CN115120744A - 重组人内皮抑素腺病毒与抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体在制备抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents

重组人内皮抑素腺病毒与抗pd-1抗体或抗pd-l1抗体在制备抗肿瘤药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及重组人内皮抑素腺病毒与抗PD‑1抗体或抗PD‑L1抗体在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明要解决的技术问题是提供一种具有较好抗肿瘤效果的药物。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种含有编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD‑1抗体或抗PD‑L1抗体为主要活性成分的抗肿瘤药物。编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD‑1抗体或抗PD‑L1抗体共同治疗能有效抑制肿瘤生长、出现肿瘤消退且未复发，且未见明显毒副作用，说明了含有编码人源内皮抑素的腺病毒的抗血管生成治疗与抗PD‑1抗体或抗PD‑L1抗体免疫治疗相结合是***的有效方法，具有很好的应用前景。

Description

重组人内皮抑素腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体在制备 抗肿瘤药物中的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及重组人内皮抑素腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
血管生成是指从已存在的血管中生成新的血管，肿瘤血管生成能够为肿瘤提供氧气和营养物质，是肿瘤细胞生长和进展的重要过程。肿瘤生长会导致肿瘤微环境含氧量降低，这会促进促血管生成因子(如血管内皮生长因子、表皮生长因子等)的表达从而促进血管生成。肿瘤血管形态迂曲、分支较多，血管***的结构和功能异常，这会对血流灌注造成严重影响，从而导致肿瘤组织乏氧，阻碍药物输送和扩散。因此开发抗血管生成药物阻断血液供应，是治疗恶性和非恶性新生血管疾病的有效途径之一。早在1971年Folkman就提出了肿瘤血管生成理论，并且通过实验证明了抗血管生成药物能够有效抑制肿瘤生长。经过多年的研究，目前已研发出多种抗血管生成的药物，主要靶向作用于促血管生成因子及其受体，如抗体类药物贝伐单抗、小分子抑制剂舒尼替尼等，已经被美国FDA批准用于治疗肺癌、转移性结直肠癌、卵巢癌等多种肿瘤。内皮抑素是一种内源性抗血管生成分子，分子量大小为20kDa。2005年，中国FDA批准具有自主知识产权的内皮抑素Endostatin(Endostar)用于治疗非小细胞肺癌。Ad-endostatin(Ad-E)是编码了人源Endostatin的腺病毒(参见中国专利ZL200510021720.7“一种重组人内皮抑素腺病毒及其制备方法和用途”)，前期的研究显示：Ad-E对肺癌、SKOV3卵巢癌和CT26结肠癌的生长有抑制作用，该重组腺病毒目前已经完成I期临床研究。
随着研究的不断深入，发现抗血管生成的治疗存在一定局限，一些肿瘤如***癌、胰腺癌等对抗血管药物不敏感。在胶质母细胞瘤中，贝伐单抗的治疗初始反应显著但反应时间有限，容易出现耐药性导致预后不良，患者的存活期有限。贝伐单抗在对转移性乳腺癌的临床研究中也未能达到预期的治疗效果。肿瘤血管生成的调节受到多个因素和受体的影响，一条信号通路的抑制可能不会影响其他信号通路，因此寻找新的治疗手段对于肿瘤治疗至关重要。目前临床上主要将内皮抑素与放疗、化疗等联合用以提高癌症患者的治愈率，延长患者的生存时间。
活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤T细胞等多种细胞都可表达PD-1分子，PD-L1是PD-1的配体，常表达于肿瘤细胞表面。研究表明在肿瘤患者肿瘤组织中，PD-1和PD-L1的结合与相互作用会使T细胞无法识别肿瘤细胞从而导致肿瘤免疫逃逸。目前针对PD-1/PD-L1所导致的肿瘤免疫逃逸已成为研究肿瘤治疗的热点领域，PD-1和PD-L1的抑制剂能够阻断PD-1/PD-L1的结合从而缓解T细胞衰竭、激活效应T淋巴细胞、降低肿瘤免疫抑制，恢复T细胞活性进而识别并杀死肿瘤细胞。目前针对PD-1以及PD-L1的抗体已批准用于多种肿瘤的治疗，FDA已批准抗PD-L1抗体对膀胱癌、黑色素瘤进行治疗，抗PD-1抗体目前在黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝癌、肾细胞癌、头颈癌以及DNA错配缺失型结直肠癌等10余种肿瘤中广泛用，治疗后肿瘤生长得到缓解，生存期提升。然而随着不断的深入研究，PD-1/PD-L1抑制剂的阻断治疗同样存在众多局限性：其单药治疗反应率不高，一般在20％～40％之间；针对不同肿瘤效果差异大，存在众多不敏感性肿瘤；即使在敏感型肿瘤中也存在显著的个体差异，只有部分人群能够获益；缓解率浮动大且不稳定，甚至有出现病人在使用抑制剂之后疾病不退反而快速进展的情况；存在继发耐药现象，有研究报道估计有高达60-70％的患者对免疫检查点抑制剂治疗产生了耐药性。目前的研究表明导致肿瘤对PD-1/PD-L1抑制剂产生原发性抵抗的原因众多，主要有：肿瘤微环境中浸润T淋巴细胞减少，肿瘤突变抗原负荷减低，表观遗传学异常导致Th1型趋化因子表达沉默，重要的免疫信号分子表达降低，免疫抑制性分子高表达进而免疫调控失衡等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有较好抗肿瘤效果的药物。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种含有编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体为主要活性成分的抗肿瘤药物。
