CN115068661B - 一种海藻酸钙复合多孔生物基质敷料、其制备方法和应用 - Google Patents

一种海藻酸钙复合多孔生物基质敷料、其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物材料技术领域,具体地说，涉及一种海藻酸钙复合多孔生物基质敷料、其制备方法和应用。所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料由如下材料制备而成：脱细胞冻干粉消化产物5～15重量份和海藻酸钙凝胶85～95重量份，两者的重量之和为100重量份。本发明所提供的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料不仅可使药物的释放持续时长延长，而且还具有较好的抗菌消炎功效。

Description

一种海藻酸钙复合多孔生物基质敷料、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域,具体地说，涉及一种海藻酸钙复合多孔生物基质敷料、其制备方法和应用。
背景技术
表皮、真皮、皮下组织共同构成了人体的皮肤结构，皮肤作为人体中最重要的器官之一，覆盖在人体表面，具有防御功能、感知功能、免疫功能、吸收功能、调节体温功能、***功能和分泌等功能。当人体皮肤受到损伤，特别是皮肤烧伤，烧伤后容易引起机体各种损害，比如免疫***失调、水分和蛋白质及其他细胞成分过度散失、新陈代谢加剧等，烧伤严重的还会危及生命。因此，伤后必须用创伤敷料将创面覆盖，临时起到皮肤屏障保护作用，并能促进创面愈合，这对大面积烧伤尤其重要。
脱细胞真皮基质敷料就是一种可以用于全层皮肤缺损的真皮替代物以及用于烧伤等皮肤损伤创面愈合的医用敷料，它是天然皮肤经过一系列处理去除了表皮和真皮中的细胞成分，但保留了真皮细胞外基质成分和其三维空间结构，这样的结构可以为皮肤再生提供“真皮模板”，诱导移植后宿主细胞成分如成纤维细胞、内皮细胞等在支架结构中分化、生长。
CN106310352A公开了一种抗菌性脱细胞真皮基质敷料的制备方法，该制备方法包括以下步骤：选取健康的哺乳动物、剥离动物皮肤、剔除毛发、制备断层皮片、激光制孔、低温冻融、超声波振荡、脱脂处理、脱细胞处理、浸泡水溶性壳聚糖、冷冻干燥、包装和辐照灭菌后得到抗菌性脱细胞真皮基质敷料。但由于壳聚糖本身的功能效果有限，制备的敷料效果不太理想，需要将壳聚糖与其他材料复合使用，以提高敷料的综合性能。
本申请人于2021年12月16日申请了申请号为202111545807.X、发明名称为“一种可降解的胎盘脱细胞多孔海绵基质敷料的制备和应用”的发明专利申请。该制备包括以下步骤：(1)胎盘组织选材；(2)胎盘组织收集及运输；(3)胎盘组织病毒灭活处理；(4)去除病毒灭活溶液残留；(5)进行多次循环冻融处理；(6)脱细胞工艺；(7)去除脱细胞溶液残留；(8)第一次冷冻干燥；(9)冷冻球磨；(10)将得到脱细胞冻干粉进行消化；(11)将得到的均匀消化产物调节pH，倒入不同规格的冻干模具中，得到脱细胞多孔海绵；(12)灭菌及灭活病毒。本申请人在此基础上，将胎盘组织替换为动物组织，如猪皮、猪小肠、猪心包膜或猪膀胱，预采用上述方法制备一种多孔生物基质敷料，但遗憾的是，所得的多孔生物基质敷料在试验中发现药物的释放持续时长较短，作用效果有限，且不具有抗菌消炎的功效。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海藻酸钙复合多孔生物基质敷料、其制备方法和应用。本发明所提供的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料不仅可使药物的释放持续时长延长，而且还具有较好的抗菌消炎功效。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种海藻酸钙复合多孔生物基质敷料，其中，所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料由如下材料制备而成：
脱细胞冻干粉消化产物 5～15重量份
海藻酸钙凝胶 85～95重量份
