CN105527334B - 一种提高寡糖离子化效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生化分析领域，涉及一种提高寡糖离子化效率的方法，尤其是一种提高寡糖在基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI‑TOF MS)中离子化的方法；该方法采用6‑联肼尼克酰胺(HYNIC)作为基质分析寡糖，选择性地提高寡糖的离子化效率，且抑制了其它被分析物如肽段的离子化。本发明中所述6‑联肼尼克酰胺具有式(Ⅰ)的结构；所述6‑联肼尼克酰胺作为基质分析寡糖时，具有灵敏度高、结晶均匀、耐盐性强、串级质谱碎片信息丰富等优点；本发明所述的方法，采用所述6‑联肼尼克酰胺作为基质分析寡糖，能选择性地提高寡糖的离子化效率，且抑制了其它被分析物如肽段的离子化，具有操作简便、步骤简单、经济省时、无需除盐的优点。
Description
技术领域
本发明属于生化分析领域，涉及一种寡糖离子化的方法，具体涉及一种提高寡糖离子化效率的方法，尤其是一种提高寡糖在基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)中离子化的方法；该方法采用6-联肼尼克酰胺(HYNIC)作为基质分析寡糖，选择性地提高寡糖的离子化效率，且抑制了其它被分析物如肽段的离子化。
背景技术
寡糖是体内一类重要的信息物质,具有诸多生物学功能，一般由3-10个单糖分子通过糖苷键连接而成。所述寡糖具有重要的生理功能，如激活细胞的自我防卫***，决定细胞识别，集聚及受体作用等，其诸多生物学功能决定了其在医药领域有着广泛的应用前景。
所述基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是20世纪末问世并迅速发展起来的质谱技术，广泛应用于生物化学领域。所述MALDI-TOF MS因快速、灵敏、可提供结构信息等优点，已成为糖类物质分析的重要工具。在所述MALDI-TOF MS分析中，基质起到极其重要的作用；其中，所述基质是一类能吸收激光的小分子有机物，将样品混于基质中，在激光的照射下，样品解吸并电离，再经过飞行时间质谱分析。但是，天然寡糖的亲水性强，且缺乏质子受体，在气相中离子化效率低，阻碍了所述MALDI-TOF MS对寡糖的研究。目前，为提高寡糖在质谱中的离子化效率，有研究者进行了各种尝试，如进行全甲基化衍生或还原氨化衍生提升寡糖的疏水性或带电性质，从而提高寡糖的质谱检测信号。所述新型基质如二元基质，离子液基质，无机基质等也陆续被报道可提高寡糖的检测灵敏度。与衍生的方法相比，直接利用基质检测具有操作简便，节省试剂，无需纯化，谱图解析方便等优点。
但迄今为止，尚未见有关采用6-联肼尼克酰胺(HYNIC)作为基质分析寡糖、提高寡糖在基质辅助激光解吸飞行时间质谱中离子化方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高寡糖离子化效率的方法，尤其是一种提高寡糖在基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)中离子化的方法；该方法采用6-联肼尼克酰胺(HYNIC)作为基质分析寡糖，选择性地提高寡糖的离子化效率，且抑制了其它被分析物如肽段的离子化。
具体而言，本发明提供的的提高寡糖在基质辅助激光解吸飞行时间质谱中离子化的方法，其特征在于，采用6-联肼尼克酰胺(HYNIC)作为寡糖在MALDI分析中的基质，其步骤包括：
(1)样品溶液点靶烘干后，将所述基质6-联肼尼克酰胺(HYNIC)溶液点在相应靶点上烘干；
(2)将靶板送入所述MALDI-TOF-MS分析。
本发明的方法中，所述6-联肼尼克酰胺(HYNIC)具有式(Ⅰ)的结构，
本发明的方法中，所述基质溶剂体系为甲醇与乙酸体系；
本发明的方法中，所述乙酸体积分数为1.5-5％，本发明的一个实施例中优选乙酸体积分数为2％；
本发明的方法中，所述6-联肼尼克酰胺(HYNIC)的终浓度为1.5-3mg/mL，本发明的一个实施例中优选为2mg/mL。
本发明进行了对比实验，其包括下述步骤：