其中，上述药物中所述的编码人源内皮抑素的腺病毒编码并表达的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的人源内皮抑素。
SEQ ID No.1：
HSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK。
进一步的，上述抗肿瘤药物中所述的腺病毒为复制缺陷型腺病毒。更进一步的，所述的腺病毒为5型复制缺陷型腺病毒。
其中，上述的抗肿瘤药物中所述的人源内皮抑素的N端还连接有信号肽。
其中，上述的抗肿瘤药物中所述的信号肽为人CD5信号肽、人CD14信号肽、人表皮生长因子类hEGF信号肽、人免疫球蛋白类κ链信号肽、人IL-12信号肽、人IL-3信号肽、人IL-18信号肽或人IL-2信号肽中的至少一种。
更进一步的，上述抗肿瘤药物中所述的信号肽为人IL-2信号肽时，连接有人IL-2信号肽的人源内皮抑素氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.2：
MYRMQLLSCIALSLALVTNSAHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK。
其中，上述的抗肿瘤药物中所述的人源内皮抑素的编码核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示。
SEQ ID No.3：
CACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTGACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTCTGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAG。
进一步的，连接有IL-2信号肽的人源内皮抑素的编码核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。
SEQ ID No.4：
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCGGCCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTGACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACA TCGTGCTCTGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAG。
其中，上述药物中所述的编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体为混合为组合物、独立分隔包装于同一包装容器内或分别独立包装在包装容器内。
同时，本发明还提供了编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体在制备抗肿瘤药物中的用途。其中，上述用途中的编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体为联合使用。
其中，上述用途中的编码人源内皮抑素的腺病毒编码并表达的氨基酸序列为SEQID No.1所示的人源内皮抑素。
进一步的，上述抗肿瘤药物中所述的腺病毒为复制缺陷型腺病毒。更进一步的，所述的腺病毒为5型复制缺陷型腺病毒。
其中，上述的抗肿瘤药物中所述的人源内皮抑素的N端还连接有信号肽。
其中，上述用途中所述的信号肽为人CD5信号肽、人CD14信号肽、人表皮生长因子类hEGF信号肽、人免疫球蛋白类κ链信号肽、人IL-12信号肽、人IL-3信号肽、人IL-18信号肽或人IL-2信号肽中的至少一种。
进一步的，上述抗肿瘤药物中所述的信号肽为人IL-2信号肽时，连接有人IL-2信号肽的人源内皮抑素氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
其中，上述的抗肿瘤药物中所述的人源内皮抑素的编码核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示。
进一步的，连接有IL-2信号肽的人源内皮抑素的编码核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。
其中，上述用途中的抗肿瘤药物中的编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或者与抗PD-L1抗体为混合为组合物、独立分隔包装于同一包装容器内或分别独立包装在包装容器内。
本发明还提供了一种***的方法，该方法包括对患有肿瘤的患者施用有效量的编码人源内皮抑素的腺病毒和施用有效量的抗PD-1抗体，或者施用有效量的编码人源内皮抑素的腺病毒和施用有效量的抗PD-L1抗体的步骤。