两者的重量之和为100重量份。
作为一种优选方案，所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料由如下材料制备而成：
脱细胞冻干粉消化产物 10重量份
海藻酸钙凝胶 90重量份。
进一步地，所述的海藻酸钙凝胶由海藻酸钠、氯化钙和葡萄酸内酯反应得到。
进一步地，所述的海藻酸钙凝胶采用如下制备方法制备得到：将海藻酸钠用适量的注射用水完全溶解，加入与海藻酸钠质量比为1～3：1的氯化钙搅拌均匀，再加入与海藻酸钠氯化钙混合液质量比为4～6：1的葡萄酸内酯，盐酸调节pH至4.5～6.5，在温度45～55℃下搅拌30～45分钟即得所述的海藻酸钙凝胶。
本发明中，加入的氯化钙的质量与海藻酸钠的质量比为1～3：1，优选2：1；加入的葡萄酸内酯的质量与海藻酸钠氯化钙混合液的质量比为4～6：1，优选5：1。
进一步地，所述的脱细胞冻干粉消化产物为将动物组织经收集及运输、病毒灭活处理、循环冻融处理、脱细胞、去除脱细胞溶液残留、冷冻干燥、冷冻球磨和胃蛋白酶消化制得。
本发明中，所述的脱细胞冻干粉消化产物是将动物组织参照CN114177340A或CN114306749A中的方法制备得到的。
优选按照如下方法制备：
(1)收集及运输：收集新鲜动物组织，剪成长宽不大于2cm小块，然后浸入病毒灭活液(过氧乙酸溶液)中，在该溶液中浸泡0.5～4小时后，放置在-8℃以下长期保存；动物组织为低温冷链运输(0℃以下)；
(2)病毒灭活处理：病毒灭活溶液由过氧乙酸、无水乙醇(≥99.7％)和纯化水按照体积比3：5：92进行混合，1kg动物组织中添加19L病毒灭活溶液处理0.5～2小时；
(3)多次循环冻融处理：将病毒灭活处理后的组织进行多次循环冻融处理，冷冻温度为-80℃～-50℃，冷冻时间不低于6小时；融解温度为23℃～28℃；每次融解后，离心弃上清，并重新加入等量纯化水再进行冷冻、融解；
(4)脱细胞：将步骤(3)处理后的组织依次用酶溶液、非离子型表面活性剂和离子型表面活性剂溶液处理60～90min，期间持续搅拌；其中，酶溶液为质量百分比浓度0.20％～0.25％的胰蛋白酶，非离子型表面活性剂溶液为质量百分比浓度0.10％～0.15％的曲拉通溶液，离子型表面活性剂溶液为质量百分比浓度0.10％～0.15％的十二烷基硫酸钠；
(5)去除脱细胞溶液残留：将步骤(4)处理后的组织用纯化水清洗15min，离心弃上清液，重复4～6次；
(6)冷冻干燥：将步骤(5)处理后的组织置入冻干托盘中，-60～-45℃预冻6～8小时，再从预冻温度梯度升温至25℃，每一梯度温度点升高5℃，前8个温度点每个温度点保持3小时，后面的每个温度点保持2小时，然后真空抽干，得到干燥的脱细胞动物组织；
(7)冷冻球磨：将步骤(6)得到的干燥的脱细胞动物组织在-20℃～-50℃温度下进行冷冻球磨，得到脱细胞冻干粉；
(8)胃蛋白酶消化：将步骤(7)得到的脱细胞冻干粉用胃蛋白酶溶液进行消化，其中脱细胞冻干粉的质量与胃蛋白酶溶液的质量体积比为10mg：1ml，胃蛋白酶溶液的浓度为1mg/ml，消化时间为24～96小时，得到脱细胞冻干粉消化产物。
其中，动物组织为猪皮、猪小肠、猪心包膜或猪膀胱。
本发明还提供所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1、制备脱细胞冻干粉消化产物
将动物组织经制备成脱细胞冻干粉消化产物；
S2、制备海藻酸钙凝胶
将海藻酸钠与氯化钙和葡萄酸内酯反应制得海藻酸钙凝胶；
S3、制备海藻酸钙复合多孔生物基质敷料
将步骤S1制得的脱细胞冻干粉消化产物与步骤S2制得的海藻酸钙凝胶制备成海藻酸钙复合多孔生物基质敷料。
进一步地，步骤S2的过程为：将海藻酸钠用适量的注射用水完全溶解，加入与海藻酸钠质量比为1～3：1的氯化钙搅拌均匀，再加入与海藻酸钠氯化钙混合液质量比为4～6：1的葡萄酸内酯，盐酸调节pH至4.5～6.5，在温度45～55℃下搅拌30～45分钟，即得所述的海藻酸钙凝胶。
进一步地，步骤S3包括如下步骤：
S3.1、将脱细胞冻干粉消化产物和海藻酸钙凝胶按质量比5～15：85～95混合，用NaOH溶液调节pH至6.5～7.5，搅拌混合均匀，得到混合物；