(1)以麦芽七糖(DP7)，葡聚糖1000为标准寡糖，标准核心岩藻糖(NA2F),标准唾液酸化N糖(A1)为标准N-糖链，测试所述HYNIC作为基质的效果，并与传统基质DHB进行对比；
(2)以标准合成肽段与DP7的混合物，核糖核酸酶B糖链与肽段混合物为模型测试所述HYNIC的选择性离子化效果，并与传统基质DHB进行对比；
(3)以DP7为标准寡糖，非挥发性盐氯化钠为溶剂测试所述HYNIC的耐盐性，并与传统基质DHB进行对比；
(4)以DP7为标准寡糖利用串级质谱测试所述HYNIC对于其碎裂方式的影响，并与传统基质DHB进行对比；
(5)以去糖链酶PNGase F释放人血清糖蛋白质N-糖链作为实际样品，测试所述HYNIC基质用于实际样品分析的可行性。
实验结果显示，本发明方法与现有技术相比，本发明能选择性地提高寡糖的离子化效率，且抑制了其它被分析物如肽段的离子化(如表1和表2所示)；且具有灵敏度高、结晶均匀、耐盐性强、串级质谱碎片信息丰富等特点。
表1 分别采用HYNIC和DHB检测到的50pmol葡聚糖1000的不同聚合度寡糖的质荷比信息
表2 采用HYNIC为基质的进行麦芽七糖串级谱图检测中跨环断裂的信息
本发明所述方法与现有技术相比，具有以下优点：
(1)所述HYNIC作为基质可大幅度提高寡糖质谱分析的信噪比与信号强度；
(2)所述HYNIC作为基质可选择性地提高寡糖的离子化效率，同时抑制肽段的离子化效率；
(3)所述HYNIC作为基质结晶均匀，提高了寡糖检测的信号稳定性与重复性；
(4)所述HYNIC作为基质提高了寡糖二级质谱信噪比，丰富了碎裂信息，有利于糖链结构解析。
附图说明
图1为HYNIC的结构示意图；
图2为上样量为1pmol的DP7，1pmol甲基化的DP7，5pmol NA2F和5pmol A1分别采用DHB(图片上部)和HYNIC(图片下部)为基质的质谱图；其中，●代表糖链加钠峰，■代表糖链加钾峰；
图3上样量为100pmol的葡聚糖1000分别采用和DHB(a)和HYNIC(b)为基质的质谱图；其中，●代表糖链加钠峰，■代表糖链加钾峰；
图4为标准肽段与DP7摩尔比为1:1(a,b)和1:10(c,d)时，分别采用DHB(a,c)和HYNIC(b,d)为基质的质谱图；其中，●代表糖链加钠峰，■代表糖链加钾峰。*代表肽段峰；
图5为10pmol当量的核糖核酸酶B糖链与肽段混合物分别采用DHB(a)和HYNIC(b)为基质的质谱图；其中，●代表糖链加钠峰，*代表肽段峰；
图6为上样量为1pmol的DP7分别采用HYNIC(红色)和DHB(黑色)为基质信号重复性示意图；
图7上样量为1pmol的麦芽七糖分别采用HYNIC(a)和DHB(b)为基质的质谱成像图；
图8为上样量为1pmol的DP7分别采用DHB(左侧)和HYNIC(右侧)以氯化钠为非挥发性溶剂进行耐盐性测试的质谱图；
图9为采用HYNIC基质检测到的人血清糖链信号的质谱图；
图10为上样量为1pmol的麦芽七糖分别采用HYNIC(A)和DHB(B)为基质的串级质谱图。
具体实施方式
实施例1
1.取1μL DP7(1pmol/L)分别与1μL10mg/mL DHB基质溶液(50％乙腈，0.1％三氟乙酸)及1μL2mg/mL HYNIC(98％甲醇，2％乙酸)混合，点靶进行MALDI-TOF MS分析，结果如图2所示，对比图2(a)与图2(b)可知，采用HYNIC作为基质可获得更高质量的DP7质谱图，且其信噪比提高10倍；其它被分析物具体实施过程和DP7类似；
2.取标准肽段和DP7分别按照摩尔比1:1和1：10混合，混合物各取1μL点靶进行MALDI-TOF MS分析，结果如图4所示，采用HYNIC基质进行分析时，糖链DP7信号强度更高，标准肽段信号被抑制；而DHB基质效果相反；
3.称取0.5mg核糖核酸酶B(Rnase B)，溶解于50mM碳酸氢铵(pH8.0)中，沸水浴加热10分钟；加入10μg胰蛋白酶(trypsin)，37℃反应12小时冷却后煮沸使胰蛋白酶失活得到Rnase B肽段；冷却后加入0.5μL PNGase F释放Rnase B糖链，37℃反应24小时，得到RnaseB糖链和肽段的混合物；将混合物稀释至10pmol后点靶，分别用DHB基质和HYNIC基质点靶进行MALDI-TOF MS分析，结果如图5所示，采用DHB作为基质分析10pmol量的混合物时，仅有肽段信号被检测到，而采用HYNIC作为基质分析等量的混合物时，所有5条糖链都被检测到，表明所述HYNIC基质可选择性地提高糖链的离子化效率，且抑制肽段信号。