进一步的，上述方法中的人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体可以同时施用，或者在疗程中分别施用。
其中，上述药物中所述的腺病毒优选为复制缺陷型腺病毒。
其中，上述各个技术方案中的肿瘤可选自结直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素癌和膀胱癌。
本发明的有益效果在于：本发明含有编码人源内皮抑素的腺病毒(Ad-E)与抗PD-1或抗PD-L1抗体的药物联合治疗能抑制血管生成、改善肿瘤抑制微环境、增强T细胞肿瘤浸润、降低免疫抑制、抑制瘤内M2型巨噬细胞极化等。实验表明两者联合治疗能有效抑制肿瘤生长、出现肿瘤消退且未复发，且未见明显毒副作用。本发明有益效果说明了Ad-E抗血管生成治疗与抗PD-1抗体免疫治疗或抗PD-L1抗体免疫治疗相结合是***的有效方法，也为进一步的临床相关实验提供了理论基础，具有很好的应用前景。
附图说明
图1.αPD-1(抗PD-1抗体)/αPD-L1(抗PD-L1抗体)在小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性。A.αPD-1治疗B16F10肿瘤。B.αPD-1治疗MC38肿瘤。C.αPD-L1治疗MC38肿瘤。ns:不显著(nonsignificant)。
图2.Ad-E治疗有效抑制肿瘤生长。A和B：Ad-E治疗后B16F10(A)和MC38(B)肿瘤体积显著减小；C:Ad-E治疗后B16F10后，流式分析肿瘤组织中CD4+和CD8+T细胞比例增加；D：Ad-E治疗后B16F10后，WB检测PD-L1蛋白表达情况；E：Ad-E治疗后B16F10后，RT-PCR检测PD-L1mRNA表达。ns:不显著(nonsignificant).*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
图3.Ad-E联合αPD-1治疗增强抗肿瘤活性。A：Ad-E和αPD-1联合治疗有效抑制MC38肿瘤生长；B：肿瘤样本CD31(红色)免疫染色和DAPI核染色(蓝色)检测血管生成情况。
图4.Ad-E联合αPD-L1治疗增强抗肿瘤活性。Ad-E和αPD-L1联合治疗有效抑制MC38肿瘤生长；
图5.体外检测联合应用后肿瘤微环境变化。A和B：流式细胞术分析肿瘤样本中CD8+和PD-1+T细胞(T细胞)的比例。C和D：流式细胞术分析肿瘤样本中CD11b+F4/80+巨噬细胞和CD206+巨噬细胞(TAMs)的比例。*p<0.05，**p<0.01。
图6.Ad-E联合αPD-1治疗后的肿瘤组织转录组学分析。A：各组样本中发现差异表达基因的数量，每组数据内左边为上调(Up)，右边为下调(Down)；B：Ad-E和αPD-1联合治疗后差异基因GO富集分析。
图7.Ad-E联合抗αPD-1治疗安全性初步评价。H&E染色检测脏器病变情况。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的介绍对本发明进行具体的说明。
本发明前期大量的创造性劳动，发现使用编码人源内皮抑素的腺病毒(重组人内皮抑素腺病毒，Ad-endostatin，缩写为Ad-E或ADE)能够抑制肿瘤生长，并促进肿瘤T细胞浸润和PD-L1表达，为与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体联用提供基础。
本发明在前期的工作中，发现施用抗PD-1抗体在B16F10肿瘤模型和MC38肿瘤模型中均没有能表现出明显的抗肿瘤效果，抗PD-L1抗体治疗也未能抑制MC38肿瘤生长。因此，本发明将Ad-E与抗PD-1抗体或PD-L1抗体联用协同提高抗肿瘤效果。本发明发现Ad-E与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体联用能起到协同作用，显著地增强抑制肿瘤生长的效果、甚至出现了出现肿瘤消退且未复发的情况。可能是肿瘤血管生成会导致免疫抑制的肿瘤微环境：对T细胞浸润产生机械屏障导致T细胞浸润减少，抑制DC细胞的抗原递呈，提高Treg、骨髓抑制细胞以及M2型肿瘤相关巨噬细胞的比例，上调T细胞表面PD-1表达，减弱T细胞的抗肿瘤功能。而Ad-E靶向血管生成可以使血管正常化，增加免疫细胞浸润和肿瘤组织中PD-L1表达，减少肿瘤诱导的免疫抑制，促进肿瘤免疫治疗的疗效。两者联用能既抑制血管生成、改善肿瘤抑制微环境、降低免疫抑制、减少M2型巨噬细胞的趋化，从而相互增强抗肿瘤效果。
在此基础上，本发明得到了上述要保护的各个技术方案。
其中之一是提供一种含有编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体为主要活性成分的抗肿瘤药物。即提供含有编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体为主要活性成分的抗肿瘤药物，或含有编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-L1抗体为主要活性成分的抗肿瘤药物。
同时提供了编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体为主要活性成分在制备抗肿瘤药物中的用途。