S3.2、将所得的混合物倒入冻干模具中冻干，得到冻干产品；
S3.3、将冻干产品放置在成型模具中压制，得到三层基质敷料；
S3.4、将三层基质敷料放置在打孔成型模具中压制、均匀打孔，得到打孔后的基质敷料；
S3.5、将打孔后的基质敷料进行包装，得到包装好的基质敷料；
S3.6、将包装好的基质敷料进行灭菌处理，即得所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料。
进一步地，步骤S3.3中，所得的三层基质敷料的最上层和最下层厚度为0.5mm～1.0mm，里层厚度为1.5mm～2.0mm；步骤S3.4中，所打的孔的孔径为2mm～3mm。
进一步地，步骤S3.6中，所述的灭菌处理为采用EB辐照灭菌处理，灭菌剂量控制在20～25kGY范围内。
进一步地，步骤S3.2中，所述的冻干为先在温度-60～-45℃下预冻6～8小时，再从预冻温度梯度升温至25℃，每一梯度温度点升高5℃，前8个温度点每个温度点保持3小时，后面的每个温度点保持2小时，然后真空抽干，得到冻干产品。
本发明中，所述的前8个温度点是自预冻温度开始的前8个温度点，如预冻温度为-55℃，前8个梯度温度点为-55℃、-50℃、-45℃、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃和-20℃。
本发明还提供所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料在制备医美、整容或女性健康产品中的应用。
本发明所提供的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料可负载多种细胞并支持细胞的生长，如真皮成纤维细胞、子宫内膜间充质干细胞或人表皮生长因子(hEGF)等，用于制备医美、整容或女性健康产品，如由于局部软组织结构松弛所造成的疾病的微创伤治疗，同时也可广泛用于隆胸、面部整形等美容医学领域。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明所提供的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料不仅可使药物的释放持续时长延长，而且还具有较好的抗菌消炎功效。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料的电镜图；
图2为对比例1制得的多孔生物基质敷料的电镜图；
图3为本发明产品和对比例产品的药物释放持续时长图；
图4为不同孔径的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料的药物释放持续时长图。
具体实施方式
以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。
以下各实施例中，所述的脱细胞冻干粉消化产物是将动物组织参照CN114177340A或CN114306749A中的方法制备得到的，优选按照如下方法制备得到：
(1)收集及运输：收集新鲜动物组织，如猪皮、猪小肠、猪心包膜或猪膀胱，剪成长宽不大于2cm小块，然后浸入病毒灭活液(过氧乙酸溶液)中，在该溶液中浸泡2.5小时后，放置在-8℃以下长期保存；动物组织为低温冷链运输(0℃以下)；
(2)病毒灭活处理：病毒灭活溶液由过氧乙酸、无水乙醇(≥99.7％)和纯化水按照体积比3：5：92进行混合，1kg动物组织中添加19L病毒灭活溶液处理1.2小时；
(3)多次循环冻融处理：将病毒灭活处理后的组织进行多次循环冻融处理，冷冻温度为-65℃，冷冻时间6小时；融解温度为25℃；每次融解后，离心弃上清，并重新加入等量纯化水再进行冷冻、融解，循环冻融处理三次；
(4)脱细胞：将步骤(3)处理后的组织依次用酶溶液、非离子型表面活性剂和离子型表面活性剂溶液处理75min，期间持续搅拌；其中，酶溶液为质量百分比浓度0.22％的胰蛋白酶，非离子型表面活性剂溶液为质量百分比浓度0.12％的曲拉通溶液，离子型表面活性剂溶液为质量百分比浓度0.12％的十二烷基硫酸钠；