实施例2
取1pmol/μL DP71μL点靶进行重复性实验；在靶点上随机选取12个位置进行质谱分析，将12张质谱图的强度进行比较；结果如图6所示，采用HYNIC作为基质时，信号强度及稳定性均优于DHB基质。
为进一步验证基质结晶的均匀性，1pmol/μL DP71μL点靶并进行质谱成像分析，结果如图7a所示，所述DHB结晶区域主要位于靶点***，而靶点中心几乎无结晶而造成信号强度低；而HYNIC结晶(如图7b所示)位于整个靶点区域范围且结晶均匀。
实施例3
取DP7与不同浓度非挥发性盐NaCl(25mM至200mM)混合后各取1μL点靶进行MALDI-TOF MS分析，结果如图8所示，较之所述DHB基质，所述HYNIC基质具有更强的耐盐性，DP7信号强度更高。
实施例4
健康人血清在8mol/L尿素与200mM Tris-HCl缓冲液中加热变性5分钟，向样品溶液中加入二硫苏糖醇(DTT)，使终浓度为10mM，置于37℃恒温、振荡反应60min，进行蛋白二硫键的还原；反应完成后，向溶液中加入IAA，使终浓度为30mM，室温、避光条件下孵育60min，实现巯基的烷基化；所述DTT与IAA及变性剂通过超滤步骤除去；随后向样品中加入1μL PNGase F进行去糖链反应，此过程持续24小时；最终N-糖链通过超滤步骤与血清中的蛋白分开。；取1μL点靶并利用HYNIC作为基质进行MALDI-TOF MS分析，结果如图9所示，检测到超过40种糖链。
实施例5
取1μL DP7(100 ng/μL)与1μL DHB基质和1μL HYNIC基质，点靶进行MALDI-TOFMS/MS分析(结果如图10所示)，选取母离子m/z1175.4进行MALDI-TOF MS/MS分析(结果如图10)；与所述DHB基质相比(如图10b所示)，所述HYNIC基质(如图10a所示)更有利于寡糖的MS/MS图谱信噪比与信号强度显著增强，且不同的碎裂方式有利于糖链结构解析。
上述实施例的结果表明，所述6-联肼尼克酰胺作为基质分析寡糖时，具有灵敏度高，结晶均匀，耐盐性强，串级质谱碎片信息丰富等优点；由于无需衍生、分离、除盐等步骤，样品不必进行纯化，避免了样品损失，所述6-联肼尼克酰胺作为基质时对标准寡糖葡萄糖七聚糖的检出限可达1amol；在分析糖链与肽段混合物时，所述6-联肼尼克酰胺可选择性提高糖链的离子化效率且抑制肽段的离子化效率；此外，在二级质谱图中，由所述6-联肼尼克酰胺得到的碎片信号强度提高且有部分跨环断裂信息，有利于糖链结构的解析；在实际样品人血清中，所述6-联肼尼克酰胺作为基质时共检测到40余种N-糖链；与现有技术相比，本发明所述方法具有操作简便、步骤简单、经济省时、无需除盐的特点。
Claims (4)
1.一种提高寡糖离子化效率的方法，其特征在于，采用6-联肼尼克酰胺(HYNIC)作为寡糖在MALDI分析中的基质，其步骤包括：
(1)样品溶液点靶烘干后，将所述6-联肼尼克酰胺(HYNIC)溶液点在相应靶点上烘干；
(2)将靶板送入所述基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析；
所述基质的溶剂体系为甲醇与乙酸体系，乙酸体积分数为1.5-5％；
所述6-联肼尼克酰胺(HYNIC)终浓度为1.5-3mg/mL。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述6-联肼尼克酰胺(HYNIC)具有式(I)的结构，
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述乙酸体积分数为2％。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述6-联肼尼克酰胺(HYNIC)终浓度为2mg/mL。
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