本领域技术人员可以理解的是，在上述药物中作为主要活性成分的编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体之间可以有多种组合方式。比如编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1或抗PD-L1抗体可以配制成组合药剂一起施用。
而编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体也可以各自分别制配制成单独的药剂，但放置在同一包装中制成药品。这样的药品在施用时可以根据需求实现两种活性成分的同时施用或者分别施用并控制各自的用量。当然，这样的制剂形式也能便于两种主要活性成分的长期保存和稳定性的提高。
本领域技术人员还可以将编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体也各自分别制配制成单独的药剂，但放置在独立的不同包装中以作联合用药的目的。
而上述这些药剂的配制，相应的药学上可接受的辅助性成分的选择，以及相应的药剂的包装材料的选择，都是本领域技术人员容易实现的。
此外，本发明还提供了一种***的方法，该方法包括对患有肿瘤的患者施用有效量的编码人源内皮抑素的腺病毒和施用有效量的与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的步骤。进一步的，上述方法中的人源内皮抑素的腺病毒和与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体可以同时施用，或者在治疗过程中分别施用。当然，对不同的肿瘤类型和病人的不同具体情况，上述编码人源内皮抑素的腺病毒和抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的具体施用量可以进行适当的调整以获得较好的协同抗肿瘤效果。
本发明中使用的编码人源内皮抑素的腺病毒也可以称为重组人内皮抑素腺病毒。所述人源内皮抑素的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。为了更好发挥作用，可在人源内皮抑素的N端还连接有信号肽。常用的信号肽为人CD5信号肽、人CD14信号肽、人表皮生长因子类hEGF信号肽、人免疫球蛋白类κ链信号肽、人IL-12信号肽、人IL-3信号肽、人IL-18信号肽或、人IL-2信号肽中的至少一种。而本发明编码人源内皮抑素的腺病毒上的腺病毒一般会使用复制缺陷型腺病毒。优选的，使用5型复制缺陷型腺病毒。
编码人源内皮抑素的制备可以使用本领域制备重组腺病毒的常规方法进行。在本发明提供的一个实例中，使用的参考中国专利ZL200510021720.7“一种重组人内皮抑素腺病毒及其制备方法和用途”中的实例所记载的方法制备的编码人源内皮抑素的腺病毒。
上述本发明提供的各个技术方案中所述的抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体为可以为各种常见的抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
以下通过实施例对本发明进行更进一步的详细描述。
实施例中主要使用的实验材料如下：
C57BL/6小鼠购自北京维通利华公司。
anti-CD4，anti-CD3，anti-CD8，anti-CD45、anti-CD11b、anti-F4/80、anti-CD206等抗体购自BD Biosciences公司。PD-L1抗体购自Bio X cell公司
PD-1抗体购自Bio X cell公司(货号BP0146)。
PD-L1抗体购自Bio X cell公司(货号BP0101)。
编码人源内皮抑素的腺病毒(重组人内皮抑素腺病毒，Ad-endostatin，缩写为Ad-E或ADE)、空载腺病毒(Ad-Null)由贵州百灵企业集团制药股份有限公司提供，Ad-E浓度1×1012VP/mL；Ad-Null浓度1.24×1012VP/mL，-80℃低温保存，临用前用稀释到所需浓度。也可参考中国专利ZL200510021720.7“一种重组人内皮抑素腺病毒及其制备方法和用途”中的记载制备实施例使用的编码人源内皮抑素的腺病毒。
实施例1αPD-1(抗PD-1抗体)体内抗肿瘤活性研究
6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，皮下注射5×105个B16F10黑色素瘤细胞或2×106个MC38结肠癌细胞，当肿瘤体积达到约100mm3时，进行随机分组。分为两组：αPD-1或αPD-L1组，采用αPD-1或αPD-L1进行治疗，每次腹腔内注射αPD-1或αPD-L1200μg；对照组为同型抗体(αPD-1的同型抗体为IgG2a，αPD-L1的同型抗体为IgG2b)，每次腹腔内注射同型抗体200μg；给药方式为1周2次，共4次。
实验结果显示：在B16F10肿瘤模型中(图1A)，与IgG2a对照组相比,αPD-1治疗未抑制肿瘤生长；在MC38肿瘤模型中(图1B)，与IgG2a对照组相比,αPD-1治疗有微弱的抗肿瘤活性，但两组之间无显著性差异。在αPD-L1治疗MC38肿瘤中(图1C)，与IgG2a对照组相比,。
实施例二重组人内皮抑素腺病毒(Ad-E)体内抗肿瘤活性研究
一、Ad-E治疗抑制肿瘤生长
取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，皮下注射5×105个B16F10黑色素瘤细胞或2×106个MC38结肠癌细胞，当肿瘤体积达到约100mm3时，进行随机分组。
(1)B16F10黑色素瘤模型分组和治疗：
Control组：等体积无菌PBS；