(5)去除脱细胞溶液残留：将步骤(4)处理后的组织用纯化水清洗15min，离心弃上清液，重复5次；
(6)冷冻干燥：将步骤(5)处理后的组织置入冻干托盘中，先在温度-55℃下预冻7小时，再从预冻温度-55℃梯度升温至25℃，每一梯度温度点升高5℃，前8个温度点每个温度点保持3小时，后面的每个温度点保持2小时，然后真空抽干，得到干燥的脱细胞动物组织；
(7)冷冻球磨：将步骤(6)得到的干燥的脱细胞动物组织在-35℃温度下进行冷冻球磨，得到脱细胞冻干粉；
(8)胃蛋白酶消化：将步骤(7)得到的脱细胞冻干粉用胃蛋白酶溶液进行消化，其中脱细胞冻干粉的质量与胃蛋白酶溶液的质量体积比为10mg：1ml，胃蛋白酶溶液的浓度为1mg/ml，消化时间为60小时，得到脱细胞冻干粉消化产物。
实施例1
该实施例的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料由如下材料制备而成：
脱细胞冻干粉消化产物 10重量份
海藻酸钙凝胶 90重量份
制备方法：
S1、制备脱细胞冻干粉消化产物
将猪皮按照上述优选方法经收集及运输、病毒灭活处理、循环冻融处理、脱细胞、去除脱细胞溶液残留、冷冻球磨和胃蛋白酶消化制得脱细胞冻干粉消化产物。
S2、制备海藻酸钙凝胶
将海藻酸钠用适量的注射用水完全溶解，加入与海藻酸钠质量比为2：1的氯化钙搅拌均匀，再加入与海藻酸钠氯化钙混合液质量比为5：1的葡萄酸内酯，盐酸调节pH至5.0，在温度50℃下搅拌40分钟，即得所述的海藻酸钙凝胶。
S3、制备海藻酸钙复合多孔生物基质敷料
S3.1、将脱细胞冻干粉消化产物和海藻酸钙凝胶按质量比10：90混合，用NaOH溶液调节pH至7.0，搅拌混合均匀，得到混合物；
S3.2、将所得的混合物倒入冻干模具中冻干，得到冻干产品；其中，所述的冻干为先在温度-55℃下预冻7小时，再从预冻温度-55℃梯度升温至25℃，每一梯度温度点升高5℃，前8个温度点每个温度点保持3小时，后面的每个温度点保持2小时，然后真空抽干，得到冻干产品；
S3.3、将冻干产品放置在成型模具中压制，得到三层基质敷料，所得的三层基质敷料的最上层和最下层厚度为0.8mm，里层厚度为1.8mm；
S3.4、将三层基质敷料放置在打孔成型模具中压制、均匀打孔，所打的孔的孔径为2mm，得到打孔后的基质敷料；
S3.5、将打孔后的基质敷料进行包装，得到包装好的基质敷料；
S3.6、将包装好的基质敷料进行EB辐照灭菌处理，灭菌剂量为22kGY，即得所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料。
所得的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料的电镜图如图1所示。
实施例2
该实施例的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料由如下材料制备而成：
脱细胞冻干粉消化产物 5重量份
海藻酸钙凝胶 95重量份
制备方法：
S1、制备脱细胞冻干粉消化产物
将猪小肠按照上述优选方法经收集及运输、病毒灭活处理、循环冻融处理、脱细胞、去除脱细胞溶液残留、冷冻球磨和胃蛋白酶消化制得脱细胞冻干粉消化产物。
S2、制备海藻酸钙凝胶
将海藻酸钠用适量的注射用水完全溶解，加入与海藻酸钠质量比为1：1的氯化钙搅拌均匀，再加入与海藻酸钠氯化钙混合液质量比为4：1的葡萄酸内酯，盐酸调节pH至4.5，在温度45℃下搅拌30分钟，即得所述的海藻酸钙凝胶。
S3、制备海藻酸钙复合多孔生物基质敷料
S3.1、将脱细胞冻干粉消化产物和海藻酸钙凝胶按质量比5：95混合，用NaOH溶液调节pH至6.5，搅拌混合均匀，得到混合物；
S3.2、将所得的混合物倒入冻干模具中冻干，得到冻干产品；其中，所述的冻干为先在温度-60℃下预冻6小时，再从预冻温度-60℃梯度升温至25℃，每一梯度温度点升高5℃，前8个温度点每个温度点保持3小时，后面的每个温度点保持2小时，然后真空抽干，得到冻干产品；
S3.3、将冻干产品放置在成型模具中压制，得到三层基质敷料，所得的三层基质敷料的最上层和最下层厚度为0.5mm，里层厚度为1.5mm；
