织样本、微生物样本和体液。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述基质辅助激光解吸电离质谱为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述萘乙二胺无机酸盐为萘乙二胺盐酸盐、萘乙二胺硝酸盐、萘乙二胺磷酸盐或萘乙二胺硫酸盐；所述萘乙二胺有机酸盐为萘乙二胺三氟乙酸盐、萘乙二胺乙酸盐、萘乙二胺甲酸盐、萘乙二胺柠檬酸盐或萘乙二胺草酸盐。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述基质辅助激光解吸电离质谱中的待测物质的分子量小于1000。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述基质辅助激光解吸电离质谱用于对待测物质进行质谱成像。

6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述萘乙二胺无机酸盐或萘乙二胺有机酸盐与所述基质辅助激光解吸电离质谱的待测物质的摩尔比为（1～100）：（1～5）。