Ad-Null组：1×109pfuAd-Null/只，每3天瘤内注射一次，共4次；
Ad-E组：1×109pfuAd-E/只，每3天瘤内注射一次，共4次；
(2)MC38结肠癌模型分组和治疗：
Control组：等体积无菌PBS；
Ad-Null组：3×108pfuAd-Null/只，每1周瘤内注射一次，共2次；
Ad-E组：3×108pfuAd-E/只，每1周瘤内注射一次，共2次；
每3天测量一次小鼠的肿瘤大小。
实验结果显示(图2)：在B16F10(图2A)和MC38肿瘤模型(图2B)中，与对照Control组和Ad-Null组相比，Ad-E治疗显著地抑制肿瘤的生长(p<0.05)。
二、Ad-E对肿瘤微环境影响检测
在B16F10黑色素瘤中，模型建立、分组和治疗方式见实施例二，至最后一次给药3天后，处死小鼠，取肿瘤组织，分别用流式细胞术检测肿瘤组织中T细胞比例、WB和RT-PCR检测肿瘤组织中PD-L1的表达。
结果显示：与对照Control相比(图2C)，Ad-Null和Ad-E显著提高了肿瘤样本中CD3+细胞中CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例(p<0.05)。与Ad-Null相比，Ad-E治疗后肿瘤样本中CD3+细胞中CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例也有增加。表明，Ad-E治疗能够增加肿瘤组织中T细胞浸润。
对照Control组肿瘤组织几乎不表达PD-L1，而Ad-Null和Ad-E治疗后增加了PD-L1的表达(图2D和2E)。因而T细胞浸润和PD-L1的表达为免疫检查点抑制剂提供治疗基础。
实施例三Ad-E联合αPD-1的抗肿瘤效果研究
一、Ad-E联合αPD-1抑制肿瘤生长
取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，皮下注射2×106个MC38结肠癌细胞，当肿瘤体积达到约100mm3时，进行随机分组。
IgG2a组：瘤内注射无菌100μlPBS+腹腔给药200μg IgG2a；
αPD-1组：瘤内注射无菌100μl PBS+腹腔给药200μgαPD-1；
Ad-Null组：瘤内注射3×108pfuAd-Null/只(100μl)+等体积腹腔无菌PBS；
Ad-E组：瘤内注射3×108pfuAd-E/只(100μl)+等体积腹腔无菌PBS；
Ad-Null+αPD-1组：瘤内注射3×108pfuAd-Null/只(100μl)+腹腔给药200μgαPD-1；
Ad-E+αPD-1组：瘤内注射3×108pfuAd-E/只(100μl)+腹腔给药200μgαPD-1；Ad-Null和Ad-E每1周瘤内注射一次，共2次；IgG2a和αPD-1为1周给药2次，共4次。每3天测量一次小鼠的肿瘤大小。
结果显示(图3A)：IgG2a组以及PD-1抗体组小鼠肿瘤生长非常快，表明PD-1抗体单独治疗效果不佳。Ad-Null和Ad-E治疗对肿瘤生长具有一定的抑制作用，。Ad-Null联合αPD-1组对肿瘤生长具有部分缓解作用，而Ad-E联合αPD-1组治疗效果最好，并有3只小鼠肿瘤完全消退＝＝并且，，结果表明Ad-E联合αPD-1能有有效抑制肿瘤生长。
二、Ad-E联合αPD-1抑制肿瘤血管生成
在MC38结肠癌中，模型建立、分组和治疗方式见实施例三，给药结束后，取肿瘤组织，通过免疫组化冷冻切片利用CD31抗体染色检测肿瘤组织中血管生长情况。
结果显示(图3B):IgG2a组的血管染色强度最高，而在Ad-E组以及Ad-E联合αPD-1组的血管密度是最低的，结果表明Ad-E联合αPD-1能够有效改善肿瘤微环境的血管生成。
实施例四Ad-E联合αPD-L1的抗肿瘤效果研究
一、Ad-E联合αPD-L1抑制肿瘤生长
取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，皮下注射2×106个MC38结肠癌细胞，当肿瘤体积达到约100mm3时，进行随机分组。
IgG2b组：瘤内注射无菌100μlPBS+腹腔给药200μg IgG2b；
αPD-L1组：瘤内注射无菌100μl PBS+腹腔给药200μgαPD-L1；
Ad-Null组：瘤内注射3×108pfuAd-Null/只(100μl)+等体积腹腔无菌PBS；
Ad-E组：瘤内注射3×108pfuAd-E/只(100μl)+等体积腹腔无菌PBS；
Ad-Null+αPD-L1组：瘤内注射3×108pfuAd-Null/只(100μl)+腹腔给药200μgαPD-L1；
Ad-E+αPD-L1组：瘤内注射3×108pfuAd-E/只(100μl)+腹腔给药200μgαPD-L1；
Ad-Null和Ad-E每1周瘤内注射一次，共2次；IgG2b和αPD-L1为1周给药2次，共4次。每3天测量一次小鼠的肿瘤大小。
结果显示(图4)：IgG2b组以及PD-L1抗体组小鼠肿瘤生长较快，表明PD-L1抗体单独治疗效果不佳。Ad-E组对肿瘤生长具有抑制作用，治疗第25天时小鼠平均肿瘤体积为1587mm3。Ad-Null联合αPD-L1组对肿瘤生长具有部分缓解作用，治疗第25天时小鼠平均肿瘤体积为918mm3。而Ad-E联合αPD-L1组治疗效果最好，治疗第25天时小鼠平均肿瘤体积为224mm3，与IgG2b、αPD-L1、Ad-Null、Ad-E组相比具有显著差异(p＜0.05)。表明Ad-E联合αPD-L1也能够抑制肿瘤生长。
实施例五Ad-E联合αPD-1治疗对体外肿瘤微环境影响分析