S3.4、将三层基质敷料放置在打孔成型模具中压制、均匀打孔，所打的孔的孔径为3mm，得到打孔后的基质敷料；
S3.5、将打孔后的基质敷料进行包装，得到包装好的基质敷料；
S3.6、将包装好的基质敷料进行EB辐照灭菌处理，灭菌剂量为20kGY，即得所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料。
实施例3
该实施例的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料由如下材料制备而成：
脱细胞冻干粉消化产物 15重量份
海藻酸钙凝胶 85重量份
制备方法：
S1、制备脱细胞冻干粉消化产物
将猪心包膜按照上述优选方法经收集及运输、病毒灭活处理、循环冻融处理、脱细胞、去除脱细胞溶液残留、冷冻球磨和胃蛋白酶消化制得脱细胞冻干粉消化产物。
S2、制备海藻酸钙凝胶
将海藻酸钠用适量的注射用水完全溶解，加入与海藻酸钠质量比为3：1的氯化钙搅拌均匀，再加入与海藻酸钠氯化钙混合液质量比为6：1的葡萄酸内酯，盐酸调节pH至6.5，在温度55℃下搅拌45分钟，即得所述的海藻酸钙凝胶。
S3、制备海藻酸钙复合多孔生物基质敷料
S3.1、将脱细胞冻干粉消化产物和海藻酸钙凝胶按质量比15：85混合，用NaOH溶液调节pH至7.5，搅拌混合均匀，得到混合物；
S3.2、将所得的混合物倒入冻干模具中冻干，得到冻干产品；其中，所述的冻干为先在温度-45℃下预冻8小时，再从预冻温度-45℃梯度升温至25℃，每一梯度温度点升高5℃，前8个温度点每个温度点保持3小时，后面的每个温度点保持2小时，然后真空抽干，得到冻干产品；
S3.3、将冻干产品放置在成型模具中压制，得到三层基质敷料，所得的三层基质敷料的最上层和最下层厚度为1.0mm，里层厚度为2.0mm；
S3.4、将三层基质敷料放置在打孔成型模具中压制、均匀打孔，所打的孔的孔径为2.5mm，得到打孔后的基质敷料；
S3.5、将打孔后的基质敷料进行包装，得到包装好的基质敷料；
S3.6、将包装好的基质敷料进行EB辐照灭菌处理，灭菌剂量为25kGY，即得所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料。
对比例1
该对比例的多孔生物基质敷料由如下材料制备而成：
脱细胞冻干粉消化产物 100重量份
制备方法：
S1、制备脱细胞冻干粉消化产物
将猪皮按照上述优选方法经收集及运输、病毒灭活处理、循环冻融处理、脱细胞、去除脱细胞溶液残留、冷冻球磨和胃蛋白酶消化制得脱细胞冻干粉消化产物。
S2、制备多孔生物基质敷料
S2.1、将脱细胞冻干粉消化产物用NaOH溶液调节pH至7.0，得到溶液；
S2.2、将步骤S2.1所得的溶液倒入冻干模具中冻干，得到冻干产品；其中，所述的冻干为先在温度-55℃下预冻7小时，再从预冻温度梯度升温至25℃，每一梯度温度点升高5℃，前8个温度点每个温度点保持3小时，后面的每个温度点保持2小时，然后真空抽干，得到冻干产品；
S3.3、将冻干产品进行EB辐照灭菌处理，灭菌剂量为22kGY，即得所述的多孔生物基质敷料。
所得的多孔生物基质敷料的电镜图如图2所示。
对比例2
该对比例的复合多孔生物基质敷料由如下材料制备而成：
脱细胞冻干粉消化产物 10重量份
壳聚糖-海藻酸钙凝胶 90重量份
制备方法：
S1、制备脱细胞冻干粉消化产物
将猪皮按照上述优选方法经收集及运输、病毒灭活处理、循环冻融处理、脱细胞、去除脱细胞溶液残留、冷冻球磨和胃蛋白酶消化制得脱细胞冻干粉消化产物。
S2、制备海藻酸钙凝胶
将2.0％(w/v)海藻酸钠溶液在1.0mol/LCaCl2溶液为凝胶浴的条件下通过静电液滴法制备得到粒径主要在400～600μm的海藻酸钙凝胶微球，并将海藻酸钙凝胶微球与0.7％(w/v)壳聚糖溶液以1：7体积比成膜，然后与0.5％(w/v)的海藻酸钠溶液以10：20体积比混合，得到壳聚糖-海藻酸钙凝胶。
S3、制备海藻酸钙复合多孔生物基质敷料
将脱细胞冻干粉消化产物和壳聚糖-海藻酸钙凝胶按质量比10：90混合，按照实施例1的方法制得所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料。
试验例1