在MC38结肠癌中，模型建立、分组和治疗方式见实施例三，给药结束后，取肿瘤组织，采用流式细胞数分析肿瘤微环境中CD8+和PD-1+T细胞的比例，以及CD11b+F4/80+巨噬细胞和CD206+巨噬细胞的比例。
实验结果显示：结果显示αPD-1治疗后肿瘤组织中CD45+CD8+T细胞的比例并没有改善。Ad-Null、Ad-E以及Ad-Null联合αPD-1治疗中CD8+T细胞的比例增加，但三组之间没有显著差异。但是，在Ad-E联合αPD-1治疗中CD8+T细胞浸润比例明显提升，并且与IgG2a和αPD-1组相比有显著差异(p<0.01)(图5A)。同时对肿瘤组织中CD8+T细胞表面的PD-1进行检测，结果显示，与其他治疗方法相比，Ad-E联合αPD-1治疗后CD8+T细胞表达PD-1阳性表型的比例最低，且与Ad-Null联合αPD-1组相比有显著差异(p<0.05)(图5B)。表明了Ad-E联合αPD-1治疗能够增加免疫浸润，激活CD8+CTLs，缓解T细胞衰竭。
同时也检测了肿瘤组织中巨噬细胞，与IgG2a组相比，αPD-1、Ad-Null以及Ad-Null联合αPD-1组中CD11b+F4/80+巨噬细胞的比例未见明显差异，而Ad-E联合αPD-1组中CD11b+F4/80+巨噬细胞的比例明显降低，与IgG2a、αPD-1和Ad-Null联合αPD-1组相比有显著差异(p<0.05)(图5C)。并且Ad-E联合αPD-1治疗能够显著减少CD206Hi TAMs的比例(p<0.05)(图5D)。表明与αPD-1和Ad-Null联合αPD-1组Ad-E联合αPD-1治疗可减轻免疫抑制并抑制瘤内M2型巨噬细胞极化。
实施例六Ad-E联合抗αPD-1治疗激活免疫相关信号通路
6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，皮下注射2×106个MC38结肠癌细胞，当肿瘤体积达到约100mm3时，进行随机分组。
IgG2a组：瘤内注射无菌100μl PBS+腹腔给药200μg IgG2a；
αPD-1组：瘤内注射无菌100μl PBS+腹腔给药200μgαPD-1；
Ad-E组：瘤内注射3×108pfuAd-E/只(100μl)+等体积腹腔无菌PBS；
Ad-E+αPD-1组：瘤内注射3×108pfuAd-E/只(100μl)+腹腔给药200μgαPD-1；
Ad-E每1周瘤内注射一次，共2次；IgG2a和αPD-1为1周给药2次，共4次。给药结束后，取肿瘤组织，进行转录组测序，生物信息学分析肿瘤组织中信号通路变化。
实验结果显示：在51912个基因探针组中，与IgG2a组相比，Ad-E联合αPD-1治疗组共识别出377个差异上调基因和120个差异下调基因。αPD-1抗体诱导72基因表达上调，10个基因表达下调。Ad-E治疗诱导22基因表达上调，6个基因表达下调(图6A)。进一步对Ad-E联合αPD-1治疗组中的差异基因进行GSEA富集分析，结果发现差异表达的众多基因中，免疫***过程、免疫应答等差异基因富集较多。进一步对免疫***过程中富集的基因进行GO生物过程分析。GO生物过程富集提示差异表达基因在T细胞活性、白细胞活性、适应性免疫应答、干扰素产生、抗原处理和递呈等方面显著富集(图6B)。表明Ad-E联合αPD-1治疗能够激活机体肿瘤微环境免疫反应。
实施例七Ad-E联合抗αPD-1治疗安全性初步评价
6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，皮下注射2×106个MC38结肠癌细胞，当肿瘤体积达到约100IgG2a组：瘤内注射无菌100μlPBS+腹腔给药200μg IgG2a；
Control组：无处理
αPD-1组：瘤内注射无菌100μl PBS+腹腔给药200μgαPD-1；
Ad-Null组：瘤内注射3×108pfuAd-Null/只(100μl)+等体积腹腔无菌PBS；
Ad-E组：瘤内注射3×108pfuAd-E/只(100μl)+等体积腹腔无菌PBS；
Ad-Null+αPD-1组：瘤内注射3×108pfuAd-Null/只(100μl)+腹腔给药200μgIgG2a；
Ad-E+αPD-1组：瘤内注射3×108pfuAd-E/只(100μl)+腹腔给药200μgαPD-1；
Ad-Null和Ad-E每1周瘤内注射一次，共2次；IgG2a和αPD-1为1周给药2次，共4次。接种肿瘤后每3天测量一次小鼠体重，治疗结束后，取小鼠脏器进行H&E染色。
结果显示，在治疗过程中，小鼠的体重并未出现明显异常，初步表明联合治疗方式对小鼠未有明显毒性。再次采用H&E染色的方式对小鼠心肝脾肺肾等重要脏器进行染色拍照观察，结果显示未见到重要脏器有明显的毒副作用(图7)。
序列表
<110> 四川大学
<120> 重组人内皮抑素腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体在制备抗肿瘤药物中的用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn
1 5 10 15
Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln
20 25 30
Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala
35 40 45
Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala
50 55 60
Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe
65 70 75 80
Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro
85 90 95
Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro
100 105 110
Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg
115 120 125
Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser
130 135 140
Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln
145 150 155 160
Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn
165 170 175
Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys
180
<210> 2
<211> 204
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His
20 25 30
Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg
35 40 45
Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala
50 55 60
Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys
85 90 95
Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu
100 105 110
Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp
115 120 125
Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser
130 135 140
Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg
145 150 155 160
Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly
165 170 175
Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val
180 185 190
Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys
195 200
<210> 3
<211> 552
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacagccacc gcgacttcca gccggtgctc cacctggttg cgctcaacag ccccctgtca 60
ggcggcatgc ggggcatccg cggggccgac ttccagtgct tccagcaggc gcgggccgtg 120
gggctggcgg gcaccttccg cgccttcctg tcctcgcgcc tgcaggacct gtacagcatc 180
gtgcgccgtg ccgaccgcgc agccgtgccc atcgtcaacc tcaaggacga gctgctgttt 240
cccagctggg aggctctgtt ctcaggctct gagggtccgc tgaagcccgg ggcacgcatc 300
ttctcctttg acggcaagga cgtcctgagg caccccacct ggccccagaa gagcgtgtgg 360
catggctcgg accccaacgg gcgcaggctg accgagagct actgtgagac gtggcggacg 420
gaggctccct cggccacggg ccaggcctcc tcgctgctgg ggggcaggct cctggggcag 480
agtgccgcga gctgccatca cgcctacatc gtgctctgca ttgagaacag cttcatgact 540
gcctccaagt ag 552
<210> 4
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60
gcccacagcc accgcgactt ccagccggtg ctccacctgg ttgcgctcaa cagccccctg 120
tcaggcggca tgcggggcat ccgcggggcc gacttccagt gcttccagca ggcgcgggcc 180
gtggggctgg cgggcacctt ccgcgccttc ctgtcctcgc gcctgcagga cctgtacagc 240
atcgtgcgcc gtgccgaccg cgcagccgtg cccatcgtca acctcaagga cgagctgctg 300
tttcccagct gggaggctct gttctcaggc tctgagggtc cgctgaagcc cggggcacgc 360