该试验例考察了本发明产品和对比例产品的药物释放持续时长。
试验方法如下：
(1)将实施例1、对比例1和对比例2制得的多孔生物基质敷料，分别添加生理盐水配制成10mg/mL溶液，上下震荡2min，得到均匀的凝胶液；
(2)将hEGF溶液与凝胶液混合，使得hEGF终浓度约为3ng/mL，得到配制好的含有hEGF的凝胶；
(3)将配制好的含有hEGF的凝胶加到48孔板中(每孔500μL)，将48孔板置于37℃细胞孵育箱，孵育1小时，使其成胶；
(4)孵育完毕后，将48孔板取出，每孔加入500μL的PBS，然后将48孔板放回孵育箱；
(5)每隔24小时，将48孔板取出，吸取上清液后加入新的PBS(500μL)，将吸取的上清液放入-80℃冰箱冻存；
(6)周而复始；
(7)ELISA试剂盒分别于第0、2、3、4、5、6、7、9、15、21和28天测每个样品的浓度。
实施例1、对比例1和对比例2制得的多孔生物基质敷料的药物释放持续时长图如图3所示。
从图3可以看出，与对比例1和对比例2制得的多孔生物基质敷料相比，本发明制得的多孔生物基质敷料负载的hEGF能够缓慢持续释放，发挥持久疗效。
试验例2
该试验例考察了多孔生物基质敷料的孔径对药物释放持续时长的影响。
试验方法：按照实施例1的方法制备多孔生物基质敷料，所不同的是步骤S3.4中所打的孔的孔径不同，分别为2mm、3mm和5mm，考察不同孔径对药物释放持续时长的影响。具体测定方法同试验例1。
测得的不同孔径的多孔生物基质敷料的药物释放持续时长图结果如图4所示。
结果表明，随着多孔生物基质敷料的孔径的减小，药物的释放持续时长会越长，可以看出孔径5mm持续释放到20天左右就达到98％左右了；而孔径3mm到28天也就释放量82％左右，而孔径2mm到28天也就释放量80％左右，后期仍然会每天缓慢释放。一般药物缓释28天是一个常用的观察周期，这一结果说明，多孔生物基质敷料的孔径直接影响药物的缓释功能。
试验例3
该试验例考察了本发明产品和对比例产品的抗菌性能。
试验方法：
将实施例和对比例制得的多孔生物基质敷料，分别用灭菌镊子夹起，各取3个样品(样品A、样品B、样品C)，分别接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，敷料一定要铺平，使菌均匀接触样品，置于灭菌平皿中，在(37±1)℃、相对湿度RH＞90％条件下培养24h。取出培养24h的样品，分别加入20ml洗脱液，反复洗样品A、样品B、样品C及覆盖膜(最好用镊子夹起薄膜冲洗)，充分摇匀后，取一定量接种于营养琼脂培养基中，在(37±1)℃下培养(24～48)h后活菌计数，测定活菌数。以上试验重复两次。
抗细菌率计算公式如下：
Figure BDA0003705552120000121
式中：
R——抗细菌率(％)；
B——空白对照样品平均回收菌数(cfu/片)；
C——样品平均回收菌数(cfu/片)。
将计算所得的敷料对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抗细菌率分别用APSS进行统计学分析。
试验结果见表1所示：
表1、抗菌性能测试结果
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2
大肠杆菌 92％ 93％ 90％ 53％ 61％
金黄色葡萄球菌 90％ 91％ 88％ 55％ 65％
白色念珠菌 93％ 95％ 91％ 59％ 67％
从上述试验结果可以看出，与对比例制得的多孔生物基质敷料相比，本发明制得的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料具有较好的抗菌性能。

Claims (9)

1.一种海藻酸钙复合多孔生物基质敷料，其特征在于，所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料由如下材料制备而成：
脱细胞冻干粉消化产物5～15重量份
海藻酸钙凝胶85～95重量份
两者的重量之和为100重量份；
所述的海藻酸钙凝胶由海藻酸钠、氯化钙和葡萄酸内酯反应得到；