atcttctcct ttgacggcaa ggacgtcctg aggcacccca cctggcccca gaagagcgtg 420
tggcatggct cggaccccaa cgggcgcagg ctgaccgaga gctactgtga gacgtggcgg 480
acggaggctc cctcggccac gggccaggcc tcctcgctgc tggggggcag gctcctgggg 540
cagagtgccg cgagctgcca tcacgcctac atcgtgctct gcattgagaa cagcttcatg 600
actgcctcca agtag 615

Claims (15)

1.抗肿瘤药物，其特征在于含有编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体为主要活性成分。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述的编码人源内皮抑素的腺病毒编码并表达的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的人源内皮抑素；或者；优选的，所述的人源内皮抑素为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列编码的内皮抑素。
3.根据权利要求3所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述人源内皮抑素的N端还连接有信号肽；或者，所述的腺病毒为复制缺陷型腺病毒；优选的，所述的腺病毒为5型复制缺陷型腺病毒。
4.根据权利要求3所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述的信号肽为人CD5信号肽、人CD14信号肽、人表皮生长因子类hEGF信号肽、人免疫球蛋白类κ链信号肽、人IL-12信号肽、人IL-3信号肽、人IL-18信号肽或、人IL-2信号肽中的至少一种。
5.根据权利要求2或3所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述的信号肽为人IL-2信号肽，连接有人IL-2信号肽的人源内皮抑素的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
6.根据权利要求5所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述的；或者人源内皮抑素的连接有IL-2信号肽的人源内皮抑素的编码核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。
7.根据权利要求1～6任一项所述的抗肿瘤药物，其特征在于：所述的抗肿瘤药物中的编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体为混合为组合物、独立分隔包装于同一包装容器内或分别独立包装在包装容器内。
8.编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体在制备抗肿瘤药物中的用途。
9.根据权利要求8述的用途，其特征在于：所述的编码人源内皮抑素的腺病毒编码并表达氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的人源内皮抑素；或者；优选的，所述的人源内皮抑素为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列编码的内皮抑素。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述人源内皮抑素的N端还连接有信号肽；或者，所述的腺病毒为复制缺陷型腺病毒；优选的，所述的腺病毒为5型复制缺陷型腺病毒。
11.根据权利要求10述的用途，其特征在于：所述的信号肽为人CD5信号肽、人CD14信号肽、人表皮生长因子类hEGF信号肽、人免疫球蛋白类κ链信号肽、人IL-2信号肽、人IL-3信号肽、人IL-18信号肽或、人IL-12信号肽中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于：所述的信号肽为人IL-2信号肽时，连接有人IL-2信号肽的人源内皮抑素氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
13.根据权利要求13述的用途，其特征在于：所述的人源内皮抑素的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。
14.根据权利要求8～13中任一项所述的用途，其特征在于：所述的抗肿瘤药物中的编码人源内皮抑素的腺病毒与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体为混合为组合物、独立分隔包装于同一包装容器内或分别独立包装在包装容器内。
15.根据权利要求1～7任一项所述的抗肿瘤药物或者权利要求8～14任一项所述的用途，其特征在于：所述的肿瘤为：结直肠癌乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、头颈癌、子宫内膜癌、黑色素癌、膀胱癌中的至少一种。
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