所述的海藻酸钙凝胶采用如下制备方法制备得到：将海藻酸钠用适量的注射用水完全溶解，加入与海藻酸钠质量比为1～3：1的氯化钙搅拌均匀，再加入与海藻酸钠氯化钙混合液质量比为4～6：1的葡萄酸内酯，盐酸调节pH至4.5～6.5，在温度45～55℃下搅拌30～45分钟，即得所述的海藻酸钙凝胶。
2.根据权利要求1所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料，其特征在于，所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料由如下材料制备而成：
脱细胞冻干粉消化产物10重量份
海藻酸钙凝胶90重量份。
3.根据权利要求2所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料，其特征在于，所述的脱细胞冻干粉消化产物为将动物组织经收集及运输、病毒灭活处理、循环冻融处理、脱细胞、去除脱细胞溶液残留、冷冻干燥、冷冻球磨和胃蛋白酶消化制得的。
4.一种权利要求1～3任意一项所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
S1、制备脱细胞冻干粉消化产物
将动物组织制备成脱细胞冻干粉消化产物；
S2、制备海藻酸钙凝胶
将海藻酸钠与氯化钙和葡萄酸内酯反应制得海藻酸钙凝胶；
S3、制备海藻酸钙复合多孔生物基质敷料
将步骤S1制得的脱细胞冻干粉消化产物与步骤S2制得的海藻酸钙凝胶制备成海藻酸钙复合多孔生物基质敷料。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S2的过程为：将海藻酸钠用适量的注射用水完全溶解，加入与海藻酸钠质量比为1～3：1的氯化钙搅拌均匀，再加入与海藻酸钠氯化钙混合液质量比为4～6：1的葡萄酸内酯，盐酸调节pH至4.5～6.5，在温度45～55℃下搅拌30～45分钟，即得所述的海藻酸钙凝胶。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S3包括如下步骤：
S3.1、将脱细胞冻干粉消化产物和海藻酸钙凝胶按质量比5～15：85～95混合，用NaOH溶液调节pH至6.5～7.5，搅拌混合均匀，得到混合物；
S3.2、将所得的混合物倒入冻干模具中冻干，得到冻干产品；
S3.3、将冻干产品放置在成型模具中压制，得到三层基质敷料；
S3.4、将三层基质敷料放置在打孔成型模具中压制、均匀打孔，得到打孔后的基质敷料；
S3.5、将打孔后的基质敷料进行包装，得到包装好的基质敷料；
S3.6、将包装好的基质敷料进行灭菌处理，即得所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S3.3中，所得的三层基质敷料的最上层和最下层厚度为0.5mm～1.0mm，里层厚度为1.5mm～2.0mm；步骤S3.4中，所打的孔的孔径为2mm～3mm。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤S3.6中，所述的灭菌处理为采用EB辐照灭菌处理，灭菌剂量控制在20～25kGY范围内。
9.一种权利要求1～3任意一项所述的海藻酸钙复合多孔生物基质敷料在制备医美、整容或女性健康产品中的应用。
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Denomination of invention: A calcium alginate composite porous biological matrix dressing, its preparation method and application

Granted publication date: 20230602

Pledgee: Suqian Haoyu Enterprise Management Partnership (L.P.)

Pledgor: Hangzhou Beirong Biotechnology Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980000236